Hybridation in situ multiplex d’ARNm fluorescent des tissus craniofaciaux en développement dans des échantillons de souris en FFPE

Résumé

L’hybridation in situ conventionnelle a du mal à visualiser l’ARNm dans les tissus craniofaciaux en raison de l’architecture complexe, du fond élevé, de la spécificité limitée de la sonde et de sa sensibilité. Ce protocole décrit une méthode multiplex d’hybridation in situ à ARN fluorescent pour la détection sensible et spécifique de plusieurs cibles d’ARNm dans les tissus craniofaciaux embryonnaires de souris en FFPE, surmontant ainsi les limitations précédentes.

Résumé

Le développement craniofacial dépend de l’activité coordonnée de populations cellulaires diverses et spécialisées qui interagissent au sein d’architectures tissulaires complexes pour former et maintenir une structure et une fonction tissulaires normales. Comprendre comment ces cellules communiquent entre elles et avec leur microenvironnement local est essentiel pour définir les mécanismes moléculaires qui régulent leur formation et leur homéostasie. La perturbation de ces processus peut entraîner des affections craniofaciales congénitales, notamment l’agénésie dentaire, la fente palatique et la fente labiale, soit seuls, soit dans le cadre de troubles syndromiques. Bien que les techniques quantitatives comme la RT-PCR offrent une sensibilité et une plage dynamique élevées, elles nécessitent une extraction d’ARN à partir de tissus homogénéisés, ce qui entraîne une perte de contexte spatial et cellulaire, une limitation particulièrement critique pour les tissus craniofaciaux hétérogènes, où l’origine cellulaire des transcrits ne peut être résolue. L’hybridation in situ à l’ARN fluorescent multiplex surmonte cette limitation en permettant une détection sensible et spécifique de multiples transcripts d’ARNm tout en maintenant l’architecture tissulaire. Cette approche avancée permet une localisation précise de l’expression génique au niveau cellulaire, fournissant un éclairage précieux sur la régulation spatiale des processus développementaux et des mécanismes pathologiques en biologie craniofaciale.

Introduction

La réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR) est la référence pour l’analyse de l’expression génique en raison de sa grande sensibilité et de sa large plage dynamique ; cependant, elle nécessite de l’ARN extrait de tissus homogénéisés, entraînant une perte de contexte spatial^{et cellulaire 1}. Cette limitation est particulièrement problématique pour les tissus hétérogènes tels que les tissus craniofaciaux lors du développement embryonnaire, où la source cellulaire des transcrits détectés ne peut pas être résolue. L’hybridation in situ à ARN (ISH), une technique pionnière en 1968 par Joseph Gall et Mary Lou Pardue, surmonte cette limitation en permettant la localisation de l’expression de l’ARNm dans l’architecture tissulaire^{intacte 2}. Néanmoins, l’ARN ISH conventionnel est techniquement exigeant et fortement dépend d’une fixation tissulaire optimale et d’une préparation des échantillons pour préserver l’intégrité de^{l’ARN 3}. Ces difficultés sont aggravées dans les tissus hautement calcifiés, qui nécessitent des procédures de décalcification impliquant souvent des produits chimiques agressifs ou un traitement prolongé, conduisant à la dégradation de l’ARN. Par conséquent, l’ARN ISH dans les tissus craniofaciaux, qui comprennent des mélanges complexes de types cellulaires, nécessite une optimisation minutieuse et une expertise technique, est chronophage et comporte un risque important de coloration sous-optimale. Le défi de visualisation de l’expression de l’ARNm est encore plus marqué dans les tissus dentaires, qui possèdent une structure et une composition très complexes. Les dents sont composées de composants minéralisés tels que l’émail, la dentine, le cément et l’os environnant, ainsi que de tissus plus mous comme la pulpe et le ligament parodontal. Ces tissus sont peuplés d’une grande diversité de types cellulaires qui jouent un rôle crucial dans le développement des^{dents 4}. Ces caractéristiques nécessitent une standardisation rigoureuse pour garantir une détection fiable du signal. En conséquence, le protocole décrit est particulièrement adapté à l’étude de l’expression génique lors des phases développementales et postnatales de la formation dentaire.

Des techniques multiples d’hybridation in situ (FISH) à fluorescence (FISH) existent pour la détection spatiale d’ARN, notamment l’ARN amplifié basé sur la sonde^{FISH 5,6,7,8,9}, la réaction en chaîne d’hybridation^{FISH 6}, l’ARN à molécule unique FISH¹⁰, l’amplification du signal par réaction d’échange^{FISH 5}, et des plateformes FISH fortement multiplexées comme MERFISH¹¹ et ^{seqFISH 12}.¹³. Parmi ceux-ci, l’ARN fluorescent multiplex^{ISH 7,8,9} est largement utilisé en raison de sa grande sensibilité à la détection d’une seule molécule d’ARN résultant de la conception à double sonde Z, dans laquelle deux sondes adjacentes doivent s’hybrider avec la séquence cible pour initier l’amplification du signal. Cette conception de double reconnaissance améliore considérablement la spécificité et réduit le signal hors cible. La méthode permet la détection multiplex de 2 à 4 cibles (extensibles jusqu’à 12 cibles ou plus selon des techniques similaires), préserve la morphologie tissulaire et est compatible avec les tissus ^FFPE7,8,9, fraîchement congelés et calcifiés sélectionnés, ce qui la rend adaptée aux échantillons complexes tels que ceux rencontrés dans le développement craniofacial et dentaire. La méthode est standardisée, reproductible, soutenue par des bibliothèques de sondes bien établies et largement validée, garantissant des résultats accessibles et fiables dans divers laboratoires.

L’ARN fluorescent multiplex ISH utilise plusieurs sondes ciblant des régions distinctes du même transcript, combinées à une amplification du signal améliorée, permettant une détection très sensible et spécifique même pour les ARNm à faible abondance ou partiellement^{dégradés 14,15}. Bien que l’ARN fluorescent multiplexé ISH ait été appliqué avec succès à des échantillons osseux^{décalcifiés 16}, et son utilisation dans des tissus craniofaciaux complexes a déjà été^{rapportée 7,8,9} ; cependant, aucun protocole détaillé détaillé décrivant son application dans ce contexte n’a pas encore été rapporté.

Les structures craniofaciales comprennent des architectures tissulaires complexes avec des types cellulaires variés, incluant ostéoblastes, ostéoclastes, ostéocytes, améloblastes, odontoblastes, fibroblastes, cellules souches, cellules immunitaires, vascularisation et neurones sensoriels, dont les interactions spatialement coordonnées sont essentielles à la formation, à la fonction, à la régénération et à la protection immunologique^{des tissus.}. L’étude des expressions géniques localisées dans ces tissus est donc cruciale, et l’ARN fluorescent multiplex ISH représente une approche de premier plan pour ce type d’analyses.

Dans cette étude, nous avons décrit comment l’ARN fluorescent multiplex, basé sur des sondes et technologies d’ARNscope, pouvait être appliqué à l’étude de tissus craniofaciaux complexes (Figure 1). De plus, nous avons mis en place un flux de travail optimisé de section FFPE qui préserve l’intégrité de l’ARN et permet une analyse d’expression génique de haute qualité et spatialement résolue.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le National Institutes of Health, le National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (IACUC), dans le cadre du protocole d’étude animale #24-031.

1. Accouplement chronométré et collecte de tissus embryonnaires

1. Organisez des accouplements chronométrés.
   1. Associez un Mus musculus mâle et une femelle sains et fertiles en fin d’après-midi. Le lendemain matin, vérifiez la présence d’un bouchon vaginal. Désignez le jour où un bouchon est observé comme jour embryonnaire (E) 0,5.
2. Euthanasiez la femelle enceinte.
   1. Au stade de développement souhaité, euthanasiez la femelle enceinte par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale, conformément aux directives institutionnelles de soins animaliers.
   2. Placez la souris sur le dos sur une surface absorbante stérile. Désinfectez la zone abdominale avec 70 % d’éthanol le long du site d’incision prévu.
3. Exposez et isolez les cornes utérines.
   1. Réalisez une incision abdominale médienne avec des ciseaux chirurgicaux stériles, puis ouvrez la paroi péritonéale avec des ciseaux microchirurgicaux pour exposer les cornes utérines.
   2. Utilisez des pinces émoussantes pour extérioriser doucement la chaîne utérine. Libérez le tissu utérin le long du myomètre et coupez l’oviducte ainsi que l’attache médiane de la corne utérine pour isoler les embryons.
4. Transférez des embryons entiers.
   1. Transférez immédiatement la chaîne utérine contenant des embryons dans une boîte de Petri de 10 cm contenant un PBS de 1× stérile glacé (pH 7,4).
5. Disséquez des embryons individuels.
   1. Séparez soigneusement chaque embryon des membranes utérine, amniotique et chorionique environnantes.
   2. Transférez les embryons nettoyés dans une nouvelle gamelle de 10 cm contenant du PBS glacé et stérile.
6. Disséquez les têtes embryonnaires de souris.
   1. À l’aide d’une lame chirurgicale stérile, disséquez les têtes et rincez les têtes disséquées une fois dans un PBS bien froid avant de poursuivre le traitement.
      REMARQUE : Collectez et disséquez les souris nouveau-nées au stade de développement souhaité conformément au protocole animal.

2. Fixation et traitement des tissus

1. Réparez le mouchoir.
   1. Immergez immédiatement le tissu disséqué dans du formol tamponné neutre à 10 % et fixez-le toute la nuit à température ambiante sur un shaker.
      REMARQUE : Une préservation correcte de l’ARN est cruciale pour le succès des analyses d’hybridation in situ. De nombreuses études ont montré que l’approche standard — fixer des échantillons de tissu dans du formol tampon neutre à 10 % pour des durées allant de 6 à 48 heures, selon la taille et l’âge spécifiques du tissu — produit des résultats fiables pour la préservation de l’ARN 16,17,18,19. Pour les stades embryonnaires plus précoces (E12.5 et moins), la pénétration du fixateur est rapide, et le temps de fixation doit être réduit en conséquence pour éviter une surfixation. À partir du jour embryonnaire 17,5 (E17,5), ainsi que dans les échantillons postnataux, la pénétration du fixateur peut être moins efficace en raison de la présence de peau sur la tête, qui agit comme une barrière physique. Ainsi, la peau doit être retirée de toute la tête pour permettre une pénétration efficace de la solution de fixation. La décalcification peut être réalisée dans 0,5 M EDTA (pH 8,0) contenant 0,5 % de formaldéhyde sans méthanol à 4 °^{C 7}. La durée de la décalcification peut être surveillée par un microscanner rapide et peut être ajustée en fonction du degré de minéralisation et du type de tissu spécifique ; pour les embryons E18,5, 24 à 48 h suffisent généralement.
2. Rincez et traitez le tissu.
   1. Retirez le fixateur et rinçez les échantillons dans le PBS. Transférez le tissu à 70 % d’éthanol et conservez à 4 °C jusqu’à un traitement supplémentaire (1 à 4 semaines⁾²⁰. Effectuez la déshydratation, le nettoyage et l’infiltration de paraffine à l’aide d’un processeur de tissus automatisé selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Le protocole typique de traitement tissulaire est le suivant : 70 % d’éthanol pendant 30 minutes, suivi de 95 % d’éthanol pendant 30 minutes (2 fois), et 100 % d’éthanol pendant 30 minutes (3 fois) pour la déshydratation ; nettoyage dans le xylène pendant 1 h (3 fois), puis infiltration avec de la cire de paraffine à 60 °C pendant 1 h (3 fois) avant d’être intégrée dans des blocs de tissu de paraffine.
3. Enfoncez le tissu.
   1. Immergez les têtes dans la paraffine et orientez les échantillons soit dans le plan coronal, soit dans le plan sagittal, selon les besoins expérimentaux.
   2. Transférez les blocs intégrés sur une plaque froide en bloc de paraffine pour permettre à la cire de durcir pendant environ 30 minutes, avec un ajustement du timing selon la taille du bloc.
4. Stockez les blocs FFPE.
   1. Laissez la paraffine se solidifier complètement. Sortez les blocs des moules, mettez-les dans des contenants hermétiques ou des sacs zip-lock, et conservez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être coupés.
      REMARQUE : Les blocs de FFPE contenant de l’ARN bien conservé peuvent être conservés pendant plusieurs années avant la coupe sans compromettre l’intégrité tissulaire.

3. Traitement du tissu FFPE pour multiplex ISH à ARN fluorescent

1. Préparez un espace de travail sans RNase.
   1. Désinfectez toutes les surfaces de travail et les instruments avec 70 % d’éthanol. Traiter les surfaces, outils et gants avec une solution décontaminante à RNase afin de minimiser la dégradation de l’ARN.
   2. Installez le microtome et installez une nouvelle lame. Réglez l’angle de jeu à 10°. Traitez la pince à épiler et les brosses avec une solution décontaminante à RNase avant utilisation.
      REMARQUE : Utilisez toujours une nouvelle lame pour la coupe afin d’obtenir des tranches de tissu précises. L’angle de la lame affecte significativement la qualité de la section, l’intégrité des tissus, l’uniformité de l’épaisseur et la préservation des caractéristiques morphologiques.
2. Préparez le bain-marie.
   1. Remplissez un bain-marie à flottaison avec de l’eau ultrapure de qualité laboratoire.
   2. Ajustez la température entre 40 et 43 °C selon les besoins, selon le stade embryonnaire et les caractéristiques tissulaires.
3. Ajustez et montez le bloc en FFPE.
   1. Coupez l’excès de paraffine autour du tissu incrusté. Refroidissez le bloc de FFPE sur de la glace et montez-le sur l’étage froid du microtome.
4. Taillez selon la région d’intérêt.
   1. Alignez la face du bloc de paraffine avec la lame du microtome et coupez à 12 μm par pas jusqu’à ce que la région d’intérêt (par exemple, la adjacente à la molaire ou à la dent incisive) apparaisse dans les coupes coronales.
   2. Repositionner le bloc et la lame selon les besoins pour des sections coronales ou sagittales symétriques et correctement orientées sur toute la tête.
5. Coupez le tissu.
   1. Une fois la région d’intérêt atteinte, coupez des sections de 5 à 7 μm. Faites flotter les sections sur le bain-marie pour permettre une relaxation douce et un aplatissement avant de les transférer sur des toboggans.
6. Montez et séchez les sections.
   1. Montez les sections sur des lames en verre chargées positivement. Examinez les lames au microscope optique pour confirmer la bonne orientation et l’intégrité des tissus.
   2. Séchez les lames sur un chauffe-lames à 40 °C pendant la nuit avant de réaliser le test multiplex d’ARN fluorescent ISH.

4. Jour 1 : Déparaffinisation et réhydratation

1. Fais cuire les diapositives.
   1. Faites cuire les lames avec des sections de FFPE pendant 1 heure à 60 °C.
      REMARQUE : Si la lame n’est pas utilisée immédiatement, conservez-la non cuite à température ambiante (RT) avec des dessiccants pendant 1 à 4 semaines. Un stockage prolongé peut entraîner une dégradation de l’ARN.
2. Équilibrez les diapositives.
   1. Laissez la lame de tissu FFPE s’équilibrer à température ambiante (RT) pendant 10 minutes.
3. Déparaffinez et réhydratez les sections.
   1. Immergez les lames dans du xylène ou un substitut de xylène avec une légère agitation pendant 5 à 10 minutes à la RT. Répétez cette étape une fois pour assurer une élimination complète de la paraffine.
      REMARQUE : Le travail avec le xylène doit être effectué dans une hotte chimique. Si un substitut au xylène à faible toxicité est utilisé, il peut être utilisé en dehors de la hotte chimique.
   2. Transférez les lames à 100 % d’éthanol et incubez pendant 2 minutes à la RT. Répétez une fois pour retirer le xylène résiduel. Réhydratez les sections à 70 % d’éthanol pendant 2 minutes.
   3. Rincez les sections 3 fois avec du PBS. Ajoutez ensuite une goutte de PBS suffisante pour couvrir complètement les sections et passez immédiatement à l’étape suivante.

5. Multiplexage d’ARN fluorescent ISH sur des sections de tissu FFPE

REMARQUE : Cette étude a suivi les instructions du fabricant pour réaliser le multiplex ISH d’ARN fluorescent sur des sections de tissu FFPE utilisant la technologie^{RNAscope 21}.

1. Jour 1 : Prétraitement et hybridation par sonde
   1. Tracez une barrière hydrophobe.
      1. À l’aide d’un stylo barrière, dessinez une barrière hydrophobe autour de chaque section de tissu. Laissez les lames sécher à l’air pendant environ 10 minutes à température ambiante (RT).
      2. Veillez à ce que les sections de tissu restent toujours couvertes de PBS pour éviter le dessèchement.
         REMARQUE : Utilisez une lingette sans peluches (lingette pour lentilles) pour sécher la lame autour du tissu tout en gardant le tissu hydraté. Assurez-vous que l’encre barrière du stylo ne touche pas la section de tissu.
   2. Effectuez un prétraitement.
      1. Appliquez le réactif de prétraitement personnalisé pour recouvrir complètement chaque section. Incubez les lames pendant 30 minutes à 40 °C dans une chambre humidifiée placée à l’intérieur d’un four d’hybridation.
         REMARQUE : Pour tous les réactifs fournis dans des flacons à compte-gouttes, ajoutez suffisamment de gouttes pour couvrir entièrement la section à l’intérieur de la barrière. Assurez-vous que tous les réactifs sont apportés à RT avant utilisation.
   3. Rincez les sections.
      1. Rincez les sections plusieurs fois avec du PBS, puis incubez dans du PBS frais pendant 2 minutes en temps de repos.
         REMARQUE : Utilisez une pipette de transfert de 5 mL pour laver chaque lame individuellement avec du PBS. Pendant le lavage de 2 minutes, assurez-vous que les sections restent entièrement couvertes de PBS.
   4. Éteindre l’activité endogène de la peroxydase.
      1. Appliquez du peroxyde d’hydrogène à 3 % sur chaque section et incubez au RT pendant 10 minutes pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase.
   5. Répétez le lavage.
      1. Lavez les lames en PBS pendant 2 minutes à la réception. Répétez deux fois.
   6. Préparez les sondes.
      1. Préchauffez les sondes à 40 °C pendant 10 minutes. Laissez les sondes refroidir en RT avant utilisation.
   7. Préparez le mélange de la sonde.
      1. La sonde C1 est fournie comme solution de travail 1× ; Utilisez cela directement.
      2. En revanche, les sondes C2, C3 et C4 sont fournies sous forme de concentrés à 50 × ; diluez ces sondes avec la solution sonde C1. Si la sonde C1 n’est pas utilisée, diluez les sondes C2, C3 et/ou C4 avec le diluant fourni par le fabricant.
   8. Hybridez les sondes.
      1. Appliquez 30 à 40 μL de mélange de sonde sur chaque section de tissu, assurant ainsi une couverture complète. Incubez les lames pendant 2 h à 40 °C dans une chambre humidifiée du four d’hybridation.
         REMARQUE : Lors de l’apprentissage de la technique RNAscope, il est recommandé d’inclure des sondes témoins négatives et positives lors des essais. Cette approche permet de valider le test et de confirmer la qualité de la procédure. Une limitation potentielle à surveiller est que certaines sondes de contrôle positive fournies par le fabricant peuvent ne pas être exprimées dans le tissu d’intérêt. Pour y remédier, des sondes spécifiques au type cellulaire peuvent être utilisées. Par exemple, Col1a1 est un contrôle positif fiable pour les tissus conjonctifs. La coloration pour Col1a1 (ou un autre gène à haute expression connue) peut être réalisée comme première étape pour évaluer la préservation de l’ARN et la morphologie tissulaire dans les échantillons. Une fois la maîtrise de la technique atteinte, les contrôles négatifs sont généralement réalisés en traitant des lames sans sondes mais en les traitant avec toutes les autres solutions. Cette méthode fournit des informations cruciales concernant le signal de fond dans tous les canaux de détection. Le kit standard Multiplex V2 permet la coloration et l’imagerie simultanées de jusqu’à quatre sondes différentes. Lorsque les niveaux d’expression génique sont établis par des études transcriptomiques antérieures, il est conseillé d’attribuer des gènes à faible expression aux canaux Cy5 et Cy7. Les gènes fortement exprimés doivent être placés dans les canaux GFP et RFP pour une détection optimale. Dans les cas où aucune des sondes ne cible des gènes à forte expression, le canal GFP doit rester inutilisé. Cela permet au canal GFP de servir de référence pour la soustraction de fond du canal RFP, améliorant la précision de la détection du signal pour les cibles à faible expression.
   9. Rincez avec un tampon de lavage.
      REMARQUE : Le tampon de lavage de 20 × disponible dans le commerce a été dilué à 1× avec de l’eau sans RNase avant utilisation.
      1. Lavez les lames pendant 2 minutes en RT dans le tampon de lavage 1× fourni avec le kit. Répétez deux fois.
   10. Incubez dans un tampon 5x saline-citrate de sodium (SSC).
       REMARQUE : Le tampon SSC de 20 × disponible commercialement (3 M NaCl, 0,3 M citrate de sodium, pH 7,0) a été dilué à 5× avec de l’eau sans RNase avant utilisation.
       1. Après lavage, incubez les sections toute la nuit dans un tampon SSC de 5× au RT.
2. Jour 2 : Amplification du signal, marquage fluorescent et montage
   1. Lavez les diapositives.
      1. Lavez les lames en 1× tampon de lavage pendant 2 minutes à température ambiante (RT). Répétez deux fois.
   2. Effectuez les étapes d’amplification.
      1. Appliquez un réactif d’amplification 1 sur chaque section et incubez pendant 30 minutes à 40 °C dans une chambre humidifiée.
      2. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      3. Appliquez le réactif Amplification 2 et incubez pendant 30 minutes à 40 °C.
      4. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      5. Appliquez le réactif Amplification 3 et incubez pendant 15 minutes à 40 °C.
         REMARQUE : Les trois étapes d’amplification sont nécessaires, quel que soit le canal (sonde) en cours de développement.
      6. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
   3. Développer la peroxydase du raifort (HRP) et le fluorophore.
      1. Calculez le volume de fluorophore nécessaire (généralement 100 à 200 μL par lame) et diluez les stocks de fluorophores opalais.
         REMARQUE : La plage de dilution recommandée pour le fluorophore est de 1:300–1:1500. Dans ces expériences, Opal Polaris 780 (réactif fluorophore) a été dilué à 1:500 en diluant anticorps, et tous les autres colorants ont été dilués à 1:1000 dans un tampon TSA. Minimisez l’exposition à la lumière des lames autant que possible.
      2. Appliquez le réactif HRP-C1 et incubez pendant 15 minutes à 40 °C.
      3. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      4. Appliquez 30 à 40 μL de colorant Opal (par exemple, Opal 570 ou Opal 690) sur chaque section. Incubez pendant 30 minutes à 40 °C.
      5. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      6. Appliquez un bloqueur HRP et faites éclore pendant 15 minutes à 40 °C.
      7. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      8. Appliquez le réactif HRP-C2 ou HRP-C3 et incubez à 40 °C pendant 15 minutes.
      9. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      10. Appliquez 30 à 40 μL du second colorant opale et incubez pendant 30 minutes à 40 °C.
      11. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      12. Appliquez un bloqueur HRP et faites éclore pendant 15 minutes à 40 °C.
      13. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      14. Appliquez le réactif HRP-C3 ou HRP-C4 et incubez pendant 15 minutes à 40 °C.
      15. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
   4. Effectuer l’amplification du signal tyramide — digoxigénine (TSA-DIG) et le marquage par fluorophore (si applicable).
      1. Appliquez 30 à 40 μL de réactif TSA-DIG dilué par coupe et incubez pendant 30 minutes à la réanimation récréative.
      2. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      3. Appliquez un réactif bloqueant et incubez pendant 15 minutes à 40 °C.
      4. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
      5. Appliquez 30 à 40 μL de réactif fluorophore dilué et incubez pendant 30 minutes à 40 °C.
      6. Rincez deux fois en 1× Wash Buffer pendant 2 minutes à RT.
   5. Effectuez le contre-teinture et le montage.
      1. Appliquer du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et incuber pendant 5 minutes à la RT dans le noir.
      2. Rincez le DAPI et montez rapidement les sections avec un support anti-décoloration, appliquez doucement la couche de couverture et évitez d’emprisonner les bulles d’air. Choisissez une taille de couverture qui correspond parfaitement à la couverture de tissu.
      3. Faites sécher les lames pendant 2 heures à la rétention dans le noir, puis gardez les lames à 4 °C pour un stockage à long terme.
         REMARQUE : La fluorescence peut être conservée jusqu’à un an si elle est stockée à 4 °C dans l’obscurité avec un montage anti-décoloration approprié.
   6. Réalisez des images d’imagerie.
      1. Réalisez l’imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence multicanal avec éclairage LED et filtres pour la séparation spectrale (Figure 2A). Utilisez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission comme suit : DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) et Cy7 (747/773 nm). Des filtres spécifiques minimisent les chevauchements spectraux et distinguent les signaux bleu, vert, orange, rouge et proche infrarouge.
      2. Acquérir toutes les images en utilisant les mêmes réglages d’exposition et d’éclairage sur les échantillons, assurant la cohérence et permettant une analyse comparative fiable.

Résultats

En utilisant le protocole décrit (Figure 1), nous démontrons la détection de transcripts ISH d’ARNm fluorescents multiplex sur une tête entière de souris imagée sur une plateforme de microscope Zeiss (Figure 2B). Des vues d’image spécifiques peuvent être sélectionnées via l’onglet latéral (encadré jaune), tandis que plusieurs canaux peuvent être visualisés simultanément à l’aide de l’onglet canal (boîte rouge). La luminosité, le...

Discussion

L’hybridation in situ est un outil fondamental pour l’étude de l’expression génique depuis plus de quarante ans et a connu un affinage continu. Cependant, les approches ISH conventionnelles sont souvent limitées par une faible sensibilité, un signal de fond élevé et des procédures longues et laborieuses. Ces contraintes ont restreint leur application plus large, en particulier dans les tissus craniofaciaux complexes où une résolution spatiale précise et la détection des transcri...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 & fois ; PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  ; pour effectuer des lavages pendant le flux de travail
20 et fois ; SSC	Thermo Fischer	J60839. K2	À utiliser pour faire le 1&aigu ; Tampon de lavage
50 mL de tubes coniques (Ambion) sans ARNase	Thermo Fischer	AM12502	Utilisation pour stocker des échantillons dans différentes solutions
Vibrateur orbital avancé	VWR	6683-470	À utiliser pour secouer les tissus dans la solution de fixation pendant l’incubation
Alcool, 70 %, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	À utiliser pour nettoyer et désinfecter tout l’espace de travail
Diluant d’anticorps & nbsp ;	Akoya Biosciences	ARD1001EA	Diluant pour TSA-DIG
Processeur de tissu à vide automatisé	Leica Biosystems	ASP300S	Utilisation pour dégager la déshydratation, la réhydratation et l’infiltration de cire des échantillons
Verre de couverture Épaisseur 1,5, 25 mm x 25 mm   ;	Corning	2850-25	Utilisation pour le montage de la culasse dans le flux de travail Visium HD
Réactif de prétraitement personnalisé	ACD, Bio-Techne	300040	Optimiser la perméabilisation tissulaire et l’accessibilité des cibles
EDTA	Millipore Sigma	03690	Utilisation pour décalcifier les tissus minéralisés
Éthanol à 100 %	Groupe AeroBase	6505001050000	À utiliser pour retirer la xyline et réhydrater les échantillons pendant le traitement
Bain Marie HistoCore & nbsp ;	Leica Biosystems	HIS2326	Utilisez pour faire flotter les sections à 40-43 °C ; C pour éliminer les plis des sections FFPE & nbsp ;
Papier humidificateur HybEZ	ACD, Bio-Techne	310015	À utiliser à l’intérieur du four HybEZ pour maintenir l’humidité et empêcher les sections de tissu de sécher lors de l’hybridation
Four, plaque et grille HybEZ	ACD, Bio-Techne	310011, 310012, 310014	À utiliser pour assurer une température contrôlée, une humidité et un positionnement correct des diapositives lors des étapes d’hybridation et d’incubation   ;
Stylo barrière hydrophobe ImmEdge	Laboratoire de vecteurs	H-4000	Utilisez pour tracer des limites hydrophobes sur les lames afin de confiner les réactifs à la section tissulaire lors des procédures de coloration.
Lames jetables à profil bas DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	À utiliser pour sectionner les blocs FFPE & nbsp ;
Formol tamponné neutre 10 %	Azer Scientific	NBF-4-G	À utiliser pour réparer les mouchoirs
PACK DE RÉACTIFS OPAL 520	Akoya Biosciences, Inc.	FP1487001KT	Amplifier et détecter les signaux d’ARN cible avec un marquage fluorescent.
PACK DE RÉACTIFS OPAL 570	Akoya Biosciences, Inc.	FP1488001KT	Amplifier et détecter les signaux d’ARN cible avec un marquage fluorescent.
PACK DE RÉACTIFS OPAL 620	Akoya Biosciences, Inc.	FP1495001KT	Amplifier et détecter les signaux d’ARN cible avec un marquage fluorescent.
PACK DE RÉACTIFS OPAL 690	Akoya Biosciences, Inc.	FP1497001KT	Amplifier et détecter les signaux d’ARN cible avec un marquage fluorescent.
Pack de réactifs Opal Polaris 780	Akoya Biosciences, Inc.	FP1501001KT	Amplifier et détecter les signaux d’ARN cible avec un marquage fluorescent.
Prolong Diamond	Thermo Fischer	P36970	Un milieu de montage antifondu pour préserver les signaux fluorescents et protéger le signal de l’ARN-scope lors de l’imagerie
Kit auxiliaire RNAscope 4-Plex UI spécifique	ACD, Bio-Techne	323120	Matériaux supplémentaires utilisés avec le test RNAscope Multiplex Fluorescent v2
RNAscope DAPI	ACD, Bio-Techne	320858	Une coloration nucléaire fluorescente utilisée dans les essais à ARN-scope pour visualiser les noyaux cellulaires
Kit de réactifs fluorescents multiplex RNAscope v2	ACD, Bio-Techne	323100	Réaliser une hybridation multiplex fluorescente in situ
Tampon TSA multiplex RNAscope	ACD, Bio-Techne	322810	Un tampon utilisé dans l’ARNscope pour diluer les colorants opale
RNAscope Réactifs tampons de lavage	ACD, Bio-Techne	310091	À utiliser pour laver les sections de tissu sur lames pendant le test
Solution de décontamination RNaseZap RNase	Thermo Fischer	AM9782	À utiliser pour nettoyer et retirer la RNase
Microtome rotatif semi-automatisé	Leica Biosystems	RM2245	Utilisez pour sectionner les blocs FFPE tels que rapportés dans les directives.
Slide Brite	Science de la microscopie électronique	23401-01	Pour l’étape de la déparaffinisation avant le traitement de l’ARNscope.
Chauffe-coulisse avec couvercle	Première & nbsp ;	XH2004	Utilisation pour l’incubation de lames à différentes températures
Slides Superfrost Plus & nbsp ;	Fisher Scientific	12-550-15  ;	Utilisation pour attacher des sections pour Vsium HD
Paraplaste Surgipath	Leica Biosystems	39601006	Utilisation pour effectuer l’infiltration tissulaire et l’implantation des tissus
Culture tissulaire DISH 100 X 20 MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Utilisation pour la collecte et la dissection d’échantillons en 1&aigu ; PBS
Xylène	Fisher Scientific	6,81001E+12	Utilisé comme agent clarifiant pour éliminer l’alcool et rendre les tissus transparents