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Article de méthode
* These authors contributed equally
L'application des cellules T CAR aux tumeurs solides est limitée par la complexité ex vivo préoccupations liées à la fabrication et à la sécurité. Ce protocole décrit une méthode pour la in situ génération de cellules CAR-T transitoires via L'administration de ARNm codant pour un CAR par des nanoparticules lipidiques (LNP), offrant une plateforme reproductible adaptable à d'autres applications de génie cellulaire immunitaire basées sur l'ARNm.
La thérapie par cellules T exprimant un récepteur chimérique d'antigène (CAR) a obtenu des succès cliniques remarquables dans les tumeurs hématologiques ; toutefois, son application plus large est limitée par des coûts de production élevés et une efficacité insuffisante contre les tumeurs solides. Pour surmonter ces obstacles, une stratégie de génération in situ de cellules CAR-T a été développée, fondée sur la délivrance par nanoparticules lipidiques (LNP) d'ARNm codant pour un CAR ciblant la Claudine18.2, permettant la production transitoire de cellules CAR-T directement au sein du tissu tumoral. Après la transfection par les LNP, les cellules T activées ont exprimé efficacement le CAR à leur surface. Ces cellules CAR-T transitoires ont démontré une activité cytotoxique puissante contre des lignées cellulaires de carcinome gastrique positives pour la Claudine18.2, notamment NUGC4 et NCI-N87, et ont produit une efficacité antitumorale significative dans des modèles murins porteurs de tumeurs. Ce protocole décrit en détail les procédures de transcription in vitro de l'ARNm du CAR, de formulation des LNP, d'activation et de transfection des cellules T, d'analyse de l'expression du CAR, ainsi que l'évaluation fonctionnelle in vitro et in vivo de la cytotoxicité médiée par les cellules CAR-T. Dans leur ensemble, cette stratégie fournit une plateforme rentable et polyvalente pour générer des cellules CAR-T transitoires et offre une approche prometteuse pour le traitement des tumeurs solides.
L'incidence et la mortalité du cancer augmentent rapidement dans le monde entier, ce qui constitue une menace pour la survie humaine et le développement sociétal. Le cancer gastrique est la troisième cause de décès liée au cancer dans le monde et est très répandu1. En raison de taux faibles de diagnostic précoce, une proportion importante de patients sont diagnostiqués à un stade avancé. Les traitements traditionnels comprennent la chirurgie, la radiothérapie et la chimiothérapie. La résection chirurgicale chez les patients atteints d'un cancer gastrique de stade moyen à avancé ou complexe peut être incomplète. De plus, les traumatismes chirurg....
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Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d'éthique pour les animaux de laboratoire de l'hôpital populaire n°10 de Shanghai (numéro d'approbation : SHDSYY-2025-P0085 ; date d'approbation : 1er janvier 2025). Cette étude respecte les lois, réglementations et exigences institutionnelles locales. Des souris femelles NSG âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées. Les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) utilisées dans cette étude ont été obtenues auprès d'une source commerciale. Les réactifs et équipements utilisés dans cette étude sont listés dans le Tableau des matériaux.
1. Pr....
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Une séquence de CAR ciblant la Claudine18,2 a été utilisée, composée du fragment variable monocaténaire (scFv) issu d'un anticorps monoclonal humanisé anti-Claudine18,2, de la région charnière de CD8, de la région transmembranaire de CD28, du domaine de costimulation et du domaine d'activation CD3ζ. Un modèle d'ADN contenant le promoteur T7 et une queue poly A a été construit à partir de cette séquence pour la transcription in vitro de l'ARNm du CAR (Figure 1A). L'ARNm du CAR mesura.......
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Ce protocole fournit un système de livraison d'ARNm non viral qui évite l'intégration dans le génome hôte, contournant ainsi de nombreux risques, notamment le rejet immunitaire. Sa fonctionnalité transitoire empêche également la toxicité hors cible, permettant une expression à court terme et contrôlable dans les cellules CAR-T afin de réduire les effets secondaires et les risques pour la sécurité.
L'optimisation de la conception de la séquence d'ARNm du CAR a été réalisée afin de réguler son e.......
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Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts
Nous tenons à exprimer notre reconnaissance à l'Université de Shanghai et au Laboratoire central de l'Hôpital populaire n°10 de Shanghai pour avoir fourni une plateforme de recherche pour cette étude.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Éthanol absolu | Sigma-Aldrich | 459836 | Phase organique |
| Agarose | Beyotime | ST004L | Électrophorèse sur gel |
| anticorps monoclonal anti-espacer G4S (B02H1) PE | Hycells | GS-ARPE100 | Détection du CAR |
| Enzyme de restriction BspQI | NEB | R0712 | Linéarisation du plasmide |
| BV421 Anti-CD25 humain de souris | BD Biosciences | 564033 | Marqueur d'activation |
| Microbilles d'activation CD3/CD28 | Thermo Fisher Scientific | 11161D | Activation des lymphocytes T |
| Cholestérol | Sigma-Aldrich | C8667 | Lipide structural |
| Incubateur de culture cellulaire au CO2 | Thermo Fisher / équivalent | 250i | Pour la culture des lymphocytes T et des cellules tumorales |
| DMG-PEG2000 | Avanti Polar Lipids | 880151 | Lipide PEGylé |
| Microbilles magnétiques d'isolement de l'ADN | SYNTHGENE | 10501-005 | Purification de l'ADN |
| DNase I (sans RNase) | NEB | M0303L | Élimination du modèle d'ADN |
| DSPC | Avanti Polar Lipids | 850365 | Phospholipide |
| Analyseur de diffusion dynamique de la lumière | Malvern Panalytical | Zetasizer | Pour la taille des nanoparticules lipidiques (LNP), l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta |
| Buffer EasySep | STEMCELL Technologies | 20144 | Séparation magnétique |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Gibco | 10099-141 | Supplément de culture |
| FITC Anti-CD3 humain de souris | BD Biosciences | 555332 | Identification des lymphocytes T |
| Cytomètre en flux | BD Biosciences / équivalent | FACSCelesta / LSRFortessa | Pour le CAR et le marqueur d'activation |
| Colorant nucléique GelGreen | Biotium | 41005 | Visualisation de l'ADN |
| Colorant fixable VIABLE/MORT | Invitrogen | L34955 | Coloration de viabilité |
| Kit de dosage de la luciférase | Promega | E1500 | Mesure de la cytotoxicité |
| Support de séparation magnétique | STEMCELL Technologies / équivalent | 18000 | Pour l'isolement des PBMC et des lymphocytes T |
| Spectrophotomètre Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | Pour la quantification de l'ADN/ARN |
| Souris femelles NSG (6–8 semaines) | Jackson Laboratory | 5557 | Modèle in vivo |
| PBMC | Shanghai Saili Biotechnology Company | ||
| Cycleur thermique PCR | Bio-Rad / équivalent | T100 | Pour l'amplification de l'ADN |
| PE Anti-CD69 humain de souris | BD Biosciences | 557050 | Activation précoce |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140-122 | Antibiotiques |
| Analyseur d'acides nucléiques Qsep | BiOptic Inc. | Qsep100 | Pour l'analyse de la taille et de l'intégrité de l'ARN |
| Kit Quant-iT RiboGreen RNA | Invitrogen | R11490 | Efficacité d'encapsulation |
| RapidSpheres | STEMCELL Technologies | 15061 | Marquage magnétique |
| IL-15 humaine recombinante | PeproTech | 200-15 | Soutien du phénotype mémoire |
| IL-2 humaine recombinante | PeproTech | 200-02 | Expansion des lymphocytes T |
| IL-7 humaine recombinante | PeproTech | 200-07 | Survivabilité des lymphocytes T |
| Centrifugeuse réfrigérée | Eppendorf / équivalent | 5425R | Pour la concentration des nanoparticules lipidiques (LNP) et le traitement cellulaire |
| Marqueur d'ARN 6000 | Thermo Fisher Scientific | AM7152 | Caractérisation de l'ARN |
| Kit de cartouche d'ARN (1 pièce) | Bioptic | C105110 | Contrôle qualité de l'ARN |
| Microbilles magnétiques d'isolement de l'ARN | SYNTHGENE | 10511-005 | Purification de l'ARNm |
| Eau sans RNase | Thermo Fisher Scientific | AM9937 | Transcription in vitro (IVT) et manipulation de l'ARN |
| RPMI 1640 GlutaMAX | Gibco | 61870-036 | Culture des lymphocytes T |
| SM-102 | MedChemExpress / équivalent | HY-112563 | Lipide ionisable |
| Cocktail d'isolement des lymphocytes T | STEMCELL Technologies | 15061 | Isolement des lymphocytes T CD3+ |
| Kit de co-transcription T7 et d'ajout de capuchon | SYNTHGENE | 10111-3011 | Synthèse d'ARNm par transcription in vitro (IVT) |
| Buffer TBS | Gibco | 3005 | Stockage des nanoparticules lipidiques (LNP) |
| Trypsine-EDTA | Gibco | 25200-056 | Détachement cellulaire |
| Système d'imagerie UV pour gels | Syngene / équivalent | NuGenius/NuGenius+ | Pour la vérification de la digestion de l'ADN |
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