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Quantification du fluorure dans le sérum, l'os et les dents dans un modèle murin par diffusion facilitée par l'hexaméthyldisiloxane et mesures par électrode sélective d'ions

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DOI :

10.3791/71488

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28 août 2026

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1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la préparation de boîtes de diffusion facilitée par l'hexaméthyldisiloxane (HMDS), suivie de mesures par électrode ionosélective afin de quantifier la masse d'ions fluorure dans le sérum, les os et les dents de souris. La méthode offre une approche sensible fondée sur l'étalonnage pour évaluer l'accumulation de fluorure dans des échantillons biologiques.

Résumé

La quantification des niveaux de fluorure dans les tissus biologiques est essentielle pour comprendre l'exposition au fluor, son métabolisme et sa toxicité. Ce protocole décrit une méthode sensible et reproductible pour mesurer la masse d'ions fluorure dans le sérum, l'os et les dents, en utilisant une diffusion facilitée par l'hexaméthyldisiloxane (HMDS) suivie d'une analyse par électrode sélective d'ions (ISE). Des échantillons biologiques, incluant le sérum, l'os fémoral et les incisives mandibulaires, sont prélevés chez des souris exposées à des traitements contrôlés de fluorure. Les échantillons osseux et dentaires sont calcinés, broyés et hydratés, tandis que le sérum est traité directement. Chaque échantillon est transféré dans une boîte de diffusion contenant de l'eau ultrapure et scellé avec un couvercle enduit de pétrolatum, portant des gouttelettes d'hydroxyde de sodium qui servent de pièges à fluorure. L'injection d'acide sulfurique saturé en HMDS déclenche la libération et la diffusion du fluorure, permettant aux ions fluorure libérés d'être captés quantitativement dans les pièges. Après une diffusion nocturne, les gouttelettes pièges sont regroupées en un seul échantillon, acidifié à la plage de pH requise, puis ajusté à un volume défini pour la mesure par ISE. Des boîtes de diffusion de calibration, préparées avec des masses connues de fluorure, permettent d'établir une courbe standard pour la quantification, tandis que des échantillons de contrôle qualité vérifient la stabilité de l'électrode. Des résultats représentatifs obtenus chez des souris adolescentes et adultes exposées à 0 ou 125 ppm de fluorure illustrent la capacité de cette méthode à détecter des différences liées à l'âge et à la dose dans les concentrations de fluorure dans le sérum, l'os et les dents. Ce protocole propose une approche robuste, fondée sur une étalonnage, pour quantifier le fluorure dans diverses matrices biologiques, et convient particulièrement aux études sur l'exposition au fluor, son dépôt tissulaire et ses effets toxicologiques chez les modèles murins. Un avantage majeur de cette méthode réside dans sa capacité à quantifier précisément le fluorure dans des échantillons extrêmement petits, notamment les 3–5 mg de cendre obtenus à partir des incisives individuelles de souris, car le processus de diffusion concentre l'ensemble du fluorure libéré dans un volume mesurable inférieur à 100 µL.

Introduction

Le fluorure est un anion présent naturellement, et un niveau optimal de fluorure est efficace pour prévenir les caries dentaires1,2,3,4,5. Aux États-Unis (U.S.), la fluoration de l'eau potable communautaire à 0,7 ppm a été mise en œuvre comme stratégie de santé publique afin de réduire l'incidence des caries et de promouvoir la santé bucco-dentaire6. Toutefois, une ingestion prolongée de quantités excessives de fluorure peut nuire à plusieurs tissus. Une exposition élevée au fluorure perturbe la formation de l'émail7,8,9, modifie la formation osseuse10 et compromet l'intégrité du squelette11.

Au niveau cellulaire, l'exposition au fluorure induit plusieurs perturbations métaboliques, notamment le stress oxydatif12, le stress du réticulum endoplasmique13, des modifications épigénétiques altérant l'expression génique14, ainsi que l'apoptose des améloblastes15,16,17,18. À l’échelle mondiale, des concentrations élevées de fluorure dans les eaux souterraines (>1,5 ppm) constituent un problème de santé publique important. Une étude récente de modélisation prédictive a estimé qu’environ 180 millions de personnes dans le monde seraient potentiellement exposées à des niveaux excessifs de fluorure, la charge la plus élevée se situant en Asie et en Afrique1. Outre l’eau potable, l’exposition au fluorure se produit également par l’alimentation (par exemple, les produits de la mer ; ~1,9 ppm), les boissons (par exemple, le thé ; 0,5–6 ppm19) et les produits dentaires tels que les dentifrices20 (1 000–1 500 ppm).

Comprendre l'exposition au fluorure, son métabolisme et son dépôt tissulaire est donc essentiel pour évaluer à la fois ses effets thérapeutiques bénéfiques et ses conséquences toxicologiques potentielles. La quantification précise du fluorure dans des échantillons biologiques — notamment l'urine, le sérum, l'os et les dents — constitue un élément critique de ces travaux. Toutefois, la mesure s'avère analytiquement difficile en raison du comportement chimique du fluorure et de son affinité élevée pour les matrices riches en calcium. Environ 99 % du fluorure présent dans l'organisme se trouve dans les tissus minéralisés tels que l'os et les dents21. Pour surmonter ces difficultés, diverses techniques analytiques ont été mises au point, notamment la potentiométrie par électrode sélective d'ions (ISE), la chromatographie ionique, les dosages colorimétriques, les méthodes titrimétriques, ainsi que des méthodes nucléaires ou par activation22. Parmi celles-ci, la technique de diffusion facilitée par l'hexaméthyldisiloxane (HMDS) combinée à la mesure par électrode sélective au fluorure s'est imposée comme l'une des approches les plus fiables et les plus largement utilisées pour les matrices biologiques, en raison de sa sensibilité, de sa reproductibilité et de sa compatibilité avec divers types d'échantillons23,24,25,26,27,28,29.

Malgré la disponibilité de plusieurs méthodes analytiques, chaque approche présente des limites qui peuvent restreindre son utilisation en recherche expérimentale ou clinique. La chromatographie ionique offre une grande sensibilité et sélectivité, mais nécessite un instrument spécialisé et une préparation d'échantillon approfondie30,31. Les dosages colorimétriques, comme la méthode SPADNS (2‑(parasulfophénylazo)‑1,8-dihydroxynaphtalène-3,6‑disulfonate de sodium), sont simples et peu coûteux, mais ils sont sensibles aux interférences dues à la turbidité et aux chromophores endogènes, ce qui limite leur fiabilité dans les échantillons biologiques complexes22,32,33. Les méthodes titrimétriques sont économiques et simples, mais manquent de sensibilité nécessaire pour la détection de traces de fluorure dans la plupart des spécimens biologiques34. Les techniques nucléaires ou basées sur l'activation offrent une sensibilité exceptionnelle, mais nécessitent un accès à des réacteurs ou à des sources de neutrons à accélérateur, ce qui les rend peu pratiques pour une utilisation courante en laboratoire35. En revanche, la diffusion facilitée par le HMDS suivie d'une mesure par ISE assure un bon compromis entre sensibilité, coût et accessibilité, tout en garantissant la libération complète du fluorure à partir des tissus mous comme des tissus minéralisés. Cela est particulièrement avantageux pour les études impliquant de petits animaux, chez lesquels la disponibilité des tissus est limitée et les structures minéralisées, telles que les incisives de souris, ne produisent que 3–5 mg de cendre par dent.

La capacité de la méthode d'ISE par diffusion à concentrer tout le fluorure libéré dans un petit volume défini permet une quantification précise, même dans des échantillons extrêmement petits. Cela rend la méthode particulièrement adaptée aux études toxicocinétiques, aux expériences de relation dose-réponse et aux investigations du métabolisme du fluorure au cours des différentes étapes de développement. Les petits rongeurs, en particulier les souris C57BL/6J, sont couramment utilisés comme modèles animaux pour étudier les effets du fluorure7,9,12,29,36 .

Dans ce protocole, les auteurs appliquent la technique de diffusion facilitée par le HMDS suivie d'une mesure à l'aide d'une électrode sélective au fluorure afin de quantifier le fluorure dans le sérum, l'os et les dents prélevés chez des souris exposées à une dose élevée de fluorure (125 ppm), comparées à des témoins non traités. Les auteurs comparent en outre l'accumulation de fluorure chez des souris adolescentes (6 semaines au début du traitement) et matures (18 semaines au début du traitement) afin d'évaluer les différences liées à l'âge dans le métabolisme du fluorure et son dépôt tissulaire. Les incisives mandibulaires ont été choisies comme tissu dentaire représentatif, car les incisives des rongeurs poussent de façon continue et atteignent un équilibre en régime permanent entre éruption et usure occlusale vers l'âge de 7 semaines environ. Ce mode de croissance continue fournit un gradient constant et accessible de développement de l'émail, ce qui fait des incisives murines un modèle largement utilisé et bien validé pour l'étude de la formation de l'émail et de la fluorose dentaire.

Protocole

Toutes les procédures décrites dans ce protocole ont été réalisées conformément aux lignes directrices et réglementations relatives à l'utilisation d'animaux vertébrés approuvées par le comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université Nova Southeastern (Protocole n° 2023.02.MSuz1), accréditée par l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Tous les travaux impliquant des animaux ont été menés conformément au guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire ainsi qu'aux lignes directrices de l'American Veterinary Medical Association (AVMA) relatives à l'euthanasie des animaux. Tous les matériaux utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le Tableau des matériaux.

1. Animaux et préparation et administration de fluorure de sodium dans un modèle murin

  1. Animaux : Répartir des souris mâles C57BL/6J en deux catégories d'âge : adolescents, 6 semaines au début du traitement, et adultes matures, 18 semaines au début du traitement.
    1. Fournir à chaque groupe de l'eau déionisée sans fluorure (0 ppm F⁻) ou de l'eau de boisson supplémentée en fluorure de sodium (125 ppm F⁻) pour une période d'exposition de 6 semaines.
    2. Inclure cinq animaux dans chaque condition d'âge et de traitement (N = 5/groupe).
    3. À la fin de la période d'exposition, prélever le sérum, les fémurs et les incisives mandibulaires, puis préparer tous les échantillons recueillis pour des analyses ultérieures.
      ​REMARQUE : Échantillon : Matériau traité tel que l'os calciné, la dent calcinée et le sérum.
  2. Hébergement et alimentation des animaux : Héberger les souris en conditions standard de laboratoire avec à discrétion accès à la nourriture et à l'eau
    1. Fournir une alimentation sans fluor à partir d'une semaine avant le prélèvement des dents, des os et du sérum afin de minimiser les taux de fluor de fond.
  3. Eau de boisson contenant du fluorure de sodium
    1. Pour préparer de l'eau de boisson supplémentée en fluorure, dissoudre du fluorure de sodium (NaF) dans de l'eau déionisée afin d'obtenir la concentration désirée en fluorure (par exemple, 125 ppm F⁻).
    2. Filtrer la solution à travers un 0.2 µm filtrer sous vide dans un flacon stérilisé à l'autoclave. Préparer une solution fraîche tous les 2 jours.
      ATTENTION : Le NaF est toxique en cas d'ingestion et peut provoquer une irritation cutanée et oculaire. Manipuler sous hotte aspirante en portant une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité.
  4. Pour l'eau témoin sans fluorure, filtrer de l'eau déionisée à travers une 0.2 µm filtrer sous vide dans un flacon stérilisé. Préparer de l'eau fraîche tous les 2 jours.
  5. Fournir de l'eau potable enrichie en fluorure ou sans fluorure ad libitum pendant la durée souhaitée pour le traitement au fluorure. Surveiller le niveau d'eau quotidiennement et remplacer les bouteilles toutes les 48 heures.
  6. À la fin de la période d'exposition, euthanasier les animaux à l'aide de dioxyde de carbone (CO₂) inhalation suivie de décapitation. Les procédures d'euthanasie ont été réalisées conformément aux recommandations de l'AVMA sur l'euthanasie des animaux et ont été approuvées dans le cadre du protocole institutionnel du comité d'éthique IACUC.
    ATTENTION : CO2 est un agent asphyxiant. Effectuez les manipulations dans un endroit bien ventilé et assurez-vous que la chambre fonctionne correctement. Évitez toute exposition par inhalation directe.

2. Préparation de l'échantillon pour la mesure du fluorure

  1. Prélèvement sanguin
    1. Provocer l'euthanasie des souris par inhalation de CO₂, puis prélever immédiatement le sang par ponction cardiaque terminale à l’aide d’une seringue tuberculinique de 1 mL. Transférer le sang dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Jeter toutes les aiguilles et seringues usagées dans un conteneur institutionnel homologué pour déchets tranchants.
      ATTENTION : Les aiguilles de seringue sont pointues et peuvent provoquer des blessures par perforation ; manipuler avec précaution.
    2. Conserver le sang 30 min à température ambiante, puis centrifuger pendant 10 min à 2 000 × g.
    3. Transférer le surnageant (sérum) dans un tube de microcentrifugation et conserver à −80 °C.
      ATTENTION : Les congélateurs ultra-bas posent un risque d'engelures. Porter des gants isolants lors de la manipulation des tubes et éviter tout contact prolongé de la peau avec des surfaces froides.
  2. Os
    1. Extraction des fémurs : Après l’euthanasie, disséquer les pattes arrière au niveau des articulations de la hanche.
    2. Retirer soigneusement tous les tissus mous des fémurs. Rincer les tissus trois fois dans de l’eau désionisée. Conserver les os à -80 °C jusqu’à un traitement ultérieur. Jeter les tissus mous retirés et tous matériaux contaminés dans le flux de déchets biologiques institutionnel.
      NOTE : Les tissus peuvent être fixés dans du paraformaldéhyde 4 % contenant 2 % de saccharose pendant 12 à 16 h, puis conservés à long terme dans de l’éthanol 70 %. Cette procédure de fixation ne modifie pas la précision de la quantification ultérieure du fluorure.
    3. Rincer soigneusement les os à l’eau désionisée. Éponger l’excès d’humidité avec un papier sans peluches.
    4. Transférer les os dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL aux couvercles ouverts pour permettre l’évaporation, puis les placer dans une étuve à 60 °C pendant 12 à 16 h.
      ATTENTION : L’étuve peut provoquer des brûlures. Utiliser des gants résistants à la chaleur lors de la manipulation des échantillons.
    5. Incinération des os : Transférer les os séchés dans des creusets en alumine. Placer les creusets dans un four à moufle et chauffer jusqu’à 600 °C à un taux de 150 °C/h, puis maintenir la température pendant 6 h. Laisser le four refroidir à moins de 200 °C avant de retirer les creusets. Éliminer les fragments osseux résiduels ou les consommables contaminés dans le flux de déchets biologiques institutionnel.
      ATTENTION : Le four à moufle et les creusets atteignent des températures extrêmes, ce qui représente un risque élevé de brûlures. Toujours laisser le four refroidir avant de manipuler les creusets. Lors du retrait des creusets, porter une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants résistants à la chaleur, et utiliser des pinces longues afin d’éviter tout contact direct avec les surfaces chaudes.
      ÉTAPE CRITIQUE : Une incinération incomplète compromettra les analyses en aval. Vérifier que le matériau osseux a atteint un état d’oxydation complète avant de poursuivre ; tout carbone résiduel interférerait avec les mesures ultérieures.
      ​NOTE : L’os correctement incinéré doit apparaître uniformément gris clair à blanc. La présence de particules plus foncées — notamment des résidus noirs ou de type charbon — indique une combustion incomplète. En cas de décoloration, prolonger la durée d’incinération afin d’éliminer complètement la matière organique.
    6. Stockage des os incinérés : Immédiatement après l’incinération, transférer les os dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Sceller les tubes avec du Parafilm et les conserver dans un dessiccateur sous vide jusqu’à utilisation.
  3. Dents
    1. Extraction des incisives mandibulaires : Effectuer une incision horizontale au niveau de l’articulation temporo-mandibulaire pour séparer le mandibule du maxillaire.
    2. Effectuer des coupes médio-sagittales pour diviser le maxillaire et le mandibule en deux moitiés gauche et droite.
    3. Rincer les tissus trois fois dans de l’eau désionisée et extraire soigneusement les incisives mandibulaires. Conserver les incisives extraites à -80 °C jusqu’à utilisation ultérieure. Jeter les tissus mous extraits et tous consommables contaminés dans le flux de déchets biologiques institutionnel.
      ATTENTION : Utiliser avec précaution des instruments de dissection tranchants lors des incisions au niveau de l’articulation temporo-mandibulaire et du plan médio-sagittal afin d’éviter toute blessure personnelle. Porter les EPI appropriés, notamment des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité.
      NOTE : Les tissus peuvent être fixés dans du paraformaldéhyde 4 % contenant 2 % de saccharose pendant 12 à 16 h, puis conservés à long terme dans de l’éthanol 70 %. Cette procédure de fixation ne modifie pas la précision de la quantification ultérieure du fluorure.
    4. Préparation des dents pour l’incinération : Rincer soigneusement les dents à l’eau désionisée, puis les placer dans du peroxyde d’hydrogène (H₂O₂) à 1 % pendant 12 à 16 h. Éliminer les solutions usagées de peroxyde d’hydrogène comme déchets chimiques dangereux.
    5. Rincer à nouveau à l’eau désionisée, sécher brièvement avec un papier sans peluches, puis transférer dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL aux couvercles ouverts. Placer les tubes dans une étuve à 60 °C pendant 12 à 16 h.
      ATTENTION : Le peroxyde d’hydrogène est un agent oxydant et peut provoquer des irritations cutanées et oculaires. Manipuler sous hotte aspirante en portant une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Éviter tout contact avec des matériaux combustibles.
    6. Incinération des dents : Transférer les dents séchées dans des creusets en alumine et incinérer dans un four à moufle à une température de maintien de 600 °C pendant 20 h, avec un taux de montée en température de 150 °C/h.
    7. Ne retirer les creusets qu’après que le four ait refroidi en dessous de 200 °C.
      ATTENTION : Le four à moufle et les creusets atteignent des températures extrêmes, ce qui représente un risque élevé de brûlures. Laisser le four refroidir en dessous de 200 °C avant de manipuler les creusets. Lors du retrait des creusets, porter une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants résistants à la chaleur, et utiliser des pinces longues afin d’éviter tout contact direct avec les surfaces chaudes.
      ÉTAPE CRITIQUE : S’assurer d’une oxydation complète ; tout carbone résiduel interférerait avec les analyses ultérieures.
      NOTE : Le matériau dentaire incinéré doit apparaître uniformément gris clair à blanc. Réaliser une nouvelle incinération si des résidus noirs persistent.
    8. Stockage des échantillons de dents incinérées : Immédiatement après l’incinération, transférer les dents dans des tubes de microcentrifugation coniques de 2 mL.
    9. Sceller les tubes avec du Parafilm et les conserver dans un dessiccateur sous vide jusqu’à utilisation.

3. Préparation des boîtes de diffusion facilitée par HMDS

  1. Réactifs et matériel
    1. Acide sulfurique 6 N : Au moins deux jours avant la préparation des boîtes de diffusion, préparer un stock d'acide sulfurique 6 N. N acide sulfurique
      REMARQUE : Boîte de diffusion : un récipient hermétique conçu pour créer un environnement clos contrôlé dans lequel les composants libérés par un matériau biologique traité peuvent être capturés par un piège chimique fixé au couvercle. La conception hermétique empêche tout échange avec l'air extérieur et garantit que les analytes libérés sont dirigés vers le piège en vue de leur mesure ultérieure.
    2. Placer un 1 bécher en plastique L avec une barre aimantée sur un agitateur magnétique et ajouter 416 mL d'eau ultrapure.
    3. En utilisant un 50 pipetteur sérologique mL, ajouter lentement 84 mL de 36 N H₂SO₄ à l'eau en agitant continuellement. La solution deviendra chaude ; laissez-la refroidir à température ambiante. Éliminer toute solution d'acide sulfurique inutilisée ou usagée comme déchet chimique dangereux dans le flux de déchets chimiques institutionnel.
      ATTENTION : L'acide sulfurique est hautement corrosif. Manipulez-le sous hotte aspirante en portant des gants résistants aux acides, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. En cas de contact, rincez immédiatement abondamment à l'eau.
    4. Acide sulfurique 6 N saturé en HMDS : Transférer l'acide 6 N acide sulfurique à un 2 L'ampoule à séparation et ajouter 15 mL d'hexaméthyldisiloxane (HMDS).
    5. Veiller à ce que le bouchon et le robinet soient fermement fermés, tenir l'ampoule séparatoire horizontalement et agiter vigoureusement jusqu'à l'apparition de fines gouttelettes de HMDS.
    6. Ouvrir le bouchon pour libérer le gaz en formation et répéter le processus deux fois supplémentaires.
    7. Laisser le bouchon entrouvert pendant plusieurs heures. Conserver l'ampoule à décanter contenant le 6 De l'acide sulfurique saturé en HMDS dans un support placé à l'intérieur de la hotte chimique. Éliminer l'acide sulfurique contenant de l'HMDS et les matériaux contaminés comme déchets chimiques dangereux.
      ATTENTION : Le HMDS est inflammable et toxique par inhalation. Manipulez-le sous hotte aspirante en portant une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité. Éloignez-le de toute source d'ignition.
    8. Hydroxyde de sodium 0,05 N : Dissoudre 1 g de pastilles de NaOH dans 25 mL d'eau ultrapure pour préparer un 1 Solution mère de N
    9. Mélanger 2 mL du 1 N NaOH stock avec 38 mL d'eau ultrapure pour obtenir un 0,05 solution de NaOH N
    10. Prélever une aliquote de 0,05 N NaOH dans 1,5 des tubes microcentrifugeurs de mL à usage unique, fixer les couvercles avec du Parafilm et conserver les tubes dans un dessiccateur sous vide pour minimiser le CO₂ absorption. Éliminer les solutions d'hydroxyde de sodium inutilisées ou usagées comme déchets chimiques dangereux.
      ATTENTION : L'hydroxyde de sodium est hautement corrosif et peut provoquer de graves brûlures. Porter une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection. Manipuler les solutions avec précaution afin d'éviter les projections.
    11. Acide acétique 0,2 N : Ajouter 575 µL acide acétique glacial à de l'eau ultrapure et ajuster à un volume final de 50 mL pour préparer 0,2 N acide acétique. Éliminer les solutions d'acide acétique comme déchets chimiques dangereux.
      ATTENTION : L'acide acétique est corrosif et peut irriter la peau, les yeux et les voies respiratoires. Manipuler sous hotte chimique en portant une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité.
    12. Pétrolatum : Faire fondre environ 100 g de pétrolatum à 60 °C dans un four. Aspirer le pétrolatum liquide dans 10 des seringues de mL et laissez refroidir et durcir. Les seringues remplies de pétrolatum peuvent être conservées à température ambiante pendant plusieurs semaines.
    13. Boîte de Pétri : utiliser 60 × 15 mm de boîtes de Petri non traitées pour la préparation des boîtes de diffusion.
    14. Faire fondre un petit trou dans le couvercle d'une boîte de Pétri à l'aide d'une aiguille de seringue chauffée de calibre 18.
    15. Appliquer sur le rebord intérieur du couvercle un joint continu de pétrolatum à l’aide d’un 10 syringe de mL munie d'une aiguille émoussée de 14 Aiguille G. Jeter toutes les aiguilles utilisées dans un conteneur institutionnel homologué pour les déchets de type « objets tranchants ».
      ATTENTION : Les aiguilles de seringue sont pointues et peuvent provoquer des blessures par perforation. Manipulez-les avec précaution et jetez-les dans des conteneurs homologués pour objets tranchants. Lors du chauffage des aiguilles, portez des gants résistants à la chaleur et une protection oculaire afin d'éviter les brûlures.
    16. Solutions mères de NaF pour les plaques de calibration de diffusion. Dissoudre 4,19 g de NaF dans 1 L’eau ultrapure pour préparer un 100 solution mère mM. Préparer 10 mM, 100 µM, et 10 µM solutions mères par des dilutions successives 1:10 de la solution à 100 solution mM
      REMARQUE : Une mole de NaF fournit 19 g F⁻; par conséquent, 1 µL sur 10 µM NaF contient 0,19 ng F⁻ et 1 µL sur 10 mM NaF contient 190 ng F⁻.
      ​REMARQUE : Plaques de diffusion de calibration : Plaques de diffusion utilisées spécifiquement pour la calibration avec une masse connue d'ions fluorure (F¯).
  2. Préparation de boîtes de diffusion spécifiques à chaque échantillon
    1. Cuvette de diffusion sérique : Pipeter 3 mL d'eau ultrapure dans le fond de la boîte de Pétri et ajouter 75 µL sérum. Jeter tous les matériaux contaminés par le sérum dans les déchets biologiques institutionnels. Passer à l'étape 3.4.
    2. Plaque de diffusion osseuse
      1. Pulvérisation des cendres osseuses : À l'aide d'une microspatule, broyer les os calcinés à l'intérieur des tubes microcentrifuges de 1,5 mL afin d'obtenir une poudre fine. Procéder immédiatement au traitement des cendres osseuses pulvérisées. Jeter les consommables contaminés par les cendres osseuses dans la filière institutionnelle des déchets chimiques.
      2. Pesée et hydratation de l'os calciné
        1. Placer le fond vide de la boîte de Pétri sur le plateau de la balance analytique dont la sensibilité est d'au moins 0,1 mg
        2. Transférer les cendres d'os broyées du 2 transférer le tube microcentrifuge de mL dans un petit récipient en porcelaine afin de minimiser les charges électrostatiques et d'éviter la dispersion de la poudre.
        3. À l’aide d’une spatule micro, ajouter environ 5 mg de cendre d'os dans la coupelle et recouvrir immédiatement la poudre avec 3 mL d'eau ultrapure avant de retirer la boîte de la balance analytique afin d'éviter la dispersion des cendres.
        4. Enregistrer le poids exact de chaque échantillon d'os calciné. Passer à l'étape suivante 3.4.
    3. Plaque de diffusion dentaire
      1. Mouture des dents calcinées
        1. Transférer les incisives calcinées dans 2 mL de tubes microcentrifuges à fond rond et ajouter un 5 ajouter une bille en acier inoxydable de mm de diamètre à chaque tube. Fermer les tubes et fixer les couvercles avec du Parafilm.
        2. Pulvériser les incisives calcinées dans un broyeur à billes à 2 500 tr/min pendant 10 s. Procéder immédiatement au traitement des dents broyées.
      2. Pesée et hydratation des dents calcinées
        1. Verser l'ensemble du contenu du tube, y compris la bille en acier inoxydable, dans le fond de la boîte de diffusion placée sur le plateau de la balance analytique. Éliminer les consommables contaminés contenant les cendres dentaires dans la filière institutionnelle des déchets chimiques.
        2. Retirer la bille en acier inoxydable de la coupelle et noter le poids exact des cendres dentaires (généralement 3–4 mg par incisive mandibulaire
        3. Ajouter immédiatement 3 mL d’eau ultrapure pour recouvrir les cendres dentaires avant de retirer le plat de la balance afin d’éviter la dispersion des cendres due à une décharge électrostatique. Poursuivre avec l’étape 3.4.
  3. Plaques de diffusion pour l'étalonnage et le contrôle qualité
    1. En parallèle avec les boîtes de diffusion d'échantillons, préparez deux séries de boîtes de diffusion de calibration pour une courbe d'étalonnage de 5 à 6 points, ainsi qu'une série identique de boîtes de contrôle de qualité, incluant un blanc.
      REMARQUE : Plaques de diffusion de contrôle qualité : préparées de la même manière que les plaques de calibration de diffusion, mais utilisées périodiquement pour vérifier la stabilité des électrodes et assurer une performance de mesure constante.
    2. Pipeter 3 mL d'eau ultrapure dans chacune de 11 ou 13 boîtes de Pétri et ajouter le stock de NaF pour couvrir la gamme prévue de F¯ plage de masse dans les échantillons prélevés. Poursuivre avec l'étape 3.4. pour compléter l'assemblage de la boîte de diffusion37.
  4. Terminaison du montage de la boîte de diffusion
    1. Pour construire un dépôt piège à fluorure, 50 µl 0,05 N de NaOH est ajouté en trois gouttes sur la surface intérieure du couvercle de la boîte de Pétri, suffisamment éloigné du bord du couvercle.
      REMARQUE : Piège à fluorures (F¯ Piège) : Une composante des boîtes de diffusion qui piège F¯, plus précisément l'hydroxyde de sodium (NaOH).
    2. Retourner le couvercle sans perturber les gouttes de NaOH et le sceller hermétiquement au fond de la boîte avec du vaseline.
    3. Pour préparer une solution d'acide sulfurique saturée en HMDS à 3 N, mélanger des volumes égaux d'acide sulfurique à 6 N saturé en HMDS et d'eau ultra-pure. Préparer la solution fraîchement immédiatement avant utilisation, car elle ne peut pas être stockée.
    4. Injecter 3 mL de l'acide sulfurique saturé en HMDS 3 N préparé à travers le trou du couvercle dans l'eau située au fond de la coupelle de diffusion à l'aide d'une seringue de 10 ml munie d'une aiguille 20 G. Veiller à ne pas éclabousser d'acide sur la surface intérieure du couvercle lors de l'insertion ou du retrait de l'aiguille de la seringue.
    5. Diffusion facilitée par le HMDS du fluorure : sceller immédiatement le trou d'injection avec une goutte de pétrolatum recouvrant entièrement l'ouverture et placer les boîtes de diffusion sur un agitateur rotatif réglé à faible vitesse. Incuber toute la nuit à température ambiante (Figure 1).

figure-protocol-1
Figure 1 : Schéma d’un plat de diffusion osseuse pour l’extraction et le piégeage du fluorure. La figure 1 illustre le design d’un plat de diffusion osseuse assemblé dans une boîte de Pétri non traitée de 60 × 15 mm. Le couvercle comporte un petit trou d’injection scellé avec une perle de pétrolatum. Sur la surface intérieure du couvercle, trois gouttes de NaOH sont placées comme pièges à ions fluorure (F⁻), suspendues au couvercle pendant la diffusion. Le couvercle est hermétiquement scellé à la base du plat à l’aide de pétrolatum. Le fond de la boîte de Pétri contient de l’eau ultrapure, de l’acide sulfurique saturé en hexaméthyldisiloxane (HMDS) et des cendres osseuses, qui forment ensemble l’environnement réactionnel nécessaire à la libération du fluorure et à son piégeage ultérieur. Cette figure a été créée par les auteurs à l’aide de Biorender et est publiée sous licence CC BY. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

4. Mesure du fluorure à l'aide d'une électrode sélective au fluorure (ISE)

  1. Configurer l'ISE
    1. Remplir l'électrode sélective au fluorure à double canal avec la solution de remplissage appropriée, la connecter au potentiomètre et fixer l'électrode dans un support d'électrode.
    2. Placer une boîte de Pétri non traitée sur un support élévateur à ciseaux sous la surface sensible de l'électrode, en veillant à ce que la surface sensible soit parallèle au fond de la boîte de Pétri, puis monter le plateau du support élévateur afin que la boîte de Pétri soit presque en contact avec l'électrode (Figure 2).
  2. Préparation des échantillons pour la mesure
    NOTE : Échantillons : Seuls les produits finaux mesurés à l’aide d’une électrode sélective aux ions (ISE), constitués du piège à F¯ après diffusion, qui a ensuite été mélangé à de l’acide acétique et de l’eau, sont désignés comme échantillons dans le protocole. 
    1. Pour ajuster le pH de l’échantillon à 5, retirer la boîte de diffusion du berceau et soulever délicatement le couvercle en rompant le joint de pétrolatum après la période d’incubation. Retourner le couvercle sur une surface plane, en veillant à ce que les trois gouttes du piège à F¯ restent intactes.
    2. Ajouter 15–20 µL d’acide acétique 0,2 N à l’aide d’une pipette P20 sur une goutte, puis fusionner les trois gouttes en une seule sans changer le bout de la pipette.
      NOTE : Les échantillons à forte concentration en F¯ ont tendance à présenter un pH initial plus bas et nécessitent donc moins d’acide acétique 0,2 N pour ajuster le pH à 5, par rapport aux échantillons contenant moins de F¯. Étant donné que le volume restant de l’échantillon après l’enregistrement du potentiel de l’électrode (étape 5.3) est minimal, utiliser le volume résiduel disponible pour vérifier le pH à l’aide de papier indicateur.
    3. Pour ajuster le volume de l’échantillon, régler une pipette P100 à 75 µL, aspirer intégralement le volume du piège à F¯ sans introduire d’air, puis ajuster l’échantillon à exactement 75 µL à l’aide d’eau ultra-pure.
    4. Effectuer cette étape avec soin afin d’assurer un volume précis pour les calculs de concentration en fluorure. Conserver l’échantillon dans le bout de la pipette et passer immédiatement à l’étape 4.3.
  3. Mesure des échantillons de spécimens, des échantillons d’étalonnage et des contrôles qualité
    1. Pour mesurer le potentiel de l’électrode de l’échantillon, le déposer entre la surface sensible de l’électrode sélective au fluorure et la boîte de Pétri. Veiller à ce que toute la surface sensible de l’électrode soit complètement immergée dans le liquide, sans toucher directement la boîte de Pétri. Laisser le potentiomètre se stabiliser et enregistrer le potentiel (mV) affiché par l’ISE.
    2. Déterminer la courbe d’étalonnage en mesurant séquentiellement le premier jeu d’étalons, en commençant par la concentration la plus faible en F¯ et en progressant vers la plus élevée.
      1. Tracer le potentiel de l’électrode (mV) en fonction du logarithme de F¯ (ng) pour construire la courbe d’étalonnage (Figure 3). Appliquer une régression exponentielle pour obtenir l’équation de la courbe d’étalonnage et le coefficient de détermination (R2). N’accepter les courbes d’étalonnage que si R2 est ≥ 0,99.
    3. Mesurer chaque échantillon de spécimen et enregistrer le potentiel de l’électrode (mV).
    4. Pour surveiller la stabilité de l’électrode et détecter d’éventuelles dérives de dosage, mesurer des échantillons de contrôle qualité de manière intermittente tout au long de chaque série analytique.
      1. Comparer directement les valeurs des échantillons de contrôle qualité avec celles des échantillons d’étalonnage correspondants et confirmer leur concordance à environ 5 % près afin de vérifier la stabilité du fonctionnement de l’électrode dans le temps.
      2. Mesurer périodiquement une boîte de diffusion témoin pour confirmer l’absence de contamination par le fluorure lors de la manipulation et de la diffusion des échantillons.
  4. Pour calculer la masse de F¯ (ng) dans chaque échantillon de spécimen, utiliser l’équation de la courbe d’étalonnage. Ensuite, diviser cette masse par le volume (µL) de sérum, ou par la masse (mg) de cendre d’os ou de dent ajoutée à la boîte de diffusion.
    1. Exemple de calcul de la concentration en F¯ dans la cendre d’os (ng/mg)
      1. Masse de cendre d’os ajoutée à la boîte de diffusion : 5,1 mg ; Potentiel de l’électrode de l’échantillon de spécimen de 75 µL : –31,6 mV
      2. Étape 1 : Calculer la masse de fluorure à l’aide de l’équation d’étalonnage
        1. Masse de F⁻ (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. Masse de F⁻ (ng) = 13 641 ng
      3. Étape 2 : Calculer la concentration en fluorure dans la cendre d’os
        1. Concentration en F⁻ =  13 641 ng  /  5,1  mg
        2. Concentration en F⁻ =  2 675 ng / mg (ppm)

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Figure 2 : Schéma du dispositif de mesure par électrode ionosélective. La figure 2 illustre la configuration utilisée pour les mesures d'ions fluorure à l'aide d'une électrode ionosélective (ISE) à double canal. Une boîte de Pétri est placée sur un support à ciseaux afin de permettre un ajustement précis de sa hauteur par rapport à l'électrode. L'ISE est reliée à un potentiomètre et orientée de manière que sa surface sensible soit parallèle au plan de la boîte de Pétri, en maintenant une distance d'environ 1–2 mm. Une fois l'espacement défini, un petit volume d'échantillon (75 µL) est pipeté dans l'espace entre la surface sensible et la boîte de Pétri, en veillant à ce que l'échantillon recouvre entièrement la zone sensible de l'électrode pendant la mesure. Cette figure a été créée par les auteurs à l'aide de Biorender et est publiée sous licence CC BY. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Courbe d'étalonnage et tableau d'étalonnage correspondant pour la quantification de la masse d'ions fluorure dans des échantillons de spécimens dentaires. Panneau supérieur : Exemple de courbe d'étalonnage utilisée pour déterminer la masse d'ions fluorure dans des échantillons de spécimens dentaires. L'axe des abscisses représente le potentiel de l'électrode (mV, échelle linéaire), et l'axe des ordonnées représente la masse correspondante d'ions fluorure (ng F⁻, échelle logarithmique). Les points d'étalonnage mesurés sont tracés sous forme de ligne continue, et la régression exponentielle ajustée est indiquée par une ligne pointillée. Une boîte en surimpression affiche l'équation de la courbe standard et le coefficient de détermination (R2 = 0,99). Panneau inférieur : Tableau contenant les valeurs numériques utilisées pour générer la courbe d'étalonnage. La première ligne énumère les cinq potentiels de l'électrode (mV) enregistrés pour les échantillons d'étalonnage. La deuxième ligne indique les masses correspondantes d'ions fluorure (ng F⁻) pour chaque échantillon d'étalonnage. La troisième ligne liste les volumes (µL) de la solution mère de NaF à 10 mM ajoutés aux boîtes de diffusion d'étalonnage ; cette masse d'ions fluorure ajoutée est équivalente à la masse piégée dans chaque échantillon d'étalonnage après diffusion. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Résultats

Pour illustrer l'application de ce protocole de mesure des concentrations de fluorure (F-) dans des matériaux biologiques, des échantillons de spécimens ont été prélevés à partir de sérum, d'os et d'incisives mandibulaires provenant de souris exposées à des traitements contrôlés de fluorure. Des souris mâles C57BL/6J ont été réparties en deux groupes d'âge, adolescents (6 semaines) et adultes (18 semaines), et ont reçu soit de l'eau déionisée sans fluorure (0 ppm F⁻), soit de l'eau de boisson enrichie en fluorure de sodium (125 ppm F⁻), pendant une période d'exposition de 6 semaines. Chaque condition d'âge et de traitement comprenait cinq animaux. À la fin de la période d'exposition, le sérum, les fémurs et les incisives mandibulaires ont été prélevés, puis les échantillons ont été préparés et analysés selon le protocole. Les concentrations représentatives de fluorure mesurées dans le sérum, l'os et les dents sont résumées ci-dessous.

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Figure 4 : Concentrations de fluorure mesurées dans le sérum, l'os fémoral et les incisives mandibulaires. Des souris mâles C57BL/6J ont été réparties en deux catégories d'âge, adolescents (6 semaines, barre ouverte) et adultes (18 semaines, barre pleine), et ont reçu soit de l'eau déionisée sans fluorure (0 ppm F⁻), soit de l'eau de boisson supplémentée en fluorure de sodium (125 ppm F⁻), pendant une période d'exposition de 6 semaines. À la fin de la période d'exposition, les concentrations de fluorure ont été mesurées dans (A) le sérum, (B) l'os fémoral et (C) les incisives mandibulaires provenant des mêmes groupes de traitement. Les valeurs sériques inférieures à la limite de détection (<0,02 ppm) ont été représentées à des fins de visualisation mais exclues de l'analyse statistique. Les données sont exprimées en moyennes ± écart-type. Les comparaisons entre les groupes adolescents et adultes ont été effectuées à l'aide d'un test U de Mann-Whitney avec correction de Bonferroni-Dunn pour les comparaisons multiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/groupe). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Concentrations de fluorure dans le sérum
Chez les deux groupes, adolescent et mature, traités avec 0 ppm de fluorure, les concentrations sériques de fluorure étaient inférieures à la limite de détection de l'électrode sélective d'ions (<0,02 ppm). Dans les groupes traités à 125 ppm, la concentration sérique de fluorure a augmenté à 0,3 ± 0,2 ppm dans le groupe adolescent et à 0,7 ± 0,2 ppm dans le groupe mature (p = 0,06). La comparaison entre les groupes adolescents et matures traités à 125 ppm a été effectuée à l'aide d'un test de Mann-Whitney U avec correction de Bonferroni-Dunn pour les comparaisons multiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/groupe). Les groupes traités à 0 ppm ont été exclus de l'analyse statistique. (Figure 4A, Tableau 1).

Concentrations de fluorure dans l'os fémoral
Dans les groupes traités à 0 ppm, les concentrations de fluorure fémoral étaient significativement plus faibles chez les adolescents (292 ± 39 ppm) par rapport aux animaux adultes (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). En revanche, dans les groupes traités à 125 ppm, les concentrations de fluorure chez les adolescents (4 108 ± 482 ppm) étaient significativement plus élevées que chez les animaux adultes (2 966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Les comparaisons entre les groupes d'adolescents et adultes ont été effectuées à l'aide d'un test U de Mann-Whitney avec correction de Bonferroni-Dunn pour les comparaisons multiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5 par groupe). (Figure 4B, Tableau 1). Figure 5A montre le facteur d'augmentation des concentrations de fluorure fémoral entre les traitements à 0 ppm et à 125 ppm pour chaque groupe d'âge. Les adolescents présentaient une augmentation de 14 fois des concentrations de fluorure à 125 ppm, tandis que les souris adultes montraient une augmentation de 3 fois.

Concentrations de fluorure dans les incisives mandibulaires
Dans les groupes à 0 ppm, les concentrations de fluorure dans les incisives mandibulaires étaient significativement plus faibles chez les adolescents (35 ± 4 ppm) par rapport aux animaux adultes (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). Dans les groupes traités à 125 ppm, les concentrations de fluorure dans les incisives augmentèrent jusqu'à 5641 ± 955 ppm chez les adolescents et 4392 ± 1694 ppm chez les animaux adultes. Les comparaisons entre les groupes adolescents et adultes ont été effectuées à l’aide d’un test Mann–Whitney U avec correction de Bonferroni–Dunn pour les comparaisons multiples. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5 par groupe). (Figure 4C, Tableau 1). Bien que les concentrations absolues de fluorure à 125 ppm ne diffèrent pas de manière significative entre les groupes d’âge, l’augmentation relative passant de 0 ppm à 125 ppm fut significativement plus importante chez les souris adolescentes (multiplication par 161) que chez les souris adultes (multiplication par 36) (Figure 5B).

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Figure 5 : Les adolescents présentent une augmentation plus importante du taux d'accumulation de fluor dans les os et les incisives par rapport aux souris adultes. Changement du taux de concentration en fluor entre un traitement à 0 ppm et un traitement à 125 ppm de fluor chez des souris adolescentes (barre blanche) et adultes (barre grise). (A) Os fémoral et (B) Incisive mandibulaire provenant des mêmes groupes de traitement. Les données sont exprimées en moyennes ± ÉT. Les comparaisons entre les groupes adolescents et adultes ont été effectuées à l'aide d'un test t non apparié. * p < ; 0,05, (N = 5/groupe). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

ÉchantillonSérumFémurIncisive mandibulaire
Groupe d'âgeAdolescentMatureAdolescentMatureAdolescentMature
Groupe de traitement0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0,020,2< 0,020,8324457693330813748241613229
< 0,020,1< 0,020,8229377892433263954511272654
< 0,020,7< 0,021,0300468387737133155441126997
< 0,020,4< 0,020,5323383280725193551141034169
< 0,020,3< 0,020,528336699372192N/A72711114909
Moyenne< 0,020,3< 0,020,7292410889629663556411234392
ÉTNA0,2NA0,239482556123955231694

Tableau 1 : Mesures individuelles de fluorure dans le sérum, l'os fémoral et les incisives mandibulaires. Le tableau 1 présente les concentrations individuelles de fluorure (ppm F⁻) mesurées dans des échantillons de sérum, d'os fémoral et d'incisives mandibulaires provenant de souris adolescentes et adultes exposées à 0 ppm ou 125 ppm de fluorure. Pour chaque type de tissu, les données sont présentées en colonnes correspondant aux quatre groupes de traitement : adolescent 0 ppm, adolescent 125 ppm, adulte 0 ppm et adulte 125 ppm. Chaque colonne inclut les cinq valeurs individuelles enregistrées (N = 5), suivies de la moyenne calculée et de l'écart-type (ET). Dans le groupe de sérum d'animaux adolescents exposés à 0 ppm, toutes les valeurs enregistrées étaient inférieures à la limite de détection de l'électrode sélective d'ions (<0,02 ppm). Le tableau fournit les données numériques brutes à la base des valeurs résumées et des comparaisons statistiques présentées dans Figure 4.

Discussion

Des mesures de fluorure ont été effectuées à l'aide d'une électrode sélective au fluorure, une électrode sélective aux ions (ESI), comportant un fluorure de lanthane (LaF₃membrane cristalline38,39. Cette membrane forme des liaisons La–F très stables, ce qui confère une forte préférence pour les ions fluorure par rapport aux autres halogénures. Selon la littérature électrochimique établie et les spécifications du fabricant, le LaF₃ la membrane présente des coefficients de sélectivité très faibles pour le chlorure, indiquant que les ions chlorure n'entraînent aucune interférence mesurable dans les conditions utilisées dans ce protocole. Bien que le chlorure soit naturellement présent dans les dents et les os, son activité n'influence pas le potentiel de l'électrode, et le signal enregistré reflète spécifiquement l'activité du fluorure. La limite de détection de 0,02 ppm correspond à la concentration minimale quantifiable validée par le fabricant pour l'électrode sélective au fluorure Orion. Cette limite correspond à la plus faible concentration en fluorure à laquelle l'électrode conserve une réponse de type néernstienne stable et une relation linéaire avec la courbe d'étalonnage. Étant donné que la limite de détection est définie par les caractéristiques de la membrane de l'électrode et validée par le fabricant, aucune détermination expérimentale supplémentaire n'a été requise pour ce protocole ; toutefois, concernant la limite supérieure de détection, les auteurs ont observé que les masses de fluorure excédant environ 38 000 ng dans un tube de 50 µL Le piège à NaOH a entraîné une réponse non linéaire de l'électrode, indiquant que la courbe d'étalonnage n'est plus fiable à de très fortes concentrations de fluorure. Cette non-linéarité est probablement due à un dépassement de la plage optimale de force ionique et d'activité pour l'électrode dans les conditions expérimentales données, et non à une limite supérieure intrinsèque à l'ISE elle-même. Pour les échantillons dont on prévoit qu'ils contiennent des masses de fluorure supérieures à ce seuil, il est conseillé d'augmenter le volume du piège de NaOH afin de maintenir les mesures dans la plage dynamique linéaire de l'électrode.

Cette considération doit être prise en compte lors de l'application du protocole à des échantillons ayant une teneur inhabituellement élevée en fluorure. Étant donné que l'étape de diffusion consomme tout le volume d'échantillon, des mesures en double et des expériences de récupération par ajout de standard n'ont pas pu être réalisées sur les échantillons biologiques. Afin de garantir l'exactitude et la précision analytiques, des échantillons de contrôle qualité (QC) contenant des concentrations connues de fluorure ont été inclus dans chaque série de mesures. Ces échantillons de contrôle qualité ont été traités et mesurés de la même manière que les échantillons expérimentaux. Dans toutes les séries, les concentrations de fluorure mesurées pour les échantillons de contrôle qualité étaient systématiquement comprises dans un intervalle de ± 5 % par rapport à leurs valeurs attendues. Pour chaque série de 10 à 20 échantillons, deux jeux indépendants de 5 à 6 échantillons d'étalonnage ont été préparés en parallèle avec les échantillons, et une courbe d'étalonnage a été enregistrée avant chaque session de mesure. La gamme d'étalonnage a été ajustée pour chaque série afin de correspondre aux masses de fluorure attendues dans les échantillons, ce qui dépendait du type d'échantillon, de la masse de matériau ajoutée dans la coupelle de diffusion, du groupe de traitement et de l'âge de l'animal. Pour les mesures sur sérum, les étalons d'étalonnage correspondaient à des concentrations de fluorure d'environ 0,06 à 1,20 ppm dans l'échantillon. Pour les mesures sur os et dent, les étalons d'étalonnage correspondaient à des concentrations de fluorure d'environ 19 à 7 600 ppm dans l'échantillon.

Ce protocole propose une méthode sensible et reproductible pour quantifier la masse d'ions fluorure dans le sérum, l'os et les dents, en utilisant une diffusion facilitée par l'hexaméthyldisiloxane suivie d'une analyse par électrode ionique sélective. La méthode permet de capter de façon fiable le fluorure libéré à partir de diverses matrices biologiques et d'évaluer quantitativement l'accumulation de fluorure après une exposition contrôlée. Des résultats représentatifs obtenus chez des souris adolescentes et adultes montrent des différences marquées, dépendantes de l'âge et de la dose, dans le dépôt de fluorure au niveau des tissus, soulignant ainsi l'utilité de cette approche pour l'étude du métabolisme et des toxicocinétiques du fluorure in vivo.

Un atout majeur de ce protocole réside dans l'utilisation de boîtes de diffusion qui séparent physiquement la réaction de libération du fluorure de l'environnement de piégeage du fluorure. La conception scellée au pétrolatum minimise les échanges avec l'atmosphère et assure un piégeage efficace des ions fluorure libérés par des gouttelettes d'hydroxyde de sodium déposées sur le couvercle. L'acide sulfurique saturé en HMDS fournit une force motrice forte et constante pour la libération du fluorure à partir des tissus minéralisés, y compris des structures fortement calcifiées telles que l'os et les dents. La mesure ultérieure par électrode ionique sélective (EIS), calibrée à l'aide d'étalons appariés par diffusion, permet une quantification précise sur une large gamme dynamique. Un autre avantage de cette approche est sa capacité à quantifier le fluorure dans des échantillons biologiques extrêmement petits. Les tissus minéralisés de souris, en particulier les incisives mandibulaires, ne produisent que 3 à 5 mg de résidu minéral par dent. Les méthodes analytiques conventionnelles nécessitent souvent des masses d'échantillons plus importantes ou des teneurs plus élevées en fluorure pour obtenir une détection fiable. En revanche, la conception fondée sur la diffusion concentre l'ensemble du fluorure libéré à partir de l'échantillon entier dans un petit volume défini, permettant une quantification précise même dans des échantillons minuscules contenant une masse absolue de fluorure faible. Cette caractéristique est particulièrement précieuse pour les études impliquant de petits animaux, une disponibilité limitée de tissus ou des structures minéralisées microdisséquées.

Une limitation principale de cette méthode réside dans la limite de détection de l'électrode ionique sélective (EIS) utilisée dans cette étude (0,02 ppm). Les échantillons sériques provenant des animaux contrôles sans fluorure se situaient fréquemment en dessous de ce seuil, empêchant ainsi la quantification de concentrations extrêmement faibles de fluorure. Une masse ou un volume plus important d'échantillon ajouté au dispositif de diffusion, si cela est possible, ou des techniques analytiques alternatives, pourraient être nécessaires lors de la mesure de concentrations traces proches ou inférieures à la limite de détection. De plus, la méthode nécessite une diffusion nocturne et une manipulation minutieuse de réactifs corrosifs, ce qui peut limiter le débit dans les études à haut volume. Bien que l'EIS permette une quantification sensible du fluorure global, elle ne permet pas d'évaluer la distribution spatiale au sein des tissus. Des approches complémentaires, telles que la microscopie électronique à balayage couplée à la spectroscopie de rayons X à dispersion d'énergie (MEB-EDX) ou l'émission gamma induite par particules (PIGE), peuvent être mises en œuvre pour visualiser et cartographier la distribution du fluorure à l'échelle micro- à macroscopique. Ces modalités basées sur l'imagerie permettent d'évaluer l'accumulation localisée de fluorure dans les tissus minéralisés ou mous, complétant ainsi les mesures par EIS et offrant une évaluation plus complète de la teneur en fluorure des tissus.

Plusieurs facteurs techniques récurrents peuvent influencer la précision et la fiabilité de la diffusion et de la mesure du fluorure dans ce protocole, et nos observations mettent en évidence comment la préparation de l'étalonnage, la fermeture des boîtes de diffusion, le contrôle du pH, la performance de l'électrode et la manipulation des échantillons influent collectivement sur la qualité des données. Les causes possibles d'une courbe d'étalonnage non linéaire (R2 < 0,99) ou de lectures d'échantillons tissulaires en dehors de la plage attendue incluent des erreurs de calcul du volume de solution mère de NaF ajouté à la boîte de diffusion ou des erreurs de pipetage lors de la préparation des étalons. Mesure recommandée : préparer au moins deux séries indépendantes d'échantillons d'étalonnage pour chaque série, afin de disposer d'une série de secours si une courbe d'étalonnage se situe en dehors de la plage attendue. Une fermeture incomplète de la boîte de diffusion peut également entraîner une perte de fluorure pendant la diffusion, conduisant à des lectures artificiellement basses. Ce phénomène survient généralement lorsqu'une quantité insuffisante de pétrolatum est appliquée sur le rebord du couvercle de la boîte de diffusion. Mesure recommandée: appliquer une quantité généreuse de pommade au pétrolatum autour du rebord du couvercle de la boîte de diffusion et appuyer fermement pour assurer une fermeture complète. Les erreurs de pipetage lors de l'ajout de la solution d'acide acétique au piège de NaOH peuvent déplacer le pH de l'échantillon en dehors de la plage optimale de pH 5,0, entraînant une récupération inexacte du fluorure. Mesure recommandée: vérifier le pH de chaque échantillon à l'aide du papier pH et rejeter tout échantillon dont le pH est en dehors de la plage pH 5. Les échantillons d'étalonnage peuvent également se situer en dehors des limites d'enregistrement valides de l'électrode sélective au fluorure. Les concentrations inférieures à 0,02 ppm sont en dessous de la limite de détection de l'électrode. Mesure recommandée: ne pas utiliser d'échantillons d'étalonnage contenant moins de 0,02 ppm de fluorure. Inversement, des échantillons d'étalonnage avec des concentrations de fluorure excessivement élevées peuvent modifier la force ionique de la solution et produire des réponses non linéaires de l'électrode. Mesure recommandée: au début du projet, préparer des solutions d'étalonnage couvrant une large gamme de concentrations de fluorure afin de déterminer la plage de fonctionnement linéaire de l'électrode spécifique utilisée. Si les échantillons tissulaires dépassent cette plage linéaire, réduire la masse tissulaire ou augmenter le volume du piège de NaOH et ajuster en conséquence le volume d'acide acétique pour maintenir un pH de 5. Difficulté à obtenir des courbes d'étalonnage linéaires dans la plage 0,02–1 ppm : une cause fréquente est le vieillissement de l'électrode. Les électrodes sélectives au fluorure plus anciennes perdent de leur sensibilité à de très faibles concentrations de fluorure. Mesure recommandée : remplacer l'électrode sélective au fluorure. Des lectures instables du potentiomètre (signal dérivant ou sursautant) surviennent généralement lorsque la surface sensible de l'électrode n'est pas entièrement immergée dans la solution échantillon. Mesure recommandée : abaisser l'électrode de sorte que la surface sensible soit complètement recouverte par l'échantillon liquide.

Dans l'ensemble, ce protocole offre une approche solide fondée sur l'étalonnage pour quantifier le fluorure dans diverses matrices biologiques et convient particulièrement bien aux études portant sur l'exposition au fluorure, le dépôt tissulaire et les effets toxicologiques chez les modèles murins.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Les travaux rapportés dans cette publication ont été financés par la Japan Society for the Promotion of Science ; les bourses de recherche à l'étranger JSPS 202560528 (S.Y.), la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) ; 2024/07452-9 (J.S.T.), ainsi que par l'Institut national de la dentisterie et de la recherche crânio-faciale des National Institutes of Health ; R01DE027648 (M.S.) et K02DE029531 (M.S.).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétique, glacialSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
Créatifs en alumineAdvalue Technology12 mm OD × 25 mm H, AL-6212AL-6212
Balance analytiqueVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
Broyeur à billesBenchmarkBeadBug 6—
Aiguille à seringue à extrémité émousséeAmazonAiguille industrielle à extrémité émoussée, 14 G × 0,5 pouceX001TT8KX1
Dioxyde de carboneAirGas——
Hotte chimiqueMott ManufacturingModèle 7421040—
Saccharose D(+)Thermo Scientific99,7 % pour biochimie177142500
Solution de remplissage pour électrodeThermo ScientificSolution de remplissage Orion IonPlus900061
Solution d'éthanolKoptec140 preuves2401
Congélateur, −80 °CThermo ScientificSérie Revco RDE—
Gants résistants à la chaleurFisher ScientificGants Bel-Art Clavies pour risques biologiques et autoclaveH13201
Hexaméthyl-disiloxane (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98 %H0091
Peroxyde d'hydrogèneVWRJ.T. Baker, 30 %2204-01
Électrode sélective d'ionsThermo ScientificÉlectrode sélective d'ions au fluorure Orion, double canal9609BNWP
Agitateur magnétiqueVWRAgitateur 360—
MicrospatuleAmazonSpatule en acier inoxydable pour modelage de cire #7A—
MicrocentrifugeuseEppendorf5427R5404000131
Four à moufleThermo ScientificPetit four à moufle de table Thermolyne, 1,3 L, FB1315MFB1315M
ÉtuveBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Solution de paraformaldéhyde dans le PBSThermo Scientific4 % de paraformaldéhyde dans le PBSJ19943-K2
Boîte de PétriVWR60 × 15 mm, non traitée25384-092
PétrolatumThermo ScientificPétrolatum, blanc, pur417090010
Papier indicateur de pHFisher ScientificpH-Fix 4,5–10,092120.3
Capsule en porcelaineFisher ScientificCapsule Fisherbrand, 5 mL, 20 mm de hauteur, forme hauteFB-965-B
PotentiomètreThermo ScientificMesureur Orion Dual Star pH/ISE2115102
Support à tige avec pinceVWRPince d'anneau, 15 cm470104-526
Aliment pour rongeursBio-ServF1515, AIN-76A, ½ granulésF1515
Cric à ciseauxAmazonCric de laboratoire à ciseaux—
Entonnoir séparateurFisher ScientificEisco, verre borosilicate, 2 LS89285
Chlorure de sodiumFisher ScientificACS certifié, cristallinS271-1
Fluorure de sodiumFisher ScientificACS certifié, poudreS299-100
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificPerles blanchesBP359-500
Billes en acier inoxydableFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 piècesSI-CS05
Acide sulfuriqueFisher ScientificQualité ACSA300-500
TISAB IIThermo ScientificSolution d'application Orion IonPlus940909
Desseccateur sous videFisher ScientificDesseccateur sous vide Bel-Art Space Saver, 10 poucesF42010-0000
Filtre sous videFisher ScientificFiltre bouteille à embout d'écoulement, PES, 90 mm, 0,2 µm597-4520
Agitateur rotatif variableMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Références

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BiologyFluorideHexamethyldisiloxane HMDS facilitated diffusionion selective electrodeserumboneteeth
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