Plateforme bioanalytique hybride 3D basée sur des cultures cellulaires pour l’imagerie optique utilisant des éponges à fibroïne de soie

Résumé

L’article décrit une méthodologie simple, accessible et reproductible pour la production et la culture en échafaudage de soie de cellules de cancer du sein 4T1-iRFP720 dans des conditions de contrôle du flux afin de soutenir une culture dynamique. La croissance et la migration cellulaires ont été évaluées comme preuve de concept à l’aide d’un instrument d’imagerie optique in vivo comme principal indicateur non invasif.

Résumé

Nous présentons une plateforme hybride bioanalytique innovante conçue pour l’évaluation préclinique des caractéristiques cellulaires. Le système combine une culture cellulaire tridimensionnelle (3D) cultivée sur une matrice extracellulaire artificielle avec une configuration de réseau inspirée par la chromatographie. Les éponges, fabriquées à partir de la protéine structurale soie fibroïne, servent à la fois de matrice extracellulaire biomimétique et de phase stationnaire. Les éponges à fibroïne de soie étaient produites en interne à l’aide d’un procédé en plusieurs étapes impliquant l’élimination des protéines inhérentes à la séricine des fibres de soie brute, suivie d’une dissolution et d’une dialyse pour purifier la solution de fibroïne, d’une dissolution dans un solvant organique, puis d’un moulage en lit salé pour produire des éponges à base de soie avec une porosité/pores contrôlée de 500 à 800 μm. Des lignées cellulaires génétiquement modifiées de cancer du sein 4T1-iRFP720 et 4T1-wt (contrôle non fluorescent) ont été cultivées dans des échafaudages de soie à l’aide d’un flux continu via une pompe, et leur croissance cellulaire ainsi que leurs caractéristiques ont été analysées de manière non invasive à l’aide de techniques d’imagerie optique (instrument d’imagerie optique in vivo ). En combinant les principaux avantages des systèmes chromatographiques (automatisation, reproductibilité) avec la pertinence biologique des cultures cellulaires 3D avancées, la plateforme permet la modélisation in vitro de l’architecture et de la morphologie tissulaires tout en facilitant la surveillance du comportement cellulaire dynamique. Parallèlement, l’application de la technologie d’imagerie médicale permet une surveillance en temps réel et prolongée de la migration et de la croissance cellulaires, entre autres facteurs. Cette approche offre un potentiel considérable pour étudier les comportements cellulaires à l’échelle macroscopique dans un système d’écoulement de type laminaire. En améliorant la pertinence physiologique des modèles in vitro , cette méthode peut contribuer à combler le fossé translationnel avec les études in vivo et est cohérente avec le cadre réducte, replace, raffiner (3R) pour l’expérimentation animale.

Introduction

Dans les tissus vivants, la migration et la croissance cellulaires se produisent au sein d’une matrice extracellulaire (ECM) hétérogène et tridimensionnelle, guidée par des indices biophysiques et biochimiques, tels que le flux de liquide interstitiel et les interactions cellule-cellule. Ces facteurs régulent la polarité cellulaire, la mécanotransduction et le mouvement coordonné, sous-jacents à des processus biologiques clés tels que la réparation tissulaire et l’invasion du cancer 1,2,3,4.

Malgré leur importance, la plupart des tests de migration in vitro, tels que les tests scratch et Transwell, évaluent le mouvement des cellules uniques sur des substrats plats et statiques. Bien que simples et économiques, ces approches 2D reproduisent mal les caractéristiques structurelles et dynamiques du microenvironnement in vivo ^5,6. Cette limitation devient particulièrement critique dans le contexte des métastases cancéreuses, où les cellules tumorales migrent collectivement à travers des matrices tissulaires mécaniquement et chimiquement^{diverses 3,7,8}. Bien que les tests 2D scratch restent populaires car faciles à réaliser, ils ne reflètent pas la complexité de l’ECM ni les effets de l’écoulement de^{fluide 6}. Les approches basées sur les transwells fournissent des lectures quantitatives, mais uniquement aux points fixes, empêchant l’observation continue de la migration ^6,9.

Des études récentes ont montré que le flux interstitiel augmente le potentiel métastatique, tandis que la rigidité et la composition de la MCE favorisent la transition épithéliale-mésenchymatose et la migration collective ^4,10. Des systèmes 3D plus avancés, tels que les sphéroïdes et organoïdes, s’approchent mieux des environnements ECM natifs ; cependant, leur utilisation est souvent limitée par la variabilité, l’accessibilité expérimentale limitée et les difficultés dans l’analyse^{standardisée 11,12}. Les plateformes microfluidiques offrent un contrôle supérieur sur les conditions mécaniques et fluidiques, mais leur dépendance à des méthodes de fabrication spécialisées et à des équipements limite leur usage^{généralisé 13}. Ainsi, recréer ces indices intégrés in vitro de manière contrôlée, accessible, non invasive et rentable reste un défi majeur ^5,14.

Pour relever ces défis et combler le fossé entre les essais 2D conventionnels et les modèles complexes in vivo , nous avons développé une plateforme cellulaire 3D simple habilitée à flux basé sur un échafaudage en éponge en fibroïne de soie. Le système utilise une éponge en soie dotée de propriétés mécaniques accordables, servant d’échafaudage de type ECM. La soie a été choisie pour sa structure poreuse, qui permet une perfusion douce et soutient un flux interstitiel physiologiquement^{pertinent 15}. Sa biocompatibilité et son utilisation établie en biomédecine et en ingénierie tissulaire en font un matériau adapté à cette application. Une publication récente a également démontré le potentiel de durabilité environnementale et de recyclage de^{l’échafaudage 16}. Dans une autre étude, nous avons également montré leur adaptabilité à différentes modalités d’imagerie, telles que la tomographie par émission^{de positons 17}. Ce travail antérieur a servi de base à la description méthodologique actuelle, dans laquelle nous nous appuyons sur le même concept de plateforme dans une configuration simplifiée basée sur l’imagerie optique in vivo . Ensemble, ces études démontrent le potentiel du système pour l’évaluation multimodale basée sur l’imagerie des constructions tissulaires modifiées et soutiennent son utilisation comme plateforme expérimentale polyvalente pour intégrer la culture in vitro et des lectures pertinentes in vivo entre différents modèles cellulaires cancéreux.

À titre de preuve de concept, nous avons cultivé des cellules de cancer du sein 4T1 triple négatives marquées iRFP720 dans l’échafaudage sous deux conditions de flux de contraintes de cisaillement faibles pendant cinq jours. La surveillance optique non invasive in vivo a révélé des schémas de croissance distincts dirigés par le flux et des changements significatifs dans la dynamique des populations cellulaires par rapport aux témoins statiques. En mettant l’accent sur la simplicité et la reproductibilité de l’ingénierie, ce modèle constitue un pont pratique entre les essais 2D et les études in vivo , permettant aux chercheurs d’examiner, à l’échelle macroscopique et non invasive, des caractéristiques cellulaires médiées par le flux dans un format physiologiquement pertinent mais accessible. Contrairement aux méthodologies précédentes qui reposent souvent sur des analyses destructrices des points de terminaison ou ne comportent pas de critères d’ensemencement standardisés, ce protocole introduit un cadre systématique pour optimiser la production d’échafaudages et, par la suite, l’ensemencement et l’imagerie cellulaires. Cette approche renforce la robustesse expérimentale et offre une vue longitudinale plus complète de la dynamique cellulaire collective au sein des matrices 3D, représentant un raffinement significatif par rapport aux méthodes existantes de suivi de la croissance et de la migration.

Protocole

La première section décrit la préparation des échafaudages en fibroïne de soie basée sur des travaux publiés^{antérieurs 16}. Les sections suivantes décrivent l’optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire, l’intégration du flux et l’imagerie optique pour le suivi des mouvements et de la croissance cellulaires. Cette étude a exclusivement utilisé des lignées cellulaires de cancer du sein murin établies (4T1-wt et 4T1-iRFP720) et n’a pas impliqué de participants humains, d’échantillons de patients, de tissus primaires ou d’animaux vivants. Conformément aux directives institutionnelles et nationales, une approbation éthique n’était pas requise. Un aperçu schématique du flux de travail est présenté à la Figure 1.

1. Préparation de l’éponge en fibroïne de soie

1. Nettoyage et dégommage du cocon.
   1. Ouvrez les cocons du ver à soie Bombyx mori L. à l’aide d’un scalpel de sécurité.
   2. Retirez les larves et extrayez la couche la plus interne du cocon (couche compacte entourant directement la cavité larvaire) à l’aide d’une aiguille de dissection standard.
   3. Remplissez un bécher avec 1,6 L d’eau double distillée (ddH₂O).
   4. Ajoutez une barre de mélange magnétique et faites ébullir l’eau en remuant ; Couvrez le bécher avec du papier aluminium pour accélérer le chauffage et réduire la perte d’eau.
   5. Ajoutez 3,4 g de Na₂CO₃ lorsque la température de l’eau atteint environ 70 °C.
   6. Lorsque le mélange commence à bouillir, ajoutez 4 g de cocons préparés dans la solution et remuez avec une tige de verre.
   7. Faites bouillir les cocons pendant 30 minutes, en remuant avec une tige de verre toutes les 10 minutes pour assurer une bonne exposition.
   8. Retirez la soie de la solution et rinçez-la plusieurs fois avec de l’eau du robinet pour enlever le reste de la séricine.
   9. Pressez trop d’eau et étalez les fibres de soie sur un bol en aluminium préparé.
   10. Séchez les fibres de soie dans un four préchauffé à 50 °C jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches (environ 18 heures).
2. Dissolution et dialyse
   1. Utilisez de l’éthanol absolu et du CaCl₂ anhydre pour les étapes suivantes. La matrice de dissolution se compose d’une partie de CaCl₂, 2 parts d’éthanol et 8 parties de_{ddH 2}O. Le rapport entre la soie dégommée sèche et la matrice de dissolution est de 1:10 [p/w].
   2. Peser la soie séchée et calculer en conséquence les bonnes quantités des composants pour la matrice de dissolution.
   3. Remplir la quantité respective de_{CaCl 2} dans une fiole à fond rond équipée d’une barre de brassage.
   4. Mesurez la quantité nécessaire d’éthanol et de_{ddH 2O}et combinez-les.
   5. Ajoutez le mélange éthanol-ddH_2Oau_{CaCl 2} pendant que vous remuez.
   6. Installez un appareil de reflux et chauffez le mélange à 100 °C dans un bain d’huile, permettant à la CaCl₂ de se dissoudre et amenant le mélange à ébullition.
   7. Quand le mélange commence à bouillir, ajoutez la soie séchée et chauffez-la sous reflux pendant 45 minutes.
   8. Préparez des tubes de dialyse en cellulose de 15 cm de long de 3,5 kDa en les rinçant plusieurs fois à l’eau pour les réhydrater, puis sécurisez une extrémité autour d’une tige en verre avec une pince de scellement.
   9. Après ébullition, transférez la solution de soie chaude dans le tube et scellez l’extrémité opposée avec une pince, laissant un espace de 2 à 3 cm entre le liquide et la pince de scellement, sans aucune enceinte d’air.
   10. Placez le tube de dialyse rempli dans un bécher de 2 L rempli de ddH_2Oet effectuez la dialyse à température ambiante pendant 72 heures, en changeant l’eau deux fois par jour pour assurer une purification efficace.
   11. Centrifugez la solution à 4500 × g pendant 10 minutes à température ambiante.
   12. Verser doucement le surnageant dans les tubes de centrifugeuse sans déranger la pastille, et conserver les tubes à -20 °C.
       REMARQUE : Remplissez les tubes de centrifugeuse jusqu’à la moitié de leur capacité et congelez-les à l’horizontale.
3. Lyophilisation
   1. Préchauffez la pompe à vide pendant 20 minutes et faites fonctionner le lyophiliseur selon les instructions du fabricant.
   2. Placez les tubes de centrifugeuse congelés, directement hors du congélateur, dans une fiole à fond rond.
   3. Fixez la fiole au lyophiliseur et liophilisez pendant 24 heures.
   4. Jusqu’à une utilisation ultérieure, conservez la fibroïne de soie lyophilisée dans un endroit sec à température ambiante.
4. Moulage de solvants et lixiviation par particules
   1. Ajouter la quantité requise de soie lyophilisée à 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP) dans un contenant d’échantillons d’urine sous une hotte pour obtenir une solution à 16 % [p/v] d’un volume final de 30 mL, puis refermer le récipient avec un couvercle.
      ATTENTION : Le HFIP est corrosif et nocif s’il est inhalé, ingéré ou absorbé par la peau ; manipulez le solvant dans une hotte à fumée tout en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, et évitez tout contact avec la peau, les yeux et les vapeurs. En cas de déversement, collectez le liquide à l’aide de matériaux absorbants et nettoyez les zones affectées. Transférer les matériaux contaminés vers des conteneurs désignés pour déchets dangereux.
   2. Scellez le récipient hermétiquement et placez-le sur le shaker orbital à 70 tr/min pendant 18 heures pour permettre à la soie de se dissoudre.
   3. Tamisez NaCl en utilisant différents maillages et mettez de côté la fraction de 500–800 μm.
   4. Remplir une boîte de Petri (9 cm de diamètre, 8,5 cm de fond de diamètre) avec 100 g de sel tamisé (fraction de 500 à 800 μm), ce qui donne une hauteur de 1,2 cm. Assurez-vous que la surface est bien nivelée.
   5. Verser doucement 25,5 mL de la solution de soie préparée sur le lit de sel (porogène pour la formation des pores en éponge).
   6. Couvrir la boîte de Petri avec le couvercle et la placer sur un shaker orbital pendant 10 minutes à 70 tr/min pour une infiltration uniforme de la solution de soie dans le lit salin.
   7. Incuber la boîte de Petri à 37 °C pendant 1 h avec le couvercle fermé ; ensuite incuber la boîte de Petri découverte à 37 °C pendant 18 heures supplémentaires.
   8. Pour induire la formation de feuilles bêta, immergez le composite de soie dans un bécher contenant du méthanol pendant 20 minutes, puis retirez-le et séchez-le au four à 50 °C (environ 1 heure).
      ATTENTION : Le méthanol est hautement toxique ; manipulez dans une hotte à fumée tout en portant des EPI appropriés, évitez le contact avec la peau et l’exposition à la vapeur. En cas de déversement, collectez le liquide à l’aide de matériaux absorbants et nettoyez les zones affectées. Transférez les matériaux contaminés vers des conteneurs désignés comme déchets toxiques.
   9. Retirez le NaCl en porogène en immergeant le composite de soie dans un bécher contenant de l’eau tiède du robinet pendant au moins 3 heures, avec un échange d’eau toutes les 20 à 30 minutes jusqu’à ce que le matériau obtienne une texture douce et épongeuse, sans parties dures restantes.
   10. Conservez l’éponge de soie dans 70 % d’éthanol pour la désinfection et la conservation à court terme à 4 °C.
       REMARQUE : Les solutions contenant du HFIP ont été collectées sous forme de déchets solvants halogénéés, tandis que les déchets de méthanol ont été éliminés séparément sous forme de déchets solvants organiques non halogénés selon les directives institutionnelles de sécurité chimique. Pour la décontamination post-utilisation, les contenants et surfaces de travail exposés à HFIP ou méthanol ont été rincés avec un solvant compatible et nettoyés avec une solution détergente. Les premiers rinçages et consommables contaminés ont été collectés comme déchets chimiques dangereux.

2. Préparation et équilibrage de l’échafaudage de soie

1. Coupez des éponges en fibroïne en soie à l’aide d’une poinçonne de biopsie de 6 mm de diamètre pour obtenir des échafaudages cylindriques de 6 mm de diamètre et 12 mm de hauteur.
   REMARQUE : Les échafaudages en éponge en fibroïne préparée peuvent être conservés à 70 % d’éthanol à 4 °C jusqu’à 4 mois ; Pour un stockage prolongé, un remplacement périodique par de l’éthanol frais est recommandé. Les échafaudages équilibrés peuvent être stockés dans un milieu de culture cellulaire à 4 °C pendant jusqu’à 1 mois.
2. Mettez les échantillons dans les tubes centrifugeuses avec 70 % d’éthanol pour désinfection.
3. Effectuez les étapes suivantes dans un cabinet de sécurité biologique certifié pour prévenir la contamination.
4. Aspirez l’éthanol à l’aide d’une pipette tout en pressant l’éponge avec une pince à épiler.
5. Placez les éponges dans une boîte de Petri contenant 10 à 20 mL complétés par un support Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 pour les immerger complètement.
6. Échangez les médias trois fois avec un petit mouvement entre chaque échange.
7. Après le troisième lavage, ajoutez du substrat frais, fermez bien le couvercle et enveloppez-le dans un film de paraffine.
8. Conservez les éponges au moins une semaine au réfrigérateur à 4 °C avant de les utiliser pour la culture cellulaire. Pendant cette période, échangez les médias 4 à 5 fois.
   REMARQUE : Assurez-vous d’éliminer complètement l’éthanol, car l’éthanol résiduel est cytotoxique et altère l’attache et la viabilité cellulaires.

3. Mesure de fond et optimisation de l’imagerie

1. Transportez les tubes de filtration optiquement transparents vides et les tubes de filtration optiquement transparents contenant des échafaudages en soie non ensemencés vers l’imagerie optique in vivo .
   REMARQUE : L’imagerie a été réalisée à l’aide d’une imagerie optique in vivo en mode épifluorescence 2D.
2. Effectuer des images sur différentes paires de filtres (excitation : 675 nm, 745 nm ; émission : 720 nm, 800 nm), temps d’exposition (4–60 s), nombres de stops (1–8), champ de vue (13,5–22,5 cm) et niveaux variables de lampe (bas et haut).
3. Évaluer l’autofluorescence en imageant les deux plateformes dans des conditions identiques avant d’utiliser des échafaudages ensemencés par cellule.
4. Remplacer l’entrée Luer-lock mâle par un connecteur Luer-lock femelle coupé pour les configurations uniquement par imagerie, afin d’éliminer les artefacts d’autofluorescence à haute intensité provenant du connecteur Luer-lock mâle. Si les matériaux sont les mêmes pour toutes les expériences, cette étape n’est requise qu’une seule fois.
    

4. Préparation des suspensions cellulaires et ensemencement sur des échafaudages en fibroïne de soie

REMARQUE : Effectuer toutes les étapes suivantes dans une armoire de sécurité biologique dans des conditions stériles, car ces procédures impliquent la manipulation de cellules vivantes et d’échantillons contenant des cellules.

1. Surveillez régulièrement les cellules murines triple négatives du cancer du sein 4T1 (4T1-wt) et 4T1-iRFP720 pour détecter une contamination et la stabilité de l’expression d’iRFP720.
2. Maintenir des cellules murines triple négatives du cancer du sein 4T1-wt et 4T1-iRFP720 dans un milieu RPMI-1640, complété avec 10 % de sérum fœtal pour veaux, 1 % de L-glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de_CO-2.
3. Les cellules du passage à environ 80 % de confluence en utilisant 0,25 % de trypsine-EDTA, suivant les procédures standard de culture cellulaire aseptique.
4. Utilisez des numéros de passage identiques et des conditions de culture pour les cellules 4T1-wt et 4T1-iRFP720 pour toutes les expériences comparatives.
5. Préparez une densité d’ensemencement de cellules allant de 5 × 10⁴ à 5 × 10⁷ cellules/mL (correspondant à une plage de 1 × 10⁴ à 1 × 10⁷ cellules par 200 μL). Préparez les concentrations suivantes pour une analyse d’imagerie afin d’évaluer l’intensité du signal à travers différentes densités cellulaires et de déterminer la concentration optimale : 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷, et 5 × 10⁷ cellules/mL.
6. Préparez les suspensions correspondantes de cellules 4T1-wt dans la même plage de concentration que les cellules 4T1-iRFP720 pour servir de témoins non fluorescents.
7. Placez des échafaudages individuels (préparés dans la Section 2) dans des boîtes de Petri stériles et non traitées.
   REMARQUE : Utilisez des boîtes de Petri non traitées pour minimiser l’attachement cellulaire à la surface plastique et favoriser l’attachement cellulaire à l’échafaudage en soie.
8. Retirez l’excès de substrat autour de chaque échafaudage et de l’échafaudage à l’aide d’une pipette, en veillant à ne pas déformer la structure.
9. Une pipette de 200 μL de la cellule appropriée suspendue directement sur la surface supérieure de chaque échafaudage, garantissant que tout le volume est absorbé par l’échafaudage.
10. Incuber les échafaudages pendant 4 h à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de_CO2 sans déranger les plats pour permettre l’attachement cellulaire.
11. Après 4 h, transférez soigneusement chaque échafaudage ensemencé dans les cellules dans un puits d’une plaque à 24 puits contenant 1 mL de milieu complet préchauffé.
12. Incubez les échafaudages toute la nuit (16–24 h) à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.

5. Assemblage de plateformes d’étalonnage avec frits

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d’assemblage dans une armoire de sécurité biologique à l’aide de gants stériles, de pinces à épiler stériles et d’outils stériles.

1. Retirez les échafaudages de soie ensemencée par des cellules des plaques à 24 puits à l’aide d’une pince à épiler stérile, en soutenant doucement chaque échafaudage pour éviter la compression.
2. Insérez un échafaudage à graines cellulaires dans la partie inférieure d’un tube d’extraction en phase solide optiquement transparent à l’aide d’une tige poussoir stérile en colonne.
3. Placez une frite stérile en polyéthylène directement au-dessus de l’échafaudage à l’aide de la tige poussoir.
   REMARQUE : Utilisez uniquement les frites de polyéthylène lors de l’optimisation du signal, car leur taille de pores est inférieure au diamètre de la cellule et empêche la migration cellulaire ou tout autre contact cellulaire. Cela permet également une séparation claire du signal, permettant d’identifier la concentration exacte des cellules correspondant à chaque signal.
4. Répétez la séquence d’empilement, un échafaudage suivi d’un frit, jusqu’à ce que cinq échafaudages à graines de cellules et cinq frits aient été insérés.
5. Fermez le bas du tube de filtration avec un connecteur Luer-lock femelle stérile.
6. Fermez le haut du tube d’extraction avec un connecteur Luer-lock mâle stérile.

6. Optimisation du signal par un instrument d’imagerie optique in vivo utilisant des plateformes d’étalonnage avec frits (une seule fois pour la validation système)

1. Transportez des plateformes ensemencées par cellules pour calibration vers la salle d’imagerie optique in vivo à l’intérieur d’une boîte sombre étanche à la lumière afin de protéger les cellules fluorescentes du photoblanchiment.
2. Préparez l’imagerie optique in vivo selon la sécurité institutionnelle et les procédures opérationnelles.
3. Placez des plateformes assemblées ensemencées par cellules sur l’étage d’imagerie.
4. Acquérir des images d’épifluorescence 2D en utilisant l’excitation à 675 nm et l’émission à 720 nm et optimiser les paramètres d’imagerie, y compris le temps d’exposition, le facteur de binning et le nombre f, afin d’atteindre une intensité maximale du signal dans la plage de détection linéaire (voir Figure 1 et Figure 2 supplémentaires).
5. Inclure au moins un tube d’extraction optiquement transparent contenant des échafaudages ensemencés de cellules 4T1-wt à des densités cellulaires correspondantes comme contrôle de référence non fluorescent.
6. Acquérir des images pour tous les échantillons en utilisant des réglages d’acquisition identiques afin de permettre une comparaison quantitative de l’intensité de fluorescence (voir Figure 3 et Figure 4 supplémentaires).
7. Quantifier les signaux de fluorescence à l’aide d’un logiciel d’analyse d’imagerie optique in vivo et déterminer la densité optimale d’ensemencement des cellules (c’est-à-dire 5 × 10⁶ cellules par échafaudage) qui fournit le signal maximal sans saturation (voir Figure supplémentaire 5).
   REMARQUE : Les réglages finaux du système d’imagerie optique in vivo ont été sélectionnés sur la base d’expériences d’optimisation afin d’assurer l’acquisition du signal dans la plage dynamique linéaire du système, en évitant la saturation de la capacité de l’échafaudage et en maintenant un rapport signal stable entre les conditions expérimentales et de contrôle. Sur la base de paramètres optimisés, semez tous les bioréacteurs expérimentaux avec 5 × 10^{cellules de 6} cellules/échafaudage. Effectuer l’imagerie en mode épifluorescence 2D avec les réglages suivants : excitation : 675 nm (bande passante 30 nm) ; Émission : 720 nm (bande passante 20 nm), temps d’exposition : 10 s, facteur de binning : 8, numéro f : 8.

7. Assemblage expérimental de la plateforme (sans frits)

1. Après optimisation du signal, semez des échafaudages expérimentaux avec la densité cellulaire optimale déterminée (c’est-à-dire 5 × 10⁶ cellules/200 μL, voir section 4).
2. Assembler la plateforme expérimentale en utilisant un total de cinq éponges en soie : un échafaudage à graines cellulaires et quatre échafaudages vides sans frites en polyéthylène pour permettre la communication cellulaire.
3. Scellez le haut du tube de filtration avec un connecteur Luer-lock mâle stérile.
4. Configurez le système de culture pour des conditions de culture statiques ou dynamiques
   1. Culture statique : Scellez le port inférieur avec un connecteur Luer-lock femelle stérile. Le système est ensuite placé dans un tube centrifugeuse avec un couvercle mal ajusté.
      REMARQUE : Comme le Luer-lock mâle possède une ouverture, cette configuration permet l’échange gazeux tout en minimisant le risque de contamination. Dans cette configuration, les médias sont échangés manuellement dans la hotte une fois par jour.
   2. Culture dynamique : Connectez le port inférieur à un tube stérile et reliez la ligne d’entrée au Luer-lock mâle au port supérieur pour permettre la culture par perfusion. Alimenter et retirer continuellement le milieu à l’aide d’un système de pompe péristaltique (Figure 6 supplémentaire).

8. Culture dynamique sur la plateforme

1. Commencez la désinfection de la pompe et des tuyaux associés en rinçant avec de l’éthanol à 70 % à débit maximal pendant 10 minutes.
2. Rincez la pompe et le tube avec un substrat complet stérile pendant au moins 10 minutes pour éliminer les résidus d’éthanol. Remplacez-le par un milieu frais et poursuivez la perfusion pendant 10 minutes supplémentaires pour assurer un équilibre complet du système avant utilisation.
   REMARQUE : Assurez-vous que tous les composants sont bien remplis de substrat et exempts de bulles d’air avant l’ensemencement des cellules.
3. Reliez l’entrée mâle Luer-lock (haute) du réacteur assemblé à la conduite de sortie de la pompe à l’aide de tubes stériles et de connecteurs Luer-lock.
4. Reliez l’entrée de la pompe à un réservoir stérile contenant un milieu complet.
5. Reliez la sortie du réacteur (en bas) au réservoir du milieu pour établir une boucle de perfusion de recirculation. Cette configuration permet une perfusion continue du milieu à travers l’échafaudage tout en maintenant un système en boucle fermée.
   REMARQUE : Dans ce protocole, la perfusion est réalisée à l’aide d’une configuration de recirculation, où le milieu est continuellement circulé entre le réservoir et le réacteur. Cette approche minimise la consommation de médium tout en maintenant un débit continu.
6. Réglez le débit souhaité sur la pompe pour cibler la contrainte de cisaillement nominale de paroi (par exemple, 1 dyn/^{cm 2} et 4 dyn/cm²), en utilisant le rayon interne du canal ( = 3 mm) en supposant l’écoulement de Poiseuille¹⁹ :
   
   où τ est la contrainte de cisaillement de paroi (dyn/cm²), et Q est le débit volumétrique (cm³/s), est la viscosité du fluide du milieu RPMI-1640 (0,958 × 10-3 N·s/^{m 2} à 37 °C)²⁰. Bien que le système réel contienne un échafaudage en soie poreuse et s’écarte donc de cette géométrie idéalisée, les valeurs calculées ont été utilisées comme repères opérationnels standardisés pour permettre des comparaisons reproductibles entre les conditions d’écoulement. Les débits correspondants étaient de 0,133 mL/min et 0,531 mL/min et étaient utilisés comme conditions de perfusion pour la culture.
7. Commencez la perfusion et surveillez le système pour détecter des fuites, la formation de bulles et un écoulement stable.
8. Commencez la perfusion avec un inhibiteur de migration ou un composé test (par exemple, Cucurbitacine E (CuE) à 0,05 μmol/L dans un milieu complet) ou sans (témoin) et maintenez l’ensemble de l’installation à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ jusqu’à cinq jours. Par conséquent, connectez l’entrée de pompe à un réservoir stérile contenant un milieu complet incluant le composé d’essai correspondant, et démarrez la pompe avec des réglages similaires à ceux utilisés précédemment.
   REMARQUE : Assurez-vous d’éliminer complètement l’éthanol de la pompe et des tubes en effectuant les étapes de rinçage définies par le médium. Éliminez la fraction initiale du milieu après rinçage avant de le connecter aux réacteurs à semence cellulaire et assurez-vous que le système est complètement rempli de milieu frais et exempt de bulles d’air.

9. Imagerie de fluorescence de la plateforme expérimentale

1. Arrêtez la pompe, déconnectez tous les tuyaux tout en maintenant des conditions stériles.
2. Scellez le bas du tube SPE à l’aide d’un connecteur Luer-lock femelle, placez l’ensemble du système dans un tube centrifugeuse stérile de 50 mL, et fermez le tube de façon sécurisée.
3. Transférez le système dans un cabinet de biosécurité pour poursuivre toutes les étapes suivantes. À l’intérieur du capot, remplacez le connecteur Luer-lock mâle par un connecteur Luer-lock femelle coupé pour fermer complètement le système.
4. Replacez le système scellé dans un tube centrifugeuse stérile de 50 mL et refermez le tube solidement pour le transport.
   REMARQUE : Selon les conditions de laboratoire, le débit n’a pas besoin d’être arrêté pour l’imagerie lorsque le système est serré. Cependant, cela n’était pas possible dans les contextes expérimentaux donnés.
5. Transportez les réacteurs scellés vers la salle du système d’imagerie optique in vivo à l’intérieur d’une boîte sombre étanche à la lumière pour protéger les cellules fluorescentes du photoblanchiment.
6. Placez les réacteurs sur l’étage du système d’imagerie optique in vivo dans le support approprié.
7. Acquérir des images d’épifluorescence 2D en utilisant les paramètres précédemment optimisés (c’est-à-dire excitation 675 nm, émission 720 nm, temps d’exposition 10 s, binning 8, nombre f 8).
8. Inclure des commandes de réacteur 4T1-wt ensemencées, non ensemencées et des contrôles vides du réacteur pour chaque séance d’imagerie.
9. Quantifier les signaux de fluorescence à l’aide d’une analyse d’imagerie optique in vivo .
10. Tracez les résultats quantitatifs pour les groupes témoins et traitements et générez des graphiques comparatifs pour visualiser l’effet du composé testé sur le résultat mesuré.

10. Analyse d’image de la plateforme expérimentale

1. Acquérir des images fluorescentes aux jours 0, jour 3 et 5 et analyser à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.
2. Pour chaque image, effectuez un calibrage spatial avant l’analyse. Mesurez la longueur physique connue de la plateforme expérimentale en pixels à l’aide de l’outil ligne, puis entrez la distance réelle correspondante (85 mm) via Analyze > Set Scale pour définir la conversion pixel-longueur.
3. Après étalonnage, quantifiez la surface fluorescente en délimitant manuellement la région d’intérêt (ROI) à l’aide de l’outil de sélection à main levée.
4. Pour minimiser le biais de l’utilisateur, délimitez les ROI en utilisant des critères visuels cohérents basés sur l’intensité du signal de fluorescence par rapport au fond. Effectuer toutes les analyses dans des paramètres identiques et, lorsque possible, faire réaliser l’analyse par un opérateur formé unique.
5. Identifiez le signal fluorescent comme des régions claires clairement distinguables du fond sombre dans les images logicielles d’analyse optique in vivo , et utilisez ces signaux pour guider une segmentation manuelle cohérente.
6. Mesurez les régions sélectionnées à l’aide d’Analyser > Mesure, et notez les valeurs de surface pour chaque point temporel. Répétez cette procédure pour toutes les images de tous les groupes expérimentaux.
7. Normaliser les mesures de surface à la valeur correspondante du jour 0 pour chaque échantillon à l’aide d’un logiciel de tableur afin de tenir compte des différences de taille initiale, et exprimer les résultats comme un changement de pli par rapport à la ligne de base (jour 0 = 1).

11. Analyse statistique

1. Effectuez toutes les expériences au moins en triple exemplaire.
2. Répétez toutes les expériences au moins trois fois (n = 3), déterminez les valeurs moyennes ainsi que les écarts-types (DE).
3. Déterminez la signification statistique en utilisant l’ANOVA bidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey avec α = 0,05.

Résultats

Ce protocole décrit une plateforme conviviale et à faible coût pour l’observation macroscopique de la croissance et du mouvement cellulaire dans un environnement 3D physiologiquement pertinent. La méthode utilise des éponges à fibroïne de soie comme imitateur de la MEC et intègre un flux interstitiel contrôlé pour modéliser les conditions dynamiques des tissus. Un aperçu schématique des procédures étape par étape, de la fabrication de l’éponge en soie et de l’échafaudage à l’ensemencemen...

Discussion

Le procédé de production de l’éponge en soie décrit dans ce protocole est standardisé, garantissant une fabrication reproductible de l’échafaudage, comme rapporté dans une étude antérieure¹⁶. La production d’éponges dans des conditions entièrement standardisées, telles que la hauteur/quantité du lit de sel, le volume de solution de soie et l’incubation au méthanol, est cruciale pour obtenir des éponges uniformes et comparables. Les éponges produites doivent respec...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Attention: Danger. Utilisé pour la dissolution de soie lyophilisée
24-Well plate	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Stockage des échafaudages ensemencés de cellules pendant l'incubation
4T1-iRFP720 cellules de cancer du sein triple négatif murin	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	N/A	Expériences de culture cellulaire; 4T1-iRFP720 a été dérivé en interne à partir de 4T1 parental (ATCC: CRL-2539)
4T1-wt cellules de cancer du sein triple négatif murin	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	ATCC: CRL-2539	Expériences de culture cellulaire
Bruker Alpha Compact FTIR avec module d'échantillonnage Platinum-ATR	Bruker	A220/D-01	Analyse FT-IR
Chlorure de calcium, anhydre, >93% qualité réactif	Sigma-Aldrich	902179	Pour la préparation de la matrice de dissolution
Flacon de culture cellulaire, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Consommable; pour la culture cellulaire
Flacon de culture cellulaire, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Consommable; pour la culture cellulaire
Centrifugeuse 5804 R	Eppendorf	5805000010	Utilisée pour la séparation des échantillons par centrifugation
Combi-bouchon (connecteur Luer-lock femelle)	Braun Melsungen AG	4495101	Utilisé pour l'assemblage de la plateforme
Cucurbitacine E	Sigma-Aldrich	SML0577	Inhibiteur de migration cellulaire
Poinçon de biopsie cutanée, Ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Utilisé pour obtenir des échafaudages d'éponge cylindriques
Tubes de dialyse (3,5 kDa, cellulose)	Spectra/Por de Spectrum Labs	SPEC132724	Pour la dialyse de la solution de fibroïne de soie
Tampon de Dulbecco à phosphate de pH 7,4	Sigma-Aldrich	D8537	Pour le maintien des cellules
Éthanol, absolu	Merck	1.07017	Pour la préparation de la matrice de dissolution
Excel	Microsoft	v2604	Organisation des données, calculs de base et tracé
Sérum foetal de veau (FCS) chauffé inactivé	Biowest	S181H-500	Supplément pour les milieux de culture cellulaire
Fiji (ancien ImageJ)	Source ouverte (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Traitement et analyse d'images
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Analyse statistique et création de graphiques
Pompe HPLC Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Pour les conditions de culture dynamique dans la plateforme assemblée
Système IVIS 200 Spectrum CT	PerkinElmer	128201	Système d'imagerie optique avec capacité CT
Logiciel IVIS Living Image	PerkinElmer	v4.5.2	Logiciel pour l'acquisition, la visualisation et l'analyse quantitative des données d'imagerie IVIS
Microscope électronique à balayage JEOL JSM-6510	JEOL GmbH	JSM-6510	Images SEM
L-glutamine, solution à 200 mM, adaptée à la culture cellulaire (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Supplément pour les milieux de culture cellulaire
Lyophilisateur Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Pour la lyophilisation de la fibroïne de soie
Connecteur Luer-lock mâle	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Adaptateur pour les réservoirs d'échantillons
Méthanol, >99,9 %, Grade Gradient HPLC	Carl Roth	7342.1	Attention: Toxique. Induction de la formation de feuillets bêta dans les composites de soie
Tubes de phase solide (SPE) optiquement transparents sans fritte	Sigma Aldrich	57240-U	Utilisé pour l'assemblage de la plateforme
Logiciel de spectroscopie OPUS	Bruker	v7.5	Analyse FT-IR
Agitateur orbital et linéaire MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Distribution/mélange uniforme
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Pour sceller/emballer les plaques et les contenants pour le stockage (par exemple, réfrigération)
Pénicilline-Streptomycine, liquide, adaptée à la culture cellulaire (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Supplément pour les milieux de culture cellulaire
Petite boîte de Petri, 9 cm	VWR	391-0598	Pour le moulage des éponges sur lit de sel; pour l'ensemencement sur des échafaudages de soie
Frittes en polyéthylène pour tubes SPE de 1 mL	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Utilisé pour l'assemblage de la plateforme
Milieu RPMI-1640, adapté à la culture cellulaire	Sigma-Aldrich	R0883	Les milieux supplémentés sont utilisés pour l'équilibrage des éponges de soie, l'entretien des cultures cellulaires et les expériences connexes
Pipette serologiste, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Consommable; pour l'entretien des cellules
Pipette serologiste, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	Consommable; pour l'entretien des cellules
Pipette serologiste, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	Consommable; pour l'entretien des cellules
Cochonne de soie de Bombyx mori L.	Sericulture and Agriculture Experimental Station, Vratsa, Bulgaria	N/A	Matière première pour la production d'éponges de fibroïne de soie
Carbonate de sodium, anhydre, >99,5% ACS	VWR	11552.A3	Utilisé pour le dégommage chimique, c'est-à-dire l'élimination de la séricine
Chlorure de sodium, >98%, technique	VWR	27788.366	Pour le moulage des éponges sur lit de sel
Bague de poussée pour colonne SPE