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Article de méthode

Une méthode de coupe intra-chambre pour la quantification en temps réel des composés volatils induits par le blessage foliaire et des échanges gazeux

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11 septembre 2026

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1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une méthode normalisée de découpe intra-chambre permettant de déterminer l'apparition, le moment du pic et la cinétique des émissions de composés volatils induites par une blessure, associée à des mesures simultanées d'échanges gazeux.

Résumé

Les composés organiques volatils (COV) émis par les feuilles des plantes jouent un rôle clé dans la signalisation du stress, les interactions plante-atmosphère et la défense des plantes. Parmi ceux-ci, les COV induits par des blessures (COV-blessure) sont libérés en quelques secondes suivant un dommage mécanique, une herbivorie ou une perturbation environnementale. La dynamique de leur émission dépend fortement du moment, de la gravité et de la méthode de la perturbation tissulaire. Toutefois, leur quantification précise reste difficile en raison d'artéfacts mécaniques, de conditions d'exposition variables et de retards entre la blessure et la mesure. Cette étude présente un protocole standardisé d'excision foliaire en chambre pour la surveillance en temps réel des COV-blessure et des échanges gazeux. Un coupeur de qualité chirurgicale a été intégré à une chambre portable d'échange gazeux afin de réaliser des coupes nettes et contrôlées à l'intérieur d'une chambre scellée, sous des conditions stables de lumière, d'humidité, de CO2 et de température. Un spectromètre de masse à temps de vol avec réaction de transfert de protons (PTR-TOF-MS) a mesuré en continu les émissions volatiles à la sortie de la chambre, minimisant ainsi les retards et la distorsion du signal. Ce dispositif permet de déterminer avec une grande fidélité temporelle le début de l'émission, le moment du pic, la vitesse maximale de montée et la libération totale. L'application de cette méthode à Quercus rubra, Acer platanoides et Gossypium hirsutum a démontré sa capacité à distinguer des profils d'émission induits par blessure différents selon les types foliaires contrastés. En éliminant les retards liés aux méthodes d'échantillonnage conventionnelles, cette approche permet de caractériser la trajectoire cinétique complète des émissions induites par blessure et surmonte les principales limites des méthodes antérieures. Elle fournit un cadre solide pour l'étude des réponses rapides au stress en physiologie végétale, en biochimie écologique et dans les interactions plante-atmosphère.

Introduction

Les plantes réagissent à une blessure en libérant un signal chimique rapide, mais la capture précise de ce signal reste techniquement difficile. En quelques secondes après un herbivorie, un dommage causé par le vent ou une perturbation mécanique, les plantes émettent une bouffée transitoire de composés organiques volatils (COV) qui activent les défenses internes et préparent les plantes voisines1,2,3,4. Ces COV induits par la blessure (COVb) comprennent les volatils des feuilles vertes (VFV), le méthanol, les alcools et aldéhydes à chaîne courte, les terpénoïdes et les dérivés des oxylipines. Ils proviennent soit d'une synthèse de novo dans les cellules du mésophylle, soit de la rupture de structures de stockage telles que les canaux à résine et les trichomes. En tant que signaux de stress immédiats, les COVb coordonnent les défenses physiologiques, médient la communication entre plantes et interagissent avec la chimie atmosphérique1,5,6,7.

Étant donné que l'herbivorie naturelle associe des dommages mécaniques à des éliciteurs salivaires et microbiens, les études expérimentales utilisent des blessures simulées afin d'isoler les réponses liées uniquement aux lésions physiques8. Toutefois, la nature transitoire des composés organiques volatils induits par les blessures (wVOCs) les rend intrinsèquement difficiles à capturer. Les méthodes classiques, telles que l'échantillonnage en espace de tête statique couplé à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), passent souvent à côté du pic initial d'émission et déforment son profil cinétique9,10. Les retards d'équilibre, les températures d'incubation élevées et les lignes d'échantillonnage prolongées augmentent le temps de séjour et altèrent le signal enregistré, en particulier pour les composés réactifs tels que les sesquiterpènes9,11,12. Pris ensemble, ces artefacts réduisent l'amplitude du signal et masquent la dynamique temporelle des émissions volatiles induites par les blessures, compliquant ainsi l'interprétation des réponses des plantes au stress.

De nombreuses études interrompent également la mesure pour blesser les feuilles à l'extérieur de la chambre. Cette interruption déstabilise le débit de gaz, modifie le moment du traumatisme et réduit le contrôle sur la précision de l'incision13,14,15. En conséquence, les premières minutes suivant la blessure sont souvent perdues ou altérées13, précisément au moment où les taux d'émission atteignent leur maximum et où apparaissent des profils cinétiques caractéristiques3,6,16,17. Certaines approches ont réalisé la section des feuilles à l'intérieur de chambres de grand volume en utilisant des lames en téflon ou des perforateurs mécaniques12,18,19. Toutefois, ces dispositifs ont souvent entraîné une instabilité d'étanchéité, des longueurs de coupure inconstantes et des incisions irrégulières dues au déplacement de l'outil ou aux différences de résistance des feuilles. Le grand volume de la chambre a en outre retardé le renouvellement de l'air et élargi le signal des composés volatils16. Prises ensemble, ces limitations expérimentales empêchent une caractérisation précise de la dynamique temporelle des émissions induites par une blessure dans des conditions physiologiques stables.

Pour surmonter ces difficultés, cette étude présente un protocole de blessure en temps réel à l'intérieur de la chambre qui intègre un coupeur de qualité chirurgicale dans un système d'échange gazeux couplé à une spectrométrie de masse à temps de vol avec réaction de transfert de protons (PTR-TOF-MS). Ce protocole permet une blessure foliaire et une détection des composés volatils synchronisées dans des conditions environnementales contrôlées, tout en mesurant simultanément les flux de volatils et les échanges gazeux avec une haute résolution temporelle. En réalisant la section foliaire directement dans la chambre de mesure, le protocole réduit au minimum les retards d'échantillonnage associés aux approches conventionnelles, préserve la dynamique temporelle des composés volatils induits par la blessure et émis rapidement, et illustre une procédure de coupe standardisée sur des feuilles aux propriétés mécaniques différentes. Cette résolution temporelle permet une caractérisation directe du début, du moment du pic et des cinétiques spécifiques à l'espèce des émissions de composés volatils induites par la blessure.

Le protocole a été évalué à l'aide de trois espèces présentant des caractéristiques anatomiques et physiologiques contrastées (Quercus rubra, Acer platanoides et Gossypium hirsutum) afin de démontrer son applicabilité à divers types de feuilles. L'application de conditions de mesure identiques pour toutes les espèces montre que le protocole permet de résoudre la dynamique des COV induits par des blessures sur une large gamme de profils d'émission, tout en minimisant la variabilité expérimentale. Cette approche est largement applicable aux études nécessitant des mesures à haute résolution temporelle des COV induits par des blessures dans des conditions environnementales contrôlées. Ensemble, ces caractéristiques offrent un cadre normalisé pour l'étude des réponses rapides des plantes au stress et facilitent l'application du protocole à différentes espèces et systèmes expérimentaux.

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Protocole

Toutes les plantes ont été cultivées dans des conditions d'environnement contrôlé, en chambre de croissance. Les réactifs et l'équipement utilisés sont répertoriés dans le Tableau du matériel.

1. Construction et installation du coupe-feuille intra-chambre

  1. Concevoir un coupe-feuille rotatif conçu pour s'adapter aux dimensions internes (4 cm × 2 cm) de la tête de mesure standard.
  2. Fixer une lame de rasoir à une tige en acier inoxydable (diamètre de 1 mm) à l’aide de brasure d’argent afin d’assurer la stabilité mécanique.
    ATTENTION : Les lames de rasoir sont extrêmement tranchantes. Porter des gants résistants aux coupures lors de la manipulation. Après usage, éliminer les lames de rasoir conformément aux procédures de sécurité en laboratoire de l’établissement pour les objets tranchants. Effectuer la brasure d’argent sous une ventilation appropriée et porter une protection oculaire.
  3. Insérer la tige porte-lame dans une aiguille de seringue en acier inoxydable (diamètre extérieur de 1,6 mm) afin de permettre une rotation axiale libre.
  4. Sceller les deux extrémités de l’aiguille à l’aide d’un bouchon en polytétrafluoroéthylène (PTFE) à faible émission afin de maintenir des conditions étanches tout en préservant la rotation.
  5. Monter une poignée de rotation manuelle à l’extrémité proximale de la tige afin de permettre une rotation contrôlée du coupeur interne.
  6. Fixer deux supports flexibles fabriqués à partir d’une feuille de laiton ressort (épaisseur de 0,2 mm) à la surface extérieure de l’aiguille afin de fixer le coupeur à la moitié inférieure de la chambre.
  7. Créer une incision triangulaire dans le joint de la chambre inférieure afin de permettre l’insertion de la lame sans contact avec la surface de la feuille.
  8. Sceller le point d’insertion à l’aide d’une pâte d’étanchéité à faible émission afin d’éviter toute fuite de gaz.
    REMARQUE : Avant de poursuivre, vérifier que l’installation du coupeur n’a pas compromis l’étanchéité de la chambre. Confirmer que la chambre se ferme complètement, que le thermocouple reste en contact avec la surface de la feuille, et que le système d’échange gazeux indique un débit d’air stable sans signe de fuite. Ne poursuivre que lorsque des conditions stables de la chambre ont été confirmées. Choisir la longueur de la lame afin d’obtenir une coupe d’environ 10 mm. La mécanique intégrée du coupeur et sa position à l’intérieur de la chambre à feuille sont illustrées dans la Figure 1B.

Dispositif d'échantillonnage par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (CPG-SM) pour l'analyse chimique ; port PTR-TOF-MS.
Figure 1 : Système modifié d'échange gazeux muni d'un coupe-feuille intégré dans la chambre et de lignes d'échantillonnage des composés volatils. (A) Aperçu du système d'échange gazeux modifié, montrant le port d'échantillonnage PTR-TOF-MS et la ligne d'échantillonnage CPG-SM positionnée près de la sortie de la chambre pour la collecte des composés volatils. (B) Vue agrandie de la chambre ouverte, montrant le mécanisme de coupe intégré et la zone où la feuille est positionnée pendant la blessure. Le coupeur est intégré de manière hermétique dans la chambre, permettant de blesser la feuille sans ouvrir l'enceinte durant la mesure. Cette configuration permet un suivi en temps réel des émissions de composés volatils et des échanges gazeux dans des conditions environnementales contrôlées. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

2. Configuration des voies d'échantillonnage des composés volatils

  1. Installez un téflon en forme de T (1/16″ ou 1/8″ de diamètre interne) à proximité de la sortie de la chambre (Figure 1A) afin de minimiser la longueur du tube entre la chambre et l'analyseur de composés volatils.
  2. Reliez la sortie au système de collecte des COV à l’aide d’un tube inerte (par exemple, FEP ou PTFE ; diamètre intérieur de 1,6 mm). Installez le raccord en T immédiatement adjacent à la sortie de la chambre pour que le tube entre la chambre et l'analyseur de composés volatils soit aussi court que possible, réduisant ainsi au minimum le volume interne, le temps de séjour et les pertes par adsorption.
  3. Maintenez le débit d’air dans la chambre à 750 µmol s-1.
    REMARQUE : Un tube inerte court réduit l’adsorption et le temps de séjour des composés réactifs.

3. Préparation du matériel végétal

  1. Faire pousser Quercus rubra, Acer platanoides et Gossypium hirsutum dans une chambre à environnement contrôlé à 25 °C le jour / 20 °C la nuit, 60 % d'humidité relative, une intensité lumineuse de 1000 µmol m-2 s-1 et un photopériode de 16 h/8 h pendant 4 mois.
  2. Maintenir les plantes sous une concentration ambiante de CO2 (~430 ppm) tout au long de l'expérience.
  3. Arroser toutes les plantes tous les deux jours jusqu'à ce que le sol atteigne sa capacité au champ.
  4. Sélectionner des feuilles complètement déployées et non sénescents pour des expériences à stade de développement comparable.

4. Expériences de blessure des feuilles et de collecte des COV

  1. Enclorez la feuille et définissez les conditions environnementales
    1. Enclorez une feuille attachée complètement développée dans la cuvette équipée du coupeur interne.
    2. Réglez la température du bloc à 25 °C, l'humidité relative de l'air à 60 %, l'intensité de la lumière actinique à 1000 µmol m-2 s-1 (90 % rouge, 10 % bleu) et le débit d'air à 750 µmol s-1.
    3. Laissez la feuille s'acclimater aux conditions environnementales choisies jusqu'à l'obtention de valeurs stables d'assimilation nette de CO2, de conductance stomatique et de signaux de base des COV, généralement atteintes 20 à 30 minutes après l'enclosure de la feuille.
  2. Réalisez les mesures d'échanges gazeux, de fluorescence et de suivi des COV
    1. Commencez les mesures simultanées d'échanges gazeux et de COV avec une résolution de 1 Hz.
    2. Après avoir terminé les mesures d'échanges gazeux, enregistrez le rendement de fluorescence en état stable (Fs), puis appliquez une impulsion saturante (8000 µmol m-2 s-1, 0,6 s) via le fluorimètre de chambre (3055-FL) afin de déterminer le rendement maximal de fluorescence (Fm′) chez les feuilles adaptées à la lumière.
    3. Éteignez la lumière actinique et adaptez la feuille à l'obscurité pendant 20 minutes.
    4. Enregistrez la respiration nocturne de la feuille.
    5. Mesurez la fluorescence initiale (F₀) à l'aide d'une faible lumière modulée de mesure (0,03 µmol m-2 s-1), suivie d'une impulsion saturante pour obtenir la fluorescence maximale chez les feuilles adaptées à l'obscurité (Fm).
    6. Rallumez la lumière actinique.
    7. Poursuivez les mesures de COV et d'échanges gazeux dans les mêmes conditions environnementales jusqu'à stabilisation du signal de base avant blessure.
      ​REMARQUE : Avant de provoquer la blessure, vérifiez que les conditions environnementales choisies restent stables et que l'assimilation nette de CO₂, la transpiration et les signaux de base des COV ont atteint des valeurs stables. Poursuivez uniquement lorsque ces conditions sont maintenues sous les paramètres de mesure sélectionnés.
  3. Blessure de la feuille et collecte des COV
    1. Insérez la première cartouche de COV dans la ligne de sortie et connectez-la à une pompe portable d'échantillonnage d'air à débit constant. Faites passer l'air de la chambre à travers la cartouche à un débit constant de 200 mL min-1. Utilisez une cartouche adsorbante en acier inoxydable à lit multiple (longueur de 10,5 cm, diamètre intérieur de 3 mm), adaptée à la capture de COV C3–C17, remplie de Carbotrap C 20/40 mesh (0,2 g), Carbopack B 40/60 mesh (0,1 g) et Carbotrap X 20/40 mesh (0,1 g), disposés du plus faible au plus fort pouvoir d'adsorption dans le sens de l'échantillonnage.
      ​REMARQUE : Avant l'échantillonnage, conditionnez les cartouches en faisant passer de l'hélium de haute pureté à 200 mL min-1 pendant 3 heures à 250 °C. La collecte sur cartouche permet une analyse ultérieure par GC-MS en mode déconnecté pour l'identification des composés, si requis par les objectifs expérimentaux. Bien que la collecte sur cartouche fasse partie du protocole décrit ici, les résultats représentatifs présentés dans cette étude proviennent de mesures continues par PTR-TOF-MS. Adaptez le choix de l'adsorbant à la gamme de volatilité et à la polarité des COV ciblés, ainsi qu'aux conditions d'échantillonnage.
    2. Collectez les COV pré-blessure pendant 15 minutes à 200 mL min-1.
    3. Remplacez la cartouche et collectez les COV pendant 2 minutes.
    4. Faites pivoter le coupeur interne de 360° pour exciser la feuille sans ouvrir la chambre, puis ramenez la lame à sa position initiale.
      REMARQUE : Placez la feuille dans la chambre de manière à ce que l'incision soit réalisée dans le limbe enfermé tout en maintenant un scellement complet de la chambre. Dans la mesure permise par la taille et la morphologie de la feuille, évitez de couper la nervure principale et maintenez la position de l'incision aussi constante que possible entre les échantillons. Des dommages aux nervures majeures pouvant augmenter considérablement les émissions de COV induites par la blessure, une localisation cohérente de la blessure améliore la reproductibilité expérimentale5.
      PRÉCAUTION : Assurez-vous que la chambre est parfaitement scellée avant de couper.
    5. Poursuivez la collecte des COV avec la même cartouche pendant 13 minutes.
    6. Insérez une troisième cartouche et collectez les COV pendant 15 minutes.
    7. Faites fonctionner le PTR-TOF-MS en continu pendant toutes les périodes pour une détection en temps réel.
      REMARQUE : Avant et après chaque mesure sur plante, collectez un échantillon de fond en chambre vide dans les mêmes conditions environnementales. Utilisez ces mesures de fond pour la correction du signal de base des émissions de COV lors de l'analyse des données.

5. Détection des composés volatils et utilisation de l'instrument

  1. Régler la température de l'entrée et du tube de dérive du PTR-TOF-MS à 80 °C, le débit d'entrée à 100 mL min-1, le débit de vapeur d'eau à 4,0 mL min-1, le courant ionique à 4,0 mA, la pression de la chambre de dérive à 2,1 mbar, le rapport densité de champ du tube de dérive à 115 Td, et la pression du module TOF-MS à 1,2 × 10-7 mbar.
  2. Enregistrer les signaux volatils avec une résolution temporelle de 1 Hz et un intervalle d'échantillonnage de 400 ps.
  3. Étalonner le PTR-TOF-MS avant chaque expérience à l'aide d'un mélange gazeux étalon certifié contenant des COV représentatifs des principales classes de composés volatils végétaux. Traiter les données d'étalonnage et calculer les concentrations de COV à l'aide du logiciel PTR-MS Viewer selon les procédures décrites13,16.

6. Analyse en mode hors ligne par GC-MS des échantillons prélevés sur cartouche

REMARQUE : La procédure suivante décrit l'analyse hors ligne des échantillons prélevés sur cartouche au cours du protocole décrit ci-dessus. L'analyse par GC-MS permet une identification complémentaire des composés, tandis que les résultats représentatifs présentés dans cette étude reposent sur des mesures continues par PTR-TOF-MS.

  1. Procéder à la désorption thermique des cartouches à l’aide d’un dispositif automatisé de désorption thermique couplé à un système de GC-MS, selon la procédure décrite par Kännaste et al.20.
  2. Identifier les composés par comparaison avec des étalons authentiques et la bibliothèque spectrale de masse NIST. Réaliser la détection spectrométrique de masse en utilisant une ionisation par impact électronique (70 eV) et confirmer les identités des composés en appariant à la fois les temps de rétention et les spectres de masse avec les étalons authentiques, lorsque disponibles.
    NOTE : L’échantillonnage sur cartouches suit le protocole modifié de Kännaste et al.20 pour la capture des volatils C3–C17.

7. Analyse des données

  1. Soustraire le fond de la chambre vide de toutes les traces d'émission avant l'analyse. Définir la ligne de base pré-lésion pour chaque masse surveillée comme le signal moyen durant un intervalle fixe immédiatement avant la coupe.
  2. Utiliser l'heure de la coupe comme point de référence commun pour toutes les masses surveillées. Déterminer le début de l'émission comme la première augmentation détectable du signal de COV corrigé par rapport à la ligne de base après la coupe de la feuille.
    NOTE : Le début de l'émission a été défini comme la première augmentation consécutive au-dessus de la ligne de base pré-lésion qui se poursuit dans la phase croissante de l'explosion d'émission, excluant ainsi les fluctuations isolées attribuables au bruit instrumental.
  3. Calculer le temps jusqu'au pic comme l'intervalle entre l'heure de la coupe et le signal d'émission maximal. Calculer la pente maximale de l'explosion d'émission à partir de la dérivée première du signal corrigé par rapport à la ligne de base, en utilisant la moyenne des pentes avant et arrière entre les points de données adjacents13. Définir l'amplitude du pic comme la valeur maximale d'émission observée durant l'explosion.

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Résultats

Afin d'évaluer si la position d'échantillonnage des composés volatils influence la détection du signal, nous avons comparé deux configurations à l'aide d'injections contrôlées de gaz dans la chambre foliaire. Dans un premier dispositif, les composés volatils étaient prélevés directement à la sortie de la chambre d'échange gazeux modifiée (Figure 1). En revanche, dans l'autre configuration, l'air passait par les tubulures de l'analyseur d'échange gazeux avant d'atteindre le détecteur. L'enreg...

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Discussion

Le protocole présenté ici permet une analyse à haute résolution temporelle des émissions de composés volatils induites par une blessure, dans des conditions expérimentales contrôlées. En intégrant directement l'événement de coupe dans la chambre foliaire et en surveillant en continu les signaux volatils (Figure 1), le système capte la réponse en émission sans les distorsions dues à un échantillonnage différé, à l'ouverture de la chambre ou à la manipulation de la feuille en dehors du disposi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous reconnaissons le financement fourni par le Conseil estonien de la recherche (PRG2207) et le ministère de l'Éducation et de la Recherche d'Estonie (Centre d'excellence Agro-CropFuture, « Agroécologie et nouvelles cultures dans les climats futurs », TK200U1).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Système GC-MS avec désorbeur thermique TD-20ShimadzuGCMS-QP2010 Plus; TD-20Système GC-MS avec désorbeur thermique TD-20. www.shimadzu.com
Système d'échange gazeux GFS-3000Walz GmbHGFS-3000Mesures d'échange gazeux foliaire. www.walz.com
Hélium de haute pureté (99,999 %)Fournisseur localN/AUtilisé pour le conditionnement des cartouches d'adsorbant et pour la désorption thermique en GC-MS. www.airliquide.com (ou fournisseur équivalent).
Étalon de calibration de l'isoprèneSigma-Aldrich Chemie GmbHPersonnaliséÉtalon de calibration personnalisé de l'isoprène (3,43 ppm). www.sigmaaldrich.com
Mastic d'étanchéité à faibles émissionsFournisseur localN/AUtilisé pour sceller le point d'insertion du coupeur dans la chambre.
Cartouche adsorbante en acier inoxydable à lit multipleSupelcoPersonnaliséLongueur de 10,5 cm × diamètre intérieur de 3 mm ; chargée avec Carbotrap C (0,2 g, 20–40 mesh), Carbopack B (0,1 g, 40–60 mesh) et Carbotrap X (0,1 g, 20–40 mesh). Utilisée pour l'identification facultative hors ligne des COV par GC-MS. www.sigmaaldrich.com
Pompe portable de prélèvement d'air à débit constantSKC Inc.210-1003MTXPompe portable de prélèvement d'air à débit constant.
Spectromètre de masse PTR-TOF 8000Ionicon Analytik GmbHPTR-TOF 8000Détection des COV. www.ionicon.com
Fil de brasure argentéeFournisseur localN/AUtilisé pour fixer une lame de rasoir à une tige en acier inoxydable.
Feuille de laiton ressort (épaisseur 0,2 mm)Fournisseur localN/ASoutiens flexibles utilisés pour fixer le coupeur.
Tige en acier inoxydable (diamètre 1 mm)Fournisseur localN/ATige de support du coupeur.
Aiguille de seringue en acier inoxydable (diamètre extérieur 1,6 mm)Fournisseur localN/ALogement pour une lame de coupe rotative.
Bouchons en téflonFournisseur localN/AUtilisés pour sceller le logement du coupeur tout en permettant la rotation.
Connecteur en téflon en forme de TFournisseur localN/AInstallé près de la sortie de la chambre pour réduire la longueur du tube.
Tuyau en téflon (FEP ou PTFE)Fournisseur localN/ALigne d'échantillonnage des COV entre la chambre et les détecteurs.
Mélange gazeux d'étalonnage des COVIonimed GmbHPersonnalisé1 ppm de chaque composé dans N2 ; utilisé pour l'étalonnage du PTR-TOF-MS. www.ionimed.com

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