Article de méthode

Microinjection d’interleukine-6 dans le sang des larves de sous-zèbre TSC pour étudier les comportements similaires à des troubles neuropsychiatriques

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DOI :

10.3791/71524

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26 juin 2026

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1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

Dans cet article

Résumé

Pour modéliser comment les signaux inflammatoires influencent le neurodéveloppement chez des organismes génétiquement sensibles, nous présentons un protocole pour microinjecter l’IL-6 dans le canal de Cuvier (veine cardinale commune) des larves de poisson-zèbre, permettant une induction contrôlée de l’inflammation et une évaluation de son impact développemental dans le contexte du complexe de la sclérose tubéreuse (TSC).

Résumé

Les patients atteints de complexe de sclérose tubéreuse (mutations TSC1/TSC2) présentent une expressivité variable du trouble du spectre autistique (TSA), et l’activation immunitaire maternelle est connue pour augmenter le risque de TSA. L’interleukine-6 (IL-6) est une cytokine pléiotrope ayant des rôles bien établis dans la régulation immunitaire, l’inflammation et les processus neuroinflammatoires. Il est produit par plusieurs types de cellules immunitaires en réponse à une infection ou à une lésion tissulaire, et est couramment caractérisé comme un médiateur pro-inflammatoire. Notamment, l’IL-6 peut traverser la barrière hémato-encéphalique et a été impliquée dans des troubles neuropsychiatriques liés à l’inflammation et à l’inflammation, notamment le trouble du spectre autistique (TSA) et la déficience intellectuelle (DI). Ici, nous décrivons un protocole pour induire une signalisation inflammatoire systémique chez le poisson-zèbre en injectant de l’IL-6 dans la circulation sanguine par injection dans le canal de Cuvier. Cette approche permet des réponses inflammatoires contrôlées et reproductibles pour étudier les changements causés par l’inflammation au début du développement. Le protocole détaille les étapes essentielles pour la préparation de l’IL-6, la microinjection et les applications expérimentales en aval dans des modèles de maladies et de neuroinflammations du poisson-zèbre, incluant des études visant à sonder les interactions gène-environnement. En permettant une induction contrôlée de la signalisation inflammatoire systémique, cette approche offre une plateforme polyvalente pour examiner comment la susceptibilité génétique et les expositions inflammatoires s’entrecroisent pour façonner les résultats développementaux.

Introduction

Comprendre comment les signaux inflammatoires façonnent le développement précoce du neurodéveloppement est essentiel pour disséquer les mécanismes sous-jacents aux troubles neurodéveloppementaux, en particulier dans des contextes génétiquement sensibles. L’objectif principal de ce protocole est de fournir une approche précise et reproductible pour induire une signalisation inflammatoire systémique chez les larves de poisson-zèbre par microinjection directe d’interleukine-6 (IL-6) dans le canal de Cuvier (la veine cardinale commune).

Le complexe de sclérose tubéreuse (TSC) illustre ces interactions gène-environnement. Le TSC est un trouble génétique rare causé par des mutations de TSC1 ou TSC2, qui codent respectivement pour l’hamartine et la tubérine, des protéines formant un complexe qui supprime normalement la signalisation du mTORC1. La perte de cette inhibition conduit à une hyperactivation de la voie mTORC1, entraînant une croissance cellulaire anormale et un large éventail de manifestations cliniques, dont le trouble du spectre autistique (TSA)1,2. On estime que le TSA touche ~1,5 % des individus ayant un âge moyen de diagnostic de ~3 ans dans les paysdéveloppés 3. Le TSA se caractérise par des comportements répétitifs, des interactions sociales altérées et une flexibilité cognitiveréduite 4, et les patients présentent souvent des difficultés neurocomportementales supplémentaires telles que de l’anxiété, une dépression ou un handicapintellectuel 3. Notamment, 40 % à 60 % des personnes atteintes de TSC présentent des caractéristiques liées auTSA 2, mais la sévérité des symptômes varie considérablement – même chez les patients présentant des mutations similaires – ce qui suggère que des facteurs environnementaux modulent le risque génétiquement causé.

L’un de ces facteurs est l’inflammation. Bien que l’étiologie du TSA reste largement inconnue, la neuroinflammation dans plusieurs régions cérébrales est depuis longtempsimpliquée 5. L’augmentation des preuves précliniques et cliniques indique que la neuroinflammation fœtale déclenchée par l’activation immunitaire maternelle (MIA) et l’élévation résultante de la signalisation des cytokines peuvent contribuer de manière significative à la pathogenèse duTSA 6. Ainsi, la modélisation de l’exposition aux cytokines inflammatoires dans des systèmes génétiquement sensibles, tels que le TSC, fournit un cadre puissant pour sonder comment les signaux immunitaires intersectent la régulation perturbée du mTORC1 afin d’influencer le développement précoce du cerveau.

La raison d’être du développement de ce protocole découle de la reconnaissance croissante que l’inflammation médiée par les cytokines, y compris la signalisation de l’IL-6, peut interagir avec des vulnérabilités génétiques pour influencer les trajectoires neurodéveloppementales. Les cytokines sont des glycoprotéines de faible poids moléculaire qui coordonnent la communication au sein du système immunitaire. Chez le TSA, plusieurs études ont constamment rapporté des niveaux élevés de cytokines pro-inflammatoires, y compris l’IL-6 dans le sangpériphérique 7,8,9,10, soutenant l’hypothèse selon laquelle une signalisation déréglée de l’IL-6 pourrait contribuer aux caractéristiques neurodéveloppementales et comportementales caractéristiques du trouble. L’IL-6 est un médiateur clé de l’activation immunitaire produite par divers types de cellules immunitaires en réponse à une infection ou à des lésions tissulaires. Parce que l’IL-6 peut traverser la barrière hémato-encéphalique et influencer directement les neurones, les astrocytes et les microglies, une élévation soutenue de cette cytokine a été impliquée dans l’altération des voies neurodéveloppementales, de la plasticité synaptique et de l’homéostasie neuro-immune – des mécanismes de plus en plus explorés dans la physiopathologie duTSA 11,12. Ces liens sont renforcés par des études sur les MIA, où une IL-6 maternelle élevée pendant la grossesse perturbe le développement cérébral fœtal et augmente le risque lié auTSA 13. Cependant, les modèles vertébrés existants reposent souvent sur une stimulation immunitaire systémique via des molécules associées aux agents pathogènes ou des paradigmes d’exposition maternelle, ce qui peut introduire de la variabilité, activer simultanément plusieurs voies immunitaires et limiter la capacité à isoler la contribution spécifique de l’IL-6. La microinjection directe d’IL-6 chez le poisson-zèbre surmonte ces limites en permettant la manipulation ciblée d’une seule cytokine au sein d’un organisme transparent et génétiquement manipulable.

Le poisson-zèbre offre plusieurs avantages pour étudier les effets du développement liés aux cytokines. Leur transparence optique permet la visualisation en temps réel des réponses immunitaires et neuronales ; leur développement rapide permet des expérimentations à haut débit ; et leurs voies de signalisation cytokines conservées en font un modèle vertébré puissant pour disséquer les mécanismes inflammatoires 14,15,16,17,18. Dans les études expérimentales, il est nécessaire d’injecter des matériaux exogènes (bactéries, cellules cancéreuses, ADN, nanoparticules, etc.) dans les larves de poisson-zèbre. Une approche consiste à exposer les larves à une solution contenant le matériau d’intérêt, permettant une absorption passive par la peau, les branchies ou le tractus gastro-intestinal. La deuxième méthode, plus directe, est la microinjection, dans laquelle des matériaux externes sont injectés dans des compartiments embryonnaires ou larvaires spécifiques à l’aide d’aiguilles fines en verre 19,20,21. Il est important de noter que la microinjection dans le canal de Cuvier offre une voie fiable pour la délivrance systémique, assurant une distribution rapide de l’IL-6 dans la circulation sans les effets de confusion de la stimulation immunitaire des organismes entiers.

Dans ce protocole, nous présentons une procédure étape par étape allant de la préparation des seringues d’injection à l’injection d’IL-6 dans la circulation sanguine via le canal de Cuvier des larves de poisson-zèbre à 2 et 3 jours après la fécondation (DPF). Cette méthode est particulièrement utile pour les chercheurs qui étudient comment des signaux inflammatoires spécifiques influencent les processus précoces de développement, les interactions gène-environnement dans des modèles de troubles neurodéveloppementaux ou immunitaires, les conséquences cellulaires et moléculaires de l’exposition in vivo aux cytokines, ou l’interaction entre mutations génétiques et voies de signalisation inflammatoire. En proposant une approche contrôlée, spécifique aux cytokines et précisément sur le plan du développement, ce protocole offre une plateforme polyvalente pour sonder les mécanismes par lesquels l’IL-6 et les signaux immunitaires associés façonnent les résultats précoces du système immunitaire, neuronal et comportemental.

Protocole

Pour la procédure décrite ici, la lignée tsc2 vu242/+ poisson-zèbre a été utilisée22,23. Toutes les expériences réalisées ont été menées conformément à toute la législation pertinente, et aucune approbation supplémentaire du comité d’éthique n’est requise spécifiquement parce que le stade de développement utilisé (<5 dpf) échappe à la portée de l’examen éthique obligatoire. La figure 1 présente un schéma du protocole.

1. Extraction des micropipettes

  1. Préparez des aiguilles de microinjection à partir de capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur de micropipette, en suivant les procéduresétablies 24.
  2. Utilisez des capillaires en verre borosilicate de 10 cm de long (diamètre extérieur de 1,0 mm, paroi fine) et chargez-les dans un extracteur de micropipette.
  3. Positionnez soigneusement le capillaire à l’intérieur du chariot de tirage, en assurant un alignement précis dans la rainure désignée, et fixez-le fermement à l’aide des pinces d’instruments pour éviter tout mouvement lors de la tirage.
  4. Ajustez le capillaire pour qu’il soit centré dans le filament chauffant, assurant un chauffage uniforme le long de la région à tirer pour une formation cohérente de l’aiguille.
  5. Lancer le programme de tirage en utilisant des paramètres optimisés (par exemple, pour un instrument Sutter, utiliser chaleur : 533, tirage : 50, vitesse : 60, délai : 90, et pression : 200) pour générer des aiguilles de microinjection à pointe fine.
    ATTENTION : Les microaiguilles extraites de capillaires en verre sont fragiles et peuvent facilement se fissurer, obstruer ou former des formes irrégulières des pointes qui modifient le volume d’injection. Inspectez chaque aiguille sous un stéréomicroscope avant utilisation, évitez de toucher la pointe aux surfaces dures, et remplacez immédiatement les aiguilles si une résistance, une fuite ou une taille de gouttelette irrégulière est observée.
    REMARQUE : Après le processus d’extraction, des pointes d’aiguille effilées se forment aux deux extrémités du capillaire. Avant utilisation, la pointe doit être délicatement ouverte en la cassant délicatement avec une pince fine sous un stéréomicroscope pour obtenir la taille d’ouverture souhaitée pour la microinjection.

2. Préparation des tampons et de la solution de type stock

  1. Préparez une solution d’origine à 60× de milieu embryonnaire E3 (voir Tableau 1). Stériliser la solution par autoclavage et la conserver à 4 °C. Pour l’utilisation, diluez la solution d’origine dans de l’eau ultrapure afin d’obtenir une solution de travail de 1× E3.
    REMARQUE : 60 × solution d’embryon E3 peut être stockée à 4 °C pour un stockage à long terme.
  2. Préparez une solution standard 20x de tricaïne (MS-222) comme décrit dans le Tableau 1. Conservez la solution à 4 °C dans l’obscurité pour éviter la dégradation. Avant utilisation, diluez à 1× concentration de travail dans le milieu E3.
    REMARQUE : Ajustez le pH de la solution de tricaïne à 7,5 en utilisant 1 M de pH Tris 9,0. Cette solution peut être aliquotée et conservée à -20 °C (congelée) pour un stockage à long terme ou stockée à 4 °C. La tricaïne se dégrade à la RT et sous la lumière pour devenir un composé toxique.
    ATTENTION : Une attention particulière doit être portée lors de l’utilisation de tricaïne (MS-222) pour l’anesthésie, car la sous-exposition et la surexposition peuvent nuire à la physiologie et au comportement larvaires. Une exposition excessive peut déprimer la fonction cardiaque et modifier le comportement ultérieur, tandis qu’une anesthésie insuffisante augmente le risque de blessure lors de la montée. Utilisez uniquement la concentration et la durée efficaces minimales, et laissez une récupération complète dans un milieu embryonnaire frais avant les tests comportementaux.
  3. Préparez une solution d’agarose à 1 % (p/v) dans un milieu E3 en chauffant jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
    REMARQUE : Si préparée à l’avance, la solution peut être stockée à 4 °C et réchauffée avant utilisation. Le jour de l’expérience, maintenir l’agarose à l’état liquide à 55–60 °C pour éviter une solidification prématurée.
  4. Préparez une solution de NaCl à 0,9 % (p/v) et conservez-la à température ambiante jusqu’à 1 semaine ou à 4 °C pour un stockage prolongé. Avant utilisation, équilibrez la solution à température ambiante ou étouffez à 28,5 °C pour correspondre aux conditions physiologiques des embryons.
  5. Préparez une solution IL-6 2 pg/nL en 0,9 % de NaCl. Aliquote la solution permet d’éviter les cycles répétés de gel-dégel et de stockage à -20 °C. Avant utilisation, décongelez et amenez l’aliquot à température ambiante.
  6. Préparez une solution de travail de pronase à 0,5 mg/mL dans un milieu E3 à partir d’une solution de bouillon de 20 mg/mL préparée dans de l’eau ultrapure.

3. Obtention et élevage des embryons jusqu’à 2 dpf

  1. Organisez la fraie en groupe en plaçant plusieurs poissons-zèbres adultes TSC2vu242/vu242 dans un bac de frai.
    REMARQUE : Mâles et femelles peuvent être séparés pendant la nuit à l’aide d’un séparateur pour éviter la fraie prématurée, le séparateur étant retiré le lendemain matin pour induire un accouplement synchronisé. Alternativement, les poissons peuvent être maintenus sans séparateur dans un environnement contrôlé par la lumière, où la transition de l’obscurité (nuit) à la lumière (matin) sert de signal de frai.
  2. Le lendemain, retirez le séparateur (si utilisé) et laissez la ponte se poursuivre pendant environ 1 heure.
  3. Collectez rapidement les embryons fécondés et transférez-les dans des boîtes de Petri de 100 mm contenant 40 mL de milieu embryonnaire E3, en maintenant une densité ne dépassant pas ~60 embryons par vase pour assurer un développement optimal.
  4. Incuber les embryons à 28,5 °C selon un cycle diurne contrôlé de 14 h en lumière et 10 h en noir.
  5. À 1 dpf et 2 dpf, examinez les embryons au stéréomicroscope et retirez les embryons morts, les ovules non fécondés et les débris pour maintenir la qualité de la culture.
  6. Remplacez le milieu E3 par une solution fraîche pour minimiser l’accumulation de déchets et soutenir un développement embryonnaire normal.

4. Préparation de plaques d’agarose pour les microinjections et la déchorionation

  1. Préparez une solution d’agarose à 1 % (p/v) dans un milieu E3 et chauffez-la jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute et que la solution devienne claire.
  2. Laissez la solution refroidir brièvement, puis versez environ 30 mL dans une boîte de Petri de 100 mm, assurant une couche uniforme sur la surface.
  3. Tant que l’agarose est encore liquide mais commence à se solidifier, placez délicatement un moule en silicone sur la surface pour créer des rainures uniformes.
    REMARQUE : Ici, des moules en silicone avec des motifs pyramidaux (Figure 2) sont utilisés pour générer des puits capables de retenir l’excès d’E3 lors de la microinjection. Ces puits sont conçus pour fournir une stabilité transitoire lors de la manipulation et de l’injection en maintenant une humidité suffisante pour prévenir la dessiccation et assurer la viabilité de l’embryon pendant plusieurs minutes en dehors des conditions d’incubation standard.
  4. Préparez des boîtes de Petri recouvertes d’agarose pour la déchorionation enzymatique (diamètre de 50 mm) en versant environ 5 mL de solution d’agarose fondue à 1 % (p/v) et en faisant doucement tourner la plaque pour recouvrir uniformément la surface.
  5. Enlève tout excès d’agarose.
  6. Laissez l’agarose solidifier à température ambiante pendant 10 à 15 minutes. Une fois pris, les plats sont prêts à être utilisés dans la déchorionation enzymatique des embryons.

5. Déchorionation enzymatique de 2 poissons dpf

  1. Transférer environ 100 embryons en chorions à 2 dpf dans une petite boîte de Petri (50 mm) recouverte d’agarose.
  2. Retirez autant de milieu E3 que possible pour minimiser la dilution de la solution enzymatique et assurer une déchorionation efficace.
  3. Ajoutez 4 mL de solution pronase fraîchement préparée (concentration d’origine : 20 mg/mL [préparée dans de l’eau ultrapure], concentration de travail : 0,5 mg/mL [diluée en E3]) au plat, afin que les embryons soient complètement immergés.
    ATTENTION : Le traitement par pronase doit être soigneusement contrôlé, car une surdigestion peut endommager les tissus larvaires, entraînant une fragilité accrue lors de la manipulation et pouvant affecter la survie ou le comportement. Utilisez uniquement le temps d’exposition efficace minimal, puis rincez soigneusement les embryons ensuite pour éviter la poursuite de l’activité enzymatique.
  4. Incubez à température ambiante pendant 3 à 5 minutes, en surveillant la libération des chorions sous un stéréomicroscope.
  5. Faites doucement tourner ou faire tourner la plaque de façon intermittente pour faciliter l’élimination enzymatique des chorions. Continuez jusqu’à ce que la majorité des embryons soient libérés de leurs chorions.
    REMARQUE : Assurez-vous que les embryons nus sont toujours immergés dans la solution ; sinon, le sac vitellin peut se rompre, entraînant la mort des embryons.
  6. Une fois la déchorionation atteinte, lavez soigneusement les embryons en les transférant à travers 5 à 6 changements de milieu E3 frais.
    REMARQUE : Assurez-vous que les embryons nus sont toujours immergés dans la solution ; sinon, le sac vitellin peut se rompre, entraînant la mort des embryons.
  7. Veillez à ce que tous les chorions et résidus de pronase soient enlevés afin d’éviter les dommages aux larves et de maintenir des conditions optimales de culture.
  8. Transférer ~50 larves déchorionées dans une boîte de Petri de 100 mm contenant 40 mL de milieu E3 à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
  9. Maintenir les larves dans ces conditions jusqu’à ce qu’elles soient microinjectées.

6. Injection d’embryons de poisson-zèbre

  1. Sous un stéréomicroscope (≥150 × grossissement), utilisez des pinces fines pour casser soigneusement la pointe du capillaire en verre tiré (section 1), générant une micropipette avec une ouverture d’environ 3 μm de diamètre.
    REMARQUE : Une micropipette adaptée peut être reconnue en s’assurant que la pointe est finement ouverte, sans aplatissement visible ni grande surface ouverte à la pointe. Si la pointe est trop cassée, elle ne pénètrera pas efficacement dans la peau du poisson et peut entraîner des injections mauvaises ou irrégulières. Par conséquent, l’ouverture de la pointe doit être effectuée avec soin sous un stéréomicroscope à fort grossissement, afin d’assurer une cassure minimale et contrôlée à l’extrémité du capillaire.
  2. Préparez des solutions d’injection de 0,9 % (v/p) de NaCl (témoin) ou d’IL-6 (2 pg/nL) dans 0,9 % de NaCl et ajoutez 1 μL de bleu de trypan à 0,1 % à chaque 10 μL de solution pour faciliter la visualisation lors de l’injection.
  3. Remplissez la micropipette préparée avec ~3 μL de la solution d’injection à l’aide d’une pointe de microchargeur, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite.
  4. Fixez la micropipette chargée dans le support capillaire (Figure 2) relié au système de microinjection.
  5. Placez une petite goutte d’huile minérale sur une lame d’étalonnage.
  6. Calibrez le volume d’injection en expulsant des gouttelettes dans l’huile minérale et en mesurant leur diamètre à l’aide d’une lame d’étalonnage (Figure 2) à une échelle de 0,01 mm. Ajustez la pression d’injection (entre 300 et 500 hPa) pour obtenir un volume de gouttelettes de ~1 nL.
  7. Ajouter la tricaïne (MS-222) au milieu contenant des larves E3 jusqu’à une concentration finale de 1× pour l’anesthésie. Pour minimiser le stress et assurer une sédation constante, utilisez les larves en petites quantités.
  8. Transférez chaque 2 larve de dpf sur une plaque d’injection d’agarose solidifiée. Plusieurs larves (par exemple, jusqu’à 10) peuvent être positionnées par plat, selon la capacité de manipulation.
  9. Placez la plaque sous le stéréomicroscope. À l’aide d’une pipette en verre, orientez doucement chaque larve de façon à ce que le canal de Cuvier soit clairement visible et accessible.
    REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec plusieurs larves, assurez-vous que la surface de l’agarose reste hydratée en ajoutant périodiquement des gouttes de milieu E3 contenant de la tricaïne (1×) pour éviter la dessiccation.
  10. Positionnez la pointe de la micropipette à l’entrée du canal de Cuvier (comme montré à la Figure 3), identifiable en suivant les globules sanguins se dirigeant vers le cœur sous le stéréomicroscope.
  11. Injecter deux gouttelettes consécutives (~1 nL chacune) de la solution préparée dans le conduit de Cuvier, avec un intervalle d’environ 20 s entre les injections pour permettre une distribution correcte.
  12. Après l’injection, transférez doucement les larves de la plaque agarose dans une nouvelle boîte de Petri de 100 mm contenant 40 mL de milieu E3. Minimisez les contraintes mécaniques lors du transfert.
  13. Retournez les larves à l’incubateur à 28,5 °C pour leur récupération.
  14. Le lendemain (3 dpf), répétez la procédure de microinjection décrite aux étapes 6.8–6.13.
    REMARQUE : Une injection unique ne produit qu’une signalisation de courte durée et aucune réponse comportementale constante, tandis que la seconde injection assure une activation soutenue des voies inflammatoires tout au long de la fenêtre de développement larvaire précoce pertinente pour le neurodéveloppement et provoque des changements comportementaux comme décrit dans la section des résultats représentatifs.
  15. À 5 dpf, utilisez les larves pour des applications en aval, y compris des tests comportementaux, des images cérébrales ou des analyses d’immunofluorescence.

Résultats

Pour évaluer les effets de la microinjection d’IL-6 sur la physiologie et le comportement larvaires, nous avons comparé les larves injectées en IL-6 avec des témoins injectés en NaCl à travers la survie et deux résultats comportementaux couramment utilisés pour évaluer les comportements anxieux et répétitifs chez le poisson-zèbre. La microinjection d’IL-6 n’a pas affecté la viabilité larvaire comparée aux injections de NaCl (Figure 4A). Les taux de survie à 5 dpf étaient indiscernables entre les groupes injectés en IL-6 et injectés en NaCl, indiquant que le schéma de posologie est bien toléré et n’introduit pas de toxicité non spécifique. Les microinjections elles-mêmes réduisent légèrement la viabilité par rapport aux sœurs non injectées, indiquant un impact modeste lié à la manipulation, indépendamment de l’exposition à l’IL-6. Cela confirme que le protocole est adapté aux analyses comportementales en aval.

Pour valider que le paradigme de la microinjection d’IL-6 induit une réponse inflammatoire mesurable à 5 dpf, nous avons quantifié la prostaglandine E2 (PGE2), un médiateur en aval de la signalisation inflammatoire25 entraînée par les cytokines. Les mutants homozygotes tsc2-/- ont montré des niveaux de PGE2 de base élevés même sans injection d’IL-6, significativement supérieurs à ceux de leurs frères et sœurs de type sauvage (WT) tsc2+/+ (Figure 4B). Les mutants hétérozygotes tsc2+/- ont montré une augmentation modeste et non significative de la PGE2 de base par rapport aux larves WT, mais il est important de noter que leurs niveaux de PGE2 ont fortement augmenté après microinjection d’IL-6. Ce schéma est cohérent avec notre objectif de modéliser les interactions gène × environnement : les larves WT restent largement épargnées par une exposition légère et transitoire à l’IL-6, tandis que les mutants TSC2+/- génétiquement sensibles présentent une réponse inflammatoire prononcée.

Conformément à ces différences de tonus inflammatoire dépendantes du génotype, nous avons ensuite examiné si la signalisation induite par l’IL-6 se traduisait par des changements comportementaux mesurables dans le test en champ ouvert. Un test en champ ouvert à 5 dpf (comme décritprécédemment 22) a révélé que les larves mutantes TSC2 présentaient un comportement anxieux accru comparé aux frères et sœurs WT (Figure 4C) ; cependant, les microinjections d’IL6 n’ont pas affecté ce comportement. Plus précisément, les larves de tsc2+/- et tsc2-/- ont passé beaucoup plus de temps dans la zone externe de l’arène et ont montré une exploration du centre réduite par rapport à tsc2+/+, ce qui correspond aux phénotypes liés à l’anxiété établis chez les larves de poisson-zèbre.

Les injections d’IL-6 ont augmenté les schémas de nage répétitifs et stéréotypés, en particulier chez les larves mutantes TSC2+/- (Figure 4D–E), une caractéristique comportementale couramment utilisée comme lecture pertinente pour le TSA dans les modèles26 de poisson-zèbre. La quantification détaillée des boucles répétitives, définies comme trois nages circulaires consécutifs ou plus, a révélé une augmentation significative de la proportion de mutants TSC2+/- injectés en IL-6 présentant ce comportement par rapport aux témoins injectés par NaCl. Cette amélioration sélective de la nage répétitive chez les larves génétiquement sensibles soutient en outre une interaction gène×environnement, dans laquelle une stimulation inflammatoire légère révèle ou amplifie les tendances comportementales de type TSA, spécifiquement dans le contexte mutant tsc2+/-

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Figure 1 : Schéma du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Installation de station de travail à microinjection. Schéma de la station de travail de microinjection utilisée pour les injections larvaires de poisson-zèbre. (1) Micropipette en verre montée sur le support de l’injecteur ; (2) une boîte de Petri recouverte d’agarose avec des puits moulés pour le positionnement larvaire ; (3) huile minérale pour l’étalonnage ; (4) solution bleue de trypan ; (5) tirage des aiguilles en verre ; (6) diapositive d’étalonnage ; (7) extrémités de pipette allongées ; (8) Pipette Pasteur ; (9) Moule en silicone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Injection dans le conduit de Cuvier. (A) Représentation schématique du canal du site d’injection de Cuvier (la veine cardinale commune) chez les larves de poisson-zèbre et des voies locomotrices en champ ouvert représentatives à 5 dpf. (B) Images représentatives du contrôle (non injecté), et des injections de NaCl et d’IL-6. Barre d’échelle : 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Résultats représentatifs de l’interaction gène x environnement utilisant la lignée mutante tsc2. (A) Taux de survie ( %) des larves tsc2 vu242 au cours de l’expérience dans les groupes témoins (non injectés), injectés par NaCl et injectés par IL-6. Les données sont présentées en moyenne ± SEM à 5 dpf (n = 4 réplicés expérimentaux indépendants, chaque génotype × combinaison de traitement contenant 60 à 70 poissons). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’ANOVA suivie du test post hoc de Tukey pour la comparaison par paires. Des différences significatives ont été observées entre les groupes témoins et injectés par IL-6 (p = 0,00150) et entre les groupes témoins et injectés par NaCl (p = 0,00243). (B) Boxplots représentant les niveaux de PGE2 chez les mutants tsc2 et leurs frères et sœurs, mesurés à 5 dpf à l’aide d’un kit d’immunoabsorption enzymatique (ELISA) selon le protocole du fabricant (ANOVA à deux voies pour le génotype : F = 7,4503 ; P = 0,01234). Chaque échantillon contient 20 têtes (les queues étaient utilisées pour le génotypage). Les points dans les boîtes représentent des répliques biologiques. (C) Boxplots des résultats du test en champ ouvert pour les poissons mutants tsc2 montrant le temps relatif passé près des parois pour chaque génotype après les injections de NaCl et IL-6 et pour les témoins non injectés (ANOVA à deux voies pour le génotype : F = 7,021 ; P = 0,00106). Le test en champ ouvert a été réalisé à l’aide d’une chambre d’analyse automatisée (Table of Materials) selon le protocole précédemmentrapporté 22. (D) Figure exemplaire montrant un comportement exploratoire aléatoire après injection de NaCl et des boucles répétitives après injections d’IL-6. (E) Boxplots représentant le nombre d’animaux présentant des comportements de boucle normaux et répétitifs pour chaque génotype tsc2 après injection de NaCl ou IL-6 et pour les poissons témoins non injectés (ANOVA à deux voies pour le génotype : F = 5,7615 ; P = 0,005849). Trois réplications expérimentales indépendantes, chaque génotype × combinaison de traitement contenant 60 à 70 poissons, ont été utilisées pour cela. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Solution d’origine 60 x E3
RéactifConcentration finaleMontant
NaCl297 mM17,4 g
KCl10,7 mM0,8 g
CaCl219,6 mM2,18 g
MgCl 2,6H 2O24 mM4,89 g
UltrapureH 2ON/Aremplir jusqu’à 1 L
TotalN/A1 L
Solution de crosse tricaïne
RéactifConcentration finaleMontant
Tricaine15,3 mM1 g
1 M Tris-HCl pH 921 mM5,25 mL
UltrapureH 2ON/A244,75 mL
TotalN/A250 mL

Tableau 1 : Composition des solutions E3 et Tricaïne.

Discussion

Comme prévu, les mutants homozygotes TSC2 ont montré des niveaux de base élevés de type anxiété, cohérents avec les phénotypes22,27 rapportés précédemment. Comme ces larves présentent déjà de graves anomalies comportementales, l’injection d’IL-6 n’a pas aggravé davantage leur phénotype. En revanche, les hétérozygotes tsc2 ont montré des changements clairs induits par l’IL-6. Cette sensibilité sélective met en lumière l’utilité de ce protocole pour sonder les interactions gène × environnement, où une signalisation inflammatoire légère mais prolongée interagit avec une vulnérabilité génétique sous-jacente pour influencer les résultats neurocomportementaux.

L’exposition au LPS reste le paradigme d’inflammation le plus largement utilisé chez le poisson-zèbre et produit de manière fiable une réponse immunitaire large et robuste, caractérisée par une forte induction de cytokines pro-inflammatoires, le recrutement de cellules immunitaires innées et une mortalité dépendant dela dose 28. Bien que puissant, le LPS active simultanément plusieurs voies de récepteurs de type Toll 28,29,30, rendant difficile l’isolement de la contribution des cytokines individuelles aux effets neurodéveloppementaux en aval. En revanche, le protocole de microinjection d’IL-6 décrit ici offre une approche ciblée et contrôlée en élevant une seule cytokine connue pour être centrale dans l’activation immunitaire maternelle. Il est important de noter que les injections d’IL-6 n’augmentent pas la mortalité par rapport aux témoins injectés par NaCl, permettant d’examiner les phénotypes comportementaux et moléculaires sans confondre la toxicité. De plus, la microinjection d’IL-6 produit un signalement inflammatoire spécifique en aval, comme le démontrent des niveaux élevés de PGE2, et induit des changements comportementaux mesurables – en particulier une augmentation de la nage répétitive chez les larves hétérozygotes TSC2 – où la susceptibilité génétique interagit avec l’exposition aux cytokines. Ensemble, ces distinctions soulignent que, tandis que le LPS modélise l’activation immunitaire globale, la microinjection d’IL-6 permet une dissection précise des mécanismes spécifiques aux cytokines pertinents au risque neurodéveloppemental.

Les résultats représentatifs présentés ici illustrent les effets de l’IL-6 dans un contexte de mutant tsc2, mais le protocole lui-même est largement applicable. La méthode peut être facilement mise en œuvre dans des larves de type sauvage ou d’autres modèles génétiques pour étudier comment des signaux inflammatoires définis s’entrecroisent avec divers contextes génétiques lors du développement neurologique précoce. Pour des applications au-delà du modèle TSC2, nous recommandons de déterminer empiriquement la dose optimale d’IL-6, car la sensibilité aux cytokines et les seuils inflammatoires peuvent varier selon les génotypes et les objectifs expérimentaux.

Une considération technique clé dans ce protocole est la constance du volume d’injection, car les effets biologiques de l’IL-6 dépendent d’une délivrance précise d’environ 1 nL par injection. La variabilité de la taille des gouttelettes provient souvent de différences d’ouverture de l’aiguille ou de la pression d’injection. Si les gouttelettes sont trop petites, augmenter progressivement la pression ou élargir légèrement la pointe de l’aiguille à fort grossissement rétablit généralement un flux adéquat. Inversement, les gouttelettes qui dépassent le volume prévu indiquent généralement que l’ouverture de l’aiguille est trop large, auquel cas il faut réduire la pression ou préparer une nouvelle aiguille avec une pointe plus étroite. Maintenir des volumes d’injection précis est essentiel, car les écarts peuvent modifier la charge inflammatoire et compromettre la reproductibilité. Parfois, les utilisateurs peuvent se retrouver dans des situations où aucune solution n’est éliminée de l’aiguille. Cela est le plus souvent dû à des bulles d’air, des débris ou des blocages au bout de l’aiguille. Inspecter l’aiguille sous un stéréomicroscope et vérifier le système d’injection pour détecter des fuites ou des connexions lâches résout généralement le problème. Garantir une pointe d’aiguille propre et sans obstruction est essentiel pour une livraison régulière et pour éviter une accumulation de pression qui pourrait endommager les larves.

Un autre facteur important est la tolérance physiologique du volume injecté. Les larves tolèrent généralement ~1 nL bien, mais des volumes plus importants peuvent augmenter la mortalité, en particulier lorsque plusieurs injections sont effectuées sur plusieurs jours consécutifs. Pour les expériences nécessitant des dosages répétés, il est crucial de minimiser le stress mécanique, de laisser un temps de récupération suffisant entre les injections, et d’ajuster la concentration d’IL-6 plutôt que de volume afin d’atteindre la dose souhaitée. Ces considérations contribuent à garantir que les phénotypes observés reflètent l’exposition aux cytokines plutôt que les dommages liés à l’injection.

Enfin, la mortalité liée aux injections peut varier considérablement selon l’expérience de l’utilisateur. Alors que les utilisateurs expérimentés atteignent généralement des taux de mortalité proches de 5 %, les utilisateurs inexpérimentés peuvent observer des taux allant jusqu’à 50 %. La plupart des pertes proviennent de dommages mécaniques lors du montage, d’un mauvais placement de l’aiguille ou d’une perforation accidentelle du sac vitellin ou des tissus environnants. Pratiquer la procédure sur des larves de type sauvage avant de commencer les injections expérimentales améliore grandement la régularité et réduit la mortalité. Un bon positionnement des larves pour visualiser clairement le canal de Cuvier, combiné à une manipulation douce lors du montage et de la récupération, minimise encore les dommages procéduraux.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Kevin Ess et Lilianna Solnica-Krezel (Université Vanderbilt) pour le poisson tsc2vu242/+ et le ZCF IIMCB pour son aide avec les poissons adultes. Ce travail a été soutenu par la subvention SONATA BIS n° 2023/50/E/NZ3/00252, une subvention accordée à JZ du Centre National des Sciences, Pologne.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (calcium chloride)Chempur118748703
Callibration Slide (1/100 mm)Bresser5916710
Capillary holder (Grip head set 4 size 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGConcentration en stock : 10 µg/mL, Concentration de travail : 2 pg/nL (dilué dans 0,9% de NaCl)
Injector pump FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (potassium chloride)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (magnesium chloride hexahydrate)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorfEPE 5242956003
Microscope Leica M165 FC 1983 magnificationLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Mineral oilSigma-AldrichM5904
NaCl (sodium chloride)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1GConcentration en stock : 20 mg/mL (préparé dans de l'eau ultrapure), Concentration de travail : 0,5 mg/mL (dilué dans E3)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris baseCarl Roth4855.3
Trypan BlueThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox extension - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxChambre d'analyse automatisée

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