Ce protocole décrit une méthode LAMP basée sur une puce microfluidique entièrement intégrée, permettant la détection au point d'intervention de 15 pathogènes responsables d'infections respiratoires basses chez les patients en soins intensifs en moins d'une heure.
Article de méthode
Détection rapide au point d'intervention des agents pathogènes responsables des infections des voies respiratoires inférieures chez les patients en unité de soins intensifs
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les infections des voies respiratoires inférieures (IVRI) figurent parmi les principales causes de détérioration clinique et de décès chez les patients gravement malades. En unité de soins intensifs (USI), l'identification rapide de l'agent pathogène responsable est essentielle pour une antibiothérapie appropriée ; toutefois, les méthodes conventionnelles de culture nécessitent de 3 à 5 jours et présentent des taux de positivité sous-optimaux, en particulier pour les champignons. Les approches moléculaires telles que la PCR réduisent le délai d'analyse, mais dépendent encore de l'extraction manuelle des acides nucléiques et du thermocyclage, ce qui limite leur utilisation au chevet du patient. Ce protocole décrit un flux de travail au point d'intervention basé sur une puce microfluidique entièrement intégrée, de forme disque (puce CD), qui associe une purification des acides nucléiques par billes magnétiques à une amplification isotherme en boucle (LAMP). Après une étape simplifiée de liquéfaction et de lyse manuelle, l'échantillon traité est chargé sur la puce, accompagné de deux flacons de réactifs préemballés. L'appareil effectue ensuite de manière autonome l'extraction, l'amplification à 65 °C et la détection en temps réel par fluorescence, fournissant des résultats qualitatifs pour 15 cibles, à savoir 11 bactéries, 3 champignons et 1 agent pathogène atypique, en 45 minutes de temps de fonctionnement de l'appareil (environ 1 heure pour l'ensemble du processus de l'échantillon au résultat, y compris l'étape préliminaire manuelle). Nous présentons des données de détection provenant de 10 échantillons prélevés en USI, incluant des crachats, des aspirations bronchiques et des lavages broncho-alvéolaires, couvrant à la fois des infections monomicrobiennes et des co-infections polymicrobiennes impliquant jusqu'à 7 micro-organismes sur une seule puce. La conception fermée de la cartouche minimise le risque de contamination par aérosols, et l'étape unique de chargement ne nécessite aucune formation spécialisée, positionnant ainsi ce système comme un outil diagnostique pratique au chevet du patient pour les équipes d'USI.
Introduction
Chez les patients gravement malades en unité de soins intensifs (USI), les infections des voies respiratoires inférieures, dont la pneumonie associée à la ventilation mécanique (PAV) est la principale cause, restent un facteur persistant de morbidité, de ventilation mécanique prolongée et de mortalité excessive1,2. Le paysage microbiologique des infections des voies respiratoires inférieures (IVRI) acquises en USI diffère nettement de celui des maladies communautaires. Les bacilles à Gram négatif multirésistants (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) prédominent, souvent dans des constellations polymicrobiennes qui compliquent les schémas thérapeutiques empiriques3,4. Les champignons opportunistes ajoutent une complexité supplémentaire. L'aspergillose pulmonaire invasive, autrefois considérée comme une manifestation caractéristique d'une immunosuppression profonde, est désormais diagnostiquée de plus en plus fréquemment chez des patients en USI non neutropéniques, notamment après une grippe sévère ou une infection à COVID-195. Les algorithmes diagnostiques actuels de l'aspergillose associent une culture peu sensible au test de détection de l'antigène galactomannane (GM), mais le test GM présente des limites bien documentées en termes de fenêtre diagnostique et de sensibilité variable chez les hôtes non neutropéniques6. Chaque heure de retard dans l'initiation d'un traitement antimicrobien approprié pour un sepsis s'accompagne d'une augmentation mesurable de la mortalité7. Pris ensemble, la rapidité et la complexité des infections en USI exigent des outils diagnostiques capables de répondre à l'urgence clinique.
La culture microbienne classique, bien qu'indispensable pour les tests de sensibilité, est fondamentalement limitée par sa vitesse : le délai d'obtention des résultats s'étend sur 3 à 5 jours, les micro-organismes exigeants sont souvent manqués, et le taux de positivité des cultures fongiques reste faible8. Le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS) offre une alternative non biaisée, mais son adoption clinique est freinée par le coût, des délais de traitement de 24 à 48 heures, la dépendance à des pipelines de bioinformatique, et une faisabilité limitée au point d'intervention9. Les panneaux basés sur la PCR ont réduit l'écart temporel, mais ils nécessitent encore une extraction d'acides nucléiques en plusieurs étapes, un équipement pour cyclage thermique, et, dans les formats conventionnels, une électrophorèse post-amplification10. Aucune de ces plateformes ne répond pleinement aux exigences convergentes des soins intensifs : rapidité inférieure à une heure, temps de manipulation minimal, détection multiplexée des agents pathogènes incluant les champignons, et simplicité d'utilisation suffisante pour du personnel non spécialisé en laboratoire.
L'amplification isototherme médiée par boucle (LAMP) permet de surmonter plusieurs de ces contraintes. Décrite pour la première fois par Notomi et al., cette méthode amplifie l'ADN cible à une température constante de 65 °C à l'aide d'un ensemble de quatre à six amorces reconnaissant six régions distinctes, grâce à une polymérase à déplacement de brin11. La réaction produit des structures d'amplicons caractéristiques en forme de tige-boucle et de type « chou-fleur », détectables par fluorescence en temps réel, générant des courbes en forme de S quelques minutes après le franchissement du seuil. La sensibilité à de faibles concentrations de matrice est élevée, et la conception multiprimers confère une sélectivité qui limite les faux positifs12,13. Lorsqu'elle est couplée à des plateformes de puces microfluidiques, la LAMP peut être parallélisée pour plusieurs cibles à partir d'une seule charge d'échantillon14. Des travaux antérieurs ont démontré que les systèmes de puces LAMP détectent des pathogènes respiratoires avec un temps de traitement nettement inférieur à trois heures15. Une limitation majeure de ces systèmes réside toutefois dans leur dépendance vis-à-vis d'une extraction manuelle séparée de l'ADN, ce qui augmente la durée d'analyse, la complexité opérationnelle et le risque de contamination.
Le système décrit ici élimine ce goulot d'étranglement. Conçu autour d'une cartouche microfluidique jetable en forme de disque (86 mm de diamètre), il intègre dans un seul et même dispositif scellé la mise en charge de l'échantillon, la purification des acides nucléiques par billes magnétiques et l'amplification LAMP en 16-plex (Figure 1). L'opérateur effectue uniquement une courte étape manuelle de liquéfaction-lyse à l’aide d’un tube de traitement spécialement conçu, puis charge le lysat et deux flacons de réactifs sur la puce (Figure 2). À partir de ce moment, l'appareil prend en charge de façon autonome l'extraction, l'amplification isotherme à 65 °C et l'acquisition de la fluorescence, fournissant en moins de 45 minutes des résultats qualitatifs pour 15 cibles cliniquement pertinentes, à savoir 11 bactéries, 3 champignons (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) et un agent pathogène atypique (Mycoplasma pneumoniae). Un gène de la famille des points de cassure du neuroblastome (NBPF), utilisé comme témoin interne, permet de valider la qualité de l'échantillon et l'intégrité de la réaction dans chaque test. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour l'ensemble du processus, depuis la collecte de l'échantillon en réanimation jusqu'au prétraitement, au chargement de la puce, à la détection automatisée et à l'interprétation des résultats, à l’intention du personnel de laboratoire clinique et des équipes de soins intensifs.
Protocole
Tous les échantillons ont été prélevés dans le cadre d'un protocole approuvé par le Comité d'éthique du Peking Union Medical College Hospital, Académie chinoise des sciences médicales (n° d'approbation : I-24PJ1778). Un consentement éclairé écrit a été obtenu auprès de chaque participant ou de leur représentant légalement habilité avant le prélèvement des échantillons. Le panel de pathogènes ciblés et les attributions des puits de réaction sont indiqués dans le Tableau 1, et les consommables utilisés lors du prétraitement des échantillons sont répertoriés dans le Tableau 2.
1. Prélèvement d'échantillons cliniques provenant du tractus respiratoire inférieur en unité de soins intensifs
- Prélèvement de crachats
- Rincer la cavité buccale avec de l'eau propre ou une solution saline physiologique stérile trois fois afin d'éliminer les résidus alimentaires et la flore orale commensale.
- Demander au patient de prendre deux à trois respirations profondes, puis de tousser vigoureusement pour expulser un crachat profond directement dans un récipient stérile de collecte.
REMARQUE : Un prélèvement acceptable consiste en un matériel visqueux, purulent ou strié de sang provenant de la région située sous la trachée ; une salive claire ou un écoulement post-nasal ne conviennent pas et peuvent compromettre la détection en aval.
- Prélèvement de l'aspirat bronchique (BAS)
- Chez les patients non intubés, introduire un cathéter d'aspiration stérile (cathéter de 10 à 12 Fr, l'aspiration étant réglée à une pression de −0,0267 MPa, équivalente à −200 mmHg) par voie nasale ou orale jusqu'à une profondeur d'environ 30 cm.
- Appliquer une aspiration tout en faisant tourner le cathéter et retirer lentement le cathéter. Recueillir les sécrétions aspirées dans un piège stérile pour échantillon.
REMARQUE : Si les sécrétions sont peu abondantes, instillez environ 5 mL de sérum physiologique stérile par le cathéter avant l'aspiration. - Pour les patients sous ventilation mécanique, sélectionner le cathéter d'aspiration en fonction de la taille du tube endotrachéal : utiliser un cathéter de 10 Fr pour un tube de 7,0 à 7,5 mm et un cathéter de 12 Fr pour un tube de 8,0 mm.
- Préoxygénez le patient avec de l'oxygène à 100 % pendant 30 à 60 secondes avant d'effectuer l'aspiration. Débranchez le circuit du ventilateur et insérez le cathéter sélectionné par l'intermédiaire de la voie aérienne artificielle jusqu'à ce qu'une résistance soit rencontrée.
- Appliquer une pression négative de −0,0267 MPa (équivalente à −200 mmHg), en limitant chaque passage d'aspiration, et donc la durée de déconnexion du ventilateur, à 15 s maximum afin de minimiser la derecrutement et l'hypoxémie, puis réoxygéner le patient avec 100 % d'oxygène pendant 30 à 60 s après l'aspiration.
- Instillez 1 à 2 mL de sérum physiologique stérile à travers le cathéter et attendez 3 s.
- Appliquer une aspiration et retirer le cathéter. Recueillir les sécrétions aspirées dans un piège à échantillons stérile. Reconnecter immédiatement le circuit du ventilateur après la collecte de l'échantillon.
REMARQUE : La technique aseptique stricte est essentielle tout au long du processus afin d'éviter toute contamination nosocomiale de l'échantillon.
- Prélèvement du liquide de lavage bronchoalvéolaire (LLBA)
- Identifier le segment cible sur l'imagerie thoracique. Introduire le bronchoscope et le positionner en bouchon dans la bronche segmentaire ou sous-segmentaire appropriée.
- Instillez rapidement des aliquotes de 20 à 50 mL de sérum physiologique stérile, en 3 à 5 aliquotes (60 à 120 mL au total). Appliquez une aspiration douce après chaque aliquote, puis recueillez le liquide récupéré dans un récipient stérile et hermétiquement fermé.
ATTENTION : Une surveillance continue de l'hémodynamique et de la ventilation est obligatoire pendant la LBA chez les patients en soins intensifs. Ajuster les paramètres du ventilateur en fonction des besoins pour les sujets sous ventilation mécanique.
REMARQUE : Le taux de récupération typique est de 40 à 60 % du volume instillé. Un faible retour peut nécessiter un repositionnement de l'extrémité du bronchoscope.
2. Liquéfaction et lyse des agents pathogènes
- À l’aide de la pipette jetable n°2, aspirez l’échantillon jusqu’à la ligne marquée (environ 1 mL) et délivrez-le dans le tube de liquéfaction. Pressez plusieurs fois la poire de la pipette pour transférer tout le matériau visqueux, puis fermez le tube avec son bouchon.
NOTE : Pour le LBA ou les crachats aqueux, chargez deux volumes de pipette afin de garantir une quantité suffisante de pathogène. - Agitez vigoureusement le tube de liquéfaction à la main pendant 1 minute. Examinez visuellement l’échantillon et poursuivez l’agitation jusqu’à ce qu’il ne reste aucun agrégat de mucus visible et que l’échantillon s’écoule librement à travers la pipette jetable n°1 sans résistance (consistance homogène, semblable à celle de l’eau). Agitez pendant au moins 1 minute, en prolongeant le temps si nécessaire pour les échantillons très visqueux, jusqu’à atteindre ces critères.
- Ouvrez le bouchon de scellage du tube de lyse.
- Aspirez environ 0,5 mL de l’échantillon homogénéisé à l’aide de la pipette jetable n°1 et délivrez l’échantillon dans le tube de lyse.
- Fermez le bouchon de scellage et vérifiez que le bouchon du bout est bien serré.
- Insérez le tube de lyse dans le dispositif de prétraitement des échantillons (dispositif SP), en appuyant vers le bas jusqu’à ce qu’il soit bien en place. Appuyez sur Démarrer.
- Laissez le dispositif SP achever le cycle automatisé de liquéfaction-lyse (paramètres indiqués dans le Tableau 3), d’une durée d’environ 15 minutes.
NOTE : Ne pas ouvrir ni retirer le tube pendant le traitement.
3. Chargement de la puce et détection automatisée
- Chargement des réactifs et des échantillons
- Retirer la puce CD de 4 °C stockage et équilibrez-le à température ambiante (environ 25 °Cpendant 10 min.
REMARQUE : Les flacons de réactifs O et B et le lysat prétraité sont utilisés à température ambiante ; l'amplification LAMP sur puce est réalisée à 65 °C (voir étape 3.2.3 et Tableau 3). - Ouvrir le sachet en aluminium et placer la puce sur une surface plane.
- Tournez le capuchon dans le sens inverse des aiguilles d'une montre pour ouvrir la puce.
- Frapper doucement le flacon O pour faire descendre le liquide au fond du flacon.
- Ouvrir le flacon O, insérer la buse dans le port O et verser la totalité du contenu dans le port.
- Jeter le flacon O. Répéter la procédure en utilisant le flacon B et le port B.
- Retirer le tube de lyse traité du dispositif SP et enlever le bouchon de l'embout.
- Aligner l'embout du tube avec le port S et verser tout le volume de lysat dans la puce.
- Jeter le tube de lyse utilisé.
- Tournez le bouchon de la puce dans le sens horaire jusqu'à ce que deux clics audibles confirment un scellement complet.
REMARQUE : Un chargement incomplet d'un port quelconque peut entraîner des défaillances au niveau de canaux individuels. Vérifiez que la distribution est complète avant de sceller. Pour éviter un scellement incomplet et les risques de contamination, ne portez pas de gants en polyéthylène (PE) lors du scellement du bouchon ; il est recommandé d'utiliser plutôt des gants en latex ou en nitrile.
- Retirer la puce CD de 4 °C stockage et équilibrez-le à température ambiante (environ 25 °Cpendant 10 min.
- Fonctionnement de l'instrument
- Mettre sous tension l'analyseur automatisé des acides nucléiques. Appuyer sur Détecter, scanner le code-barres sur l'emballage en feuille du puces, puis saisir les données démographiques du patient et l'identifiant de l'échantillon.
- Montez la puce sur le mandrin rotatif et appuyez vers le bas jusqu'à ce qu'un clic confirme l'engagement.
- Tapoter Démarrer. L'instrument effectue de manière autonome la distribution centrifuge des réactifs, l'extraction par billes magnétiques et l'amplification par LAMP à 65 °C, et l'acquisition de la fluorescence. La durée d'exécution est d'environ 45 min (le chargement des réactifs/échantillons et le protocole de l'instrument sont résumés dans Figure 3).
REMARQUE : Ne pas ouvrir le couvercle pendant l'exécution.
- Interprétation des résultats
- Le logiciel identifie le point d'inflexion de chaque courbe d'amplification en forme de S par une analyse du maximum de la dérivée seconde et indique la valeur TP correspondante (temps de positivité).
- Comparer chaque valeur de TP à la limite seuil correspondante énumérée dans Tableau 4Classer les canaux dont les valeurs de TP sont inférieures ou égales au seuil comme positifs, et les canaux dont les valeurs de TP sont supérieures au seuil comme négatifs.
- Vérifiez que le canal de contrôle interne (puits 16) présente une courbe d'amplification en forme de S avec une valeur de TP inférieure à 12 min.
- Rejetez l'analyse si le contrôle interne échoue. Répétez le test en utilisant une nouvelle puce ou recueillez à nouveau l'échantillon.
Résultats
À l'issue d'une exécution valide, l'appareil affichait les tracés de fluorescence en temps réel pour les 16 canaux. Les canaux positifs présentaient une cinétique d'amplification en forme de S attendue, avec des valeurs de TP annotées automatiquement, tandis que les canaux négatifs restaient au niveau de la ligne de base. Le canal IC (puits 16) produisait une courbe en forme de S avec un TP < 12 min lors de toutes les exécutions valides.
À titre de démonstration pilote et de principe, 10 échantillons représentatifs ont été sélectionnés afin d'illustrer la variété des scénarios cliniques rencontrés en pratique en unité de soins intensifs, incluant 6 aspirations bronchiques (BAS), 2 échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) et 2 échantillons de crachats profonds (Spt). Ces échantillons ont été délibérément choisis pour couvrir des cas monomicrobiens et des cas polymicrobiens complexes, et non pour estimer la prévalence des pathogènes ; 8 des 10 étaient polymicrobiens (de 2 à 7 cibles chacun), et 2 étaient monomicrobiens. Les données complètes de TP sont présentées dans le Tableau 5, et des courbes d'amplification représentatives sont illustrées dans la Figure 4.
À un extrémité du spectre de complexité, l'échantillon S1 (BAS) a produit un seul signal positif pour les Aspergillus spp. (TP = 8 min), tandis que tous les canaux bactériens sont restés négatifs. Ce profil était compatible avec une aspergillose invasive isolée, un diagnostic que la culture conventionnelle peine souvent à détecter rapidement. L'échantillon S10 (Spt) a également donné un seul résultat positif pour Streptococcus pneumoniae (TP = 5,5 min). Ces résultats ont démontré la capacité du test à identifier des infections monomicrobiennes en présence d'une cible de 15 pathogènes.
Des infections polymicrobiennes ont été observées dans les prélèvements restants, en accord avec l'épidémiologie des infections respiratoires chez les patients en soins intensifs. Les échantillons S2 à S5 contenaient chacun des Aspergillus spp. associés à un ou plusieurs pathogènes bactériens et, dans deux prélèvements, Candida albicans. L'échantillon le plus complexe, S5 (LBA), a produit sept signaux positifs simultanés, incluant Aspergillus spp., Burkholderia cepacia, Corynebacterium striatum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus et Stenotrophomonas maltophilia. Ces résultats ont démontré la capacité de détection multiplex de la puce microfluidique à 16 puits dans des conditions de tests cliniques.
Les échantillons S6 à S9, qui contenaient des co-infections bactériennes sans implication fongique, allaient de la détection de deux agents pathogènes (S6 : B. cepacia et E. coli) à la détection de quatre agents pathogènes (S8 : Acinetobacter baumannii, B. cepacia, Klebsiella pneumoniae et S. maltophilia). Sur l'ensemble des 10 prélèvements, les valeurs de TP pour les voies positives variaient de 3,5 à 9 min, et toutes les voies de contrôle interne ont satisfait au critère de validité prédéfini de TP < 12 min.
Pour ce jeu pilote, les résultats de la puce ont été comparés à deux méthodes de référence réalisées en parallèle sur les mêmes 10 prélèvements : le séquençage ciblé de métagénomique de nouvelle génération (tNGS) et la culture conventionnelle de crachats. La concordance par cible pour les 15 canaux de pathogènes est résumée dans Tableau 6. Par rapport au tNGS, le test a montré un accord positif de 100 % (PPA) et un accord négatif de 100 % (NPA) pour toutes les cibles dans ces prélèvements. Par rapport à la culture de crachats, le PPA était de 100 % pour chaque cible positive en culture, tandis que le NPA variait entre 44,4 % et 100 % ; les valeurs plus faibles de NPA reflétaient des cibles détectées par la puce (et par le tNGS) mais non retrouvées en culture, ce qui est cohérent avec une sensibilité analytique plus élevée de l'amplification d'acides nucléiques par rapport à la culture, et non avec une positivité fausse. Étant donné la petite taille et le caractère délibérément sélectionné de l'échantillon, ces chiffres constituent des estimations descriptives de concordance pour la cohorte pilote et ne visent pas à représenter des mesures formelles de précision diagnostique. Comme le tNGS est lui-même une méthode basée sur les acides nucléiques, l'accord avec le tNGS confirme la concordance au niveau des acides nucléiques, sans établir pour autant le statut clinique de chaque organisme ; aucune des deux méthodes, prise isolément, ne permet de distinguer une infection réelle d'une simple colonisation.
Figure 1 : Architecture de la puce microfluidique et consommables associés. (A) Aperçu de la puce en forme de disque de 86 mm, montrant trois zones concentriques : une zone de chargement, une zone intermédiaire de purification par billes magnétiques et une zone externe d'amplification et de détection. (B) Anneau externe d'amplification contenant les 16 puits de réaction (positions 1, 4, 8, 12 et 16 indiquées). (C) Composants du tube de lyse (bouchon d'embout, bouchon d'étanchéité et corps du tube). (D) Vials de réactifs monodose « O » et « B ». (E) Zone de chargement montrant le puit d'échantillon « S » et les puits de réactifs « O » et « B ». Abréviations : O = réactif O ; B = réactif B ; S = échantillon. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Kit de prétraitement et protocole de prétraitement des échantillons. (A) L'échantillon est transféré dans le tube de liquéfaction et homogénéisé par agitation manuelle. (B) L'échantillon homogénéisé est transféré du tube de liquéfaction vers le tube de lyse. (C) Le tube de lyse est placé dans l'appareil de prétraitement des échantillons (SP) pour le cycle automatisé de liquéfaction-lyse. (D) Consommables de prétraitement : les pipettes jetables n°1 et n°2 (les flèches rouges indiquent les repères de chargement de l'échantillon), le tube de lyse et le tube de liquéfaction. Abréviation : SP = Prétraitement des échantillons. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Chargement de la puce et flux de travail de détection automatisée. (A) Le flacon de réactif O, le flacon de réactif B et l'échantillon traité sont chargés dans les ports correspondants de la puce (O, B et S). (B) La puce est assemblée et scellée. (C) La puce est fixée sur l'analyseur automatisé d'acides nucléiques et le code-barres est numérisé. (D) La course est lancée depuis l'écran tactile ; l'extraction, l'amplification et la détection par fluorescence des acides nucléiques s'effectuent ensuite automatiquement. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Courbes d'amplification représentatives obtenues à partir de 10 prélèvements des voies respiratoires inférieures provenant de patients en unité de soins intensifs. Chaque panneau représente un prélèvement unique (S1–S10). Les courbes d'amplification en forme de S indiquent des cibles positives avec les valeurs TP annotées, tandis que les tracés plats indiquent des cibles négatives. Le prélèvement S1 contenait uniquement des Aspergillus spp. ; les prélèvements S2–S5 contenaient des Aspergillus spp. associés à des agents pathogènes bactériens et/ou à Candida albicans ; les prélèvements S6–S9 présentaient des infections bactériennes polymicrobiennes ; et le prélèvement S10 contenait uniquement Streptococcus pneumoniae. Les valeurs TP correspondantes sont indiquées dans le Tableau 5. Abréviations : Aba = Acinetobacter baumannii ; Asp = Aspergillus spp. ; Bcc = Burkholderia cepacia ; Cal = Candida albicans ; Cst = Corynebacterium striatum ; Eco = Escherichia coli ; Hin = Haemophilus influenzae ; IC = contrôle interne ; Kpn = Klebsiella pneumoniae ; Lpn = Legionella pneumophila ; Mpn = Mycoplasma pneumoniae ; Pae = Pseudomonas aeruginosa ; Pji = Pneumocystis jirovecii ; Sau = Staphylococcus aureus ; Sma = Stenotrophomonas maltophilia ; Spn = Streptococcus pneumoniae. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
| Puits | Cible | Abbréviation | Catégorie | Type |
| 1 | Acinetobacter baumannii | Aba | Bactéries | Bactérie |
| 2 | Aspergillus spp. | Asp | Champignons | Champignon |
| 3 | Burkholderia cepacia | Bcc | Bactéries | Bactérie |
| 4 | Candida albicans | Cal | Champignons | Champignon |
| 5 | Corynebacterium striatum | Cst | Bactéries | Bactérie |
| 6 | Escherichia coli | Eco | Bactéries | Bactérie |
| 7 | Haemophilus influenzae | Hin | Bactéries | Bactérie |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Kpn | Bactéries | Bactérie |
| 9 | Legionella pneumophila | Lpn | Bactéries | Bactérie |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | Mpn | Atypique | Bactérie atypique |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | Pae | Bactéries | Bactérie |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | Pji | Champignons | Champignon |
| 13 | Staphylococcus aureus | Sau | Bactéries | Bactérie |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | Sma | Bactéries | Bactérie |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | Spn | Bactéries | Bactérie |
| 16 | NBPF (contrôle interne) | IC | contrôle interne | Contrôle interne |
Tableau 1 : Panel des agents pathogènes ciblés et répartition des puits de réaction.
| Consommable | Spécification / volume | Fonction |
| Tube de liquéfaction | 2 mL/tube | Reçoit l'échantillon ; homogénéisation manuelle |
| Tube de lyse | 0,5 mL/tube | Corps en silicone compressible avec membrane filtrante de 200 µm ; réactifs de lyse préchargés |
| Pipette jetable #1 | 0,5 mL | Transfère l'échantillon homogénéisé dans le tube de lyse |
| Pipette jetable #2 | 2 mL | Aspire l'échantillon jusqu'à la graduation indiquée dans le tube de liquéfaction |
Tableau 2 : Spécifications des consommables utilisés lors du prétraitement des échantillons.
| Étape | Température | Durée |
| Liquéfaction | 50 °C | 10 min |
| Lyse des agents pathogènes | 95 °C | 5 min |
| Cycle total | — | ~15 min |
Tableau 3 : Paramètres de fonctionnement du cycle de l'appareil de prétraitement des échantillons (SP).
| Cible | Seuil de TP (min) | Règle de classification |
| Acinetobacter baumannii | 13 | TP ≤ seuil = positif |
| Aspergillus spp. | 15,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Burkholderia cepacia | 12,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Candida albicans | 13,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Corynebacterium striatum | 13 | TP ≤ seuil = positif |
| Escherichia coli | 12 | TP ≤ seuil = positif |
| Haemophilus influenzae | 13,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Klebsiella pneumoniae | 15,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Legionella pneumophila | 14,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Mycoplasma pneumoniae | 14 | TP ≤ seuil = positif |
| Pseudomonas aeruginosa | 12 | TP ≤ seuil = positif |
| Pneumocystis jirovecii | 14,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Staphylococcus aureus | 15,5 | TP ≤ seuil = positif |
| Stenotrophomonas maltophilia | 12 | TP ≤ seuil = positif |
| Streptococcus pneumoniae | 14,5 | TP ≤ seuil = positif |
| NBPF (contrôle interne) | 12 | Exécution valide si TP < 12 min |
Tableau 4 : Valeurs seuils de TP utilisées pour la classification des cibles.
| Échantillon | Type | Cible détectée | TP (min) | Culture / tNGS (lectures) |
| S1 | BAS | Aspergillus spp. | 8 | + / 1,253 |
| S2 | BAS | Aspergillus spp. | 7,5 | – / 3,877 |
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 55,039 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6,5 | – / 3,087 | ||
| S3 | BAS | Aspergillus spp. | 5,5 | + / 6,145 |
| Burkholderia cepacia | 6 | – / 3,221 | ||
| Candida albicans | 7,5 | – / 3,280 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | + / 13,189 | ||
| S4 | BALF | Acinetobacter baumannii | 6,5 | + / 10,485 |
| Aspergillus spp. | 7,5 | – / 4,432 | ||
| Burkholderia cepacia | 5,5 | – / 1,676 | ||
| Candida albicans | 8,5 | – / 576 | ||
| S5 | BALF | Aspergillus spp. | 7,5 | + / 2,869 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 6,532 | ||
| Corynebacterium striatum | 5,5 | – / 71,839 | ||
| Escherichia coli | 7 | – / 1,891 | ||
| Pseudomonas aeruginosa | 4 | + / 31,386 | ||
| Staphylococcus aureus | 6,5 | – / 26,683 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | + / 21,467 | ||
| S6 | BAS | Burkholderia cepacia | 5,5 | – / 1,984 |
| Escherichia coli | 5,5 | + / 8,005 | ||
| S7 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5,5 | + / 28,007 |
| Burkholderia cepacia | 4 | + / 3,585 | ||
| Haemophilus influenzae | 6,5 | – / 8,912 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | – / 8,865 | ||
| S8 | BAS | Acinetobacter baumannii | 5,5 | – / 43,721 |
| Burkholderia cepacia | 4 | – / 53,796 | ||
| Klebsiella pneumoniae | 3,5 | + / 23,757 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 4 | – / 26,898 | ||
| S9 | Spt | Haemophilus influenzae | 9 | – / 3,636 |
| Staphylococcus aureus | 8,5 | + / 1,918 | ||
| Stenotrophomonas maltophilia | 8,5 | – / 872 | ||
| S10 | Spt | Streptococcus pneumoniae | 5,5 | – / 29,893 |
Tableau 5 : Résultats de détection et valeurs de TP pour 10 prélèvements représentatifs des voies respiratoires inférieures collectés chez des patients en unité de soins intensifs.
| Cible | tNGS + | POCT + | tNGS − | POCT − | PPA | NPA | (SC) PPA/NPA |
| Acinetobacter baumannii | 3 | 3 | 7 | 7 | 100% | 100% | 100% / 87,5% |
| Aspergillus spp. | 5 | 5 | 5 | 5 | 100% | 100% | 100% / 71,4% |
| Burkholderia cepacia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 44,4% |
| Candida albicans | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80,0% |
| Corynebacterium striatum | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Escherichia coli | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88,9% |
| Haemophilus influenzae | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80,0% |
| Klebsiella pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Legionella pneumophila | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Mycoplasma pneumoniae | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Pseudomonas aeruginosa | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| Pneumocystis jirovecii | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| Staphylococcus aureus | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88,9% |
| Stenotrophomonas maltophilia | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 50,0% |
| Streptococcus pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | – / 90,0% |
Tableau 6 : Concordance par cible de l'essai avec le séquençage ciblé de métagénome de nouvelle génération (tNGS) et la culture conventionnelle de crachats pour les 10 échantillons représentatifs. Pour chacune des 15 cibles pathogènes, le nombre de résultats positifs et négatifs obtenus par chaque méthode ainsi que les pourcentages d'accord positif (PPA) et négatif (NPA) correspondants sont indiqués. Abréviations : PPA = pourcentage d'accord positif ; NPA = pourcentage d'accord négatif ; tNGS = séquençage ciblé de métagénome de nouvelle génération ; PPA/NPA indiqué par « / » lorsqu'aucun résultat de référence positif (ou négatif) n'était disponible.
| No. | Agent pathogène | DL (copies/mL) |
| 1 | Acinetobacter baumannii | 1 000 |
| 2 | Aspergillus spp. | 2 000 |
| 3 | Burkholderia cepacia | 2 000 |
| 4 | Candida albicans | 1 000 |
| 5 | Corynebacterium striatum | 1 000 |
| 6 | Escherichia coli | 4 000 |
| 7 | Haemophilus influenzae | 2 000 |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 4 000 |
| 9 | Legionella pneumophila | 2 000 |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | 1 000 |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | 2 000 |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | 1 000 |
| 13 | Staphylococcus aureus | 2 000 |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | 2 000 |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | 4 000 |
| 16 | Contrôle interne (NBPF) | Non applicable (contrôle interne) |
Tableau 7 : Limite analytique de détection (LoD) pour chaque cible du panel. La LoD a été déterminée à l'aide d'acide nucléique génomique quantifié par PCR numérique, ajouté à une matrice négative de liquide de lavage bronchoalvéolaire, diluée en série et testée par triplicaté ; elle est définie comme la concentration la plus faible détectée dans au moins 95 % des réplicats. Les valeurs sont exprimées en copies/mL. Abréviation : LoD = limite de détection.
| Dimension | POCT (ce test) | Culture de crachats | PCR conventionnelle | mNGS |
| Délai d'exécution | ~1 h | 2–5 jours | 4–8 h | > 24 h |
| Compétence requise de l'opérateur | Faible | Élevée | Élevée | Élevée |
| Exigence en laboratoire | Faible ; au chevet du patient | Élevée ; laboratoire de bactériologie | Élevée ; laboratoire de PCR | Élevée ; installation spécialisée |
| Investissement en équipement | Faible à modéré | Faible | Modéré | Élevé |
| Coût par test | Modéré | Faible | Modéré | Élevé |
| Sensibilité analytique | Élevée | Faible | Élevée | Élevée |
| Avantage principal | Entièrement intégré, échantillon entrant/résultat sortant, aucune opération spécialisée requise | Standard de référence ; fournit la sensibilité | Haute sensibilité ; quantitatif | Non biaisé ; détecte les agents pathogènes rares ou inattendus ; résout les cas difficiles |
Tableau 8 : Comparaison qualitative du test diagnostique actuel réalisé au point d’intervention avec la culture de crachats, la PCR conventionnelle et le séquençage métagénomique. Les méthodes sont comparées selon le temps de rendu des résultats, le niveau de compétence requis de l’opérateur, les besoins en infrastructure de laboratoire, l’investissement en équipement, le coût par test, la sensibilité analytique et les principaux avantages. Abréviations : POCT = test diagnostique au point d’intervention ; PCR = réaction en chaîne par polymérase ; mNGS = séquençage métagénomique de nouvelle génération.
Discussion
L'identification rapide des agents pathogènes est essentielle dans la prise en charge des infections en soins intensifs. Le système décrit ici réduit le délai d'identification de l'agent pathogène, qui passe de 3 à 5 jours habituellement nécessaires pour une culture, à moins d'une heure, une période durant laquelle les décisions concernant les antimicrobiens de première intention sont souvent prises7. En intégrant l'extraction et la purification des acides nucléiques ainsi que l'amplification LAMP en 16-plex dans une cartouche scellée unique, ce protocole élimine l'étape manuelle d'extraction de l'ADN, qui constituait jusqu'à présent le goulot d'étranglement opérationnel principal des précédentes plates-formes de puces LAMP15. Le résultat est une procédure unique de chargement, pouvant être réalisée par du personnel ne possédant pas de formation spécialisée en biologie moléculaire.
Plusieurs aspects procéduraux méritent une attention particulière. La qualité de l'échantillon est essentielle. Chez les patients sous ventilation, les prélèvements respiratoires profonds, tels que l'aspirat bronchique ou le liquide de lavage bronchoalvéolaire, sont préférables au crachat expectoré, chez qui une contamination oropharyngée peut masquer le signal du véritable agent pathogène. Une liquéfaction incomplète est la cause la plus fréquente d'une lyse sous-optimale ; par conséquent, l'agitation manuelle doit se poursuivre jusqu'à ce que l'échantillon atteigne clairement une consistance aqueuse. Lors du chargement de la puce, le vidage incomplet du flacon de réactif ou du tube de lyse peut priver les puits en aval du matériel d'entrée requis, entraînant des échecs spécifiques à certains canaux qui pourraient être interprétés à tort comme des résultats négatifs. En outre, la fermeture en deux clics du capuchon de la puce n'est pas seulement une caractéristique mécanique : elle est nécessaire pour maintenir l'espace libre scellé requis pour l'amplification isotherme et pour prévenir les pertes par évaporation.
Le dépannage est relativement simple. Les crachats visqueux provenant des unités de soins intensifs peuvent nécessiter un brassage manuel plus long que la durée recommandée de 1 min. Les échantillons dilués, en particulier les lavages broncho-alvéolaires, peuvent nécessiter une charge à un volume de pipetage double de la normale afin de compenser la densité plus faible de pathogènes. L'échec du contrôle interne, défini par l'absence d'une courbe d'amplification en forme de S ou par une valeur de TP supérieure à 12 min, indique soit une cellulité insuffisante de l'échantillon, soit une défaillance du système fluidique dans la cartouche. Dans de tels cas, la démarche appropriée consiste à recueillir un nouvel échantillon ou à répéter le test en utilisant une cartouche neuve, plutôt que de réinterpréter les canaux individuels.
Cette méthode présente également des limites importantes. Le panel est limité à 15 cibles prédéfinies, et les organismes en dehors de cette liste, y compris de nombreux déterminants de résistance aux antimicrobiens, ne peuvent pas être détectés. Chaque jeu d'amorces cible une région conservée et spécifique à l'espèce de l'organisme visé, à l'exception du test de genre Aspergillus ; par conséquent, les espèces ou souches non représentées dans le panel ne sont pas détectées, et le panel ne capte pas la variation intraspécifique au niveau des souches. Étant donné que chacun des 16 puits contient un jeu d'amorces lyophilisées dédié, le panel est modulaire et peut être reconfiguré dans des versions futures pour ajouter de nouvelles cibles.
Le résultat du test est qualitatif. Bien que les valeurs de TP puissent présenter une corrélation approximative avec la charge en pathogène, elles ne peuvent pas remplacer les résultats quantitatifs obtenus par culture ou les estimations basées sur la valeur seuil de cycle en PCR. Comme pour tout test d'amplification d'acides nucléiques effectué sur des prélèvements respiratoires, ce test ne permet pas, à lui seul, de distinguer une colonisation d'une infection réelle. L'interprétation clinique doit donc intégrer les résultats du puces avec des marqueurs inflammatoires tels que la protéine C-réactive et la procalcitonine, les résultats d'imagerie, les biomarqueurs fongiques incluant le galactomannane et le (1,3)-β-D-glucane, ainsi que l'évolution clinique globale. En outre, le système ne fournit pas de données sur la sensibilité aux antimicrobiens, et la culture conventionnelle reste indispensable à cet effet.
Enfin, tous les échantillons inclus dans cette étude ont été obtenus à partir d'une seule unité de soins intensifs tertiaire, et la prévalence des agents pathogènes ainsi que les profils de co-infection peuvent varier selon les établissements et les populations de patients. Ce travail doit donc être considéré comme une étude pilote, une démonstration de principe du protocole sur un petit ensemble d'échantillons représentatifs délibérément choisis ; il n'avait pas pour objectif d'estimer la précision diagnostique. La sensibilité et la spécificité cliniques par cible, ainsi que la concordance systématique avec la culture conventionnelle et le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS), seront établies dans le cadre d'une étude prospective planifiée, multicentrique, incluant des patients consécutifs.
Comme première mesure de performance analytique, la limite de détection (LoD) pour chaque cible a été estimée à l’aide d’acide nucléique génomique quantifié par PCR numérique, ajouté à une matrice de liquide de lavage broncho-alvéolaire négatif. Les échantillons ont été dilués en série et testés par triplicata. La LoD a été définie comme la concentration la plus faible détectée dans au moins 95 % des réplicats. Les valeurs de LoD obtenues variaient de 1 000 à 4 000 copies/mL selon les cibles (Tableau 7). Étant donné que la quantification basée sur le dénombrement de colonies pour chaque organisme n’était pas disponible dans cette étude pilote, ces estimations de LoD seront affinées à l’aide de souches de référence formellement numérotées dans des travaux ultérieurs.
La comparaison avec les approches diagnostiques existantes précise davantage la place de cette plateforme. La culture conventionnelle, bien qu'elle soit lente, reste la référence standard et fournit des informations sur la sensibilité aux antimicrobiens. Le séquençage métagénomique de nouvelle génération offre une couverture beaucoup plus étendue des organismes, mais à un coût nettement plus élevé, avec des délais d'obtention des résultats plus longs (généralement de 24 à 48 h) et des besoins en bioinformatique que de nombreuses unités de soins intensifs ne peuvent pas assurer sur place9. Les panels standards de PCR multiplex réduisent le délai d'obtention des résultats, mais nécessitent généralement encore une extraction séparée des acides nucléiques et, selon la plateforme, un traitement par lots pouvant introduire un retard supplémentaire10.
Du point de vue des coûts, bien qu'une analyse formelle de rentabilité ait dépassé le cadre de cette étude pilote, la plateforme s'attaque aux principaux facteurs de coût réels en unité de soins intensifs (USI), notamment la culture bactérienne et la PCR conventionnelle ou multiplexe (une comparaison qualitative entre les méthodes est fournie dans Tableau 8). Elle fournit des résultats en environ 1 h, contre 2 à 5 jours pour la culture de crachats, 4 à 8 h pour la PCR conventionnelle (qui nécessite généralement un traitement par lots) et >24 h pour le séquençage métagénomique. Étant donné que le flux de travail est entièrement intégré (échantillon entrant, résultat sortant), il nécessite une seule étape manuelle de chargement, sans extraction séparée des acides nucléiques, peut être réalisé au chevet du patient sans laboratoire de bactériologie ou de biologie moléculaire dédié ni personnel spécialisé en biologie moléculaire, et utilise une cartouche fermée et jetable qui réduit les tests répétés liés à la contamination. Les coûts du matériel sont également modérés, évitant ainsi la nécessité d'un appareil de PCR quantitative en temps réel ou d'une plateforme de séquençage. Chez les patients gravement malades en USI, ce délai d'obtention rapide des résultats pourrait réduire la durée de traitements empiriques inappropriés et la durée d'hospitalisation, offrant ainsi un bénéfice indirect mais potentiellement important en termes de coûts.
Le système actuel occupe un créneau particulier défini par un temps de traitement rapide, une simplicité d'utilisation et une biosécurité assurée par la cartouche fermée, des caractéristiques qui rendent réalisable une mise en œuvre au chevet du patient. L'inclusion de trois cibles fongiques constitue une fonctionnalité particulièrement importante. Les Aspergillus spp. ont été détectés dans 5 des 10 échantillons (intervalle TP : 5,5–8 min). Compte tenu des limites connues de la culture et de la fenêtre diagnostique restreinte du test de la galactomannane pour Aspergillus5,6, un signal moléculaire disponible en moins de 45 minutes pourrait permettre une prise en considération plus précoce d'un traitement antifongique ciblé, bien que la valeur clinique de ce signal précoce doive être établie dans des études prospectives.
Plusieurs perspectives futures se dégagent. L'élargissement du panel afin d'inclure, au minimum, les gènes de déterminants clés de résistance tels que les gènes de carbapénémases et mecA, permettrait de combler l'écart entre l'identification des pathogènes et le choix empirique d'antimicrobiens. En outre, à mesure que les ensembles de données TP s'agrandiront, des modèles d'apprentissage automatique entraînés sur des profils d'amplification appariés et des métadonnées cliniques pourraient éventuellement aider à distinguer la colonisation d'une infection véritable, bien que ces applications nécessitent une validation prospective rigoureuse. De manière plus générale, une évaluation multicentrique menée auprès de populations de patients de réanimation provenant de régions géographiquement diverses sera nécessaire avant que la performance diagnostique de cette plateforme puisse être considérée comme généralisable.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Maladies chroniques non transmissibles — Projet majeur national de science et de technologie (n° 2023ZD0516500), Financement national pour la recherche clinique des hôpitaux de haut niveau (2026-PUMCH-A-103), Programme de concours ouvert CMB (24-561) et Programme de formation des talents de l'Hôpital Peking Union Medical College (n° UGG11571).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Analyseur automatisé d'acides nucléiques | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T ; effectue la distribution centrifuge des réactifs, l'extraction par billes magnétiques, la LAMP à 65 °C et la détection fluorescente en temps réel (environ 45 min d'exécution) |
| Pipette Pasteur jetable n°1 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consommable jetable ; 0,5 mL ; permet le transfert de l'échantillon homogénéisé dans le tube de lyse |
| Pipette Pasteur jetable n°2 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consommable jetable ; 2 mL ; aspire l'échantillon jusqu'à la graduation indiquée dans le tube de liquéfaction |
| Puce CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; disque de 86 mm avec une zone centrale de chargement (ports O, B, S), une zone de purification par billes magnétiques et un anneau externe comportant 16 puits de réaction (15 cibles pathogènes + contrôle interne NBPF) |
| Réactifs de la réaction LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | Réactifs de la réaction LAMP préalablement stockés dans la puce CD sous forme de pastilles lyophilisées |
| Tube de liquéfaction | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; 2 mL/tube ; reçoit l'échantillon destiné à l'homogénéisation manuelle |
| Tube de lyse | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; 0,5 mL/tube ; corps en silicone compressible équipé d'une membrane filtrante de 200 µm ; contient des réactifs de lyse préchargés |
| Amorces | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | Mélange d'amorces intégré dans la chambre de réaction de la puce CD |
| Dispositif de prétraitement des échantillons | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000 ; cycle automatisé de liquéfaction–lyse (environ 15 min) |
| Flacon monodose “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; réactif préemballé sur puce ; un par test ; stocké à 4 °C et équilibré à température ambiante (environ 25 °C) avant chargement |
| Flacon monodose “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; réactif préemballé sur puce ; un par test ; stocké à 4 °C et équilibré à température ambiante (environ 25 °C) avant chargement |
Références
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