Ce protocole décrit une méthode LAMP basée sur une puce microfluidique entièrement intégrée, permettant la détection au point d'intervention de 15 pathogènes responsables d'infections respiratoires basses chez les patients en soins intensifs en moins d'une heure.
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Article de méthode
Détection rapide au point d'intervention des agents pathogènes responsables des infections des voies respiratoires inférieures chez les patients en unité de soins intensifs
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Résumé
Résumé
Les infections des voies respiratoires inférieures (IVRI) figurent parmi les principales causes de détérioration clinique et de décès chez les patients gravement malades. En unité de soins intensifs (USI), l'identification rapide de l'agent pathogène responsable est essentielle pour une antibiothérapie appropriée ; toutefois, les méthodes conventionnelles de culture nécessitent de 3 à 5 jours et présentent des taux de positivité sous-optimaux, en particulier pour les champignons. Les approches moléculaires telles que la PCR réduisent le délai d'analyse, mais dépendent encore de l'extraction manuelle des acides nucléiques et du thermocyclage, ce qui limite leur utilisation au chevet du patient. Ce protocole décrit un flux de travail au point d'intervention basé sur une puce microfluidique entièrement intégrée, de forme disque (puce CD), qui associe une purification des acides nucléiques par billes magnétiques à une amplification isotherme en boucle (LAMP). Après une étape simplifiée de liquéfaction et de lyse manuelle, l'échantillon traité est chargé sur la puce, accompagné de deux flacons de réactifs préemballés. L'appareil effectue ensuite de manière autonome l'extraction, l'amplification à 65 °C et la détection en temps réel par fluorescence, fournissant des résultats qualitatifs pour 15 cibles, à savoir 11 bactéries, 3 champignons et 1 agent pathogène atypique, en 45 minutes de temps de fonctionnement de l'appareil (environ 1 heure pour l'ensemble du processus de l'échantillon au résultat, y compris l'étape préliminaire manuelle). Nous présentons des données de détection provenant de 10 échantillons prélevés en USI, incluant des crachats, des aspirations bronchiques et des lavages broncho-alvéolaires, couvrant à la fois des infections monomicrobiennes et des co-infections polymicrobiennes impliquant jusqu'à 7 micro-organismes sur une seule puce. La conception fermée de la cartouche minimise le risque de contamination par aérosols, et l'étape unique de chargement ne nécessite aucune formation spécialisée, positionnant ainsi ce système comme un outil diagnostique pratique au chevet du patient pour les équipes d'USI.
Introduction
Chez les patients gravement malades en unité de soins intensifs (USI), les infections des voies respiratoires inférieures, dont la pneumonie associée à la ventilation mécanique (PAV) est la principale cause, restent un facteur persistant de morbidité, de ventilation mécanique prolongée et de mortalité excessive1,2. Le paysage microbiologique des infections des voies respiratoires inférieures (IVRI) acquises en USI diffère nettement de celui des maladies communautaires. Les bacilles à Gram négatif multirésistants (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) prédominent, souvent dans des constellations polymicrobiennes qui compliquent les schémas thérapeutiques empiriques3,4. Les champignons opportunistes ajoutent une complexité supplémentaire. L'aspergillose pulmonaire invasive, autrefois considérée comme une manifestation caractéristique d'une immunosuppression profonde, est désormais diagnostiquée de plus en plus fréquemment chez des patients en USI non neutropéniques, notamment après une grippe sévère ou une infection à COVID-195. Les algorithmes diagnostiques actuels de l'aspergillose associent une culture peu sensible au test de détection de l'antigène galactomannane (GM), mais le test GM présente des limites bien documentées en termes de fenêtre diagnostique et de sensibilité variable chez les hôtes non neutropéniques6. Chaque heure de retard dans l'initiation d'un traitement antimicrobien approprié pour un sepsis s'accompagne d'une augmentation mesurable de la mortalité7. Pris ensemble, la rapidité et la complexité des infections en USI exigent des outils diagnostiques capables de répondre à l'urgence clinique.
La culture microbienne classique, bien qu'indispensable pour les tests de sensibilité, est fondamentalement limitée par sa vitesse : le délai d'obtention des résultats s'étend sur 3 à 5 jours, les micro-organismes exigeants sont souvent manqués, et le taux de positivité des cultures fongiques reste faible8. Le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS) offre une alternative non biaisée, mais son adoption clinique est freinée par le coût, des délais de traitement de 24 à 48 heures, la dépendance à des pipelines de bioinformatique, et une faisabilité limitée au point d'intervention9. Les panneaux basés sur la PCR ont réduit l'écart temporel, mais ils nécessitent encore une extraction d'acides nucléiques en plusieurs étapes, un équipement pour cyclage thermique, et, dans les formats conventionnels, une électrophorèse post-amplification10. Aucune de ces plateformes ne répond pleinement aux exigences convergentes des soins intensifs : rapidité inférieure à une heure, temps de manipulation minimal, détection multiplexée des agents pathogènes incluant les champignons, et simplicité d'utilisation suffisante pour du personnel non spécialisé en laboratoire.
L'amplification isototherme médiée par boucle (LAMP) permet de surmonter plusieurs de ces contraintes. Décrite pour la première fois par Notomi et al., cette méthode amplifie l'ADN cible à une température constante de 65 °C à l'aide d'un ensemble de quatre à six amorces reconnaissant six régions distinctes, grâce à une polymérase à déplacement de brin11. La réaction produit des structures d'amplicons caractéristiques en forme de tige-boucle et de type « chou-fleur », détectables par fluorescence en temps réel, générant des courbes en forme de S quelques minutes après le franchissement du seuil. La sensibilité à de faibles concentrations de matrice est élevée, et la conception multiprimers confère une sélectivité qui limite les faux positifs12,13. Lorsqu'elle est couplée à des plateformes de puces microfluidiques, la LAMP peut être parallélisée pour plusieurs cibles à partir d'une seule charge d'échantillon14. Des travaux antérieurs ont démontré que les systèmes de puces LAMP détectent des pathogènes respiratoires avec un temps de traitement nettement inférieur à trois heures15. Une limitation majeure de ces systèmes réside toutefois dans leur dépendance vis-à-vis d'une extraction manuelle séparée de l'ADN, ce qui augmente la durée d'analyse, la complexité opérationnelle et le risque de contamination.
Le système décrit ici élimine ce goulot d'étranglement. Conçu autour d'une cartouche microfluidique jetable en forme de disque (86 mm de diamètre), il intègre dans un seul et même dispositif scellé la mise en charge de l'échantillon, la purification des acides nucléiques par billes magnétiques et l'amplification LAMP en 16-plex (Figure 1). L'opérateur effectue uniquement une courte étape manuelle de liquéfaction-lyse à l’aide d’un tube de traitement spécialement conçu, puis charge le lysat et deux flacons de réactifs sur la puce (Figure 2). À partir de ce moment, l'appareil prend en charge de façon autonome l'extraction, l'amplification isotherme à 65 °C et l'acquisition de la fluorescence, fournissant en moins de 45 minutes des résultats qualitatifs pour 15 cibles cliniquement pertinentes, à savoir 11 bactéries, 3 champignons (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) et un agent pathogène atypique (Mycoplasma pneumoniae). Un gène de la famille des points de cassure du neuroblastome (NBPF), utilisé comme témoin interne, permet de valider la qualité de l'échantillon et l'intégrité de la réaction dans chaque test. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour l'ensemble du processus, depuis la collecte de l'échantillon en réanimation jusqu'au prétraitement, au chargement de la puce, à la détection automatisée et à l'interprétation des résultats, à l’intention du personnel de laboratoire clinique et des équipes de soins intensifs.
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Protocole
Tous les échantillons ont été prélevés dans le cadre d'un protocole approuvé par le Comité d'éthique du Peking Union Medical College Hospital, Académie chinoise des sciences médicales (n° d'approbation : I-24PJ1778). Un consentement éclairé écrit a été obtenu auprès de chaque participant ou de leur représentant légalement habilité avant le prélèvement des échantillons. Le panel de pathogènes ciblés et les attributions des puits de réaction sont indiqués dans le Tableau 1, et les consommables utilisés lors du prétraitement des échantillons sont répertoriés dans le Tableau 2.
1. Prélèvement d'échantillons cliniques provenant du tractus respiratoire inférieur en unité de soins intensifs
- Prélèvement de crachats
- Rincer la cavité buccale avec de l'eau propre ou une solution saline physiologique stérile trois fois afin d'éliminer les résidus alimentaires et la flore orale commensale.
- Demander au patient de prendre deux à trois respirations profondes, puis de tousser vigoureusement pour expulser un crachat profond directement dans un récipient stérile de collecte.
REMARQUE : Un prélèvement acceptable consiste en un matériel visqueux, purulent ou strié de sang provenant de la région située sous la trachée ; une salive claire ou un écoulement post-nasal ne conviennent pas et peuvent compromettre la détection en aval.
- Prélèvement de l'aspirat bronchique (BAS)
- Chez les patients non intubés, introduire un cathéter d'aspiration stérile (cathéter de 10 à 12 Fr, l'aspiration étant réglée à une pression de −0,0267 MPa, équivalente à −200 mmHg) par voie nasale ou orale jusqu'à une profondeur d'environ 30 cm.
- Appliquer une aspiration tout en faisant tourner le cathéter et retirer lentement le cathéter. Recueillir les sécrétions aspirées dans un piège stérile pour échantillon.
REMARQUE : Si les sécrétions sont peu abondantes, instillez environ 5 mL de sérum physiologique stérile par le cathéter avant l'aspiration. - Pour les patients sous ventilation mécanique, sélectionner le cathéter d'aspiration en fonction de la taille du tube endotrachéal : utiliser un cathéter de 10 Fr pour un tube de 7,0 à 7,5 mm et un cathéter de 12 Fr pour un tube de 8,0 mm.
- Préoxygénez le patient avec de l'oxygène à 100 % pendant 30 à 60 secondes avant d'effectuer l'aspiration. Débranchez le circuit du ventilateur et insérez le cathéter sélectionné par l'intermédiaire de la voie aérienne artificielle jusqu'à ce qu'une résistance soit rencontrée.
- Appliquer une pression négative de −0,0267 MPa (équivalente à −200 mmHg), en limitant chaque passage d'aspiration, et donc la durée de déconnexion du ventilateur, à 15 s maximum afin de minimiser la derecrutement et l'hypoxémie, puis réoxygéner le patient avec 100 % d'oxygène pendant 30 à 60 s après l'aspiration.
- Instillez 1 à 2 mL de sérum physiologique stérile à travers le cathéter et attendez 3 s.
- Appliquer une aspiration et retirer le cathéter. Recueillir les sécrétions aspirées dans un piège à échantillons stérile. Reconnecter immédiatement le circuit du ventilateur après la collecte de l'échantillon.
REMARQUE : La technique aseptique stricte est essentielle tout au long du processus afin d'éviter toute contamination nosocomiale de l'échantillon.
- Prélèvement du liquide de lavage bronchoalvéolaire (LLBA)
- Identifier le segment cible sur l'imagerie thoracique. Introduire le bronchoscope et le positionner en bouchon dans la bronche segmentaire ou sous-segmentaire appropriée.
- Instillez rapidement des aliquotes de 20 à 50 mL de sérum physiologique stérile, en 3 à 5 aliquotes (60 à 120 mL au total). Appliquez une aspiration douce après chaque aliquote, puis recueillez le liquide récupéré dans un récipient stérile et hermétiquement fermé.
ATTENTION : Une surveillance continue de l'hémodynamique et de la ventilation est obligatoire pendant la LBA chez les patients en soins intensifs. Ajuster les paramètres du ventilateur en fonction des besoins pour les sujets sous ventilation mécanique.
REMARQUE : Le taux de récupération typique est de 40 à 60 % du volume instillé. Un faible retour peut nécessiter un repositionnement de l'extrémité du bronchoscope.
2. Liquéfaction et lyse des agents pathogènes
- À l’aide de la pipette jetable n°2, aspirez l’échantillon jusqu’à la ligne marquée (environ 1 mL) et délivrez-le dans le tube de liquéfaction. Pressez plusieurs fois la poire de la pipette pour transférer tout le matériau visqueux, puis fermez le tube avec son bouchon.
NOTE : Pour le LBA ou les crachats aqueux, chargez deux volumes de pipette afin de garantir une quantité suffisante de pathogène. - Agitez vigoureusement le tube de liquéfaction à la main pendant 1 minute. Examinez visuellement l’échantillon et poursuivez l’agitation jusqu’à ce qu’il ne reste aucun agrégat de mucus visible et que l’échantillon s’écoule librement à travers la pipette jetable n°1 sans résistance (consistance homogène, semblable à celle de l’eau). Agitez pendant au moins 1 minute, en prolongeant le temps si nécessaire pour les échantillons très visqueux, jusqu’à atteindre ces critères.
- Ouvrez le bouchon de scellage du tube de lyse.
- Aspirez environ 0,5 mL de l’échantillon homogénéisé à l’aide de la pipette jetable n°1 et délivrez l’échantillon dans le tube de lyse.
- Fermez le bouchon de scellage et vérifiez que le bouchon du bout est bien serré.
- Insérez le tube de lyse dans le dispositif de prétraitement des échantillons (dispositif SP), en appuyant vers le bas jusqu’à ce qu’il soit bien en place. Appuyez sur Démarrer.
- Laissez le dispositif SP achever le cycle automatisé de liquéfaction-lyse (paramètres indiqués dans le Tableau 3), d’une durée d’environ 15 minutes.
NOTE : Ne pas ouvrir ni retirer le tube pendant le traitement.
3. Chargement de la puce et détection automatisée
- Chargement des réactifs et des échantillons
- Retirer la puce CD de 4 °C stockage et équilibrez-le à température ambiante (environ 25 °Cpendant 10 min.
REMARQUE : Les flacons de réactifs O et B et le lysat prétraité sont utilisés à température ambiante ; l'amplification LAMP sur puce est réalisée à 65 °C (voir étape 3.2.3 et Tableau 3). - Ouvrir le sachet en aluminium et placer la puce sur une surface plane.
- Tournez le capuchon dans le sens inverse des aiguilles d'une montre pour ouvrir la puce.
- Frapper doucement le flacon O pour faire descendre le liquide au fond du flacon.
- Ouvrir le flacon O, insérer la buse dans le port O et verser la totalité du contenu dans le port.
- Jeter le flacon O. Répéter la procédure en utilisant le flacon B et le port B.
- Retirer le tube de lyse traité du dispositif SP et enlever le bouchon de l'embout.
- Aligner l'embout du tube avec le port S et verser tout le volume de lysat dans la puce.
- Jeter le tube de lyse utilisé.
- Tournez le bouchon de la puce dans le sens horaire jusqu'à ce que deux clics audibles confirment un scellement complet.
REMARQUE : Un chargement incomplet d'un port quelconque peut entraîner des défaillances au niveau de canaux individuels. Vérifiez que la distribution est complète avant de sceller. Pour éviter un scellement incomplet et les risques de contamination, ne portez pas de gants en polyéthylène (PE) lors du scellement du bouchon ; il est recommandé d'utiliser plutôt des gants en latex ou en nitrile.
- Retirer la puce CD de 4 °C stockage et équilibrez-le à température ambiante (environ 25 °Cpendant 10 min.
- Fonctionnement de l'instrument
- Mettre sous tension l'analyseur automatisé des acides nucléiques. Appuyer sur Détecter, scanner le code-barres sur l'emballage en feuille du puces, puis saisir les données démographiques du patient et l'identifiant de l'échantillon.
- Montez la puce sur le mandrin rotatif et appuyez vers le bas jusqu'à ce qu'un clic confirme l'engagement.
- Tapoter Démarrer. L'instrument effectue de manière autonome la distribution centrifuge des réactifs, l'extraction par billes magnétiques et l'amplification par LAMP à 65 °C, et l'acquisition de la fluorescence. La durée d'exécution est d'environ 45 min (le chargement des réactifs/échantillons et le protocole de l'instrument sont résumés dans Figure 3).
REMARQUE : Ne pas ouvrir le couvercle pendant l'exécution.
- Interprétation des résultats
- Le logiciel identifie le point d'inflexion de chaque courbe d'amplification en forme de S par une analyse du maximum de la dérivée seconde et indique la valeur TP correspondante (temps de positivité).
- Comparer chaque valeur de TP à la limite seuil correspondante énumérée dans Tableau 4Classer les canaux dont les valeurs de TP sont inférieures ou égales au seuil comme positifs, et les canaux dont les valeurs de TP sont supérieures au seuil comme négatifs.
- Vérifiez que le canal de contrôle interne (puits 16) présente une courbe d'amplification en forme de S avec une valeur de TP inférieure à 12 min.
- Rejetez l'analyse si le contrôle interne échoue. Répétez le test en utilisant une nouvelle puce ou recueillez à nouveau l'échantillon.
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Résultats
À l'issue d'une exécution valide, l'appareil affichait les tracés de fluorescence en temps réel pour les 16 canaux. Les canaux positifs présentaient une cinétique d'amplification en forme de S attendue, avec des valeurs de TP annotées automatiquement, tandis que les canaux négatifs restaient au niveau de la ligne de base. Le canal IC (puits 16) produisait une courbe en forme de S avec un TP < 12 min lors de toutes les exécutions valides.
À titre de démonstration pilote et de principe, 10 é...
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Discussion
L'identification rapide des agents pathogènes est essentielle dans la prise en charge des infections en soins intensifs. Le système décrit ici réduit le délai d'identification de l'agent pathogène, qui passe de 3 à 5 jours habituellement nécessaires pour une culture, à moins d'une heure, une période durant laquelle les décisions concernant les antimicrobiens de première intention sont souvent prises7. En intégrant l'extraction et la purification des acides nucléiques ainsi que l'amplification LAMP...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Maladies chroniques non transmissibles — Projet majeur national de science et de technologie (n° 2023ZD0516500), Financement national pour la recherche clinique des hôpitaux de haut niveau (2026-PUMCH-A-103), Programme de concours ouvert CMB (24-561) et Programme de formation des talents de l'Hôpital Peking Union Medical College (n° UGG11571).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Analyseur automatisé d'acides nucléiques | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T ; effectue la distribution centrifuge des réactifs, l'extraction par billes magnétiques, la LAMP à 65 °C et la détection fluorescente en temps réel (environ 45 min d'exécution) |
| Pipette Pasteur jetable n°1 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consommable jetable ; 0,5 mL ; permet le transfert de l'échantillon homogénéisé dans le tube de lyse |
| Pipette Pasteur jetable n°2 | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Consommable jetable ; 2 mL ; aspire l'échantillon jusqu'à la graduation indiquée dans le tube de liquéfaction |
| Puce CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; disque de 86 mm avec une zone centrale de chargement (ports O, B, S), une zone de purification par billes magnétiques et un anneau externe comportant 16 puits de réaction (15 cibles pathogènes + contrôle interne NBPF) |
| Réactifs de la réaction LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | Réactifs de la réaction LAMP préalablement stockés dans la puce CD sous forme de pastilles lyophilisées |
| Tube de liquéfaction | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; 2 mL/tube ; reçoit l'échantillon destiné à l'homogénéisation manuelle |
| Tube de lyse | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; 0,5 mL/tube ; corps en silicone compressible équipé d'une membrane filtrante de 200 µm ; contient des réactifs de lyse préchargés |
| Amorces | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | Mélange d'amorces intégré dans la chambre de réaction de la puce CD |
| Dispositif de prétraitement des échantillons | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000 ; cycle automatisé de liquéfaction–lyse (environ 15 min) |
| Flacon monodose “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; réactif préemballé sur puce ; un par test ; stocké à 4 °C et équilibré à température ambiante (environ 25 °C) avant chargement |
| Flacon monodose “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Consommable jetable ; réactif préemballé sur puce ; un par test ; stocké à 4 °C et équilibré à température ambiante (environ 25 °C) avant chargement |
Références
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Réimpressions et autorisations
