Protocole de transfection inverse optimisé pour l'administration d'ARNm de la télomérase aux fibroblastes humains en sénescence précoce

Sukanta Jash; John Sedivy

doi:10.3791/71538

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Article de méthode

Protocole de transfection inverse optimisé pour l'administration d'ARNm de la télomérase aux fibroblastes humains en sénescence précoce

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DOI :

10.3791/71538

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18 août 2026

Sukanta Jash^*¹ , John Sedivy^*¹

¹Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole de transfection inverse optimisé pour une délivrance efficace d'ARNm modifié au niveau des nucléosides codant pour la transcriptase inverse de la télomérase humaine (hTERT) (ARNm hTERT) dans des fibroblastes humains sénescents. Le pré-recouvrement des surfaces de culture avec des complexes ARNm hTERT-lipides améliore l'absorption, permettant l'activation de la télomérase, l'allongement des télomères et une réjuvénation partielle. Les cultures réintègrent finalement la sénescence ou entrent en crise sans toutefois s'immortaliser.

Résumé

La sénescence cellulaire est associée à des altérations profondes de la physiologie cellulaire, notamment une fluidité membranaire réduite, un trafic endosomal altéré, une capacité endocytaire diminuée et une activité extracellulaire accrue des RNases, ce qui entrave une livraison efficace des ARNm. Ces obstacles ont limité l'application des approches basées sur l'ARN dans les cellules sénescentes, en particulier pour la délivrance de longs transcrits thérapeutiques. Ce protocole décrit une méthode de transfection inverse optimisée permettant une livraison efficace d'ARN messager (ARNm) modifié dans des fibroblastes humains sénescents. Bien qu'un ARNm codant pour la transcriptase inverse de la télomérase humaine (hTERT) ait été utilisé comme transcrit modèle, le flux opératoire est largement applicable à d'autres ARNm. Contrairement aux méthodes conventionnelles de transfection, où les complexes ARN-lipides sont ajoutés au milieu de culture après l'attachement des cellules, la transfection inverse consiste à déposer les complexes sur la surface du milieu de culture avant la mise en culture des cellules, permettant ainsi une interaction directe entre les cellules en cours d'attachement et les complexes de transfection. Afin d'optimiser l'efficacité de la transfection, le protocole utilise un ARNm modifié par des nucléosides contenant de la pseudouridine et de la 5-méthylcytidine, des queues poly(A) prolongées, un timing optimisé de formation des complexes, une inhibition des RNases, une élévation transitoire du pH endosomal par la chloroquine, une densité de semis cellulaire accrue et des périodes d'incubation prolongées. Grâce à cette approche, des efficacités de transfection d'environ 50 % à 80 % ont été obtenues dans les fibroblastes sénescents après livraison d'un transcrit d'ARNm hTERT de 5 kb. Une activité maximale de la télomérase a été détectée 24 à 48 heures après la transfection. Un seul cycle de transfection a induit un allongement mesurable des télomères, tandis que trois transfections consécutives ont entraîné un allongement substantiel mais fini des télomères. Un rétablissement partiel des phénotypes associés à la sénescence a été observé entre 72 et 96 heures, incluant une diminution de l'activité de la β-galactosidase associée à la sénescence, une réduction de l'expression de p16 et de p21, un rétablissement de la morphologie cellulaire et une prolongation de la durée de vie réplicative. L'ARNm hTERT livré a été dégradé dans un délai de 72 à 96 heures, et aucune immortalisation n'a été observée. Ce protocole fournit une méthode pratique pour la livraison transitoire d'ARNm dans des cellules sénescentes et pourrait être adapté à un large éventail de types cellulaires et d'espèces.

Introduction

L'approche de transfection inverse représente une adaptation méthodologique essentielle pour les cellules sénescentes, permettant de surmonter les obstacles fondamentaux que ces cellules opposent aux méthodes de transfection classiques. Contrairement à la transfection directe, au cours de laquelle les cellules sont préalablement mises en culture et laissées s'attacher avant l'ajout des complexes de transfection, la transfection inverse consiste à ajouter directement les cellules en suspension sur des complexes préformés d'ARNm hTERT et de lipides. Cette technique augmente considérablement l'efficacité de la transfection dans les cellules sénescentes en maximisant l'exposition aux complexes de transfection durant la phase critique d'attachement, période au cours de laquelle le remaniement membranaire est le plus actif.

Le changement conceptuel fondamental de ce protocole consiste à considérer les cellules sénescentes comme un problème de délivrance particulier, et non simplement comme des versions difficiles à transfecter de cellules jeunes. Lors de la sénescence, des modifications globales de la composition lipidique membranaire, incluant les phospholipides, les sphingolipides et le cholestérol, altèrent la fluidité membranaire, la courbure et les interactions protéine-lipide, tout en contribuant au phénotype sécréteur associé à la sénescence¹^,²^,³. Les cellules sénescentes présentent également une endocytose récepteur-médiée dépendante de la clathrine et des cavéoles réduite, ainsi qu'un routage endocytique modifié, en partie dus à la diminution de l'amphiphysine-1 et à des adaptations compensatoires de l'expression de la cavéoline, ce qui atténue l'internalisation et la signalisation dépendantes des récepteurs⁴^,⁵^,⁶. Parallèlement, l'axe des endosomes tardifs et des lysosomes régulé par Rab7 ainsi que le réseau plus vaste endosomal-autophagique-lysosomal (EAL) deviennent dysrégulés, Rab7 agissant comme un régulateur maître de la maturation endolysosomale et de la fusion autophagosome-lysosome, processus perturbés au cours du vieillissement et des maladies neurodégénératives⁷.

Les cellules sénescentes surexpriment fréquemment plusieurs composants du système de traitement et d'adaptation lysosomale (LYPAS), notamment la biogenèse lysosomale induite par TFEB/TFE3 et l'autophagie médiée par des chaperonnes, augmentant ainsi la masse lysosomale. Toutefois, les lysosomes individuels présentent souvent un pH intraluminal élevé, des dommages membranaires et une capacité protéolytique altérée, ce qui contribue à une dysfonction lysosomale malgré leur abondance accrue⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Dans leur ensemble, ces modifications peuvent diriger plus efficacement les matériaux internalisés vers des compartiments endolysosomaux dégradatifs, augmentant ainsi la probabilité que l'ARN ou les protéines livrés soient dégradés avant une libération cytosolique productive⁹^,¹⁰^,¹¹. La transfection inverse cible directement la fenêtre temporelle la plus précoce, durant l'adhésion, lorsque les membranes se remodelent, forçant un contact prolongé et de haute affinité entre les cellules et les complexes ARNm-lipides, contournant ainsi au moins partiellement l'endocytose altérée à l'état stationnaire dans les cellules sénescentes complètement adhérentes⁴^,⁵^,⁶^,¹².

Du point de vue de la conception de l'ARN, le protocole suppose que, dans un contexte de vieillissement, une simple structure de base composée d'une coiffe et d'une queue poly(A) est insuffisante : la modification complète des nucléosides (par exemple, pseudouridine ou N1‑méthylpseudouridine associée à de la 5‑méthylcytidine) est considérée comme indispensable afin de dissocier la traduction de la détection par les récepteurs Toll-like endosomaux et de l'induction d'interféron de type I. Des travaux fondamentaux ont montré que l'incorporation de nucléosides modifiés dans l'ARN supprime l'activation des TLR3, TLR7 et TLR8, et réduit fortement la production de cytokines par les cellules dendritiques, fournissant ainsi une base mécanistique à la moindre immunogénicité innée des plateformes d'ARNm modifiées actuelles¹³. Des revues plus récentes sur les vaccins ARNm–LNP et les médicaments à base d'ARNm soulignent l'ingénierie coordonnée de la coiffe 5′, des régions non traduites (UTR), de la séquence codante et de la queue poly(A) afin d'augmenter la stabilité et la traduction in vivo, tout en minimisant l'activation de l'immunité innée¹⁴. En particulier, la longueur et l'architecture de la queue poly(A) se sont imposées comme des déterminants clés de la stabilité et du rendement traductionnel de l'ARNm transcrit in vitro, justifiant l'utilisation de conceptions poly(A) prolongées ou ingénierisées dans l'ARNm thérapeutique¹⁵.

Par ailleurs, le protocole intègre explicitement une protection contre les RNases extracellulaires et endosomales durant la formation des complexes et leur internalisation, ainsi qu'une fenêtre définie d'échappement endosomique à l'aide d'un agent lysosomotrope transitoire tel que la chloroquine¹⁶^,¹⁷. La chloroquine est depuis longtemps utilisée comme sonde fonctionnelle des barrières endosomiques et peut augmenter de manière marquée la liaison à la cible et la silencing par ARNsi ou oligonucléotides antisens en favorisant la rupture de la membrane endosomique et la libération du matériel d'acide nucléique dans le cytosol¹⁸. Parallèlement, l'imagerie en cellules vivantes et en super-résolution de l'ARNm délivré par des nanoparticules lipidiques (LNP) a montré que le transport productif est fortement limité par des événements d'échappement rares depuis les endosomes précoces ou de recyclage, plutôt que par l'internalisation initiale en tant que telle, soulignant ainsi l'importance de concevoir délibérément une étape d'échappement endosomique pour les thérapeutiques à base d'ARNm¹⁹.

Collectivement, ces altérations associées au vieillissement, concernant la dynamique membranaire, le trafic endocytaire, le traitement lysosomal et l'activation du système immunitaire inné, créent des obstacles importants à une livraison efficace des ARNm. La stratégie de transfection inverse décrite ici a été mise au point pour surmonter ces limitations en combinant une ingénierie optimisée des ARNm, une protection contre les RNases, une échappatoire endosomale améliorée et une exposition directe des cellules en phase d'attachement à des complexes préformés d'ARNm et de lipides. Bien que l'ARNm d'hTERT soit utilisé comme ARN modèle, ce protocole est largement applicable à la livraison d'autres ARNm thérapeutiques de grande taille dans des populations cellulaires sénescentes ou difficiles à transfecter²⁰^,²¹^,²².

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Protocole

1. Transcription in vitro de l'ARNm de hTERT

Transcription in vitro (IVT) avec ARCA et ΨUTP
1. Préparer une réaction IVT de 20 µL selon le Tableau 1. Adapter linéairement la réaction si un rendement plus élevé est requis.
2. Combiner tous les composants de la réaction sauf la polymérase ARN T7 dans un tube sans RNase. Ajouter la polymérase ARN T7 en dernier, mélanger délicatement, puis centrifuger brièvement le tube.
3. Incuber la réaction à 37 °C pendant 0,5 à 4 h.
  NOTA : Ajuster le temps d'incubation en fonction de la longueur du brin matrice. Incuber les réactions contenant des matrices courtes (environ 500 pb) pendant environ 30 min et celles contenant des matrices plus longues (environ 4 kb) pendant 3 à 4 h.
Traitement par DNase
1. Ajouter 1 µL de DNase I sans RNase directement dans le mélange de réaction IVT.
2. Incuber la réaction à 37 °C pendant 15 min.
  NOTA : Le traitement par DNase doit être effectué directement dans le mélange de réaction IVT, sans purification préalable de l'ARNm synthétisé.
Purification de l'ARNm
1. Ajouter 115 µL d'H₂O sans nucléase pour diluer le mélange de réaction.
2. Purifier l'ARNm à l'aide d'un kit de purification ARN selon les instructions du fabricant.
3. Éluer l'ARNm purifié dans 20 à 30 µL d'H₂O sans nucléase.
4. Mesurer la pureté de l'ARNm par spectrophotométrie et vérifier l'intégrité de l'ARN par électrophorèse sur gel d'agarose dénaturant à 1,0–1,5 % ou sur gel de polyacrylamide à faible pourcentage.
Adénylation (ajout de la queue poly(A))
1. Préparer une réaction d'adénylation de 50 µL selon le Tableau 2. Mélanger délicatement les composants de la réaction et incuber à 37 °C pendant 30 à 60 min.
  NOTA : Ajuster le temps d'incubation en fonction de la quantité d'ARN utilisé.
2. Arrêter la réaction en ajoutant 2 µL d'EDTA 0,5 M (pH 8,0).
Purification finale et contrôle qualité
1. Purifier l'ARNm adénylé à l'aide d'un kit de purification ARN selon les instructions du fabricant.
2. Éluer l'ARNm purifié dans 20 à 30 µL d'H₂O sans nucléase.
3. Évaluer la qualité de l'ARNm avant de passer à la transfection
  1. Mesurer la concentration d'ARNm à 260 nm et déterminer la pureté à l'aide des rapports A260/A280 et A260/A230. Utiliser des préparations d'ARNm dont les valeurs A260/A280 sont d'environ 2,0 et les valeurs A260/A230 supérieures à 2,0.
  2. Évaluer l'intégrité de l'ARNm par électrophorèse sur gel ou à l'aide d'un système d'analyse ARN selon les instructions du fabricant.
  3. Confirmer la longueur de la queue poly(A) par RT-PCR ou analyse sur Bioanalyzer. Vérifier que la longueur de la queue poly(A) se situe entre 120 et 200 nucléotides.
  4. Aliquoter l'ARNm purifié et conserver les aliquots à −80 °C afin de minimiser les cycles de congélation-décongélation.

2. Transfection inverse

Jour −1 : Préparation avant la transfection
1. Vérifier le phénotype sénescen
  1. Réaliser une coloration par la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal) sur un échantillon représentatif de cellules. Vérifier que plus de 70 % des cellules sont positives.
  2. Confirmer l'expression des marqueurs de sénescence (p16 et p21) par qRT-PCR ou immunofluorescence.
  3. Déterminer la viabilité cellulaire et vérifier qu'elle dépasse 90 %.
2. Préparer les réactifs
  1. Préchauffer le milieu de culture complet à 37 °C.
  2. Préchauffer le tampon phosphate-saline (PBS) à 37 °C.
  3. Préparer du milieu Opti-MEM I frais.
    NOTA : N'ajoutez pas d'inhibiteur de RNase à l'Opti-MEM I avant utilisation.
Jour 0 : Jour de la transfection
NOTA : Prévoir environ 3 h entre la préparation des réactifs et l'incubation des cellules transfectées.
1. Préparation de l'ARNm hTERT
  1. Dégeler l'ARNm hTERT sur de la glace. Mesurer la concentration en ARNm et utiliser des préparations dont la concentration est comprise entre 0,5 et 1,0 µg/µL.
  2. Diluer la quantité souhaitée d'ARNm hTERT dans l'Opti-MEM I selon le format de culture utilisé (Tableau 3). Ajouter l'inhibiteur de RNase à une concentration finale de 0,5 à 1,0 U/µL et mélanger délicatement.
  3. Garder l'ARNm dilué sur de la glace jusqu'à la formation des complexes.
    NOTA : Ajouter l'inhibiteur de RNase immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker l'ARNm avec l'inhibiteur de RNase, car son activité diminue après congélation.
2. Préparation du réactif de transfection
  1. Mélanger 6,0 µL de réactif de transfection avec 100 µL d'Opti-MEM I dans un tube stérile sans RNase. Mélanger délicatement par pipetage.
  2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
    NOTA : Pour les grands ARNm hTERT (~5 kb), optimiser les rapports réactif/ARNm entre 0,4 et 0,6 µL de réactif par 100 ng d'ARNm.
3. Formation du complexe ARNm-lipide
  1. Ajouter la solution d'ARNm hTERT diluée (100 µL) à la solution de réactif de transfection diluée (106 µL). Mélanger délicatement en pipetant 5 à 6 fois.
  2. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 à 20 min.
  3. Ne pas dépasser 30 min de complexation.
  4. Vérifier la formation réussie du complexe par l'apparition d'une solution légèrement trouble.
    NOTA : Réaliser la préparation des cellules pendant la période de complexation.
4. Préparation des cellules pour la transfection inverse
  1. Aspirer le milieu de culture des cultures cellulaires sénescents.
  2. Laver les cellules une fois avec du PBS préchauffé (2 mL par puits d'une plaque 6 puits).
  3. Ajouter 500 µL de trypsine-EDTA 0,05 % par puits.
  4. Incuber les cellules à 37 °C pendant 3 à 5 min.
  5. Neutraliser la trypsine avec 3 mL de milieu complet contenant du sérum.
  6. Triturer doucement les cellules pour obtenir une suspension monocellulaire.
  7. Déterminer le nombre de cellules à l'aide d'un hématimètre ou d'un compteur cellulaire automatisé.
  8. Préparer une suspension contenant 2,0–2,5 × 10⁵ cellules par puits dans du milieu complet.
    NOTA : Éviter une trypsination prolongée car les cellules sénescents sont très sensibles au stress mécanique. Maintenir les cellules en suspension ; ne pas les pré-plater avant la transfection inverse.
5. Transfection inverse
  1. Préparation de la plaque de culture
    1. Ajouter 500 µL de poly-L-lysine 0,01 % dans chaque puits d'une plaque 6 puits et incuber pendant 30 min à température ambiante.
    2. Aspirer la solution d'ensemencement immédiatement avant utilisation.
    3. Ajouter 200 µL du complexe ARNm hTERT-lipide au centre de chaque puits.
    4. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % CO₂ pendant 30 min.
      NOTA : Réaliser l'ensemencement de la plaque en parallèle avec la formation des complexes et la préparation des cellules.
  2. Préparation de la suspension cellulaire
    1. Suspendre 2,0–2,5 × 10⁵ cellules dans 1800 µL de milieu complet sans antibiotique.
    2. Resuspendre doucement les cellules pour obtenir une suspension monocellulaire homogène.
      NOTA : Utiliser un milieu sans antibiotique pendant la transfection.
  3. Ensemencement des cellules sur les complexes
    1. Ajouter 1800 µL de la suspension cellulaire directement sur les complexes ARNm hTERT-lipide préformés.
    2. Incliner doucement la plaque 2 à 3 fois dans chaque direction pour répartir uniformément les cellules.
      NOTA : Ne pas pipeter la suspension après l'ajout des cellules, car cela pourrait perturber les complexes ARNm-lipide.
  4. Incubation des cellules
    1. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ pendant 6 à 8 h.
    2. Surveiller l'attachement cellulaire par microscopie optique 2 à 3 h après la transfection.
    3. Vérifier que les cellules sont uniformément réparties et commencent à s'attacher à la surface de culture.
      NOTA : Un nombre excessif de cellules en suspension ou de débris cellulaires peut indiquer une cytotoxicité associée à la transfection.

3. Atténuation de la cytotoxicité

Réduire la durée d'exposition à la transfection à 48 h si la perte cellulaire dépasse 20 %.
Supplémenter les cultures avec 10 µM d'inhibiteur de ROCK, Y-27632, pendant la période de transfection afin d'améliorer la survie cellulaire.
Après 6 à 8 h de transfection, aspirer soigneusement le milieu de transfection en minimisant la perturbation des cellules partiellement attachées. Laisser environ 100 µL de milieu résiduel dans chaque puits.
Ajouter 1 mL de milieu de croissance complet frais, préalablement réchauffé et supplémenté avec 15 % de FBS, dans chaque puits.
Ajouter la chloroquine à une concentration finale de 10 à 20 µM immédiatement après le remplacement du milieu.
Incuber les cultures pendant 2 h supplémentaires à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
Remplacer le milieu contenant la chloroquine par du milieu de croissance complet frais.
Replacer les cultures dans l'incubateur pour une croissance continue.
NOTE : Surveiller la morphologie et la viabilité cellulaire tout au long de la période de récupération. Un détachement cellulaire excessif ou la présence de débris peuvent indiquer une cytotoxicité associée à la transfection.

4. Analyse après transfection

Évaluer l'expression protéique de TERT 24 à 48 heures après la transfection.
Mesurer les niveaux de la protéine TERT par immunoblot ou coloration en immunofluorescence selon les procédures de laboratoire standard.
Mesurer l'activité de la télomérase durant le même intervalle à l'aide d'un dosage approprié de l'activité télomérasique.
NOTE : L'activité télomérasique diminue généralement après 48 heures en raison de la dégradation de l'ARNm hTERT transféré de façon transitoire.
Évaluer la longueur des télomères 48 à 72 heures après la transfection à l'aide de la PCR quantitative multiplex monochrome (MMqPCR) ou d'une méthode équivalente d'analyse de la longueur des télomères.
NOTE : Un allongement détectable des télomères peut être observé suite à une livraison réussie de l'ARNm hTERT.
Évaluer les phénotypes associés au vieillissement cellulaire et à la rajeunissement 7 jours après la transfection
1. Mesurer l'activité de la β-galactosidase associée au vieillissement (SA-β-gal).
2. Mesurer les niveaux d'expression de p16 et de p21.
3. Évaluer l'expression de Ki67.
4. Examiner la morphologie cellulaire par microscopie optique.
  NOTE : Comparer les cultures traitées avec des témoins non traités ou transférés avec un faux transgène (mock-transfected) et âgés afin d'évaluer les changements dans les phénotypes associés au vieillissement et les caractéristiques prolifératives.

5. Protocole de doses répétées (facultatif)

Réaliser la transfection initiale comme décrit dans les sections 2 à 4.
Répéter les transfections selon le calendrier suivant : jour 0 : première transfection ; jour 5 : deuxième transfection ; jours 10 à 12 : troisième transfection.
Conserver les cellules en culture adhérente et ne pas les trypsiner avant les transfections suivantes.
Préparer des complexes frais d'ARNm hTERT–lipides comme décrit dans les sections 2.2.1 à 2.2.3.
Aspirer le milieu de culture de chaque puits.
Ajouter directement 200 µL de complexes d'ARNm hTERT–lipides dans chaque puits.
Ajouter immédiatement 800 µL de milieu F-10 complet frais après l'ajout des complexes.
Incuber les cellules pendant 4 à 6 h à 37 °C dans un incubateur humide contenant 5 % de CO₂.
Remplacer le milieu de transfection par du milieu complet frais.
REMARQUE : Limiter le traitement à un maximum de trois cycles de transfection afin de minimiser la cytotoxicité cumulative associée à la transfection.

6. Protocole de transfection directe (2 µg/mL, format 6 puits)

Jour −1 : Semis des cellules
1. Détacher les fibroblastes sénescents ou pré-sénescents à l’aide de trypsine-EDTA 0,05 %.
2. Neutraliser la trypsine avec un milieu de culture complet.
3. Déterminer le nombre de cellules et leur viabilité.
4. Ensemencer les cellules dans des plaques de 6 puits à une densité de 2,0–2,5 × 10⁵ cellules par puits.
5. Incuber les cellules toute la nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence d’environ 60–80 %.
Jour 0 : Préparation des complexes ARNm-hTERT–réactif
1. Dégeler un aliquot d’ARNm hTERT modifié au niveau des nucléosides sur de la glace.
2. Diluer l’ARNm hTERT dans du Opti-MEM pour obtenir une concentration finale de 2 µg/mL dans un tube stérile sans RNase (Tube A).
3. Ajouter un inhibiteur de RNase dans le Tube A pour atteindre une concentration finale de 0,5–1,0 U/µL et mélanger délicatement.
4. Diluer le réactif de transfection dans du Opti-MEM dans un second tube sans RNase (Tube B), en utilisant 0,4–0,6 µL de réactif par 100 ng d’ARNm.
5. Ajouter goutte à goutte le contenu du Tube B dans le Tube A tout en mélangeant doucement.
6. Incuber le mélange à température ambiante pendant 15 à 20 minutes.
Jour 0 : Transfection directe
1. Vérifier que les cellules présentent une confluence de 60 à 80 % et une morphologie saine.
2. Aspirer le milieu de culture.
3. Laver les cellules une fois avec 1 à 2 mL de PBS préalablement réchauffé.
4. Ajouter 0,5 mL de milieu complet ou à teneur réduite en sérum, préalablement réchauffé, dans chaque puits.
5. Éventuellement, ajouter du chloroquine à une concentration finale de 10 à 20 µM.
6. Ajouter 0,5 mL des complexes ARNm-hTERT–réactif préparés à l’étape 6.2.6 dans chaque puits.
7. Agiter doucement la plaque pour répartir uniformément les complexes.
8. Incuber les cellules pendant 4 à 6 heures à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
  REMARQUE : Prolonger la durée d’incubation à 6–8 heures pour les cellules sénescentes si nécessaire.
9. Aspirer le milieu de transfection.
10. Ajouter 2,0 mL de milieu complet frais dans chaque puits.
11. Effectuer les analyses post-transfection décrites dans la section 4.
  REMARQUE : Utiliser la même préparation d’ARNm hTERT, le même réactif de transfection et la même dose nominale lors de la comparaison des conditions de transfection directe et inverse.

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Résultats

Le modARNm d2EGFP-T2A-hTERT a été conçu comme un cadre de lecture ouvert hybride dans lequel un rapporteur EGFP instable (d2EGFP) était relié à la TERT humaine par un peptide auto-clivable T2A. Les séquences complètes en nucléotides et en protéines de toutes les constructions sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1. La séquence codante était encadrée par une région non traduite (UTR) 5′ synthétique et l’UTR 3′ de la β-globine humaine afin d’augmenter l’efficacité de la traduction et la stabilité d...

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Discussion

Cette étude redéfinit le vieillissement cellulaire comme un problème de délivrance particulier, plutôt que comme une simple variation de la physiologie proliférative, et développe une stratégie de transfection par ARNm de la télomérase adaptée aux contraintes biophysiques et immunologiques de l'état sénescen. Les cellules sénescen présentent des membranes rigidifiées enrichies en cholestérol et une activité endocytique réduite, créant ainsi une barrière importante à une délivrance efficace des acides nucléiques. En adopt...

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Déclarations de divulgation

J.M.S. est cofondateur et président du comité consultatif scientifique de Transposon Therapeutics.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH) P01 AG051449, R01 AG016694 et R01 AG078925 attribuées à JS.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher	11550043	Milieu de culture cellulaire.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog	New England Biolab	S1411L	Pour la plupart des ARN, la structure de capuchon augmente la stabilité, diminue la sensibilité à la dégradation par les exonucléases et favorise la formation de complexes d'initiation de l'ARNm.
5-Methyl-Cytidine-5´-Triphosphate (5-Methyl-CTP)	New England Biolab	N0432S	Les NTP modifiés sont couramment utilisés pour réduire l'immunogénicité des ARN transcrits in vitro.
Plaque 6 puits	Corning	351146	Pour cultiver et traiter des volumes moyens à élevés de cellules adhérentes ou en suspension dans des conditions expérimentales indépendantes.
Anticorps anti-Ki67 (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 est principalement exprimé dans les cellules proliférantes.
Kit d'analyse de sénescence cellulaire (coloration SA-bêta-gal)	cellbiolabs	CBA-230	Identification des cellules sénescentes par le test de coloration SA-β-gal.
Tubes DNA LoBind 0,5 ml	Eppendorf	022431005	Pour récupérer efficacement l'ADN et l'ARN sans aucune perte.
Tubes DNA LoBind 1,5 ml	Eppendorf	22431021	Pour récupérer efficacement l'ADN et l'ARN sans aucune perte.
DNase I, sans RNase (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	La DNase I, sans RNase, est une endonucléase qui digère l'ADN simple et double brin.
Poly(A) polymérase d’E. coli	New England Biolab	M0276S	Dans Escherichia coli, la poly(A) polymérase I (PAP I) agit principalement comme un catalyseur pour l'ajout, indépendant du modèle, de résidus d'adénosine monophosphate (AMP) à l'extrémité 3' des molécules d'ARN.
Sérum de veau fœtal	Thermo Fisher	A5256701	Supplément pour milieu de culture cellulaire
Kit HiScribe T7 ARCA mRNA	New England Biolab	E2065S	Le kit HiScribe T7 ARCA mRNA (avec rallongement) est conçu pour la production rapide d'ARNm capé ARCA et doté d'une queue poly(A) in vitro. Les ARNm capés sont synthétisés par incorporation co-transcriptionnelle d'un analogue de capuchon anti-inversion (ARCA) à l'aide de la polymérase ARN T7.
Kit HiScribe T7 mRNA avec réactif CleanCap AG	New England Biolab	E2080S	les kits HiScribe T7 mRNA avec réactif CleanCap AG permettent la production rapide et simplifiée d'un ou de plusieurs transcrits avec des rendements typiques de ≥90 μg par réaction,
LongAmp Hot Start Taq ADN polymérase	New England Biolab	M0534S	La LongAmp Hot Start Taq ADN polymérase offre des performances exceptionnelles avec des amplicons longs.
Transcriptase inverse M-MuLV	New England Biolab	M0253L	La transcriptase inverse M-MuLV synthétise un brin d'ADN complémentaire amorcé à partir d'un initiateur en utilisant soit l'ARN (synthèse d'ADNc) soit l'ADN simple brin comme matrice.
Kit Monarch de purification rapide de l'ARN par colonne (50 μg)	New England Biolab	T2040L	La fonction principale du kit Monarch® de purification rapide de l'ARN par colonne (50 μg) est de purifier et concentrer jusqu'à 50 μg d'ARN de haute qualité provenant de réactions enzymatiques ou de mélanges d'extraction.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolab	E2621L	Le mélange maître NEBuilder HiFi DNA Assembly permet l'assemblage fluide de plusieurs fragments d'ADN, quelle que soit leur longueur ou la compatibilité de leurs extrémités. Il est utile pour la communauté de biologie synthétique, ainsi que pour le clonage en une seule étape de plusieurs fragments, grâce à sa facilité d'utilisation, sa souplesse et son format simple de mélange maître.
Opti-MEM - Milieu à faible teneur en sérum	Thermo Fisher	31985070	Pour maximiser l'efficacité de transfection cellulaire lors de la formation de complexes lipides-charge utile. Il constitue un environnement optimisé et chimiquement défini qui maintient une viabilité élevée des cellules de mammifères tout en réduisant le besoin de supplémentation standard en sérum.
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	L'utilisation fonctionnelle principale du tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,4 est de maintenir un pH stable et un équilibre osmotique pour les cellules de mammifères et les molécules biologiques.
Bandes PCR	Thermo Fisher	AB0776	L'utilisation fonctionnelle principale des tubes en bande PCR (généralement en format 8 ou 12 bandes) est de contenir des réactions liquides à faible volume pendant le cyclage thermique à haut débit.
Poly-L-lysine hydrobromure	Millipore Sigma	P4707-50ML	L'utilisation fonctionnelle principale du poly-L-lysine (PLL) hydrobromure pour l'attachement cellulaire est de recouvrir des surfaces solides chargées négativement (comme le verre ou le plastique) afin de créer un substrat hautement adhésif chargé positivement.
Pseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	Le pseudouridine-5´-triphosphate (Pseudo-UTP) est couramment utilisé pour réduire l'immunogénicité des ARN transcrits in vitro.
Jeu de solutions de ribonucléotides	New England Biolab	N0450L	Quatre solutions séparées d'ATP, de GTP, de CTP et d'UTP.
Inhibiteur ROCK Y-27632 (dihydrochlorure)	Stem cell technologies	72302	Le Y-27632 est un inhibiteur cellulaire, très puissant et sélectif, de la kinase associée à Rho contenant un domaine enroulé (ROCK). Le Y-27632 inhibe à la fois ROCK1 (Ki = 220 nM) et ROCK2 (Ki = 300 nM) en compétition avec l'ATP pour la liaison au site catalytique
Eau de qualité RT-PCR	Thermo Fisher	AM9935	L'utilisation fonctionnelle principale de l'eau de qualité RT-PCR (souvent étiquetée comme eau sans nucléase) est de servir de solvant ultra-pur pour des tests enzymatiques sensibles où toute contamination dégraderait l'échantillon ou inhiberait l'amplification.
SUPERase·In inhibiteur de RNase	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In inhibiteur de RNase est un inhibiteur protéique d'origine non humaine qui se lie de manière non covalente et inhibe les RNases les plus courantes et problématiques, notamment les RNases A, B, C, 1 et T1.
Colorant SYBR Green I pour gélatine d'acides nucléiques	Thermo Fisher	S7563	L'utilisation fonctionnelle principale du colorant SYBR™ Green I pour gélatine d'acides nucléiques est de visualiser et quantifier l'ADN double brin (ADNdb) dans des gélatines d'agarose ou de polyacrylamide.
Kit de transfection TransIT-mRNA	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Réactif de transfection à haute efficacité et faible toxicité pour les grands ARN.
Kit de détection de la télomérase TRAPeze	Millipore Sigma	S7700	Le test TRAP (protocole d'amplification des répétitions télomériques) est une méthode PCR sensible et largement utilisée pour détecter et mesurer l'activité de la télomérase dans les cellules et échantillons tissulaires de mammifères. Il comprend trois étapes principales : l'extension des répétitions télomériques par la télomérase, l'amplification de ces produits par PCR, puis leur détection.
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol	Thermo Fisher	25300054	Pour détacher les cellules de mammifères adhérentes des récipients de culture lors du passage courant des cellules (sous-culture) et de leur récolte.

Références

Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

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