miR-486-3p supprime les phénotypes malins et est associé à une réduction de l'expression de WNT5B, DVL1 et de la β-caténine dans les cellules de carcinome pulmonaire adénomateux

Wanli Cheng; Weibo Qi; Niu Niu; Junjie Zhao

doi:10.3791/71545

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Article de recherche

miR-486-3p supprime les phénotypes malins et est associé à une réduction de l'expression de WNT5B, DVL1 et de la β-caténine dans les cellules de carcinome pulmonaire adénomateux

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DOI :

10.3791/71545

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21 août 2026

Wanli Cheng^*¹ , Weibo Qi^*¹ , Niu Niu¹ , Junjie Zhao¹

¹Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La surexpression forcée de miR-486-3p supprime l'activité associée à la prolifération, la croissance clonogénique, la fermeture de la plaie et la migration à travers le Matrigel dans les cellules d'adénocarcinome pulmonaire A549 et H358. Ces effets s'accompagnent d'une réduction de l'expression de WNT5B, DVL1, β-catenin et BCL-2, indiquant une association in vitro avec des modifications liées à la voie Wnt, sans toutefois établir un ciblage direct ou une causalité au sein de la voie.

Résumé

Le carcinome adénocarcinomateux du poumon (LUAD) est le sous-type histologique prédominant du cancer du poumon non à petites cellules et reste associé à une morbidité et une mortalité importantes. Des études antérieures ont identifié des fonctions suppresseur de tumeur de miR-486-3p dans le LUAD, mais sa relation avec les modifications d'expression liées à WNT5B, DVL1 et à la β-caténine n'a pas été clairement définie. Ici, l'abondance basale de miR-486-3p a été examinée dans les cellules de LUAD A549 et H358 et comparée à celle des cellules épithéliales bronchiques Beas-2b cultivées dans leurs conditions habituelles respectives. Des modèles stables surexprimant miR-486-3p ont été générés par transduction lentivirale. L'activité liée à la croissance cellulaire, la croissance clonogénique, la fermeture de la plaie et la traversée de membranes revêtues de Matrigel ont été évaluées à l'aide des tests au kit de comptage cellulaire-8, de formation de colonies, de cicatrisation des plaies et de migration dans des inserts Transwell. L'abondance des protéines WNT5B, DVL1, β-caténine et BCL-2 a été évaluée par immunoblotting, et les niveaux d'ARNm de WNT5B, DVL1, CTNNB1 et BCL2 ont été supplémentairement analysés par RT-qPCR. Dans les conditions de culture utilisées, l'abondance de miR-486-3p était plus faible dans les cellules A549 et H358 que dans les cellules Beas-2b, et la transduction lentivirale a permis une surexpression stable dans les deux lignées cellulaires de LUAD. La surexpression forcée de miR-486-3p a réduit le signal CCK-8, la formation de colonies, la fermeture de la plaie et la traversée de membranes revêtues de Matrigel, et s'est accompagnée d'une diminution de l'abondance protéique de WNT5B, DVL1, de la β-caténine totale et de BCL-2. La RT-qPCR a en outre montré une diminution de l'abondance des transcrits de WNT5B, DVL1, CTNNB1 et BCL2 dans les deux lignées cellulaires de LUAD après surexpression de miR-486-3p. Ces résultats soutiennent une association in vitro entre l'expression forcée de miR-486-3p, l'atténuation de plusieurs paramètres caractéristiques des cellules malignes et une modification de l'expression liée à la voie Wnt ; toutefois, ils n'établissent pas de liaison directe entre le miARN et sa cible, ni l'activité de la voie ou un mécanisme de signalisation linéaire causal.

Introduction

Le carcinome adénocarcinome pulmonaire (LUAD) est le sous-type histologique le plus fréquent du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) et contribue de manière importante à la morbidité et à la mortalité liées au cancer du poumon dans le monde entier¹^,²^,³^,⁴^,⁵. La classification moléculaire et les thérapies ciblées ont amélioré les résultats pour certains groupes de patients, mais le LUAD avancé reste difficile à traiter et est biologiquement hétérogène¹^,²^,³^,⁴^,⁵. La définition des processus régulateurs qui contribuent au comportement des cellules malignes reste donc pertinente pour l'élaboration d'hypothèses thérapeutiques pouvant être testées.

La signalisation Wnt comprend des voies dépendantes de β-caténine et indépendantes de β-caténine, qui régulent la prolifération, la survie, la polarité et la motilité⁶^,⁷^,⁸^,⁹. WNT5B est généralement associé à la signalisation non canonique, bien que ses effets biologiques varient selon le récepteur et le contexte cellulaire¹⁰^,¹¹. DVL1 est une protéine cytoplasmique de transduction du signal partagée par plusieurs voies Wnt et a été associé à des comportements liés à β-caténine dans le cancer du poumon¹². Par conséquent, des modifications concomitantes de WNT5B, DVL1 et β-caténine ne doivent pas être interprétées en soi comme une preuve d'une voie linéaire unique.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression des gènes par des interactions dépendantes de la séquence avec des transcrits cibles¹³^,¹⁴^,¹⁵. Étant donné qu'un seul miARN peut affecter plusieurs ARN, une modification de l'abondance des miARN peut influencer divers phénotypes associés aux tumeurs¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Plusieurs miARN ont été associés à la croissance, à la motilité et à la signalisation du cancer du poumon, et des interactions entre les miARN et les réseaux liés à la voie Wnt ont été décrites dans de nombreux contextes de cancer¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Le locus MIR486 donne naissance aux brins matures miR-486-3p et miR-486-5p. Le miR-486-3p a montré une activité suppresseur de tumeur dans le cancer buccal et le glioblastome, tandis qu'un effet promoteur de tumeur a été rapporté dans le carcinome spinocellulaire cutané²¹^,²²^,²³^,²⁴^,²⁵. Le miR-486-3p a été sélectionné pour la présente étude selon une stratégie fondée sur une hypothèse, basée sur sa faible abondance dans les données publiques de LUAD, son activité suppresseur de tumeur précédemment rapportée dans le LUAD, et des prédictions bioinformatiques l'associant à des transcrits candidats liés à la voie WNT. Tomioka et al. ont démontré des effets suppresseurs de tumeur des deux brins du miR-486 dans le LUAD et ont identifié GINS4 par criblage ciblé à l'échelle du génome²⁶. Par conséquent, la présente étude ne prétend pas démontrer pour la première fois un phénotype antitumoral. Elle évalue plutôt si une surexpression forcée du miR-486-3p s'accompagne de modifications de l'abondance de WNT5B, DVL1 et de la β-caténine, ainsi que de changements phénotypiques reproductibles dans deux lignées cellulaires de LUAD. Ces analyses permettent d'évaluer des associations, mais n'établissent ni le ciblage direct, ni l'activité de la voie, ni un mécanisme linéaire WNT5B/DVL1/β-caténine.

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Protocole

Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.

Culture cellulaire

Des lignées cellulaires de carcinome adénocarcinomateux du poumon humain (LUAD) A549 et H358, ainsi que la lignée épithéliale bronchique immortalisée Beas-2b ont été utilisées. Les lignées A549 (KRAS G12S) et H358 (KRAS G12C ; déficiente en STK11) ont été choisies comme modèles couramment utilisés de LUAD présentant des fonds génétiques distincts porteurs de mutations KRAS, tandis que Beas-2b a été incluse comme témoin non cancéreux d'épithélium bronchique. Les cellules A549 et H358 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640, et les cellules Beas-2b dans un milieu DMEM ; chaque milieu contenait 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂. Étant donné que les lignées cellulaires tumorales et la lignée épithéliale témoin étaient entretenues dans des milieux de culture différents, les comparaisons d'expression de base entre les lignées cellulaires ont été interprétées avec prudence.

Transduction par rétrovirus lentiviral et sélection stable des cellules

Des vecteurs rétroviraux lentiviraux portant le précurseur de l'hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) ou une séquence contrôle négative aléatoire (LV-NC) ont été utilisés dans un dispositif expérimental de gain de fonction stable. Les cellules A549 et H358 ont été semées dans des plaques de 6 puits à raison de 5 × 10⁴ cellules par puits et cultivées pendant une nuit. Le jour suivant, les cellules ont été exposées au lentivirus à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 en présence de 8 µg/mL de polybrene. Après 24 h, l'inoculum viral a été remplacé par un milieu complet frais. Les cellules transduites ont été sélectionnées avec 2 µg/mL de puromycine pendant 7 jours. Après sélection, les cellules survivantes ont été laissées en reprise et amplifiées pour les tests moléculaires et fonctionnels ultérieurs. Aucune branche avec un inhibiteur de miR-486-3p n'a été incluse, car la présente étude a été conçue spécifiquement pour évaluer les effets d'une surexpression forcée stable.

REMARQUE : Le MOI, la durée d'exposition à la polybrene et les conditions de sélection à la puromycine doivent être maintenues identiques entre les groupes LV-NC et LV-miR-486-3p afin de minimiser les différences liées au traitement concernant la viabilité cellulaire.

RT-qPCR

La RT-qPCR a été réalisée afin de déterminer les niveaux d'expression de miR-486-3p et de confirmer l'efficacité de la surexpression lentivirale dans les cellules A549 et H358. L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol conformément aux instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l'ARN ont été évaluées par spectrophotométrie, un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,1 étant considéré comme acceptable. Pour l'analyse des ARNm, 1 µg d'ARN total a été rétrotranscrit en ADNc à l'aide d'un kit commercial de synthèse d'ADNc selon le protocole du fabricant. Pour l'analyse des microARN, la synthèse d'ADNc a été effectuée à l'aide d'un crible de transcription inverse spécifique du microARN, de type stem-loop. La PCR quantitative a été réalisée dans un volume réactionnel total de 20 µL contenant 10 µL de mélange maître 2× SYBR Green, 0,4 µM de chaque amorces et 2 µL de matrice d'ADNc. Le protocole d'amplification comprenait une étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 5 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s et d'hybridation/extension à 60 °C pendant 30 s. Une analyse de courbe de fusion a ensuite été réalisée pour vérifier la spécificité de l'amplification. L'ARN nucléolaire petit U6 a servi de témoin interne pour la quantification des microARN, tandis que GAPDH a été utilisé comme gène de référence pour la normalisation des ARNm. Les niveaux d'expression relatifs ont été déterminés selon la méthode 2^−ΔΔCq.

Les séquences des amorces pour les miARN étaient les suivantes : amorce de transcription inverse en boucle-stémie, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′ ; amorce avant miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′ ; amorce arrière universelle, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′ ; amorce avant U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ ; et amorce arrière U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Les séquences des amorces pour WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 et GAPDH, ainsi que les longueurs des amplicons et les efficacités d'amplification, sont indiquées dans Tableau 1. L'expression des ARNm a été normalisée par rapport à GAPDH, tandis que l'expression du miR-486-3p a été normalisée par rapport à U6. Chaque expérience comprenait trois réplicats biologiques indépendants, avec trois réplicats techniques par réplicat biologique.

Immunotransfert

Après la sélection de 7 jours par la puromycine et une période de récupération, les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéase. La concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un dosage protéique BCA. Des quantités équivalentes de protéines (20 µg par piste) ont été séparées sur des gels de SDS-PAGE à 10 % et transférées sur des membranes PVDF par transfert humide à 300 mA pendant 120 min. Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % préparé dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20 (TBST), pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre WNT5B (1:1 000), DVL1 (1:1 000), β-catenin (1:1 000), BCL-2 (0,5 µg/mL) ou β-actin (1:5 000). Les fabricants et les numéros de catalogue de tous les anticorps sont indiqués dans le tableau des matériaux. Après trois lavages de 10 min avec du TBST, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP), dilué à 1:5 000, pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont ensuite été lavées trois fois avec du TBST, et les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat chimiluminescent et capturées à l’aide d’un système de documentation et d’imagerie de gels. L’intensité des bandes a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ. L’abondance de chaque protéine cible a été normalisée par rapport au signal correspondant de β-actin provenant du même échantillon biologique. Seules les expositions se situant dans la plage linéaire de détection, non saturée, ont été utilisées pour l’analyse densitométrique. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées.

Essai Cell Counting Kit-8

Des cellules A549 et H358 transduites de façon stable avec LV-NC ou LV-miR-486-3p ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à raison de 1,5 × 10⁴ cellules/puit dans 100 µL de milieu complet. Après une nuit d’attachement, le milieu a été remplacé et l’absorbance à 0 h a été mesurée immédiatement après l’ajout du réactif du kit de comptage cellulaire (Cell Counting Kit-8). Aux temps 0 h, 24 h, 48 h, 72 h et 96 h, 10 µL de réactif ont été ajoutés par puit, puis incubés pendant 1 h à 37 °C avant la lecture de l’absorbance à 450 nm. Pour l’analyse cinétique révisée, chaque groupe a été normalisé à sa propre valeur à 0 h avant représentation graphique. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées, et les puits techniques au sein de chaque expérience ont été moyennés avant l’analyse statistique.

Dosage de formation de colonies

Des cellules A549 et H358 sélectionnées de façon stable ont été préparées sous forme de suspensions monocellulaires à raison de 5 × 10² cellules/mL. Un millilitre de suspension cellulaire a été semé par puits dans une plaque 6 puits, puis complété par 3 mL de milieu complet. Les cellules ont été cultivées pendant 14 jours, avec un renouvellement du milieu tous les 5 jours. Les colonies ont été lavées au PBS, fixées pendant 20 minutes avec du paraformaldéhyde 4 %, colorées à la violet de crésyl pendant 20 minutes, rincées puis séchées à l’air. Les colonies comprenant au moins 50 cellules ont été dénombrées à l’aide d’ImageJ. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées.

REMARQUE : Une suspension uniforme de cellules isolées et une perturbation minimale de la plaque pendant l'établissement des colonies sont nécessaires pour éviter un regroupement artificiel des cellules.

Test de migration cellulaire

Des cellules A549 et H358 transduites de manière stable ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits et cultivées jusqu'à la formation d'une monocouche confluente. Une estafilade droite a été réalisée à l'aide d'un embout de pipette stérile de 10 µL, les cellules détachées ont été éliminées, et les mêmes champs marqués ont été photographiés à 0 h, 24 h, 48 h et 72 h. La surface de la lésion a été mesurée à l'aide d'ImageJ, et la fermeture de la plaie a été calculée selon la formule suivante : (surface à 0 h − surface au temps indiqué) / surface à 0 h × 100 %. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées. Aucun inhibiteur pharmacologique de la prolifération n'a été utilisé ; par conséquent, ce test a été interprété comme une mesure de la fermeture de la plaie plutôt qu'un indicateur spécifique de migration.

REMARQUE : Les rayures doivent être produites avec une largeur et une pression constantes, et les mêmes champs doivent être suivis tout au long du cours du temps.

Test d'invasion cellulaire

Des tests d'invasion Transwell ont été réalisés à l'aide d'inserts en membrane de polycarbonate à 24 puits, dotés de pores de 8 µm de diamètre. La surface supérieure de chaque insert a été recouverte de 100 µL de matrice membranaire basale Matrigel diluée au sérum libre de DMEM selon un rapport de 1:8, afin d'obtenir une concentration finale approximative en protéines de 1 mg/mL, puis incubée à 37 °C pendant 4 h. Les cellules A549 et H358 ont été reprises dans un milieu RPMI-1640 sans sérum à des densités respectives de 8 × 10⁵ cellules/mL et de 4 × 10⁵ cellules/mL. Un aliquot de 200 µL de la suspension cellulaire a été ajouté dans la chambre supérieure, correspondant à 1,6 × 10⁵ cellules A549 ou à 8 × 10⁴ cellules H358 par insert. La chambre inférieure a été remplie de 500 µL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % de sérum bovin fœtal servant de chimiopréférent. Après une incubation de 48 h à 37 °C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂, les cellules non envahissantes restant sur la surface supérieure de la membrane ont été délicatement retirées à l’aide d’un coton-tige. Les cellules ayant traversé la membrane ont été fixées pendant 20 min avec du paraformaldéhyde 4 %, puis colorées pendant 20 min à température ambiante avec du violet de crésyl 0,1 %. Cinq champs microscopiques choisis aléatoirement ont été photographiés pour chaque insert, et le nombre de cellules ayant envahi a été quantifié à l’aide du logiciel ImageJ. Le nombre moyen de cellules comptées dans les cinq champs a été considéré comme une seule valeur par insert, et c’est l’insert, et non le champ microscopique individuel, qui a été pris comme unité expérimentale. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées.

REMARQUE : Retirer délicatement et uniformément les cellules non envahissantes afin d'éviter d'endommager la membrane ou de déloger les cellules qui ont migré vers sa surface inférieure.

Analyse statistique

Les données sont présentées comme la moyenne ± SD, et n indique le nombre d'expériences biologiques indépendantes, sauf indication contraire. Les réplicats techniques ou les différents champs microscopiques provenant d'une même unité expérimentale ont été moyennés avant les tests inférentiels. Pour la comparaison entre les trois lignées cellulaires, une analyse de variance à un facteur suivie de comparaisons par paires ajustées selon Tukey a été utilisée. Pour les cinétiques de CCK-8 et de fermeture de la plaie, une analyse de variance à deux facteurs avec mesures répétées a été employée afin d'évaluer les effets du traitement, du temps et de l'interaction traitement-par-temps, suivie de comparaisons ajustées selon Šídák à chaque point temporel. Les comparaisons entre deux groupes ont été analysées à l'aide d'un test t de Student non apparié bilatéral. tests t. Les analyses statistiques et la visualisation des données ont été effectuées à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique et de graphisme. Exacte pLes valeurs sont indiquées dans les panneaux des figures ou dans les tableaux de données brutes. La signification statistique a été définie comme étant p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 et ****p < 0.0001.

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Résultats

L'analyse TCGA/starBase montre une abondance réduite de miR-486-3p dans le LUAD, et TargetScan identifie des sites de liaison candidats

Les données d'expression issues de TCGA et accessibles via starBase v3.0 ont montré que miR-486-3p l'abondance était significativement plus faible dans 512 échantillons de carcinome pulmonaire à cellules adénocarcinomateuses (LUAD) que dans 20 échantillons pulmonaires non tumoraux (test de Wilcoxon, somme des rangs) p = 3.2 ×...

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Discussion

La présente étude d'acquisition de fonction a évalué les effets d'une expression stable et forcée de miR-486-3p dans les cellules de carcinome pulmonaire à adénocarcinome (LUAD) A549 et H358. Dans les deux modèles, la surexpression de miR-486-3p était associée à une diminution des signaux CCK-8 liés à la croissance, à une réduction de la croissance clonogénique, à une fermeture plus lente des blessures et à un nombre moindre de cellules traversant des membranes Transwell revêtues de Matrigel. Ces modifications phénotypiq...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d'intérêts.

Remerciements

Le Plan scientifique et technologique médical et de santé de la province du Zhejiang (2025KY349) et la Discipline clé soutenue de la ville de Jiaxing (2023-zc-014) ont fourni un appui financier à cette étude.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tris-HCl 1 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020	Préparation du gel concentrateur SDS-PAGE
Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010	Préparation du gel de séparation SDS-PAGE
Solution tampon TBS 20×	Solarbio	71080	Solution mère pour les lavages en immunotransfert et la dilution des anticorps
Solution d'acrylamide/bis-acrylamide 30 % (29:1)	Solarbio	A1010	Préparation des gels SDS-PAGE
Fixateur au paraformaldéhyde 4 %	Servicebio	G1101	Fixation pour les tests de formation de colonies et les essais Transwell
Solution de charge des protéines 5×	Beyotime	P0015	Préparation des échantillons protéiques pour SDS-PAGE
Persulfate d'ammonium	Solarbio	427A038	Initiateur de polymérisation du gel SDS-PAGE
Kit d'analyse des protéines BCA	Beyotime	P0009-1	Dosage de la concentration en protéines
Anticorps anti-BCL-2	Boster Biological Technology	A00040-2	Anticorps polyclonal de lapin ; immunotransfert à 1:5 000
Kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8)	TargetMol	C0005	Essai d'activité métabolique associée à la croissance cellulaire ; 10 μL par 100 μL de milieu de culture
Système d'imagerie chimiluminescente	Bio-Rad	ChemiDoc MP	Imagerie en immunotransfert
Chloroforme	Servicebio	G3005	Séparation des phases lors de l'extraction d'ARN par TRIzol
Solution de coloration au violet de crésyl	Servicebio	G1014	Coloration des colonies et des membranes Transwell
DMEM	Servicebio	G4511	Milieu de culture courant pour les cellules Beas-2b
Anticorps anti-DVL1	Signalway Antibody	53180	Anticorps primaire de lapin ; immunotransfert à 1:5 000
Sérum de veau fœtal (FBS)	Biosharp	BL203B	Supplément à 10 % (v/v) pour la culture cellulaire courante ; 20 % (v/v) dans la chambre inférieure Transwell
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	Version 8	Préparation des graphiques et analyse statistique
Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (sans Rox)	Yeasen Biotechnology	11201ES08	PCR quantitative basée sur le SYBR Green
Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix pour qPCR (avec digesteur d'ADNg)	Yeasen Biotechnology	11141ES60	Transcription inverse pour RT-qPCR des ARNm
IBM SPSS Statistics	IBM	Version 22,0	Analyse statistique
ImageJ	National Institutes of Health	Version 1,53	Densitométrie en immunotransfert, mesure de la surface de la plaie, comptage des colonies et comptage cellulaire Transwell
Microscope inversé	Olympus	CKX53	Imagerie des essais de cicatrisation et des essais Transwell
Isopropanol	Servicebio	G3006	Précipitation de l'ARN lors de l'extraction par TRIzol
Préparations lentivirales LV-miR-486-3p et LV-NC	GenePharma	Synthèse sur mesure	Vecteur d'overexpression stable de miR-486-3p et vecteur contrôle négatif aléatoire
Matrice de membrane basale Matrigel	Corning	354234	Diluée 1:8 dans du DMEM sans sérum ; concentration finale en protéines d'environ 1 mg/mL
Méthanol	Xilong Scientific	GB/T 683-2006	Activation de la membrane PVDF
Lecteur de microplaques	BioTek	ELx800	Mesure de l'absorbance à 450 nm
Spectrophotomètre UV-Vis microvolume	Allsheng	Nano-600	Dosage de la concentration en ARN et évaluation de la pureté A260/A280
Pénicilline-streptomycine	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15240062	Supplément à 1 % (v/v) pour la culture cellulaire courante
Solution tampon phosphate-saline (PBS)	Servicebio	G0002	Lavage des cellules et des membranes
Cocktail d'inhibiteurs de protéases	APExBIO	K1007	Ajouté au tampon de lyse RIPA
Marqueur de poids moléculaire	Biosharp	BL712A	Référence de poids moléculaire pour immunotransfert
Membrane PVDF	Millipore	K2MA8350E	Membrane de transfert protéique pour immunotransfert
Système de PCR en temps réel QuantStudio 5	Thermo Fisher Scientific	QuantStudio 5	Acquisition des données RT-qPCR
Tampon de lyse RIPA	Beyotime	P0013B	Extraction des protéines cellulaires totales
Réactif d'extraction d'ARN (type TRIzol)	Servicebio	G3013	Extraction totale d'ARN
Milieu RPMI 1640	Servicebio	G4510	Milieu de culture courant pour les cellules A549 et H358 et suspension cellulaire Transwell sans sérum
SDS	Solarbio	S8010	Réactif SDS-PAGE
Poudre de lait écrémé	BD	2271470	Solution de blocage à 5 % pour immunotransfert
StarBase v3.0	Sun Yat-sen University	https://rnasysu.com/encori/	Analyse de l'expression de miR-486-3p issue de TCGA
TargetScanHuman	Whitehead Institute for Biomedical Research	https://www.targetscan.org/vert_80/	Prédiction des sites candidats de liaison de miR-486-3p
TEMED	Sigma-Aldrich	T8090	Catalyseur de polymérisation du gel SDS-PAGE
Inserts Transwell, 24 puits, taille de pore 8 μm	Corning	3428	Essai de migration à travers membrane revêtue de Matrigel
Tripsine	Servicebio	G4000	Détachement cellulaire
Tween-20	Solarbio	815A043	Préparation du tampon de lavage pour immunotransfert
Système électrophorétique vertical	Liuyi Biotechnology	DYCZ-24DN	Séparation des protéines par SDS-PAGE
Réactif chimiluminescent au luminol pour détection HRP en immunotransfert	Affinity Biosciences	KF001	Détection immunotransfert chimiluminescente
Système de transfert humide	Bio-Rad	1703930	Transfert des protéines sur membrane PVDF
Anticorps anti-WNT5B	Signalway Antibody	56808	Anticorps primaire de lapin ; immunotransfert à 1:5 000
Anticorps anti-β-actine	Abcam	ab8227	Témoin de charge ; immunotransfert à 1:5 000
Anticorps anti-β-caténine	Signalway Antibody	21725	Anticorps primaire de lapin ; immunotransfert à 1:5 000

Références

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