La surexpression forcée de miR-486-3p supprime l'activité associée à la prolifération, la croissance clonogénique, la fermeture de la plaie et la migration à travers le Matrigel dans les cellules d'adénocarcinome pulmonaire A549 et H358. Ces effets s'accompagnent d'une réduction de l'expression de WNT5B, DVL1, β-catenin et BCL-2, indiquant une association in vitro avec des modifications liées à la voie Wnt, sans toutefois établir un ciblage direct ou une causalité au sein de la voie.
Article de recherche
miR-486-3p supprime les phénotypes malins et est associé à une réduction de l'expression de WNT5B, DVL1 et de la β-caténine dans les cellules de carcinome pulmonaire adénomateux
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le carcinome adénocarcinomateux du poumon (LUAD) est le sous-type histologique prédominant du cancer du poumon non à petites cellules et reste associé à une morbidité et une mortalité importantes. Des études antérieures ont identifié des fonctions suppresseur de tumeur de miR-486-3p dans le LUAD, mais sa relation avec les modifications d'expression liées à WNT5B, DVL1 et à la β-caténine n'a pas été clairement définie. Ici, l'abondance basale de miR-486-3p a été examinée dans les cellules de LUAD A549 et H358 et comparée à celle des cellules épithéliales bronchiques Beas-2b cultivées dans leurs conditions habituelles respectives. Des modèles stables surexprimant miR-486-3p ont été générés par transduction lentivirale. L'activité liée à la croissance cellulaire, la croissance clonogénique, la fermeture de la plaie et la traversée de membranes revêtues de Matrigel ont été évaluées à l'aide des tests au kit de comptage cellulaire-8, de formation de colonies, de cicatrisation des plaies et de migration dans des inserts Transwell. L'abondance des protéines WNT5B, DVL1, β-caténine et BCL-2 a été évaluée par immunoblotting, et les niveaux d'ARNm de WNT5B, DVL1, CTNNB1 et BCL2 ont été supplémentairement analysés par RT-qPCR. Dans les conditions de culture utilisées, l'abondance de miR-486-3p était plus faible dans les cellules A549 et H358 que dans les cellules Beas-2b, et la transduction lentivirale a permis une surexpression stable dans les deux lignées cellulaires de LUAD. La surexpression forcée de miR-486-3p a réduit le signal CCK-8, la formation de colonies, la fermeture de la plaie et la traversée de membranes revêtues de Matrigel, et s'est accompagnée d'une diminution de l'abondance protéique de WNT5B, DVL1, de la β-caténine totale et de BCL-2. La RT-qPCR a en outre montré une diminution de l'abondance des transcrits de WNT5B, DVL1, CTNNB1 et BCL2 dans les deux lignées cellulaires de LUAD après surexpression de miR-486-3p. Ces résultats soutiennent une association in vitro entre l'expression forcée de miR-486-3p, l'atténuation de plusieurs paramètres caractéristiques des cellules malignes et une modification de l'expression liée à la voie Wnt ; toutefois, ils n'établissent pas de liaison directe entre le miARN et sa cible, ni l'activité de la voie ou un mécanisme de signalisation linéaire causal.
Introduction
Le carcinome adénocarcinome pulmonaire (LUAD) est le sous-type histologique le plus fréquent du cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) et contribue de manière importante à la morbidité et à la mortalité liées au cancer du poumon dans le monde entier1,2,3,4,5. La classification moléculaire et les thérapies ciblées ont amélioré les résultats pour certains groupes de patients, mais le LUAD avancé reste difficile à traiter et est biologiquement hétérogène1,2,3,4,5. La définition des processus régulateurs qui contribuent au comportement des cellules malignes reste donc pertinente pour l'élaboration d'hypothèses thérapeutiques pouvant être testées.
La signalisation Wnt comprend des voies dépendantes de β-caténine et indépendantes de β-caténine, qui régulent la prolifération, la survie, la polarité et la motilité6,7,8,9. WNT5B est généralement associé à la signalisation non canonique, bien que ses effets biologiques varient selon le récepteur et le contexte cellulaire10,11. DVL1 est une protéine cytoplasmique de transduction du signal partagée par plusieurs voies Wnt et a été associé à des comportements liés à β-caténine dans le cancer du poumon12. Par conséquent, des modifications concomitantes de WNT5B, DVL1 et β-caténine ne doivent pas être interprétées en soi comme une preuve d'une voie linéaire unique.
Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codants qui régulent l'expression des gènes par des interactions dépendantes de la séquence avec des transcrits cibles13,14,15. Étant donné qu'un seul miARN peut affecter plusieurs ARN, une modification de l'abondance des miARN peut influencer divers phénotypes associés aux tumeurs13,14,15,16,17,18. Plusieurs miARN ont été associés à la croissance, à la motilité et à la signalisation du cancer du poumon, et des interactions entre les miARN et les réseaux liés à la voie Wnt ont été décrites dans de nombreux contextes de cancer16,17,18,19,20.
Le locus MIR486 donne naissance aux brins matures miR-486-3p et miR-486-5p. Le miR-486-3p a montré une activité suppresseur de tumeur dans le cancer buccal et le glioblastome, tandis qu'un effet promoteur de tumeur a été rapporté dans le carcinome spinocellulaire cutané21,22,23,24,25. Le miR-486-3p a été sélectionné pour la présente étude selon une stratégie fondée sur une hypothèse, basée sur sa faible abondance dans les données publiques de LUAD, son activité suppresseur de tumeur précédemment rapportée dans le LUAD, et des prédictions bioinformatiques l'associant à des transcrits candidats liés à la voie WNT. Tomioka et al. ont démontré des effets suppresseurs de tumeur des deux brins du miR-486 dans le LUAD et ont identifié GINS4 par criblage ciblé à l'échelle du génome26. Par conséquent, la présente étude ne prétend pas démontrer pour la première fois un phénotype antitumoral. Elle évalue plutôt si une surexpression forcée du miR-486-3p s'accompagne de modifications de l'abondance de WNT5B, DVL1 et de la β-caténine, ainsi que de changements phénotypiques reproductibles dans deux lignées cellulaires de LUAD. Ces analyses permettent d'évaluer des associations, mais n'établissent ni le ciblage direct, ni l'activité de la voie, ni un mécanisme linéaire WNT5B/DVL1/β-caténine.
Protocole
Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le Tableau des matériaux.
Culture cellulaire
Des lignées cellulaires de carcinome adénocarcinomateux du poumon humain (LUAD) A549 et H358, ainsi que la lignée épithéliale bronchique immortalisée Beas-2b ont été utilisées. Les lignées A549 (KRAS G12S) et H358 (KRAS G12C ; déficiente en STK11) ont été choisies comme modèles couramment utilisés de LUAD présentant des fonds génétiques distincts porteurs de mutations KRAS, tandis que Beas-2b a été incluse comme témoin non cancéreux d'épithélium bronchique. Les cellules A549 et H358 ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640, et les cellules Beas-2b dans un milieu DMEM ; chaque milieu contenait 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂. Étant donné que les lignées cellulaires tumorales et la lignée épithéliale témoin étaient entretenues dans des milieux de culture différents, les comparaisons d'expression de base entre les lignées cellulaires ont été interprétées avec prudence.
Transduction par rétrovirus lentiviral et sélection stable des cellules
Des vecteurs rétroviraux lentiviraux portant le précurseur de l'hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) ou une séquence contrôle négative aléatoire (LV-NC) ont été utilisés dans un dispositif expérimental de gain de fonction stable. Les cellules A549 et H358 ont été semées dans des plaques de 6 puits à raison de 5 × 104 cellules par puits et cultivées pendant une nuit. Le jour suivant, les cellules ont été exposées au lentivirus à une multiplicité d'infection (MOI) de 10 en présence de 8 µg/mL de polybrene. Après 24 h, l'inoculum viral a été remplacé par un milieu complet frais. Les cellules transduites ont été sélectionnées avec 2 µg/mL de puromycine pendant 7 jours. Après sélection, les cellules survivantes ont été laissées en reprise et amplifiées pour les tests moléculaires et fonctionnels ultérieurs. Aucune branche avec un inhibiteur de miR-486-3p n'a été incluse, car la présente étude a été conçue spécifiquement pour évaluer les effets d'une surexpression forcée stable.
REMARQUE : Le MOI, la durée d'exposition à la polybrene et les conditions de sélection à la puromycine doivent être maintenues identiques entre les groupes LV-NC et LV-miR-486-3p afin de minimiser les différences liées au traitement concernant la viabilité cellulaire.
RT-qPCR
La RT-qPCR a été réalisée afin de déterminer les niveaux d'expression de miR-486-3p et de confirmer l'efficacité de la surexpression lentivirale dans les cellules A549 et H358. L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol conformément aux instructions du fabricant. La concentration et la pureté de l'ARN ont été évaluées par spectrophotométrie, un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,1 étant considéré comme acceptable. Pour l'analyse des ARNm, 1 µg d'ARN total a été rétrotranscrit en ADNc à l'aide d'un kit commercial de synthèse d'ADNc selon le protocole du fabricant. Pour l'analyse des microARN, la synthèse d'ADNc a été effectuée à l'aide d'un crible de transcription inverse spécifique du microARN, de type stem-loop. La PCR quantitative a été réalisée dans un volume réactionnel total de 20 µL contenant 10 µL de mélange maître 2× SYBR Green, 0,4 µM de chaque amorces et 2 µL de matrice d'ADNc. Le protocole d'amplification comprenait une étape initiale de dénaturation à 95 °C pendant 5 min, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s et d'hybridation/extension à 60 °C pendant 30 s. Une analyse de courbe de fusion a ensuite été réalisée pour vérifier la spécificité de l'amplification. L'ARN nucléolaire petit U6 a servi de témoin interne pour la quantification des microARN, tandis que GAPDH a été utilisé comme gène de référence pour la normalisation des ARNm. Les niveaux d'expression relatifs ont été déterminés selon la méthode 2−ΔΔCq.
Les séquences des amorces pour les miARN étaient les suivantes : amorce de transcription inverse en boucle-stémie, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′ ; amorce avant miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′ ; amorce arrière universelle, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′ ; amorce avant U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ ; et amorce arrière U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Les séquences des amorces pour WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 et GAPDH, ainsi que les longueurs des amplicons et les efficacités d'amplification, sont indiquées dans Tableau 1. L'expression des ARNm a été normalisée par rapport à GAPDH, tandis que l'expression du miR-486-3p a été normalisée par rapport à U6. Chaque expérience comprenait trois réplicats biologiques indépendants, avec trois réplicats techniques par réplicat biologique.
Immunotransfert
Après la sélection de 7 jours par la puromycine et une période de récupération, les cellules ont été lysées dans un tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéase. La concentration en protéines a été déterminée à l’aide d’un dosage protéique BCA. Des quantités équivalentes de protéines (20 µg par piste) ont été séparées sur des gels de SDS-PAGE à 10 % et transférées sur des membranes PVDF par transfert humide à 300 mA pendant 120 min. Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % préparé dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20 (TBST), pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre WNT5B (1:1 000), DVL1 (1:1 000), β-catenin (1:1 000), BCL-2 (0,5 µg/mL) ou β-actin (1:5 000). Les fabricants et les numéros de catalogue de tous les anticorps sont indiqués dans le tableau des matériaux. Après trois lavages de 10 min avec du TBST, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP), dilué à 1:5 000, pendant 1 h à température ambiante. Les membranes ont ensuite été lavées trois fois avec du TBST, et les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat chimiluminescent et capturées à l’aide d’un système de documentation et d’imagerie de gels. L’intensité des bandes a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ. L’abondance de chaque protéine cible a été normalisée par rapport au signal correspondant de β-actin provenant du même échantillon biologique. Seules les expositions se situant dans la plage linéaire de détection, non saturée, ont été utilisées pour l’analyse densitométrique. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées.
Essai Cell Counting Kit-8
Des cellules A549 et H358 transduites de façon stable avec LV-NC ou LV-miR-486-3p ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à raison de 1,5 × 104 cellules/puit dans 100 µL de milieu complet. Après une nuit d’attachement, le milieu a été remplacé et l’absorbance à 0 h a été mesurée immédiatement après l’ajout du réactif du kit de comptage cellulaire (Cell Counting Kit-8). Aux temps 0 h, 24 h, 48 h, 72 h et 96 h, 10 µL de réactif ont été ajoutés par puit, puis incubés pendant 1 h à 37 °C avant la lecture de l’absorbance à 450 nm. Pour l’analyse cinétique révisée, chaque groupe a été normalisé à sa propre valeur à 0 h avant représentation graphique. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées, et les puits techniques au sein de chaque expérience ont été moyennés avant l’analyse statistique.
Dosage de formation de colonies
Des cellules A549 et H358 sélectionnées de façon stable ont été préparées sous forme de suspensions monocellulaires à raison de 5 × 102 cellules/mL. Un millilitre de suspension cellulaire a été semé par puits dans une plaque 6 puits, puis complété par 3 mL de milieu complet. Les cellules ont été cultivées pendant 14 jours, avec un renouvellement du milieu tous les 5 jours. Les colonies ont été lavées au PBS, fixées pendant 20 minutes avec du paraformaldéhyde 4 %, colorées à la violet de crésyl pendant 20 minutes, rincées puis séchées à l’air. Les colonies comprenant au moins 50 cellules ont été dénombrées à l’aide d’ImageJ. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées.
REMARQUE : Une suspension uniforme de cellules isolées et une perturbation minimale de la plaque pendant l'établissement des colonies sont nécessaires pour éviter un regroupement artificiel des cellules.
Test de migration cellulaire
Des cellules A549 et H358 transduites de manière stable ont été ensemencées dans des plaques de 6 puits et cultivées jusqu'à la formation d'une monocouche confluente. Une estafilade droite a été réalisée à l'aide d'un embout de pipette stérile de 10 µL, les cellules détachées ont été éliminées, et les mêmes champs marqués ont été photographiés à 0 h, 24 h, 48 h et 72 h. La surface de la lésion a été mesurée à l'aide d'ImageJ, et la fermeture de la plaie a été calculée selon la formule suivante : (surface à 0 h − surface au temps indiqué) / surface à 0 h × 100 %. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées. Aucun inhibiteur pharmacologique de la prolifération n'a été utilisé ; par conséquent, ce test a été interprété comme une mesure de la fermeture de la plaie plutôt qu'un indicateur spécifique de migration.
REMARQUE : Les rayures doivent être produites avec une largeur et une pression constantes, et les mêmes champs doivent être suivis tout au long du cours du temps.
Test d'invasion cellulaire
Des tests d'invasion Transwell ont été réalisés à l'aide d'inserts en membrane de polycarbonate à 24 puits, dotés de pores de 8 µm de diamètre. La surface supérieure de chaque insert a été recouverte de 100 µL de matrice membranaire basale Matrigel diluée au sérum libre de DMEM selon un rapport de 1:8, afin d'obtenir une concentration finale approximative en protéines de 1 mg/mL, puis incubée à 37 °C pendant 4 h. Les cellules A549 et H358 ont été reprises dans un milieu RPMI-1640 sans sérum à des densités respectives de 8 × 105 cellules/mL et de 4 × 105 cellules/mL. Un aliquot de 200 µL de la suspension cellulaire a été ajouté dans la chambre supérieure, correspondant à 1,6 × 105 cellules A549 ou à 8 × 104 cellules H358 par insert. La chambre inférieure a été remplie de 500 µL de milieu RPMI-1640 contenant 20 % de sérum bovin fœtal servant de chimiopréférent. Après une incubation de 48 h à 37 °C dans une atmosphère humide contenant 5 % de CO₂, les cellules non envahissantes restant sur la surface supérieure de la membrane ont été délicatement retirées à l’aide d’un coton-tige. Les cellules ayant traversé la membrane ont été fixées pendant 20 min avec du paraformaldéhyde 4 %, puis colorées pendant 20 min à température ambiante avec du violet de crésyl 0,1 %. Cinq champs microscopiques choisis aléatoirement ont été photographiés pour chaque insert, et le nombre de cellules ayant envahi a été quantifié à l’aide du logiciel ImageJ. Le nombre moyen de cellules comptées dans les cinq champs a été considéré comme une seule valeur par insert, et c’est l’insert, et non le champ microscopique individuel, qui a été pris comme unité expérimentale. Trois expériences biologiques indépendantes ont été réalisées.
REMARQUE : Retirer délicatement et uniformément les cellules non envahissantes afin d'éviter d'endommager la membrane ou de déloger les cellules qui ont migré vers sa surface inférieure.
Analyse statistique
Les données sont présentées comme la moyenne ± SD, et n indique le nombre d'expériences biologiques indépendantes, sauf indication contraire. Les réplicats techniques ou les différents champs microscopiques provenant d'une même unité expérimentale ont été moyennés avant les tests inférentiels. Pour la comparaison entre les trois lignées cellulaires, une analyse de variance à un facteur suivie de comparaisons par paires ajustées selon Tukey a été utilisée. Pour les cinétiques de CCK-8 et de fermeture de la plaie, une analyse de variance à deux facteurs avec mesures répétées a été employée afin d'évaluer les effets du traitement, du temps et de l'interaction traitement-par-temps, suivie de comparaisons ajustées selon Šídák à chaque point temporel. Les comparaisons entre deux groupes ont été analysées à l'aide d'un test t de Student non apparié bilatéral. tests t. Les analyses statistiques et la visualisation des données ont été effectuées à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique et de graphisme. Exacte pLes valeurs sont indiquées dans les panneaux des figures ou dans les tableaux de données brutes. La signification statistique a été définie comme étant p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 et ****p < 0.0001.
Résultats
L'analyse TCGA/starBase montre une abondance réduite de miR-486-3p dans le LUAD, et TargetScan identifie des sites de liaison candidats
Les données d'expression issues de TCGA et accessibles via starBase v3.0 ont montré que miR-486-3p l'abondance était significativement plus faible dans 512 échantillons de carcinome pulmonaire à cellules adénocarcinomateuses (LUAD) que dans 20 échantillons pulmonaires non tumoraux (test de Wilcoxon, somme des rangs) p = 3.2 × 10⁻5; Figure 1). TargetScanHuman a identifié un site candidat 7mer-m8 peu conservé pour miR-486-3p aux positions 468–474 du DVL1 région non traduite 3′ (3′ UTR), avec un score context++ de −0,23 et un centile de score context++ de 80. Un site candidat 8mer peu conservé a été identifié aux positions 913–920 de la WNT5B 3′ UTR, avec un score context++ de −0,46 et un centile de score context++ de 97 (Figure 2). Ces sites prédits par calcul ont été utilisés pour formuler l'hypothèse expérimentale et n'ont pas été considérés comme une preuve de liaison directe entre le ARNmi et sa cible. Les URL sources sont fournies dans Tableau 2.
L'abondance de miR-486-3p est réduite dans les lignées cellulaires de CUPA et fortement augmentée après transduction lentivirale
Dans leurs conditions de culture habituelles respectives, l'analyse par RT-qPCR a montré que l'abondance de miR-486-3p était plus faible dans les cellules A549 et H358 que dans les cellules épithéliales bronchiques Beas-2b. Des comparaisons ajustées selon Tukey après une analyse de variance à un facteur ont révélé des différences significatives entre les cellules A549 et Beas-2b (p < 0,01) et entre les cellules H358 et Beas-2b (p < 0,001 ; Figure 3A).
La transduction stable avec LV-miR-486-3p a nettement augmenté l'abondance de miR-486-3p par rapport aux groupes LV-NC correspondants. L'expression a augmenté d'environ 1 470 fois dans les cellules A549 et de 220 fois dans les cellules H358, les deux comparaisons atteignant une signification statistique (p < 0,001 ; Figure 3B,C). Ces résultats ont confirmé la mise en place réussie de modèles cellulaires stables surexprimant miR-486-3p.
L'expression forcée de miR-486-3p est associée à une réduction de l'expression de WNT5B, DVL1, β-catenin et BCL-2
Le transfert Western a montré une abondance protéique moindre de WNT5B, DVL1, de la β-catenine totale et de BCL-2 dans les cellules transduites par LV-miR-486-3p par rapport aux témoins respectifs LV-NC (Figure 4A–E). Dans les cellules A549, une expression forcée de miR-486-3p était associée à une réduction de l'abondance protéique de la β-catenine (p = 0,022), de WNT5B (p = 0,0008), de DVL1 (p = 0,019) et de BCL-2 (p = 0,0017). Des réductions correspondantes ont également été observées dans les cellules H358 pour la β-catenine (p = 0,001), WNT5B (p = 0,0002), DVL1 (p = 0,0003) et BCL-2 (p = 0,0018).
Une RT-qPCR a ensuite été réalisée afin de déterminer si des changements au niveau des transcrits accompagnaient les résultats protéiques (Figure 4F–I). Dans les cellules A549, l'expression forcée de miR-486-3p a réduit l'ARNm de CTNNB1 à 0,226 fois par rapport au groupe LV-NC (p = 0,004), l'ARNm de WNT5B à 0,180 fois (p = 0,004), l'ARNm de DVL1 à 0,278 fois (p = 0,006) et l'ARNm de BCL2 à 0,259 fois (p = 0,003).
Des modifications similaires au niveau des transcrits ont été détectées dans les cellules H358. L'ARNm de CTNNB1 a été réduit à 0,288 fois celui du groupe LV-NC (p = 0,028), l'ARNm de WNT5B à 0,250 fois (p = 0,019), l'ARNm de DVL1 à 0,271 fois (p = 0,020) et l'ARNm de BCL2 à 0,534 fois (p = 0,003). Ainsi, le sens des modifications au niveau des transcrits était cohérent avec les résultats correspondants au niveau protéique dans les deux lignées cellulaires. Ces résultats montrent des changements coordonnés d'expression, mais ne permettent pas d'établir un ciblage direct ni l'activité d'un mécanisme de signalisation linéaire WNT5B/DVL1/β-caténine.
L'expression forcée de miR-486-3p réduit le signal CCK-8 associé à la croissance
Les mesures CCK-8 ont été normalisées par rapport à la valeur correspondante à 0 h pour chaque groupe expérimental. Le signal CCK-8 normalisé a augmenté au fil du temps à la fois dans les cellules transduites par LV-NC et celles transduites par LV-miR-486-3p, mais des valeurs plus faibles ont généralement été observées après l'expression forcée de miR-486-3p (Figure 5).
Dans les cellules A549, des comparaisons ajustées selon Šídák après une analyse de variance à deux facteurs avec mesures répétées ont montré des signaux CCK-8 significativement plus faibles dans le groupe LV-miR-486-3p à 24, 48 et 96 h par rapport au groupe LV-NC (p < 0,05), tandis que la différence à 72 h n’était pas statistiquement significative (Figure 5A). Dans les cellules H358, le signal CCK-8 était significativement plus faible dans le groupe LV-miR-486-3p à 24, 48, 72 et 96 h (p < 0,05 ; Figure 5B). Ces résultats indiquent qu'une surexpression forcée de miR-486-3p réduit l'activité métabolique associée à la croissance, avec un effet plus constant tout au long du cours temporel chez les cellules H358.
L'expression forcée de miR-486-3p réduit la croissance clonogène
Des tests de formation de colonies ont été réalisés afin d'évaluer la croissance clonogénique à long terme. Les cellules A549 transduites avec le LV-miR-486-3p ont formé significativement moins de colonies que les cellules correspondantes LV-NC (p = 0,013 ; Figure 6A). Une réduction significative du nombre de colonies a également été observée dans les cellules H358 (p = 0,006 ; Figure 6B). Cette réduction était plus marquée dans les cellules H358 que dans les cellules A549, indiquant que l'ampleur de l'effet clonogénique différait entre les deux modèles de LUAD.
L'expression forcée de miR-486-3p réduit la fermeture de la plaie
La fermeture de la plaie a été quantifiée à 24 h, 48 h et 72 h après le grattage (Figure 7). Dans les cultures de A549, le groupe LV-miR-486-3p a montré une fermeture de la plaie significativement plus faible que le groupe LV-NC à 24, 48 et 72 h (p < 0,05 pour chaque comparaison ; Figure 7A,C).
De même, la fermeture de la plaie a été réduite dans les cultures de H358 transduites par LV-miR-486-3p à 24 h et 48 h (p < 0,05) ainsi qu’à 72 h (p < 0,01 ; Figure 7B,D). Étant donné que le test a été réalisé sans inhibiteur pharmacologique de la prolifération, ces résultats ont été interprétés comme une réduction de la fermeture de la plaie, plutôt que comme une preuve d’un effet spécifique exclusivement à la migration.
L'expression forcée de miR-486-3p réduit la traversée des membranes revêtues de Matrigel
La capacité des cellules à traverser les membranes Transwell revêtues de Matrigel a été évaluée après 48 h. Un nombre significativement inférieur de cellules colorées au violet de criste a été détecté sur la surface inférieure de la membrane dans le groupe A549 LV-miR-486-3p par rapport au groupe A549 LV-NC (p = 0,0001 ; Figure 8A). Une réduction similaire a été observée dans les cellules H358 (p = 0,0007 ; Figure 8B).
Cinq champs microscopiques ont été moyennés pour chaque insert, et l'insert a été considéré comme l'unité expérimentale. Ces résultats démontrent une traversée réduite des membranes revêtues de Matrigel suite à l'expression forcée de miR-486-3p dans les conditions utilisées lors de ce dosage.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Toutes les données brutes à l'origine des figures sont incluses dans le Fichier supplémentaire 1, y compris les fichiers sources de la base de données, les données de RT-qPCR, les immunotransferts Western non recadrés, les valeurs de densitométrie, les images de microscopie, les registres de dénombrement, les mesures au CCK-8 et les fichiers d'analyse statistique.
Figure 1 : Abondance de miR-486-3p dans des échantillons de LUAD et de tissu pulmonaire normal provenant de TCGA/starBase. Les données d'expression issues de TCGA ont été récupérées via starBase v3.0 en mai 2026 et comprenaient 512 échantillons de carcinome adénoïde du poumon (LUAD) et 20 échantillons de tissu pulmonaire normal. Les groupes ont été comparés à l'aide du test de somme des rangs de Wilcoxon (p = 3,2 × 10⁻5). LUAD, carcinome adénoïde du poumon. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Sites candidats de liaison du miR-486-3p prédits par TargetScan dans les régions 3′ UTR de DVL1 et WNT5B. TargetScanHuman a identifié un site candidat de type 7mer-m8 aux positions 468–474 de la région 3′ non traduite (3′ UTR) de DVL1 et un site candidat de type 8mer aux positions 913–920 du 3′ UTR de WNT5B. Les URL sources sont indiquées dans le tableau 2. Ces prédictions informatiques ont servi à générer des hypothèses et ne constituent pas une preuve expérimentale d'une liaison directe. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Abondance initiale de miR-486-3p et vérification de la surexpression par lentivirus. (AAnalyse RT-PCR quantitative miR-486-3p abondance dans les cellules A549, H358 et Beas-2b maintenues dans leurs milieux de culture habituels respectifs. (B,C) Vérification par RT-qPCR de miR-486-3p surexpression dans A549 (B) et H358 (C) cellules transduites avec LV-NC ou LV-miR-486-3p. L'expression a été normalisée à U6. Les données sont exprimées comme moyenne ± ÉT de trois expériences biologiques indépendantes. (A) a été analysé par une ANOVA à un facteur suivie de comparaisons multiples ajustées selon Tukey. (B,C) ont été analysés à l'aide du test t de Student non apparié bilatéral t-tests. *p < 0.01; **p < 0,001. LV-NC, rétrovirus lentiviral contrôle négatif ; RT-qPCR, PCR quantitative par transcription inverse ; DS, écart type. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L'expression forcée du miR-486-3p est associée à une réduction de l'expression des gènes candidats. (A) Immunoblots représentatifs montrant l'abondance de β-catenin, WNT5B, DVL1, BCL-2 et β-actin dans les cellules A549 et H358 transduites avec LV-NC ou LV-miR-486-3p. Les masses moléculaires sont indiquées en kilodaltons. (B–E) Quantification densitométrique de β-catenin (B), WNT5B (C), DVL1 (D) et BCL-2 (E), normalisée à β-actin. (F–I) Analyse RT-qPCR de l'abondance des transcrits de CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H) et BCL2 (I), normalisée à GAPDH. Les données sont présentées comme moyenne ± SD provenant de trois expériences biologiques indépendantes ; chaque point représente un réplicat biologique indépendant. Les groupes ont été comparés à l'aide de tests t de Student non appariés bilatéraux. Les valeurs exactes de p et les facteurs de variation sont indiqués dans les panneaux correspondants. kDa, kilodaltons ; LV-NC, rétrovirus lentiviral contrôle négatif ; RT-qPCR, PCR quantitative avec transcription inverse ; SD, écart type. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : L'expression forcée de miR-486-3p réduit au fil du temps les signaux de CCK-8 associés à la croissance. Les cellules A549 (A) et H358 (B) transduites avec LV-NC ou LV-miR-486-3p ont été analysées à 0 h, 24 h, 48 h, 72 h et 96 h. Les valeurs d'OD450 ont été normalisées par rapport à la valeur correspondante à 0 h dans chaque groupe. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (SD) provenant de trois expériences biologiques indépendantes. Les effets du traitement, du temps et de l'interaction traitement-par-temps ont été analysés à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées, suivie de comparaisons ajustées selon Šídák entre les groupes à chaque point temporel. *p < 0,05. CCK-8, Cell Counting Kit-8 ; LV-NC, rétrovirus lentiviral contrôle négatif ; OD450, densité optique à 450 nm ; SD, écart-type. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : L'expression forcée de miR-486-3p réduit la croissance clonogénique. Des images représentatives de puits entiers et des décomptes quantitatifs de colonies sont présentés pour les cellules A549 (A) et H358 (B) transduites avec LV-NC ou LV-miR-486-3p. La quantification des colonies a été réalisée à l’aide d’ImageJ avec des paramètres d’analyse identiques pour tous les groupes. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type (ET) provenant de trois expériences biologiques indépendantes et ont été analysées à l’aide de tests t de Student non appariés bilatéraux. Les valeurs p exactes sont indiquées dans les panneaux correspondants. LV-NC, rétrovirus lentiviral contrôle négatif ; ET, écart-type. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : L'expression forcée du miR-486-3p réduit la fermeture de la plaie. Des images représentatives et des mesures quantitatives de la fermeture de la plaie sont présentées pour les cellules A549 (A,C) et H358 (B,D) à 0 h, 24 h, 48 h et 72 h après griffure. La fermeture de la plaie a été calculée selon la formule suivante : (surface de la plaie à 0 h − surface de la plaie au temps indiqué) / surface de la plaie à 0 h × 100 %. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type (SD) provenant de trois expériences biologiques indépendantes. Les effets du traitement, du temps et de l'interaction traitement-par-temps ont été analysés à l'aide d'une ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées, suivie de comparaisons ajustées selon Šídák entre les groupes à chaque point temporel. Échelles, 200 µm. *p < 0,05 ; **p < 0,01. LV-NC, rétrovirus lentiviral contrôle négatif ; SD, écart-type. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 8: L'expression forcée de miR-486-3p réduit la traversée des membranes Transwell revêtues de Matrigel. Des champs microscopiques représentatifs colorés au violet de crésyl et des décomptes quantitatifs des cellules au niveau des inserts sont présentés pour les A549 (A) et H358 (B) cellules transduites avec LV-NC ou LV-miR-486-3p. Inserts Transwell avec un pore de 8-µm la taille des pores utilisée. La moyenne de cinq champs microscopiques a été calculée pour chaque insert, et chaque insert a été considéré comme une unité expérimentale. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de trois expériences biologiques indépendantes et ont été analysées à l'aide d'un test t de Student non apparié bilatéral t-tests. Échelles, 200 µm. Exact pLes valeurs sont indiquées dans les panneaux correspondants. LV-NC, rétrovirus lentiviral contrôle négatif ; DS, déviation standard. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
| Gène | Séquences des amorces | Longueurs des amplicons | Efficacités d'amplification | |
| WNT5B | Sens : 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 pb | 101 % | |
| Antisens : 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Sens : 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 pb | 95,60 % | |
| Antisens : 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Sens : 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 pb | 96,30 % | |
| Antisens : 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Sens : 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 pb | 97,20 % | |
| Antisens : 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Sens : 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 pb | 98,30 % | |
| Antisens : 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tableau 1 : Séquences des amorces utilisées pour la RT-qPCR.
| Cible | Informations de prédiction | Source | ||
| DVL1 | 7mer-m8, positions 468–474 | URL TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, positions 913–920 | URL TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
Tableau 2 : Base de données TargetScan et URL correspondante.
Fichier supplémentaire 1 : Données soutenant les résultats de cette étude.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
La présente étude d'acquisition de fonction a évalué les effets d'une expression stable et forcée de miR-486-3p dans les cellules de carcinome pulmonaire à adénocarcinome (LUAD) A549 et H358. Dans les deux modèles, la surexpression de miR-486-3p était associée à une diminution des signaux CCK-8 liés à la croissance, à une réduction de la croissance clonogénique, à une fermeture plus lente des blessures et à un nombre moindre de cellules traversant des membranes Transwell revêtues de Matrigel. Ces modifications phénotypiques étaient accompagnées d'une diminution de l'abondance protéique de WNT5B, DVL1, β-catenine totale et BCL-2, ainsi que de niveaux transcriptiques inférieurs pour WNT5B, DVL1, CTNNB1 et BCL2. Dans leur ensemble, ces résultats soutiennent une association entre l'expression forcée de miR-486-3p, l'atténuation de plusieurs phénotypes cellulaires malins et des modifications coordonnées de certaines molécules liées à la voie Wnt. Toutefois, ils n'établissent pas de liaison directe entre le microARN et sa cible, ni l'activité de la voie ou une séquence de signalisation causale.
Le phénotype suppresseur de tumeur général observé dans cette étude est conforme aux rapports antérieurs et ne doit pas être interprété comme la découverte principale et novatrice. Tomioka et al. ont précédemment démontré que miR-486-3p et miR-486-5p suppriment tous deux les phénotypes malins dans les cellules de CUPA et ont identifié GINS4 au moyen d'une stratégie de criblage ciblé sans biais26. La contribution de la présente étude est plus précise : l'expression forcée de miR-486-3p s'est accompagnée d'une réduction de l'abondance de WNT5B, DVL1 et de la β-caténine dans deux modèles cellulaires de CUPA. En outre, l'étude propose un protocole expérimental intégré combinant la transduction lentivirale stable, la RT-qPCR, le transfert Western, l'analyse CCK-8, la formation de colonies, la fermeture de blessure et des tests Transwell recouverts de Matrigel. Cette distinction est importante car les travaux actuels approfondissent les observations moléculaires associées à la surexpression de miR-486-3p, sans revendiquer la première démonstration de son activité antitumorale dans la CUPA.
Les découvertes liées à Wnt nécessitent une interprétation prudente. WNT5B est couramment décrit comme un ligand Wnt non canonique et peut activer la signalisation de la polarité cellulaire planaire ou la voie Wnt/Ca2⁺ de manière dépendante du récepteur et du contexte. Dans certains contextes cellulaires, la signalisation Wnt non canonique peut également s'opposer à la signalisation dépendante de β-caténine10,11. DVL1 est un médiateur intracellulaire commun qui peut participer à la fois à la signalisation Wnt canonique et non canonique et a été associé à des phénotypes liés à la β-caténine dans le cancer du poumon non à petites cellules12. Par conséquent, la réduction simultanée de WNT5B, de DVL1 et de la β-caténine totale ne démontre pas une voie linéaire WNT5B→DVL1→β-caténine. Les données actuelles indiquent plutôt des réductions concomitantes de l'expression de WNT5B et de l'abondance de DVL1 et de β-caténine après une surexpression forcée de miR-486-3p.
Les résultats au niveau des transcrits étaient directionnellement cohérents avec les observations obtenues par immunobuvardage. L'expression forcée de miR-486-3p a réduit l'abondance des transcrits WNT5B, DVL1 et CTNNB1 dans les cellules A549 et H358. Cette concordance suggère que les modifications observées au niveau protéique pourraient s'accompagner d'une modification de l'abondance des transcrits, plutôt que de résulter exclusivement de changements dans la stabilité des protéines. Toutefois, la diminution des niveaux de transcrits et de protéines n'établit pas formellement une liaison directe de miR-486-3p aux régions non traduites 3′ prédites. Des tests rapporteurs à double luciférase utilisant des sites de liaison de type sauvage et mutés, ainsi que des expériences de sauvetage, seraient nécessaires pour déterminer si WNT5B ou DVL1 est directement régulé par miR-486-3p. De même, la réduction de l'abondance de BCL-2 indique une altération d'une protéine associée à la survie, mais ne peut, en l'absence de tests validés de mort cellulaire, être interprétée comme une preuve d'augmentation de l'apoptose.
Les tests fonctionnels présentent également des limites spécifiques à chaque test. Le CCK-8 mesure l'activité métabolique cellulaire plutôt que de déterminer directement le nombre de cellules, et les variations d'absorbance peuvent refléter des modifications de la prolifération, du métabolisme ou de la viabilité. La formation de colonies fournit une mesure à plus long terme de la capacité clonogénique, mais l'ampleur de l'effet diffère entre les deux lignées cellulaires, avec une réduction modeste chez les cellules A549 et une réduction plus importante chez les cellules H358. Cette différence suggère que la réponse à l'expression forcée de miR-486-3p pourrait dépendre du contexte moléculaire et cellulaire.
Une fermeture réduite des blessures a été observée dans les deux lignées cellulaires, mais aucun inhibiteur de prolifération n'a été utilisé pendant le test. Étant donné qu'une surexpression forcée de miR-486-3p affecte également les mesures liées à la croissance, une prolifération réduite pourrait avoir contribué au phénotype de fermeture des blessures. Les résultats doivent donc être interprétés comme une fermeture réduite des blessures, et non comme un effet spécifique à la migration. De manière similaire, le test Transwell de 48 h sur Matrigel peut être influencé par des différences dans la traversée de la membrane, la prolifération, la survie ou l'adhérence. La réduction observée du nombre de cellules à la surface inférieure de la membrane soutient par conséquent une traversée altérée dans les conditions testées, sans toutefois isoler un mécanisme d'invasion spécifique.
Une autre considération concerne l'ampleur de la surexpression de miR-486-3p. La transduction lentivirale a augmenté l'abondance de miR-486-3p d'environ 1 470 fois dans les cellules A549 et de 220 fois dans les cellules H358 par rapport aux groupes témoins correspondants. Une telle expression supraphysiologique pourrait accroître la répression hors cible dépendante de la séquence « seed », affecter la disponibilité des composants du complexe d'interférence ARN ou induire un stress cellulaire non spécifique. En l'absence de série dose-réponse, la relation entre l'abondance de miR-486-3p et les phénotypes observés n'a pas pu être définie. De plus, l'absence d'une expérience de perte de fonction basée sur un inhibiteur empêche de tirer des conclusions quant au rôle physiologique endogène de miR-486-3p dans les cellules de CUP. Les résultats présentés doivent donc être interprétés spécifiquement comme les conséquences d'une surexpression forcée stable.
Plusieurs limites doivent être prises en compte. Seules deux lignées cellulaires de carcinome pulmonaire à cellules non petites (LUAD) portant une mutation du gène KRAS ont été examinées, et l'utilisation de milieux de culture différents limite l'interprétation des comparaisons avec les cellules Beas-2b. L'authentification des lignées cellulaires et les tests de recherche de mycoplasmes n'ont pas été réalisés au cours de l'étude, et U6 a été utilisé comme unique référence pour la quantification du miR-486-3p. L'étude n'a pas non plus inclus d'essais d'extinction d'expression, de réponse dose-dépendante, de rapporteur, de complémentation, ou d'évaluation fonctionnelle de la voie Wnt. De plus, les résultats des tests de fermeture de blessure et des essais Transwell ont pu être influencés par des différences de prolifération, de viabilité ou d'adhésion. Enfin, aucun modèle animal, prélèvement de patient ou cohorte de validation clinique n'a été inclus. Par conséquent, les résultats se limitent à ce système d'expression forcée in vitro et n'établissent ni ciblage direct, ni causalité au sein de la voie, ni utilité clinique.
En conclusion, une expression stable et forcée de miR-486-3p a réduit plusieurs paramètres associés à la croissance et à la motilité dans les cellules de CAVP A549 et H358, et s'est accompagnée d'une diminution de l'expression de WNT5B, de DVL1, de la β-caténine totale et de BCL-2. Ces résultats fournissent une base pour des études mécanistiques ultérieures, mais n'établissent pas que WNT5B ou DVL1 soient des cibles directes, qu'il existe un axe linéaire WNT5B/DVL1/β-caténine, ni la valeur clinique du miR-486-3p.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d'intérêts.
Remerciements
Le Plan scientifique et technologique médical et de santé de la province du Zhejiang (2025KY349) et la Discipline clé soutenue de la ville de Jiaxing (2023-zc-014) ont fourni un appui financier à cette étude.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl 1 M (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | Préparation du gel concentrateur SDS-PAGE |
| Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Préparation du gel de séparation SDS-PAGE |
| Solution tampon TBS 20× | Solarbio | 71080 | Solution mère pour les lavages en immunotransfert et la dilution des anticorps |
| Solution d'acrylamide/bis-acrylamide 30 % (29:1) | Solarbio | A1010 | Préparation des gels SDS-PAGE |
| Fixateur au paraformaldéhyde 4 % | Servicebio | G1101 | Fixation pour les tests de formation de colonies et les essais Transwell |
| Solution de charge des protéines 5× | Beyotime | P0015 | Préparation des échantillons protéiques pour SDS-PAGE |
| Persulfate d'ammonium | Solarbio | 427A038 | Initiateur de polymérisation du gel SDS-PAGE |
| Kit d'analyse des protéines BCA | Beyotime | P0009-1 | Dosage de la concentration en protéines |
| Anticorps anti-BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Anticorps polyclonal de lapin ; immunotransfert à 1:5 000 |
| Kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Essai d'activité métabolique associée à la croissance cellulaire ; 10 μL par 100 μL de milieu de culture |
| Système d'imagerie chimiluminescente | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Imagerie en immunotransfert |
| Chloroforme | Servicebio | G3005 | Séparation des phases lors de l'extraction d'ARN par TRIzol |
| Solution de coloration au violet de crésyl | Servicebio | G1014 | Coloration des colonies et des membranes Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Milieu de culture courant pour les cellules Beas-2b |
| Anticorps anti-DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Anticorps primaire de lapin ; immunotransfert à 1:5 000 |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Biosharp | BL203B | Supplément à 10 % (v/v) pour la culture cellulaire courante ; 20 % (v/v) dans la chambre inférieure Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Préparation des graphiques et analyse statistique |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (sans Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | PCR quantitative basée sur le SYBR Green |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix pour qPCR (avec digesteur d'ADNg) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Transcription inverse pour RT-qPCR des ARNm |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22,0 | Analyse statistique |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1,53 | Densitométrie en immunotransfert, mesure de la surface de la plaie, comptage des colonies et comptage cellulaire Transwell |
| Microscope inversé | Olympus | CKX53 | Imagerie des essais de cicatrisation et des essais Transwell |
| Isopropanol | Servicebio | G3006 | Précipitation de l'ARN lors de l'extraction par TRIzol |
| Préparations lentivirales LV-miR-486-3p et LV-NC | GenePharma | Synthèse sur mesure | Vecteur d'overexpression stable de miR-486-3p et vecteur contrôle négatif aléatoire |
| Matrice de membrane basale Matrigel | Corning | 354234 | Diluée 1:8 dans du DMEM sans sérum ; concentration finale en protéines d'environ 1 mg/mL |
| Méthanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Activation de la membrane PVDF |
| Lecteur de microplaques | BioTek | ELx800 | Mesure de l'absorbance à 450 nm |
| Spectrophotomètre UV-Vis microvolume | Allsheng | Nano-600 | Dosage de la concentration en ARN et évaluation de la pureté A260/A280 |
| Pénicilline-streptomycine | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Supplément à 1 % (v/v) pour la culture cellulaire courante |
| Solution tampon phosphate-saline (PBS) | Servicebio | G0002 | Lavage des cellules et des membranes |
| Cocktail d'inhibiteurs de protéases | APExBIO | K1007 | Ajouté au tampon de lyse RIPA |
| Marqueur de poids moléculaire | Biosharp | BL712A | Référence de poids moléculaire pour immunotransfert |
| Membrane PVDF | Millipore | K2MA8350E | Membrane de transfert protéique pour immunotransfert |
| Système de PCR en temps réel QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Acquisition des données RT-qPCR |
| Tampon de lyse RIPA | Beyotime | P0013B | Extraction des protéines cellulaires totales |
| Réactif d'extraction d'ARN (type TRIzol) | Servicebio | G3013 | Extraction totale d'ARN |
| Milieu RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Milieu de culture courant pour les cellules A549 et H358 et suspension cellulaire Transwell sans sérum |
| SDS | Solarbio | S8010 | Réactif SDS-PAGE |
| Poudre de lait écrémé | BD | 2271470 | Solution de blocage à 5 % pour immunotransfert |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Analyse de l'expression de miR-486-3p issue de TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Prédiction des sites candidats de liaison de miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Catalyseur de polymérisation du gel SDS-PAGE |
| Inserts Transwell, 24 puits, taille de pore 8 μm | Corning | 3428 | Essai de migration à travers membrane revêtue de Matrigel |
| Tripsine | Servicebio | G4000 | Détachement cellulaire |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Préparation du tampon de lavage pour immunotransfert |
| Système électrophorétique vertical | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Séparation des protéines par SDS-PAGE |
| Réactif chimiluminescent au luminol pour détection HRP en immunotransfert | Affinity Biosciences | KF001 | Détection immunotransfert chimiluminescente |
| Système de transfert humide | Bio-Rad | 1703930 | Transfert des protéines sur membrane PVDF |
| Anticorps anti-WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Anticorps primaire de lapin ; immunotransfert à 1:5 000 |
| Anticorps anti-β-actine | Abcam | ab8227 | Témoin de charge ; immunotransfert à 1:5 000 |
| Anticorps anti-β-caténine | Signalway Antibody | 21725 | Anticorps primaire de lapin ; immunotransfert à 1:5 000 |
Références
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.