Isolement, purification et caractérisation des mitochondries fonctionnelles dérivées du muscle squelettique de souris pour la transplantation mitochondriale

Summary

Un protocole standardisé combinant la digestion de la trypsine et la centrifugation différentielle a été établi pour l’isolement, la purification et la caractérisation fonctionnelle des mitochondries à partir du muscle squelettique de la souris, ainsi que pour évaluer leur application dans la transplantation mitochondriale.

Abstract

Les mitochondries sont des organites essentiels qui régulent le métabolisme énergétique, la transduction du signal et l’homéostasie cellulaire dans les cellules eucaryotes. Le dysfonctionnement mitochondrial contribue à la pathogenèse de nombreuses maladies et a conduit au développement de la transplantation mitochondriale comme stratégie thérapeutique régénératrice. La réussite de la transplantation mitochondriale dépend de la disponibilité de mitochondries hautement purifiées et fonctionnellement intactes. Le muscle squelettique est une source donneuse appropriée en raison de sa forte teneur en mitochondriales, de son activité métabolique et de son accessibilité. Cette étude a établi un protocole standardisé et reproductible pour l’isolement, la purification et la caractérisation des mitochondries fonctionnelles à partir du muscle squelettique de la souris et a évalué leur utilisation dans la transplantation mitochondriale. La procédure se composait de deux grandes étapes. D’abord, les mitochondries ont été isolées du muscle squelettique de souris C57BL/6 par digestion de trypsine suivie d’une centrifugation différentielle. Deuxièmement, les mitochondries isolées ont été caractérisées pour évaluer la pureté, l’ultrastructure et l’activité fonctionnelle. La pureté mitochondriale a été évaluée par quantification des protéines à l’acide bicinchoninique (BCA) et analyse par Western blot. L’intégrité ultrastructurelle a été examinée par microscopie électronique en transmission. L’activité fonctionnelle a été évaluée à l’aide de JC-1 et de marquage fluorescent mitochondrial, accompagné de mesures de la consommation d’oxygène, de la capacité de production d’ATP et du rapport de contrôle respiratoire à l’aide d’un système respirométrique haute résolution. Les mitochondries isolées présentaient un potentiel membranaire préservé, une ultrastructure intacte et une activité respiratoire stable, indiquant une adéquation pour des études fonctionnelles en aval et des applications de transplantation mitochondriale.

Introduction

Les mitochondries sont les principaux sites de production d’adénosine triphosphate (ATP) et jouent un rôle central dans l’apoptose, l’homéostasie du calcium et le métabolisme des espèces réactives de l’oxygène (ROS). L’intégrité fonctionnelle des mitochondries est donc cruciale pour maintenir l’homéostasie cellulaire et déterminer le destin cellulaire ^1,2. Le dysfonctionnement mitochondrial, incluant les mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) et les anomalies de la chaîne de transport électronique (ETC), conduit à un métabolisme énergétique altéré, à un stress oxydatif et à une apoptose^{déréglée 3,4}. Ces anomalies sont associées à un large éventail de maladies, notamment les troubles mitochondriaux héréditaires, les maladies neurodégénératives et les maladies^{cardiovasculaires 5,6}. Les stratégies thérapeutiques conventionnelles pour les dysfonctions mitochondriales, telles que les antioxydants et les cofacteurs métaboliques, offrent généralement une efficacité limitée car elles soulagent les symptômes sans restaurer directement la fonction^{mitochondriale 7,8}. Par conséquent, la transplantation mitochondriale s’est imposée comme une approche thérapeutique prometteuse en médecine régénérative. Cette stratégie consiste à livrer des mitochondries exogènes intactes dans des cellules endommagées ou dysfonctionnelles afin de restaurer l’activité mitochondriale et le métabolisme énergétique cellulaire ^9,10. Des études antérieures ont démontré que les mitochondries exogènes peuvent être internalisées par les cellules receveuses et intégrées au réseau mitochondrial endogène, ce qui améliore la fonction bioénergétique et améliore la survie cellulaire 11,12,13.

Le muscle squelettique est considéré comme un donneur adapté à l’isolement mitochondrial en raison de sa forte teneur mitochondriale, de son activité métabolique et de son accessibilité 14,15,16. La transplantation mitochondriale nécessite plusieurs étapes cruciales, notamment l’isolement, la purification, la caractérisation fonctionnelle et une livraison efficace dans les cellules receveuses. Cependant, une variabilité méthodologique importante subsiste parmi les protocoles rapportés à ce jour, notamment dans les procédures impliquant l’homogénéisation tissulaire, la digestion enzymatique, le contrôle de la température et la purification. Une telle variabilité peut affecter le rendement, la pureté et l’intégrité fonctionnelle mitochondriales, limitant ainsi la reproductibilité expérimentale.

Pour améliorer la cohérence méthodologique et la reproductibilité, cette étude présente un protocole standardisé pour isoler et caractériser les mitochondries fonctionnelles du muscle squelettique de la souris en utilisant la digestion de la trypsine et la centrifugation différentielle. Les mitochondries isolées ont été évaluées pour leur pureté, leur intégrité ultrastructurale et leur activité fonctionnelle à l’aide de la quantification des protéines à l’acide bicinchoninique (BCA), du Western blotting, de la microscopie électronique en transmission, des tests de potentiel membranaire à fluorescence et de la respirométrie à haute résolution. De plus, l’absorption des mitochondries isolées par les cellules receveuses a été évaluée afin d’évaluer leur adéquation aux applications de transplantation mitochondriale. Ce protocole offre un flux de travail reproductible pour obtenir des mitochondries fonctionnelles issues du muscle squelettique pour des études expérimentales en aval.

Protocol

Toutes les expériences animales ont été réalisées dans une installation spécifique sans agents pathogènes (SPF) et approuvées par le Comité d’éthique et d’utilisation animale du Troisième Hôpital affilié de l’Université médicale de l’Armée de l’air (Approbation n° : IACUC-2024kq-065).

Des souris mâles C57BL/6 (6-8 semaines, 18-20 g) ont été achetés au Laboratory Animal Center de l’Air Force Medical University (Licence de production : SCXK (Shaanxi) 2024-002). Les souris étaient hébergées dans des cages ventilées individuellement (IVC) sous pression positive et dans des conditions propres, avec une température de 20 à 26 °C, une humidité relative de 40 % à 70 %, un cycle clair-obscur de 12 heures, et au moins 15 changements d’air par heure. Un régime stérilisé, de l’eau potable et un enrichissement environnemental étaient fournis.

Les réactifs, produits chimiques et instruments expérimentaux utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Sacrifice d’animaux et collecte de tissus

1. Placez la souris dans une chambre d’euthanasie hermétique et euthanasiez par inhalation progressive de dioxyde de carbone (CO₂), soit 30 % à 70 % du volume de chambre par minute.
2. Confirmer la mort par arrêt de la respiration et du rythme cardiaque spontanés, perte des réflexes pupillaires et absence de réponse à la stimulation mécanique.
3. Immergez les souris euthanasiées C57BL/6 dans de l’éthanol à 75 % pendant 5 minutes pour désinfection.
   REMARQUE : Pour éviter la fixation tissulaire induite par l’alcool et les dommages cellulaires, limitez le temps d’immersion à 10 minutes. Utilisez du tissu frais tout au long du protocole car la congélation compromet la viabilité mitochondriale et l’intégrité fonctionnelle.
4. Placez la souris dans une boîte de Petri stérile à l’intérieur d’un capot à flux laminaire, l’abdomen orienté vers le haut pour exposer complètement les régions abdominales et postérieures.
5. Soulevez la peau du bas de l’abdomen près de la région génitale à l’aide de pinces et faites une petite incision. Effectuez une dissection contondante pour séparer la peau du tissu sous-jacent. Étendez l’incision vers le haut le long de la ligne médiane jusqu’à la cheville et latéralement vers les deux membres postérieurs afin d’exposer complètement les groupes musculaires des membres postérieurs.
6. Identifiez le muscle quadriceps fémoral sur la face antérieure de la cuisse et séparez soigneusement le muscle le long de la direction des fibres musculaires à l’aide d’une dissection contondante. Sectionner le ligament rotulien distal et le tendon proximal afin d’isoler complètement le tissu musculaire.
   REMARQUE : Lavez le tissu trois fois dans une solution physiologique pré-refroidie et tamponnée au phosphate (PBS) complétée par 2 % de pénicilline-streptomycine en utilisant une boîte de Petri fraîche à chaque lavage afin de minimiser la contamination.
7. Placez immédiatement le tissu musculaire isolé dans un PBS pré-refroidi et rincez soigneusement pour éliminer les poils et le sang de la surface tissulaire.
8. Séchez doucement l’excès d’humidité du tissu à l’aide d’une gaze stérile. Divisez le tissu en tubes microcentrifuge de 1,5 mL et pesez les échantillons. Utilisez environ 100 mg de tissu par échantillon pour maintenir la constance entre les préparations.

2. Hachage des tissus et homogénéisation

1. Placez le tube de microcentrifuge contenant le tissu de l’étape 1.8 sur de la glace. Réduisez le tissu en petits fragments d’environ 1 à 2^{mm 3} de taille à l’aide de ciseaux stériles.
2. Ajoutez 8 volumes de trypsine pré-refroidie à 0,25 % et digérez les fragments de tissu sur de la glace pendant 15 minutes.
   REMARQUE : Calculez le volume requis de trypsine selon la masse tissulaire (1 mg ≈ 1 μL). Par exemple, ajoutez 640 μL de tripsine à 0,25 % à 80 mg de tissu.
3. Centrifugez le mélange à 1 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant et conservez la granule de tissu. Resuspendez le pellet dans 1 mL de tampon d’isolation mitochondriale pré-refroidi contenant du D-mannitol (215 mM), du saccharose (75 mM), du HEPES (20 mM), de l’EGTA (1 mM) et de l’albumine sérique bovine sans acides gras (0,5 % en va).
4. Transférez la suspension à un homogénéisateur en verre maintenu sur glace. Homogénéisez le tissu en utilisant 10 à 12 mouvements doux de haut en bas jusqu’à ce que la suspension devienne trouble.
   REMARQUE : Évitez de faire pivoter latéralement le pilon en verre au bas de l’homogénéiseur, car une force mécanique excessive pourrait endommager les membranes mitochondriales et nuire à sa fonction.

3. Centrifugation différentielle

1. Transférez l’homogénéat dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et centrifugez à 1 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
2. Transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge neuf de 1,5 mL et centrifuger à 12 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C pour obtenir la pelote mitochondriale brute.
   REMARQUE : Prélever soigneusement le surnageant à l’aide d’une seringue de 1 mL tout en évitant de perturber la pellete et les résidus tissulaires.

4. Purification et stockage mitochondrial

1. Résuspendez doucement la pellete mitochondriale brute dans un tampon de lavage pré-refroidi contenant du saccharose (250 mM), du HEPES (10 mM, pH 7,4), de l’EGTA (1 mM) et de l’albumine sérique bovine (0,15 % en va-et-vue). Centrifugez la suspension à 1 000 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
2. Transférez le surnageant dans un tube centrifugeuse neuf et centrifugez à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour obtenir la pellete mitochondriale purifiée.
   REMARQUE : Utilisez immédiatement les mitochondries fraîchement isolées dès que possible. Un stockage à court terme à 4 °C ou un stockage à long terme à −80 °C dans un tampon mitochondrial contenant du saccharose (0,25 M), Tris-MOPS (10 mM, pH 7,4) et EGTA (0,1 mM) est réalisable. Cependant, la congélation peut altuer l’activité enzymatique mitochondriale et la fonction respiratoire. Utilisez principalement des échantillons congelés pour l’analyse des protéines.

5. Extraction des protéines mitochondriales et cytosoliques et quantification des BCA

1. Extraction de protéines mitochondriales
   1. Résuspendez le pellet mitochondrial purifié dans 50 μL de tampon de lyse RIPA pour 100 mg de tissu de départ et incubez la suspension sur glace pendant 15 minutes.
   2. Centrifugez le lysat à environ 14 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Transférez le surnageant dans un tube microcentrifuge neuf de 1,5 mL pour obtenir la fraction protéique mitochondriale.
2. Extraction de protéines cytosoliques
   1. Centrifugez le surnageant cytosolique obtenu à l’étape 4.2 à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Écartez le surnageant et conservez la pellete comme fraction cytosolique enrichie.
   2. Resuspendez la pellete cytosolique dans 50 μL de tampon de lyse RIPA et traitez l’échantillon comme décrit aux étapes 5.1.1-5.1.2.
      REMARQUE : Préparez le tampon de lyse fraîchement avec des inhibiteurs de protéases et effectuez toutes les procédures sur la glace pour minimiser la dégradation des protéines. Les mitochondries utilisées à cette étape peuvent être fraîches ou congelées.
3. Quantification des protéines BCA
   1. Préparez la solution de travail BCA en mélangeant le réactif A et le réactif B dans un rapport de 50:1 (v/v). Ajoutez 200 μL de solution de travail à chaque puits d’une plaque à 96 puits.
      REMARQUE : Préparez la solution de travail BCA immédiatement avant l’utilisation et utilisez-la dans la 1 heure à température ambiante.
   2. Diluez la solution d’origine sérique d’albumine bovine (BSA) (2 mg/mL) à 0,5 mg/mL et conservez la solution sur la glace jusqu’à utilisation.
   3. Préparez la courbe standard en ajoutant 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 ou 0 μL de solution BSA à des puits séparés. Ajustez le volume final à 20 μL avec une solution NaCl.
   4. Ajoutez 4 μL de protéine mitochondriale et 16 μL de solution de NaCl dans un ensemble de puits. Ajoutez 4 μL de protéine cytosolique et 16 μL de solution de NaCl à un autre ensemble de puits.
   5. Ajoutez 200 μL de solution de travail BCA à chaque puits et faites couver la plaque à 37 °C dans l’obscurité pendant 30 minutes. Mesurez l’absorbance à 562 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
   6. Construisons une courbe standard protéique avec un coefficient de corrélation (R²) ≥ 0,999. Calculez les concentrations de protéines (μg/μL) en interpolant les valeurs d’absorbance à partir de la courbe standard.

6. Évaluation de la pureté des mitochondries dérivées du muscle squelettique

1. Diluez des échantillons de protéines mitochondriales et cytosoliques jusqu’à une concentration finale de 1,5 μg/μL. Préparez des mélanges réactionnels de 20 μL contenant 30 μg de protéines et 4 tampons de chargement ×. Ajustez le volume restant avec une solution NaCl. Faites bouillir les échantillons pendant 10 minutes et conservez-les à −80 °C jusqu’à utilisation.
2. Séparez les échantillons de protéines à l’aide de gels préfabriqués à gradient de 4 % à 20 %. Effectuez l’électrophorèse à 140-150 V pendant 50 minutes.
3. Activez la membrane PVDF (0,22 μm) dans le méthanol pendant 1 minute. Transférez les protéines en utilisant le tampon de transfert rapide à 400 mA pendant 30 minutes.
4. Retirez la membrane PVDF du sandwich de transfert et lavez-la au TBST pendant 5 minutes. Bloquez la membrane avec 5 % de lait écrémé à température ambiante pendant 1 h en secouant doucement.
5. Diluez les anticorps primaires (COX IV, cytochrome c, β-actine) 1:1 000 dans un tampon de dilution d’anticorps. Incubez la membrane avec des anticorps primaires toute la nuit à 4 °C.
6. Lavez la membrane trois fois avec TBST pendant 10 minutes par lavage.
7. Incubez la membrane avec un anticorps secondaire dilué à 1:10 000 à température ambiante pendant 1 heure.
8. Lavez la membrane trois fois avec TBST pendant 10 minutes chacune. Développez la tache et capturez les images.

7. Coloration MitoTracker des mitochondries dérivées du muscle squelettique

1. Diluez la solution de travail de coloration à une concentration finale de 200 nM dans un milieu préchauffé immédiatement avant utilisation.
2. Résuspendez la pellete mitochondriale dans 100 μL de la solution de travail et incubez à 37 °C dans l’obscurité pendant 20 minutes.
3. Ajoutez cinq volumes de tampon de stockage pré-refroidi après l’incubation. Centrifugez la suspension à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C et jetez le surnageant contenant le colorant non lié.
4. Transférez une aliquote de la suspension mitochondriale colorée sur une lame en verre et couvrez l’échantillon avec une gaine de protection.
5. Capturez des images de fluorescence à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec des réglages d’excitation et d’émission appropriés pour la détection des colorants mitochondriaux fluorescents rouges.

8. Évaluation du potentiel de la membrane mitochondriale par coloration JC-1

1. Groupe de traitement CCCP (m-chlorophényl hydrazone) au cyanure de carbonyle
   1. Traiter la suspension mitochondriale avec du CCCP à une concentration finale de 10 μM et incuber pendant 20 minutes pour dissiper le potentiel de la membrane mitochondriale.
   2. Incuber la suspension mitochondriale traitée au CCCP avec 250 μL de solution de coloration JC-1 à 37 °C pendant 20 minutes avec une légère agitation.
2. Groupe de traitement JC-1
   1. Resuspendez la pastille mitochondriale dans 100 μL de solution de travail JC-1 et incubez à 37 °C pendant 20 minutes à l’abri de la lumière.
   2. Préparez 1× tampon de coloration JC-1 en diluant la solution d’origine 5× avec de l’eau distillée au ratio 2:8 (v/v) et en maintenant le tampon sur glace.
   3. Retirez la solution de coloration et lavez la pastille mitochondriale deux fois avec un tampon de coloration JC-1 pré-refroidi 1×.
   4. Resuspendez les mitochondries colorées dans le PBS et imagez-les à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Utilisez des réglages d’excitation et d’émission appropriés pour la détection des monomères fluorescents verts JC-1 et des agrégats fluorescents rouges JC-1.

9. Analyse ultrastructurale des mitochondries isolées des muscles squelettiques par microscopie électronique en transmission

1. Fixez les mitochondries fraîchement isolées dans du glutaraldéhyde à 2,5 % préparé dans un tampon phosphate 0,2 M (pH 7,4) et incubez les échantillons toute la nuit à 4 °C.
2. Lavez les échantillons avec une solution de phosphate tamponnée à 0,1 M (PBS, pH 7,4) et fixez les échantillons dans du tétroxyde d’osmium à 1 % pendant 1 h à température ambiante.
3. Déshydratez les échantillons à l’aide d’une série d’éthanol graduée suivie d’une infiltration, d’un plongement et d’une polymérisation dans la résine époxy.
4. Sécuriser les échantillons intégrés à une épaisseur de 50 à 70 nm à l’aide d’un ultramicrotome.
5. Colorez les coupes avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb. Observez et imagez les échantillons à l’aide d’un microscope électronique à transmission.

10. Captation cellulaire des mitochondries dérivées du muscle squelettique

1. Culture NCTC clone 929 (L929 ; RRID : CVCL_0462) cellules obtenues auprès d’un fournisseur commercial dans un milieu complet contenant de la MEM Alpha, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine.
2. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 90 %, aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec du PBS préchauffé. Ajoutez la trypsine à EDTA et incubez jusqu’à ce que les cellules se détachent.
3. Ajouter un milieu complet pour terminer la digestion et générer une suspension monocellulaire par pipetage doux. Centrifugez la suspension à 1 000 × g pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
4. Resuspendez la granulation cellulaire dans un milieu complet et ensemençez les cellules dans de nouvelles couches de culture à une densité appropriée. Incubez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
5. Faites passer les cellules de 5 graines (P5) dans des plats à fond en verre de 35 mm et cultivez les cellules pendant la nuit.
6. Marquez les mitochondries isolées avec un colorant rouge fluorescent spécifique aux mitochondries à 37 °C dans l’obscurité pendant 20 minutes, puis lavez les mitochondries avec du PBS pour éliminer le colorant non lié.
7. Ajoutez des mitochondries fluorescentes rouges marquées par un colorant (20 μg de protéine mitochondriale par bol) aux cellules et incubez pendant 24 heures à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
8. Colorez les cellules avec une sonde d’actine-fluorescente pendant 30 minutes pour visualiser le cytosquelette d’actine et contre-colorer les noyaux avec un colorant nucléaire fluorescent.
   REMARQUE : Contrôlez soigneusement la concentration sérique pendant la co-incubation, car un excès sérique peut réduire l’efficacité de l’absorption mitochondriale. Les mitochondries utilisées à cette étape sont fraîches.

11. Mesure de la fonction respiratoire mitochondriale à l’aide de respirométrie haute résolution

1. Préparation des instruments
   1. Nettoyez les chambres respiratoires, les compartiments des électrodes et les bouchons.
   2. Placez une barre magnétique d’agitation dans chaque chambre et vérifiez l’intégrité de la membrane électrode à oxygène.
2. Étalonnage des instruments
   1. Ajoutez 2,1 mL de tampon de respiration mitochondriale (MiR05, pH 7,10) dans chaque chambre respiratoire et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente.
   2. Équilibrez le système de respirométrie haute résolution à 37 °C pendant 30 minutes et effectuez une étalonnage de l’air quotidienne après stabilisation de la base d’oxygène.
      REMARQUE : Évitez d’introduire des bulles d’air dans la chambre respiratoire, car elles interfèrent avec les signaux des électrodes d’oxygène et compromettent la qualité des données. Les mitochondries utilisées à cette étape sont fraîches.
3. Charge et équilibrage de l’échantillon
   1. Ajoutez des mitochondries fraîchement isolées contenant environ 30 μg de protéines dans la chambre respiratoire et scellez la chambre.
   2. Équilibrez la chambre pendant 5 à 8 minutes et enregistrez la consommation basale d’oxygène.
      REMARQUE : Maintenez les mitochondries sur la glace et effectuez des mesures de respiration immédiatement après l’isolement pour préserver l’activité.
4. Protocole SUIT
   1. Ajoutez 5 μL de pyruvate (2 M), 10 μL de glutamate (2 M) et 10 μL de malate (400 mM) de façon séquentielle. Stabiliser la réaction pendant 5 minutes et enregistrer la respiration de fuite de CI.
   2. Ajouter 10 μL d’ADP (500 mM) pour induire la phosphorylation oxydative et enregistrer la respiration CI OXPHOS. Ajoutez 10 μL de chlorure de magnésium (0,3 M).
   3. Ajouter 20 μL de succinate (1 M) et enregistrer la respiration CI+CII OXPHOS après la stabilisation.
   4. Ajoutez 2 μL d’inhibiteur d’ATP synthase (0,01 mM) et enregistrez la fuite de protons respiratoires.
   5. Ajoutez le CCCP (1 mM) progressivement en trois ajouts de 2 μL tous les 2 minutes jusqu’à ce que la consommation d’oxygène atteigne un plateau. Enregistrez la capacité maximale du système de transfert d’électrons.
   6. Ajoutez 1 μL de roténone (1 mM) pour inhiber l’activité du complexe I.
   7. Ajouter 1 μL d’antimycine A (5 mM) pour inhiber l’activité du complexe III et enregistrer la consommation résiduelle d’oxygène.
   8. Ajoutez 5 μL d’ascorbate (800 mM) et 5 μL de n,n,n',N'-tétraméthyle-p-phénylénediamine (200 mM). Enregistrer une activité respiratoire IV complexe maximale après stabilisation.
      REMARQUE : Alyquotez tous les réactifs avant la congélation pour éviter les cycles répétés de congélation-dégel. Ajoutez progressivement le CCCP, car un découplage excessif inhibe la respiration mitochondriale.
5. Analyse des données
   1. Obtenez les paramètres de respiration mitochondriale, incluant la fuite CI, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII fuite, CI+CII ET, CII ET ET CIV, en utilisant le logiciel d’analyse de données.
   2. Calculer le rapport de contrôle respiratoire (RCR ; État 3 respiration/État 4 respiration) et la capacité de production d’ATP. Conservez toutes les valeurs à trois chiffres significatifs pour l’analyse statistique. Le logiciel utilisé pour l’analyse des données était Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Results

Un aperçu schématique du flux de travail d’isolement et de purification mitochondriale est présenté à la Figure 1. Toutes les procédures ont été réalisées à 4 °C afin de préserver l’intégrité mitochondriale et l’activité fonctionnelle. Le tissu musculaire squelettique fraîchement isolé a été haché et digéré avec de la trypsine pour faciliter la dissociation tissulaire, puis homogénéisé dans un tampon isotonique à l’aide d’un homogénéiseur en verre. Une centrifugation différentielle a ensuite été réalisée pour séparer les mitochondries des débris tissulaires et des contaminants cytosoliques. La centrifugation initiale à 1 000 × g a retiré les noyaux et les gros débris, tandis que la centrifugation ultérieure à 12 000 × g a donné un pellet mitochondrial rudimentaire. Des étapes supplémentaires de lavage et de centrifugation ont encore réduit la contamination cytosolique, produisant des mitochondries purifiées adaptées aux analyses structurelles et fonctionnelles en aval (Figure 1).

Figure 1 : Schéma de l’isolement et de la purification mitochondriale. Les mitochondries de haute pureté ont été isolées grâce à une approche combinée de digestion contrôlée de trypsine et centrifugation différentielle. Toutes les interventions ont été réalisées à 4 °C afin de préserver l’intégrité structurelle et fonctionnelle mitochondriale. Le tissu musculaire squelettique fraîchement isolé a été soumis à des étapes de digestion enzymatique, d’homogénéisation et de centrifugation séquentielle afin d’obtenir des mitochondries purifiées, adaptées à des analyses fonctionnelles et structurales en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

L’activité fonctionnelle des mitochondries isolées a été évaluée à l’aide de coloration JC-1 et de marquage mitochondrial fluorescent (Figure 2). La coloration JC-1 a démontré une forte fluorescence rouge dans les mitochondries fraîchement isolées dans des conditions basales, indiquant la préservation du potentiel de membrane mitochondriale. Après un traitement avec le m-chlorophénylhydrazone (CCCP) au cyanure de carbonyle, la fluorescence rouge a diminué et celle verte a augmenté, ce qui correspond à la dépolarisation de la membrane mitochondriale. Ces résultats ont confirmé que les mitochondries isolées conservaient la réactivité potentielle de la membrane et restaient fonctionnellement actives après l’isolement. Le marquage fluorescent a également démontré que les mitochondries apparaissaient comme des structures ponctuées discrètes, uniformément distribuées dans tout le champ, sans agrégation évidente ni précipitation de colorant. La faible fluorescence de fond et le schéma uniforme de coloration suggéraient la préservation de l’intégrité mitochondriale et du potentiel membranaire après l’isolement.

Figure 2 : Caractérisation de l’activité fonctionnelle des mitochondries isolées. (A) Évaluation du potentiel de la membrane mitochondriale par coloration JC-1. Les mitochondries purifiées ont été colorées avec du JC-1 et observées à la microscopie à fluorescence. Des agrégats fluorescents rouges distincts ont été observés dans le groupe témoin des mitochondries, indiquant un potentiel de membrane mitochondriale préservé. Après le traitement avec le découpleur CCCP, la fluorescence s’est principalement orientée vers les monomères verts JC-1, indiquant une dé-polarisation membranaire et un effondrement du potentiel membranaire (barre d’échelle = 50 μm). (B) Marquage fluorescent mitochondrial des mitochondries purifiées. Les mitochondries marquées fluorescentement apparaissaient sous forme de structures dispersées et ponctuées, sans agrégation évidente et avec une fluorescence de fond minimale, indiquant une intégrité mitochondriale préservée et un potentiel membranaire stable (barre d’échelle = 100 μm). (C) Analyse quantitative des rapports d’intensité de fluorescence de JC-1 dans différents groupes après coloration JC-1. Les données sont présentées en moyenne ± SEM (n = 3). La signification statistique a été analysée à l’aide d’un test t non apparié (****P < 0,0001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

L’intégrité ultrastructurelle des mitochondries isolées a été examinée à l’aide de microscopie électronique en transmission (Figure 3). L’imagerie à faible grossissement a révélé des mitochondries purifiées avec une morphologie principalement ovale, tandis que l’imagerie à fort grossissement a montré des membranes externes intactes et des structures de cristes clairement définies. Aucun gonflement, rupture ou perturbation structurelle évidente n’a été observé. Pour l’évaluation quantitative, cinq champs sélectionnés au hasard contenant environ 40 à 60 mitochondries par champ ont été analysés. Ces observations ont démontré que la procédure d’isolement préservait efficacement l’ultrastructure mitochondriale et générait des mitochondries adaptées aux études fonctionnelles en aval.

Figure 3 : Intégrité ultrastructurelle des mitochondries musculaires squelettiques isolées évaluée par microscopie électronique en transmission. (À gauche) Image TEM représentative à faible grossissement (4 000× ; barre d’échelle = 2 μm) montrant des mitochondries purifiées avec une morphologie majoritairement ovale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

(À droite) Image TEM à fort grossissement (40 000× ; barre d’échelle = 200 nm) montrant des membranes mitochondriales externes lisses et continues ainsi que des structures cristes clairement définies. Les flèches jaunes indiquent des membranes mitochondriales externes intactes, tandis que les flèches blanches indiquent des cristes mitochondriales bien organisées. Aucune trace de gonflement, de rupture ou de perturbation structurelle n’a été observée. Cinq champs sélectionnés au hasard contenant environ 40 à 60 mitochondries par champ ont été analysés. Ces résultats démontrent que le protocole d’isolation préservait l’intégrité ultrastructurale mitochondriale et fournissait une base structurelle fiable pour les essais fonctionnels en aval.

Le rendement et la pureté mitochondriaux ont ensuite été évalués par quantification des protéines et analyse immunoblot (Figure 4). La comparaison entre les méthodes de digestion de la trypsine (TD) et d’extraction normale (NE) a montré que la méthode TD a donné environ 2,3 à 2,4 μg de protéines mitochondriales par mg de tissu, tandis que la méthode NE a donné environ 1,7 à 1,8 μg/mg de tissu. L’analyse immunoblot a démontré un fort enrichissement des marqueurs mitochondriaux, cytochrome c oxydase et COX IV, dans les fractions mitochondriales, avec une détection minimale dans les fractions cytosoliques. En revanche, le marqueur cytosolique β-actine n’a montré que des signaux faibles dans les fractions mitochondriales, indiquant une contamination cytosolique limitée. La comparaison entre les groupes TD et NE a suggéré que la digestion de la trypsine améliorait le rendement et la pureté mitochondriales. Collectivement, ces résultats ont démontré que le protocole générait des mitochondries adaptées à des analyses moléculaires et fonctionnelles en aval.

Figure 4 : Comparaison du rendement et de la pureté des mitochondries purifiées. (A) Comparaison du rendement protéique mitochondrial par unité de masse tissulaire obtenue en utilisant les méthodes de digestion de la trypsine (TD) et d’extraction normale (NE). Le groupe TD a produit environ 2,3 à 2,4 μg/mg de tissu, tandis que le groupe NE a produit environ 1,7 à 1,8 μg/mg de tissu. Les données sont présentées en moyenne ± SEM (n = 3). La signification statistique a été analysée à l’aide d’un test t non apparié (*P < 0,05). (B) Analyse immunoblot des protéines marqueuses mitochondriales et cytosoliques dans des fractions mitochondriales isolées à l’aide des méthodes TD et NE. (C-D) Analyse quantitative des protéines marqueuses mitochondriales, cytochrome c oxydase et COX IV. Les marqueurs mitochondriaux étaient fortement enrichis en fractions mitochondriales mais présentaient une expression minimale en fractions cytosoliques. Le marqueur cytosolique β-actine n’a montré qu’une expression faible dans les fractions mitochondriales, indiquant une élimination efficace des contaminants cytosoliques. Comparé au groupe NE, le groupe TD a montré une amélioration de la pureté mitochondriale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM (n = 3). La signification statistique a été analysée à l’aide d’un test t non apparié (*P < 0,05 ; **P < 0,01). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Pour évaluer davantage la fonction respiratoire mitochondriale, la consommation d’oxygène a été mesurée à l’aide de respirométrie à haute résolution (Figure 5). Les mitochondries isolées par la méthode TD ont montré des valeurs de rapport de contrôle respiratoire (RCR) d’environ 9 à 10, tandis que les mitochondries isolées par la méthode NE ont montré des valeurs RCR d’environ 8 à 9. Parce que des valeurs RCR supérieures à 4 sont généralement considérées comme indicatives d’une activité respiratoire mitochondriale préservée, ces résultats ont démontré que les mitochondries isolées par les deux méthodes conservaient leur intégrité fonctionnelle. Les valeurs RCR plus élevées observées dans le groupe TD suggéraient une meilleure préservation de la fonction respiratoire mitochondriale que dans le groupe NE. L’efficacité du couplage biochimique a également été évaluée à l’aide de l’équation 1 − (taux de fuite respiratoire/taux de transfert d’électrons), avec des valeurs proches de 1 indiquant un couplage respiratoire plus serré et une production d’ATP plus efficace. Les deux groupes ont présenté des efficacités de couplage proches de 1, indiquant que la fonction bioénergétique mitochondriale a été préservée après l’isolement.

Figure 5 : Analyse de la fonction respiratoire dans les mitochondries purifiées. (A) Comparaison du rapport de contrôle respiratoire mitochondrial (RCR) entre les groupes de digestion de la trypsine (TD) et d’extraction normale (NE). Les valeurs de RCR dans les deux groupes étaient supérieures à 4, indiquant la préservation de l’activité respiratoire mitochondriale après l’isolement. Le groupe TD présentait des valeurs RCR légèrement plus élevées que le groupe NE, suggérant une meilleure préservation de la fonction respiratoire. Les données sont présentées en moyenne ± SEM (n = 3). La signification statistique a été analysée à l’aide d’un test t non apparié (**P < 0,01). (B) Comparaison de l’efficacité de couplage biochimique mitochondriale et de la capacité de synthèse d’ATP entre les groupes TD et NE. Les valeurs d’efficacité de couplage approchaient 1 dans les deux groupes, indiquant une respiration fortement couplée et une production efficace d’ATP. Les données sont présentées en moyenne ± SEM (n = 3). La signification statistique a été analysée à l’aide d’un test t non apparié (*P < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

L’absorption des mitochondries isolées par les cellules receveuses a été évaluée à l’aide de cellules L929 (Figure 6). Les cellules ont été co-incubées avec des mitochondries squelettiques musculaires marquées par un colorant rouge fluorescent, et le cytosquelette d’actine a été visualisé à l’aide d’une sonde fluorescente d’actine. La microscopie confocale a révélé des structures fluorescentes rouges ponctuées réparties dans tout le cytoplasme, indiquant que les cellules L929 avaient absorbé des mitochondries exogènes. L’analyse quantitative a démontré une augmentation dépendante du temps de l’absorption mitochondriale à 12, 24 et 48 heures. Cependant, seule une augmentation modérée a été observée entre 24 h et 48 h, ce qui suggère que l’efficacité d’absorption approchait la saturation après 24 h. De plus, les cellules L929 receveuses ont montré un potentiel accru de la membrane mitochondriale après l’absorption mitochondriale, indiquant une amélioration de la fonction mitochondriale. Ces résultats ont démontré que les mitochondries dérivées du muscle squelettique, isolées à l’aide de ce protocole, pouvaient être efficacement internalisées par les cellules receveuses tout en maintenant une activité fonctionnelle.

Figure 6 : Captation cellulaire des mitochondries dérivées du muscle squelettique par les cellules L929. (A) Captation des mitochondries purifiées par les cellules L929 à différents moments d’incubation (12h, 24h et 48h). Mitochondries marquées par un colorant fluorescent (rouge) ont été détectées dans le cytoplasme des cellules recevrices, tandis que la coloration par phalloïdine (verte) a été utilisée pour visualiser le cytosquelette d’actine. La coloration nucléaire a été réalisée à l’aide de DAPI (bleu). La microscopie confocale a confirmé l’internalisation des mitochondries exogènes par les cellules L929 (barre d’échelle = 50 μm). (B) Analyse quantitative de l’efficacité d’absorption mitochondriale par les cellules L929 à différents moments temporels. (C) Analyse de coloration JC-1 du potentiel de la membrane mitochondriale dans les cellules L929 après l’absorption des mitochondries dérivées du muscle squelettique. (D) Analyse quantitative des rapports de fluorescence entre les agrégats et les monomères de JC-1 dans les cellules L929 receveuses après captation mitochondriale. Le potentiel de la membrane mitochondriale a été significativement augmenté après l’internalisation des mitochondries actives dérivées du muscle squelettique. Les données sont présentées en moyenne ± SEM (n = 3). La signification statistique a été analysée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle (*P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

La transplantation mitochondriale est une stratégie émergente en thérapie cellulaire et en médecine régénérative qui restaure la fonction physiologique des cellules souffrant d’un métabolisme énergétique altéré grâce à la délivrance de mitochondries fonctionnellement intactes. En plus de réguler le métabolisme énergétique cellulaire, cette technique peut moduler des processus biologiques clés tels que l’apoptose et le stress oxydatif, offrant ainsi de nouvelles opportunités thérapeutiques pour une variété de maladies ^4,17,18,19. Cependant, la traduction clinique de la transplantation mitochondriale fait encore face à plusieurs défis, parmi lesquels l’absence de protocoles d’isolement mitochondrial standardisés, efficaces et reproductibles, qui reste un goulot d’étranglement majeur.

Pour répondre à cette question, la présente étude a établi un protocole expérimental standardisé et visualisé basé sur la centrifugation différentielle pour l’isolation efficace des mitochondries libres fonctionnelles à partir du muscle squelettique de souris C57BL/6. En optimisant la procédure de purification et en intégrant les étapes de pré-digestion, lavage et purification de la trypchine, cette méthode améliore efficacement la dissociation tissulaire, préserve l’intégrité structurelle mitochondriale et réduit la contamination par des composants cellulaires non ciblés.

Le protocole proposé permet d’obtenir un équilibre favorable entre la pureté mitochondriale et le rendement. Comparée aux méthodes d’extraction conventionnelles basées sur le broyage, la méthode actuelle est plus rapide, plus pratique et plus économique, ce qui la rend adaptée aux applications de laboratoire de routine et à la préparation mitochondriale par donneur. Les approches d’isolation mitochondriale existantes présentent chacune certaines limites. Par exemple, la centrifugation à gradient de densité et la purification par immunoaffinité peuvent atteindre une pureté plus élevée mais sont longues et coûteuses, tandis que les approches basées sur des sondes à l’échelle nanométrique restent insuffisamment développées pour un usage courant^20,21. Pour les tissus denses tels que le muscle squelettique, l’étape optimale de pré-digestion de la trypsine (0,25 % de trypsine à 37 °C pendant 10-15 minutes), combinée à une homogénéisation douce, préserve mieux l’intégrité mitochondriale que la centrifugation différentielle conventionnelle seule.

Dans cette étude, un kit de centrifugation différentielle disponible dans le commerce a été utilisé dans des conditions de basse température tout au long de la procédure et suivant un flux de travail standardisé, permettant l’acquisition rapide de mitochondries structurellement intactes. Pour traiter les problèmes potentiels rencontrés lors du processus d’extraction, notamment le faible rendement, la contamination des protéines et un potentiel anormal de membrane, plusieurs stratégies de dépannage sont proposées.

Un faible rendement mitochondrial est souvent causé par une homogénéisation insuffisante, une quantité de tissu insuffisante ou une perte centrifuge. Ces problèmes peuvent être minimisés en assurant une pré-digestion adéquate, en pratiquant une homogénéisation douce (10 à 15 passages avec un homogénéiseur ajusté), en utilisant au moins 100 à 150 mg de tissu musculaire squelettique frais, en contrôlant strictement les conditions de centrifugation (1 000 × g pour l’élimination des débris et 10 000 à 12 000 g × pour le granulage mitochondrial), et en resuspendant les échantillons à l’aide de pointes de pipette à large calibre. La contamination des protéines résulte principalement d’un retrait incomplet des débris ou d’une interférence lipidique ; Il est donc recommandé de répéter l’étape de centrifugation de 1 000 × g , d’intégrer deux étapes supplémentaires de lavage de 12 000 × g, et de retirer soigneusement le tissu adipeux. Un potentiel anormal de la membrane mitochondriale est souvent associé à des lésions mécaniques ou à des fluctuations de température. Une homogénéisation excessive doit donc être évitée, l’ensemble de la procédure doit être réalisé sur glace et achevé en 60 à 90 minutes, et les tampons d’isolement doivent être complétés par de l’EGTA et 0,5 % de BSA. L’homogénéisation incomplète peut être améliorée en assurant une digestion enzymatique adéquate, en choisissant un homogénéiseur approprié et en effectuant une filtration post-homogénéisation.

Bien que le protocole actuel améliore significativement l’efficacité et la pureté de l’isolation mitochondriale, plusieurs limitations subsistent. Premièrement, la procédure dépend fortement de la fraîcheur des tissus ; Idéalement, les échantillons de tissu doivent être traités dans la 1 heure post-mortem. Deuxièmement, la trypsine résiduelle peut dégrader les protéines de surface mitochondriale, y compris celles liées à la translocase, si elle n’est pas suffisamment retirée lors du lavage, ce qui peut affecter l’efficacité de l’absorption cellulaire ultérieure. Troisièmement, le temps de stockage mitochondrial reste limité, car un stockage prolongé à 4 °C ou la cryoconservation réduisent considérablement l’activité mitochondriale.

Au niveau translationnel, d’autres défis subsistent, notamment l’amélioration de l’efficacité de la délivrance in vivo , la compréhension des mécanismes à long terme de l’intégration mitochondriale, et la clarification des interactions potentielles entre les mitochondries transplantées et le génome de l’hôte. Avec les progrès continus dans les technologies d’isolement et de purification mitochondriale, d’autres innovations méthodologiques devraient accélérer la traduction clinique de la thérapie de transplantation mitochondriale.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Caractérisation mitochondriale
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Réduire le photoblanchiment des colorants fluorescents
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Essai de concentration de protéines
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	L'anticorps Beta-actin a été utilisé pour détecter la pureté des mitochondries isolées
BSA	Sigma	A6003	Lors de l'isolement, il lie les acides gras libres pour protéger l'activité mitochondriale.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	Centrifugation à 4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	pour découpler la phosphorylation oxydative mitochondriale et induire une fuite de protons maximale
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	Observation de coloration immunofluorescence
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Caractérisation mitochondriale
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	Pour la contre-coloration nucléaire
D-mannitol	Solarbio	IM00402	maintenir l'équilibre osmotique et prévenir le gonflement mitochondrial pendant l'isolement
EGTA	Sigma	E4378	Communément utilisé dans les tampons d'isolement mitochondrial pour protéger la fonction mitochondriale en se liant spécifiquement au Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	Culture des cellules L929
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Utilisé pour saisir, tenir et soulever des tissus
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Utilisé pour l'homogénéisation des tissus et l'isolement des mitochondries
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	Il fixe et stabilise rapidement l'ultrastructure cellulaire en réticulant les protéines, empêchant l'autolyse pour préserver la morphologie naturelle des organites.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Fournit un environnement de pH stable.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	Culture des cellules L929
JC-1	Solarbio	M8650	Détection des changements dans le potentiel membranaire des mitochondries purifiées.
L929 cell line	Procell	CL-0137	Pour l'essai d'endocytose mitochondriale
Lead citrate	Sigma	15326	pour colorer les coupes ultrafines pour l'observation fine de la structure subcellulaire.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Culture des cellules L929
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	Comme composant du tampon de transfert, il est utilisé pour éliminer le SDS et faciliter le transfert des protéines du gel à la membrane à phase solide.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Mesurer l'absorbance des mitochondries colorées au JC-1
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	Détection du potentiel membranaire mitochondrial dans le muscle squelettique
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Kits pour l'extraction basée sur la centrifugation différentielle
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	Pour la préservation des mitochondries
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Caractérisation mitochondriale
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	En tant que tampon dans la préparation de solution
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 cible l'IgG de souris (H+L) en Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 cible l'IgG de lapin (H+L) en ELISA et Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	Il est principalement utilisé comme agent de blocage pour réduire le signal de fond en occupant les sites de liaison non spécifiques sur la membrane.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Déterminer la fonction respiratoire mitochondriale et le métabolisme de l'oxygène.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	ou postfixation pour préserver les lipides et améliorer le contraste des membranes dans les échantillons TEM.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Nettoyer le tissu musculaire
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	Culture des cellules L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Labeller l'actine F-cytosquelettique pour l'imagerie microscopique à fluorescence
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	Pour la séparation des protéines par électrophorèse SDS-PAGE
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Utilisé pour la séparation par SDS-PAGE des protéines mitochondriales et cellulaires totales
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Inhibe l'activité des protéases endogènes et exogènes, empêchant la dégradation des protéines cibles pendant le traitement des échantillons.
RIPA lysis buffer	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	Utilisé pour l'extraction totale des protéines des tissus animaux et cellulaires
Sodium Chloride Injection (0.9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Numéro d'approbation H61020014	Tamponnage expérimental des cellules/tissus, rinçage et maintien de la pression osmotique
Sterile gloves	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	Isoler la contamination et protéger les opérateurs et les échantillons expérimentaux
Sucrose	Sucrose	S818048	Fournit un support osmotique et maintient la morphologie et l'intégrité