Quantification du taux de létalité embryonnaire chez Caenorhabditis elegans

Résumé

Ce protocole propose une procédure simple et peu coûteuse pour quantifier le taux de létalité embryonnaire chez Caenorhabditis elegans. Il permet une détection simple des anomalies embryonnaires à travers les populations sans équipement spécialisé ni expertise en cueillement de vers. Le protocole peut être utilisé pour quantifier les effets des mutations génétiques, des dégradations génétiques médiées par l’interférence ARN et de l’alimentation.

Résumé

La létalité embryonnaire est un phénotype fondamental utilisé dans la recherche de Caenorhabditis elegans pour caractériser les défauts du développement résultant de facteurs tels que des expositions toxiques et des mutations génétiques. Par conséquent, quantifier avec précision la pénétration de la létalité embryonnaire est essentiel pour comprendre les mécanismes et l’impact de ces perturbations sur le développement animal. Bien que des plateformes de notation automatisées existent, ces approches nécessitent souvent un investissement financier important et du matériel ou logiciel spécialisé. Cet article décrit un test à faible coût et peu technologique qui quantifie la létalité embryonnaire en mesurant le pourcentage d’embryons qui échouent à éclore. Notamment, cette version du test élimine le besoin d’un pioche à vers, ce qui le rend particulièrement adapté aux débutants. Un avantage supplémentaire de cette approche est que chaque test technique réplique la progéniture de plusieurs animaux, évitant ainsi les biais potentiels des tests à vers unique. Ce protocole inclut une discussion des paramètres critiques, tels que le nombre minimum de descendants nécessaires pour capturer avec précision la pénétrance du phénotype et la logique de la méthodologie. Enfin, nous fournissons des conseils pour adapter le test afin d’évaluer les effets du knockdown génétique via l’interférence de l’ARN, des traitements pharmacologiques ou une supplémentation nutritionnelle, ajoutant un outil polyvalent et accessible à la boîte à outils des chercheurs sur C. elegans .

Introduction

La létalité embryonnaire est un phénotype critique pour évaluer les rôles des gènes et des facteurs environnementaux dans le développement précoce. C. elegans est un modèle puissant pour étudier les processus développementaux en raison de sa lignée cellulaire invariante, de son corps transparent et de son cycle de vie^{rapide 1}. La létalité embryonnaire de C. elegans peut être utilisée pour évaluer l’intégrité du développement sous des perturbations chimiques, pharmacologiques, nutritionnelles et^génétiques 2,3,4,5. Par conséquent, des méthodes accessibles et polyvalentes pour quantifier avec précision le taux de létalité embryonnaire bénéficieraient à la communauté scientifique.

Des méthodes avancées à haut débit et à haut contenu qui étudient l’embryogenèse reposent sur des systèmes d’imagerie spécialisés et des logiciels, nécessitant souvent un investissement financier^{important 4,6,7}, tandis que les approches plus simples à haut débit fournissent principalement des lectures^{qualitatives 8,9}. Les méthodes classiques, en revanche, utilisent une approche manuelle et peu coûteuse qui implique généralement le transfert répété d’hermaphrodites individuels avec un pic de vers pour évaluer la létalité embryonnaire de toute la^{progéniture 2,10}. Cependant, cette méthode peut être techniquement difficile pour les débutants et a une scalabilité limitée. De plus, les tests classiques basés sur la taille de la couvée quantifient la viabilité embryonnaire chez la progéniture d’une mère seule, ce qui peut introduire un biais involontaire.

L’objectif global de cette méthode est de proposer une approche alternative, simple, rentable et polyvalente pour quantifier la viabilité embryonnaire à débit moyen. Cette méthode mesure les taux de létalité embryonnaire chez la progéniture de plusieurs animaux par réplication, ne nécessite pas l’utilisation d’un pic de ver, et évite tout équipement spécialisé ou coûteux. L’étude montre également comment la méthode peut être appliquée à des perturbations courantes, telles que l’interférence ARN et les tests de médicaments ou de nutriments.

Protocole

1. Entretien de C. elegans

REMARQUE : Des directives détaillées sur l’élevage de C. elegans se trouvent dans WormBook¹¹.

1. Préparez les plaques de milieu de croissance nématode (NGM) d’entretien.
   1. Pour obtenir 1 L de NGM, combinez 3 g de NaCl, 2,5 g de peptone bactériologique et 17 g d’agar dans une bouteille de 2 L. Ajoutez 975 mL d’eau distillée et une barre de remuage, puis faites de l’autoclave pendant 20 minutes à 121 °C.
   2. Laissez refroidir le milieu à 55 °C dans un bain-marie. Placez la bouteille sur une plaque de remuage et, en utilisant une technique aseptique, ajoutez 25 mL de 1 M tampon phosphate de potassium et 1 mL chacun des éléments suivants : 1 M_{MgSO 4}, 1 M_{CaCl 2} et 5 mg/mL de cholestérol. Verser environ 25 mL dans chaque plaque de 100 mm.
2. Préparez des cultures OP50 d’E. coli toute la nuit.
   1. En utilisant une technique aseptique, remplir une fiole d’Erlenmeyer de 1 L jusqu’à un cinquième de son volume (200 mL) avec un milieu LB. Inoculez le milieu avec une seule colonie d’E. coli OP50 à l’aide d’une boucle inoculante stérile. Incubez toute la nuit à 37 °C sur un vibrateur orbital à 200 tr/min.
3. Semez les plaques d’entretien NGM avec E. coli OP50 (Figure 1A).
   1. Transférez la culture E. coli OP50 dans des bouteilles centrifugeuses autoclavées et centrifugez pendant 30 minutes à 3 500 x g à température ambiante. Resuspendez la pellete bactérienne dans un vingtième du volume initial. Utilisez 1 à 1,5 mL de culture concentrée pour semer chaque plaque de 100 mm NGM.
   2. Incubez les plaques toute la nuit à température ambiante pour permettre aux bactéries de se développer.
      REMARQUE : Ces plaques d’entretien contiennent une forte densité de bactéries pour supporter jusqu’à 4 000 vers par plaque, ce qui est souhaitable lors de la réalisation d’un grand nombre d’essais ou du travail avec une souche de C. elegans à croissance lente. Les assiettes d’entretien semées peuvent être conservées au réfrigérateur à 4 °C pendant jusqu’à 1 mois.
4. Établir une culture primaire de C. elegans (Figure 1A).
   1. Utilisez une pointe de pipette stérile pour découper un petit morceau d’agar contenant ~1 000 vers d’une plaque d’entretien affamée. Placez le morceau d’agar sur une plaque NGM avec graines.
   2. Placez la nouvelle assiette dans un contenant en plastique et éclovez à 20 °C pendant 3 jours, jusqu’à ce que les vers soient gravides et pondent des œufs. Assurez-vous que la pelouse bactérienne est suffisante et que la population de vers ne meure pas de faim. À ce stade, la population de vers est prête pour l’expérience.

2. Préparation de milieux expérimentaux et de cultures bactériennes

REMARQUE : À cette étape, procéder soit à la Méthode 1 pour tester l’effet du knockdown génétique médié par l’ARNi, soit à la Méthode 2 pour étudier les compléments alimentaires.

1. Méthode 1 : Préparer des plaques NGM expérimentales pour l’ARN en les alimentant.
   1. Préparez 1 L de NGM comme décrit à l’étape 1.1, puis, en utilisant une technique aseptique, ajoutez 1 mL de 1 M IPTG et 1 mL d’ampicilline à 50 mg/mL. Verser environ 5 mL dans chaque plaque de 35 mm.
   2. Inoculer le nombre désiré de clones nourrissant l’ARN HT115 d’E. coli portant des plasmides L4440 ciblant les gènes d’intérêt de C. elegans , ainsi que le contrôle du vecteur vide. Choisissez une colonie unique avec une anse inoculante et transférez-la dans 1,5 mL de LB contenant 50 μg/mL d’ampicilline. Incuber pendant 18 heures à 37 °C sur un vibreur orbital à 200 tr/min.
   3. Semez des plaques NGM de 35 mm contenant de l’ampicilline et de l’IPTG avec 100 μL de culture E. coli HT115 pendant la nuit, en préparant deux réplications techniques par condition. Incubez les plaques toute la nuit à température ambiante pour permettre la croissance bactérienne et induire la production d’ARN double brin. Conservez un nombre égal d’assiettes non semées à 4 °C pour une utilisation ultérieure lors du transfert d’œufs.
2. Méthode 2 : Préparer des plaques expérimentales NGM avec un complément nutritionnel ou médicamenteux.
   1. Préparez 1,5 fois la concentration de NGM en suivant les instructions de l’étape 1.1, mais ajoutez 642 mL d’eau distillée au lieu de 975 mL. Gardez le milieu préparé dans un bain-marie à 55 °C.
   2. Préparez un stock à base d’eau du complément d’intérêt à 3 fois la concentration cible (par exemple, pour préparer des plaques contenant 40 mM de formate sodium, faites un stock de 120 mM). Calculez le volume de stock requis en multipliant le nombre de plaques expérimentales par 1,666 mL (un tiers du volume de la plaque). Utilisez un filtre à seringue pour filtrer la bouillon, puis chauffez-la à 55 °C dans un bain-marie.
   3. Dans un tube conique de 50 mL, mélangez 2 parties 1,5x NGM avec 1 pièce de supplément. Pour éviter le contrôle des suppléments, mélangez 2 parts de 1,5x NGM avec 1 part d’eau chaude stérile. Mélangez doucement en inversant le tube 10 fois, puis, en utilisant une technique aseptique, versez rapidement environ 5 mL de substrat dans chaque plaque de 35 mm.
      REMARQUE : 1,5x NGM est utilisé pour compenser la dilution moyenne lorsque de grandes quantités de complément sont ajoutées. Cependant, si le stock de médicament ou de métabolite est concentré à 100× ou plus de la concentration finale, on peut utiliser une NGM classique au lieu de 1,5× NGM. Lors d’un supplément d’acide organique, l’utilisation de sa forme de sel sodique aide à prévenir une baisse du pH du moyen.
   4. En utilisant une technique aseptique, remplir une fiole d’Erlenmeyer de 50 mL sur un cinquième de son volume (10 mL) avec un milieu LB. Inoculez avec une colonie d’E. coli OP50 et incubez toute la nuit à 37 °C sur un shaker orbital à 200 tr/min.
   5. Semez des plaques NGM de 35 mm avec 100 μL de culture OP50 d’E. coli pendant la nuit, en préparant deux réplications techniques par condition. Faites couver les assiettes toute la nuit à température ambiante. Conservez un nombre égal d’assiettes non semées à 4 °C pour une utilisation ultérieure lors du transfert d’œufs.

3. Obtenir une population synchronisée de larves L1

1. Préparez une solution alcaline d’eau de Javel en combinant 7 mL d’eau stérile, 2 mL de solution d’hypochlorite de sodium à 5 % et 1 mL de NaOH à 5 N.
2. Préparez le tampon M9 en dissolvant 3 g de_{KH 2}PO₄, 6 g de Na₂HPO₄, et 5 g de NaCl dans 1 L d’eau distillée, puis ajustez le pH à 6,5. Autoclave pendant 20 minutes à 121 °C, laissez refroidir la solution, puis ajoutez aseptiquement 1 mL de 1 M MgSO4.
3. Lavez les vers adultes gravides (étape 1.4.2) de la plaque avec un tampon M9 et transférez-les dans un tube conique de 15 mL. Centrifugez à 350 x g pendant 2 minutes, aspirez le surnageant, puis remplissez le tube avec un tampon M9 frais. Répétez le lavage deux fois.
4. Ajoutez 2 mL de tampon M9 et 2 mL de solution d’eau de Javel alcaline à la pastille de vers. Vortex et secoue vigoureusement, en vérifiant périodiquement au microscope jusqu’à ce que presque tous les vers soient dissous.
5. Remplissez le tube avec un tampon M9 et centrifugez à 350 x g pendant 2 minutes. Retirez le surnageant en inversant le tube, puis lavez quatre fois avec un tampon M9. Assurez-vous que le premier lavage est effectué immédiatement après la lyse des vers pour éviter un décolorement excessif. Après le dernier lavage, remplir le tube avec 8 mL de tampon M9 et couver sur un bascule pendant 18 à 20 heures, jusqu’à l’éclosion.

4. Cultiver les populations maternelles

1. Placez cinq gouttes de 3 μL de suspension de vers sur une lame en verre et comptez le nombre de larves L1 écloses au microscope. Divisez le nombre total de doses par 15 pour obtenir la concentration par microlitre.
2. Placez 30 larves L1 sur chaque plaque de 35 mm ensemencées et étouffez à 20 °C pendant 72 heures. Si les conditions expérimentales induisent un retard de développement, prolongez le temps d’incubation jusqu’à ce que les vers deviennent gravides et commencent à pondre des œufs (Figure 1B).

5. Transfert des embryons vers les plaques d’éclosion

1. Retirez les assiettes de 35 mm non semées du réfrigérateur et laissez-les atteindre la température ambiante.
2. Examinez les plaques de vers au microscope et confirmez qu’elles contiennent plus de 100 embryons, sans qu’aucune larve L1 éclate ne soit présente.
3. Remplissez soigneusement l’assiette avec un tampon M9. Utilisez une conduite sous vide pour aspirer le liquide et éliminer la population maternelle. Veillez à ce qu’aucun vers adulte ne reste sur l’assiette.
4. Remplissez une pointe de micropipette avec 200 μL de tampon M9 et pipettez de haut en bas avec force pour détacher les embryons de la pelouse bactérienne. En observant au microscope, guidez la pointe de la pipette vers les zones denses en embryons.
5. Prenez une plaque non semée et pipettez une goutte de suspension embryonnaire au centre. Examinez la gouttelette au microscope. S’il ne contient pas 100 à 300 embryons, ajouter une nouvelle suspension d’embryons jusqu’à atteindre cette fourchette. Assurez-vous qu’aucun ver de la population parentale n’est transféré avec les embryons.
6. Laissez sécher le liquide, puis faites éclore les plaques de transfert à 20 °C pendant au moins 24 heures.
   REMARQUE : Si des larves de L1 sont déjà présentes sur la plaque expérimentale, utilisez une ligne sous vide au lieu d’un lavage M9 pour éliminer toute la population maternelle une par une. Cela empêche d’emporter les nouveau-nés L1, qui ne s’accrochent pas à la pelouse bactérienne comme le font les embryons. Procéder au transfert de descendance, qui inclura désormais à la fois les embryons et les larves de L1. Veillez à ce que la même approche soit appliquée à toutes les conditions.

Figure 1 : Chronologie expérimentale et schéma des étapes clés du test de létalité embryonnaire. (A) Chronologie d’organigramme représentant la durée totale du protocole expérimental, de la préparation du support de maintenance à la notation des plaques de hachurage. Les procédures clés sont indiquées pour les jours correspondants de l’expérience. (B) Schéma du test de létalité embryonnaire (étapes 4 à 6). Au jour 4, des larves L1 synchronisées sont ajoutées aux plaques expérimentales d’ARN ou de suppléments pour établir une population maternelle. Après 72 heures, au jour 7, une fois que les vers ont pondu, la population maternelle est emportée tandis que les embryons restent attachés à la pelouse bactérienne. Les embryons sont ensuite lavés de la pelouse à l’aide d’une pipette et transférés sur une plaque d’éclosion, avec au moins 100 embryons par plaque. Après 24 heures d’incubation, les larves écloses et les embryons non éclos sont comptés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

6. Plaques de pointage

1. Utilisez un marqueur permanent pour tracer une grille d’environ 4 mm × 4 mm sur le couvercle d’une boîte de Petri de 35 mm, puis placez le couvercle sous la plaque. Utilisez la grille comme guide et, au microscope, comptez le nombre de larves L1 et d’embryons non éclos avec un compteur de clics portatif.
2. Comptez les combine-combinées à partir des réplications techniques pour garantir une pondération appropriée de chaque réplication en fonction de son nombre de descendants. Plus précisément, additionnez le nombre d’embryons non éclos et de larves écloses à travers des répliques techniques.
3. Calculez un taux de létalité embryonnaire par réplication biologique en divisant le nombre d’embryons (vers non éclos) par le nombre total de vers et d’embryons, puis multipliez par 100 pour exprimer la valeur en pourcentage.
   REMARQUE : Si une plaque ne contient que des larves écloses ou uniquement des embryons, cette étape de comptage peut être sautée, car le taux de létalité embryonnaire est respectivement de 0 (0 %) ou 1 (100 %).

7. Analyse statistique

1. Répétez l’ensemble de l’expérience au moins trois fois pour obtenir des répliques biologiques indépendantes. Pour chaque réplication biologique, utilisez deux plaques de réplication technique par condition, avec un minimum de 100 embryons par réplication technique.
2. Déterminer si les taux de létalité embryonnaire diffèrent significativement entre les conditions en utilisant une ANOVA unidirectionnelle, suivis de tests t de Student par paires post-hoc avec correction à tests multiples, comme la méthode de Benjamini-Hochberg.
   REMARQUE : La combinaison de deux réplications techniques donne au moins 200 embryons par réplication biologique. Cela satisfait l’exigence de taille d’échantillon (~184 embryons/condition) estimée par le test de puissance de la fonction de base R pour détecter une différence de létalité de 15 % (par exemple, 20 % contre 35 %) avec 90 % de puissance et un niveau de signification de α = 0,05.

Résultats

Le test de létalité embryonnaire a été réalisé sur deux souches : le type sauvage N2 et la souche ARNhypersensible rrf-3(pk1426). En utilisant l’ARN par alimentation, nous avons éliminé des gènes précédemment signalés comme responsables de la létalité embryonnaire lors de criblages à haut débit ^9,12. La figure 2 offre une démonstration représentative de la performance du test. Le knockdown T04G9.4 a produit une létalité embr...

Discussion

Plusieurs étapes sont cruciales pour assurer la reproductibilité et la précision du test. Tout d’abord, l’étape de blanchiment doit être soigneusement synchronisée pour dissoudre les vers adultes sans endommager les embryons. Un autre point important est de transférer un nombre suffisant d’embryons pour le comptage : trop peu réduit la précision, tandis que trop nombreux rendent le comptage inutilement fastidieux. Ensuite, le transfert d’embryons doit être effectué avant que les embryons...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriological peptone	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi hypersensitive
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conical tubes, 15 mL	VWR	60818-725
Culture tubes, 14 mL	VWR	470150-966
Diaphragm vacuum pump	Amazon	TC-100
Dissecting microscope	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficient, used for RNAi by feeding experiments
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulated agar	Fischer Scientific	BP97445
Handheld tally counter	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxane free (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	Pour préparer le milieu LB, dissolvez 25 g de poudre LB dans 1 L d'eau distillée. Autoclavez pendant 20 min à 121,1 °C.
Luer Lok disposable syringe	BH Supplies	BH20LL
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Microscopy slides	Sail Brand	7101
Petri dishes, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petri dishes, 35 mm	Tritech Research	T3501
Potassium Phosphate Buffer (PPB)			Pour préparer le tampon de phosphate de potassium (1 M), dissolvez 98 g de phosphate de potassium monobasique et 48 g de phosphate de potassium dibasique dans 1 L d'eau distillée. Ajustez le pH à 6. Autoclavez pendant 20 min à 121 °C.
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	529568
Rocker (nutating mixer)	Corning LSE	6720
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Celltreat	229235
Shaking incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium hydroxide solution, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Sodium hypochlorite, 5%	LabDepot	LC246302
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Stir plate	ONilab	ONi28-S
Syringe filters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Water bath	FOUR E's Scientific	WB401