Logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) : un outil open source et convivial pour l’analyse quantitative de la morphologie de la microglie

Résumé

Le logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS) est un pipeline d’analyse convivial qui ne nécessite aucune expertise en codage et qui automatise semi-automatisé l’analyse de morphologie microgliale unicellulaire à partir d’images d’immunofluorescence. Validé dans un modèle de neuroinflammation induit par des lipopolysaccharides de rongeurs, le MMPS détecte de manière reproductible les changements morphologiques associés à l’activation et permet un phénotypage microglial standardisé et évolutif.

Résumé

La microglie est constituée de cellules immunitaires issues des myéloïdes du système nerveux central qui médiatisent la dégradation et le remodelage des tissus après une lésion neurologique et se sont révélées comme des cibles thérapeutiques prometteuses dans plusieurs maladies neurodégénératives. L’analyse quantitative de la morphologie microgliale peut révéler des différences subtiles entre les sous-populations microgliales tout en préservant des informations importantes in situ . Cependant, de nombreuses plateformes d’analyse de morphologie microgliale actuellement disponibles ne sont soit pas accessibles au public, soit nécessitent une expertise informatique spécialisée, limitant ainsi leur adoption généralisée. Pour remédier à ces limitations, une plateforme open source d’analyse de morphologie microgliale, appelée Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), utilisant Python 3.11, a été développée. MMPS est compatible avec les flux de travail basés sur l’immunofluorescence et ne nécessite aucune expertise en codage pour l’installation ou le fonctionnement. Le logiciel semi-automatise l’analyse de la morphologie microgliale unicellulaire via une interface graphique accessible et intègre des flux de travail personnalisables pour le traitement d’images et la génération de masques. L’étude consiste à valider le MMPS à l’aide d’un modèle de neuroinflammation induit par des lipopolysaccharides de rongeurs (LPS). L’analyse quantitative au niveau animal a montré que la microglie des animaux traités par LPS présentait une augmentation significative de la surface du soma (p < 0,01) et une réduction du périmètre cellulaire (p < 0,05) par rapport aux témoins traités par véhicule, ce qui correspondait à des caractéristiques morphologiques associées à l’activation microgliale et à la neuroinflammation. Dans l’ensemble, MMPS offre une plateforme standardisée et reproductible pour l’analyse quantitative de la morphologie microgliale à travers les laboratoires.

Introduction

La microglie est des cellules immunitaires innées du système nerveux central (SNC) qui surveillent en permanence leur environnement à la recherche d’agents pathogènes et de lésions^{tissulaires 1}. Lors de l’activation, les microglies rétractent leurs processus et passent d’une morphologie homéostatique ramifiée à un phénotype^{amiboïde 2,3}. Dans les maladies neurodégénératives telles que l’AVC^{ischémique 4,5} et la maladie d’Alzheimer ^6,7. La microglie perpétue souvent la neuroinflammation par une production soutenue de cytokines, une dégradation tissulaire importante et une^{phagocytose 2}. Ces processus contribuent à la perturbation de l’unité neurovasculaire, aggravant encore l’activation microgliale et la blessure du^{SNC 8}, faisant ainsi de la microglie des cibles thérapeutiques^{prometteuses 9,10}.

Une approche pour identifier les différences subtiles entre les sous-populations microgliales dans les maladies neurodégénératives est l’analyse morphologique. Cela est couramment réalisé à l’aide d’animaux Cx3CR1-GFP avec microscopie à deux photons in vivo ¹¹ ou par marquage immunofluorescence (IF) de marqueurs microgliaux établis tels que la molécule adaptatrice ionisée de liaison au calcium-1 (Iba1) ou le récepteur purinocepteur^{P2Y 12}. Bien que la microglie passe fréquemment de morphologies homéostatique à amiboïde après une blessure, des études antérieures ont démontré que la microglie peut également adopter d’autres phénotypes, notamment la microglie hyperramifiée ^3,13, la microglie en nid^{d’abeilles 3,14}, la microglie^{réactive 15} et la microglie des bâtonnets ^3,16. Cependant, les études de morphologie microgliale reposent souvent sur la catégorisation manuelle des phénotypes homéostatique et amiboïdes. Ces approches nécessitent des pipelines d’analyse spécialisés qui manquent fréquemment de standardisation entre laboratoires et rendent difficile la différenciation entre morphologies similaires, telles que les phénotypes homéostatiques versus hyperramifiés, même pour le personnel^{formé 17}. De plus, l’analyse basée sur le FI des altérations morphologiques subtiles nécessite une imagerie à haute résolution, ce qui peut présenter des défis techniques supplémentaires.

Pour remédier à ces limitations, plusieurs plateformes analytiques ont été développées qui, de manière^{semi-automatique, 11} ou^{automatiquement 18} détectent la microglie et génèrent plusieurs représentations binaires des cellules, appelées « masques », sur des zones cibles définies par l’utilisateur (par exemple, 200–800^{μm 2}). Ces approches réduisent le biais de l’utilisateur, améliorent la reproductibilité et augmentent l’efficacité analytique. Malgré ces avancées, de nombreuses plateformes logicielles actuellement disponibles présentent des limites qui limitent une adoption généralisée, notamment un manque d’accessibilité open^{source 17}, des exigences d’expertise en^{codage 11, 19, 20}, une dépendance aux systèmes de microscopie à deux photons in ^{vivo 11, 19}, l’absence d’interfaces graphiques intuitives^{11, 21, 22}, lenteur vitesses de traitement¹¹, ou dépendance aux plateformes logicielles^{commerciales 12, 19, 21}. Bien que des études récentes aient commencé à traiter plusieurs de ces problèmes, de nombreuses plateformes existantes restent peu adaptées aux flux de travail basés sur le jeûne intermittenti, qui restent largement utilisés pour étudier la morphologie microgliale.

Voici une plateforme d’analyse de morphologie microgliale orientée utilisateur appelée Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS ne nécessite aucune expertise en codage, s’intègre aux flux de travail établis basés sur ImageJ, et est conçu spécifiquement pour une utilisation avec des images FI. Le logiciel a été développé en Python 3.11 et intègre des concepts des plateformes morphologiques open source précédemment^{publiées 11}. MMPS propose une interface graphique intuitive qui permet d’importer et de traiter de grandes quantités d’images FI en utilisant plusieurs options personnalisables de traitement d’image. La plateforme intègre également la sélection manuelle des cellules pour minimiser les artefacts de suréchantillonnage introduits lors de l’imagerie IF, ainsi qu’un contour manuel du soma pour empêcher l’inclusion de processus cellulaires dans les mesures du soma. De plus, MMPS inclut des paramètres personnalisables de génération de masques et plusieurs fonctionnalités d’assurance qualité pour améliorer la précision du masque. Le logiciel calcule plusieurs paramètres morphologiques couramment utilisés, notamment le périmètre, la distance moyenne du centroïde, la surface du masque, l’excentricité, la rondeur et la surface du soma. Pour des études plus avancées, les sorties générées par MMPS sont compatibles avec plusieurs plugins ImageJ et peuvent être analysées davantage à l’aide de plugins associés pour les analyses fractales, squelettes et coques.

La MMPS a été validée à l’aide d’un modèle de neuroinflammation induit par un lipopolysaccharide de rongeur (LPS) en examinant les altérations microgliales au sein de la couche corticale IV. L’analyse quantitative a démontré que l’administration de LPS augmentait significativement la zone du soma microglial tout en diminuant le périmètre cellulaire par rapport aux témoins traités par véhicule, indiquant que le MMPS détecte avec précision des changements morphologiques subtils associés à l’activation microgliale.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie-Occidentale (protocole #2109047180) et au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire soutenu par les National Institutes of Health. Les équipements, réactifs et logiciels utilisés dans cette méthode sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Animaux expérimentaux

1. Procurez 10 rats mâles de Sprague-Dawley (âgés de 2-3 mois). Une fois arrivés à l’étape, les rats doivent être hébergés en groupe selon un cycle clair/obscur de 12 heures avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau. À leur arrivée, les rats sont acclimatés pendant 3 jours avant utilisation.
2. Assigner aléatoirement les rats aux groupes traités par véhicule ou LPS (n = 5 rats/groupe).
   REMARQUE : En raison du faible nombre de rats à utiliser, une stratégie de randomisation simple peut être employée, avec des nombres aléatoires générés par ordinateur pour assigner les rats à un groupe de traitement.
3. Surveillez les rats après un traitement pour des « comportements de maladie » : perte de poids (>15 %), sécrétion de porphyrine, anomalies respiratoires ou diminution de l’activité.
   REMARQUE : Les symptômes de comportement de maladie apparaissent souvent dans les 12 premières heures suivant l’administration, donc injectez des agents tôt le matin (6-8h), surveillez leur comportement tout au long de la journée, et ramenez les rats à l’établissement en fin de journée (17h-19h).

2. Modèle de neuroinflammation

1. Préparez la solution d’origine LPS (O111 :B4) (10 mg/mL) en dissolvant 50 mg de sel dans 5 mL de solution saline tamponnée phosphate.
   REMARQUE : Le LPS est une endotoxine. Les chercheurs doivent suivre la procédure standard de leur institution pour la manipulation et l’élimination.
2. Peser les rats puis injecter intraperitonéalement du LPS (10 mg/kg) ou du PBS (véhicule par voie de départ).
3. En fonction du poids des rats, un volume d’injection entre 150 et 300 μL est attendu.
4. Euthanasiez les rats 24 heures après l’injection par perfusion cardiaque suivie d’une décapitation.
5. Anesthésiez les rats avec de l’isoflurane inhalé (5 % dans_O2) pendant 5 à 10 minutes. Confirmez l’anesthésie en l’absence du réflexe de retrait des pédales.
6. Pendant l’anesthésie, créez une incision thoracique médiane pour exposer le diaphragme et le sternum. Clampez le processus xiphoïde à l’aide d’hémostaux pour révéler la cavité thoracique.
7. Coupez le diaphragme et la cage thoracique vers les membres antérieurs pour exposer le cœur.
8. Pincez l’aorte descendante et la veine cave inférieure avec des hémostats. Insérez une aiguille ailée de calibre 25 dans le ventricule gauche.
9. Perfusez les rats avec du PBS glacé (25 mL à 30 mL/min) à l’aide d’une pompe péristaltique. Incisez l’oreillette gauche dans les quelques secondes suivant l’initiation de la perfusion pour permettre le drainage perfusé.
10. Rats perfusés avec 4 % de paraformdéhyde (25 mL à 30 mL/min).
    ATTENTION : Manipulez le paraformoldéhyde à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié dans un environnement bien ventilé. Éliminer les déchets de paraformoldéhyde conformément aux réglementations institutionnelles et locales.
11. Décapiter les rats avec une guillotine après une perfusion.
    REMARQUE : Suivez les directives de votre institution concernant l’enregistrement des décapitations et l’aiguisage des lames.
12. Exposez le crâne en rétractant le cuir chevelu vers la pavillon pinna.
13. Brisez l’os frontal à l’aide d’hémostats ou de rongeurs insérés dans les alvéoles orbitales.
14. Insérez des pinces dans le foramen magnum et retirez les os pariétaux.
15. Retirez le cerveau à l’aide de pinces fines et faites couver toute la nuit dans du paraformodéhyde à 4 %.
16. Transférez les cerveaux séquentiellement dans 20 % de saccharose et 30 % de saccharose pendant la nuit pour la cryoprotection.

3. Immunofluorescence

1. Congelez les cerveaux cryoprotégés dans le composé Tissue Tek O.C.T. sur de la glace sèche.
2. Coupe le cerveau à 30 μm à l’aide d’un cryostat.
3. Collectez des sections dans des PBS et transférez-les dans des puits filets insérés dans une plaque à 12 puits.
4. Sélectionnez au moins deux sections par rat contenant l’hippocampe dorsal antérieur.
5. Lavez les sections en PBS pendant 5 minutes deux fois en faisant basculer.
6. Perméabiliser les coupes en 0,3 % de Triton X-100/PBS pendant 45 minutes en balançant.
   REMARQUE : Utilisez 3 mL de solution par étape de lavage ou d’incubation, sauf indication contraire.
7. Laver les sections dans PBS pendant 5 minutes deux fois.
8. Diluez la solution de prélèvement antigénique à 1x dans PBS et ajoutez 2 mL par puits.
9. Incubez des sections à 80°C pendant 20 minutes à l’aide d’un bain-marie.
10. Laissez les sections refroidir à température ambiante avant de continuer.
11. Laver les sections dans PBS pendant 5 minutes deux fois.
12. Coupes en bloc dans 10 % sérum d’âne/0,05 % Triton X-100/PBS pendant 2 heures à 37°C en secouant à 75 tr/min.
13. Lavez les sections dans un sérum d’âne à 1 % / 0,05 % Triton X-100 / PBS pendant 5 minutes trois fois.
14. Transférer les sections dans une nouvelle plaque à 12 puits sans les puits nets contenant 500 μL de solution primaire d’anticorps anti-Iba1 préparée dans 1 % de sérum d’âne/0,05 % de Triton X-100/PBS.
15. Préparez des contrôles négatifs en omettant l’anticorps primaire de la solution d’incubation.
16. Incubez toutes les sections toute la nuit à 4°C sur un bascule orbital
17. Retournez les sections aux puits du filet.
18. Lavez les sections avec un sérum d’âne à 1 % / 0,05 % Triton X-100 / PBS pendant 10 minutes trois fois.
19. Incubez des sections avec un anticorps secondaire anti-lapin (dilution 1:1000) dans 1 % de sérum d’âne/0,05 % de Triton X-100/PBS pendant 1,5 h à température ambiante.
    REMARQUE : Minimisez l’exposition à la lumière lors de toutes les procédures suivantes et enveloppez les plaques dans du papier aluminium pour éviter la dégradation du fluorophore.
20. Laver les sections dans PBS pendant 5 minutes deux fois.
21. Montez les sections sur des lames de microscope.
22. Séchage à l’air dans l’obscurité pendant >2 heures.
23. Coupes de couverdisse utilisant des composés solubles dans l’eau.
24. Préparez des glissières de contrôle négatif à l’aide d’un support de montage.
25. Stockez les lames dans une boîte à diapositives à température ambiante dans un environnement sombre.

4. Imagerie

1. Identifiez la taille des pixels d’un système d’imagerie à un grossissement de 40x. Si l’échelle n’est pas trouvée, ajoutez une barre d’échelle à chaque image.
2. Utilisez la coloration DAPI pour identifier une bande dense de noyaux corticaux à faible grossissement correspondant à la couche corticale IV.
3. Concentrez l’image sur la région corticale identifiée.
4. Passez au grossissement 40x.
5. Ajustez les paramètres d’exposition du canal pour maximiser la séparation des signaux DAPI et Iba1 de la fluorescence de fond.
6. Acquérir des images Z-stack (> 30 étapes) couvrant toute la profondeur des microglies.
7. Générez et enregistrez une image de projection composite à intensité maximale à partir de la pile Z acquise des deux colorations.
   REMARQUE : Optimisez les réglages d’exposition et de pile Z pour chaque image afin de maximiser la séparation du signal entre DAPI/Iba1 et la fluorescence de fond. Une mauvaise séparation du signal réduit la précision de la génération du masque.

5. Logiciel de cartographie des paramètres microgliaux (MMPS)

1. Stockez toutes les images composites dans un seul répertoire d’images.
2. Créez un répertoire de sortie séparé pour les résultats générés par MMPS.
3. Téléchargez le paquet autonome MMPS ou MMPS.py script depuis le dépôt GitHub.
4. Installez toutes les dépendances listées dans le fichier requirements.txt si vous lancez MMPS via MMPS.py.
5. Ouvre le paquet MMPS ou exécute MMPS.py script.
6. Sélectionnez « Sélectionner le dossier image » et choisissez le répertoire d’images.
7. Sélectionnez « Sélectionner dossier de sortie » et choisissez le répertoire de sortie.
8. Accordez les permissions d’accès aux dossiers si le système d’exploitation le demande.
   REMARQUE : Des instructions d’installation supplémentaires, des conseils de dépannage et des exemples d’utilisation sont fournis dans la documentation complémentaire et le dépôt GitHub.
9. Sélectionnez « Étiquetage de l’image » et attribuez des identifiants animaux et des groupes de traitement à chaque image.
   REMARQUE : Si l’étiquetage des images est omis, MMPS demande des identifiants de groupe de traitement et d’animaux avant l’exportation des données.
10. Saisissez la taille du pixel dans l’onglet « Paramètres ».
11. Sélectionnez « Calibrer à partir de la barre d’échelle » si la taille du pixel est inconnue. Sélectionnez les points de début et de fin de la barre d’échelle quand on vous le demande. Voici la distance connue entre la barre d’échelle en micromètres.
12. Sélectionnez le canal de fluorescence contenant le signal microglial.
13. Sélectionnez les images pour le traitement en cochant la case à côté de chaque nom d’image. Traiter les images individuellement lorsque la fluorescence de fond diffère considérablement d’une image à l’autre.
14. Examinez les onglets « Original », « Aperçu », « Traité » et « Masques » pour comparer les étapes de traitement d’image.
15. Sélectionnez « Aperçu de l’image actuelle » pour évaluer les paramètres de traitement de l’image.
16. Ajustez les réglages de soustraction de fond roulant, de réduction du bruit et d’accentuation selon les besoins.
17. Utilisez des valeurs de billes roulantes entre 5 et 150 pixels pour la soustraction de fond.
18. Utilisez des valeurs de réduction du bruit entre 3 et 7 pixels pour réduire les artefacts d’éclairage irréguliers.
19. Utilisez des valeurs de netteté comprises entre 1 et 2 pour améliorer la définition des arêtes.
20. Sélectionnez « Traiter les images sélectionnées » après optimisation des paramètres de traitement d’image.
    REMARQUE : Le temps de traitement de l’image varie en fonction du nombre d’image et des paramètres sélectionnés.
21. Sélectionnez « Choisissez des Somas (toutes les images) ».
22. Sélectionnez « Afficher la couleur (C) » pour afficher les images composites RVB. Sélectionnez « Chaînes... » et désélectionner les canaux inutilisés si la coloration de l’image apparaît déformée.
23. Sélectionnez les somas microgliaux affichant la localisation DAPI et Iba1. Évitez de sélectionner des cellules en contact avec les bordures de l’image. Supprimez les marqueurs soma mal sélectionnés en utilisant la touche « Retour arrière » ou « Supprimer ».
24. Appuyez sur « Entrée » ou « Retour » pour passer à l’image suivante.
25. Sélectionnez « Esquisser les Somas (Toutes) » une fois la sélection du soma terminée.
26. Décrivez le périmètre soma de chaque cellule microgliale sélectionnée. Excluez les processus cellulaires du contour du soma et utilisez au moins huit points de contour par soma. Supprimez les points de contour mal placés en utilisant « Annuler le dernier point », « Supprimer » ou « Retour arrière ».
27. Presse « Entrer », « Revenir », double-clic ou clic droit pour finaliser chaque plan de soma.
28. Sélectionnez « Refaire le dernier plan » pour répéter le précédent plan du soma si besoin.
29. Sélectionnez « Générer tous les masques » après avoir terminé le plan Soma.
30. Appliquez une valeur seuil minimale pour restreindre l’intégration de pixels de fond de faible intensité dans les masques.
    REMARQUE : Des valeurs plus élevées préservent la précision du soma au détriment du ramification, tandis que des valeurs plus basses conservent la précision du ramification au détriment du soma. Les seuils entre 10 et 30 % permettent généralement une suppression équilibrée du fond et la préservation des branches.
    REMARQUE : Le temps de génération du masque varie en fonction du nombre de cellules sélectionnées.
31. Sélectionnez « QA Tous les masques » pour commencer l’assurance qualité des masques.
32. Examinez les masques présentés du plus grand (800^{μm 2}) au plus petit (200^{μm 2}).
33. Comparez chaque masque à la microglie correspondante à l’aide des onglets « Traité » et « Masque ».
34. Acceptez les masques en utilisant le raccourci clavier « A ». Rejetez les masques en utilisant le raccourci clavier « R ». Appuyez sur « B » pour annuler une acceptation ou un refus. Naviguez entre les tailles de masques à l’aide des flèches du clavier.
35. Sélectionnez le plus grand masque acceptable qui capture avec précision la branche microgliale sans inclure les cellules voisines, l’excès de fond, les bordures d’image ou les barres d’échelle.
    REMARQUE : Rejetez les masques s’il y a une incertitude quant à leur exactitude.
    REMARQUE : Sélectionnez « Effacer tous les masques », puis régénérez les masques avec une valeur seuil différente si la plupart sont inexacts.
36. Sélectionnez « Calculer les caractéristiques simples » après la fin de l’assurance qualité du masque pour
    Calculez la distance moyenne du centroïde, la surface du masque, le périmètre, l’excentricité, la rondeur et la taille du SOMA en utilisant les masques acceptés et les contours du SOMA.
37. Voir le tableau 1 pour les définitions des paramètres et les tendances microgliales dans la neuroinflammation.
38. Télécharger « Sholl.py », « FractalAnalysis_ImageJ.py » et « SkeletonAnalysisImageJ.py » pour effectuer des analyses supplémentaires.
39. Ouvrez « FractalAnalysis_ImageJ.py » comme plugin Fiji pour les analyses fractales et de coques.
40. Saisissez l’emplacement du répertoire de sortie et la taille des pixels lorsqu’on le demande. Sélectionnez l’option « plus grand masque uniquement » si l’analyse du plus grand masque accepté est souhaitée.
41. Ouvrez « Sholl.py » comme plugin Fiji pour l’analyse de Sholl.
42. Saisissez l’emplacement du répertoire de sortie et la taille des pixels lorsqu’on le demande.
43. Voici la taille d’étape souhaitée pour l’analyse de Sholl. Sélectionnez « Utiliser le rayon soma comme rayon de départ » pour utiliser les rayons soma dérivés de MMPS comme rayon de départ pour l’analyse de Sholl. Entrez une valeur de rayon de soma fixe si les rayons de soma dérivés de MMPS ne sont pas utilisés.
44. Ouvrez « SkeletonAnalysisImageJ.py » comme plugin fidji pour l’analyse de squelettes.
45. Entrez l’emplacement du répertoire de sortie, la taille des pixels et le dossier masques lorsque vous le demandez.
46. Exportez tous les résultats générés par le plugin sous forme de fichiers CSV dans le répertoire de sortie une fois terminé.

6. Formules utilisées dans le MMPS pour les calculs de morphologie de la microglie

REMARQUE : Tous les calculs sont effectués automatiquement par MMPS lorsque « Calculer les caractéristiques simples » est appuyé sur l’opuscule. Les calculs des paramètres sont présentés ci-dessous.

1. Périmètre
   1. Calculez le périmètre à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Définissons comme périmètre, comme le nombre de pixels sur les arêtes, et comme la taille des pixels en μm.
2. Distance moyenne du centroïde
   REMARQUE : La distance moyenne du centroïde est également appelée dispersion cellulaire¹¹.
   1. Identifiez quatre points d’extrémité de branche en fonction des coordonnées de la cellule :
      branche supérieure : coordonnée y minimale,
      Branche inférieure : coordonnée y maximale,
      branche gauche : coordonnée X minimale,
      Branche droite : Coordonnée X maximale.
   2. Calculez les coordonnées du centroïde à l’aide des équations suivantes :
      
      
   3. Définissons c_x et _{c y} comme coordonnées de centroïde, x_i et _{y i} comme coordonnées de pixels, et comme le nombre total de pixels.
   4. Calculez la distance de branchement à l’aide de l’équation suivante :
      
   5. Définissons d comme la distance de branchement, x_i et _{y i} comme coordonnées d’extrémité de branche, et c_x et _{c y} comme coordonnées de centroïde.
   6. Calculez la distance moyenne du centroïde à l’aide de l’équation suivante :
      
   7. Définissons comme la distance moyenne du centroïde, la distance de branche, d_i et la taille des pixels en μm.
3. Zone du masque
   1. Calculez la surface du masque à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Définissons une zone de masque en μm², comme le nombre de pixels à l’intérieur du masque, et comme la taille des pixels en μm.
4. Excentricité
   1. Calculez les seconds moments centraux à l’aide des équations suivantes :
      
      
      
   2. Définissons μ₂₀, μ₀₂ et μ₁₁ comme secondes secondes centrales, x_i et _{y i} comme coordonnées pixel, c_x et _{c y} comme coordonnées centroïdales, et N comme nombre total de pixels.
   3. Calculez les valeurs propres de la matrice de covariance à l’aide de l’équation suivante :
      
   4. Définissons λ₁ ≥ λ₂.
   5. Calculez les longueurs des grands et mineurs axes à l’aide des équations suivantes :
      
   6. Définissons a comme la longueur des grands axes et b comme la longueur des mineurs.
   7. Calculez l’excentricité à l’aide de l’équation suivante :
      
   8. Définissez par excentricité.
5. Rondeur
   1. Calculez la rondeur à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Définissons la rondeur, la longueur des grands axes, et la longueur des mineurs.
6. Taille Soma
   1. Calculez la surface de soma à l’aide de l’équation suivante :
      
   2. Définissons Sa comme une aire de soma en^{μm 2}, comme le nombre de pixels à l’intérieur du masque de soma, et S comme la taille des pixels en μm.

7. Analyse statistique

1. Effectuez toutes les analyses statistiques en utilisant la version 4.3.2 de R.
2. Filtrez les jeux de données en utilisant le plus grand masque accepté pour chaque cellule.
3. Paramètres cellulaires moyens au niveau animal avant analyse statistique.
4. Évaluer la normalité et la variance à l’aide des tests de Shapiro–Wilk et Levene.
5. Effectuer des tests t de Student ou des ANOVA à moyennes répétées avec des tests t par paires corrigés post-hoc lorsque les ensembles de données satisfont à des hypothèses paramétriques.
6. Effectuer des tests de Wilcoxon à somme de rangs ou de Friedman avec des tests de Wilcoxon en rang signé corrigés par Holm lorsque les ensembles de données ne satisfont pas aux hypothèses paramétriques.
7. Définissons la signification statistique comme p < 0,05 .

Résultats

Une plateforme open source et autonome d’analyse de la morphologie microgliale, appelée Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), a été développée pour offrir un flux de travail accessible et standardisé pour l’analyse de morphologie microgliale basée sur le jeûne intermittentiel. La plateforme s’appuie sur des méthodologies d’analyse morphologique précédentes, ne nécessite aucune expertise en codage et intègre une interface graphique accessible. MMPS a été conçu pour améliorer la détection des branches microgliales subtiles tout en intégrant plusieurs mesures de protection afin de minimiser la surestimation des masques microgliaux.

Le MMPS a été validé à l’aide d’un modèle de neuroinflammation rongeur induit par le LPS. Après traitement tissulaire et acquisition d’image (Figure 1), la spécificité du FI a été confirmée à l’aide de sections témoins négatives dépourvues de coloration primaire par anticorps (Figure supplémentaire 1). Le traitement MMPS commence par l’importation des images FI dans l’interface logicielle (Figure 2A). Le logiciel offre plusieurs options de traitement d’image pour améliorer la détection des microglies et la séparation du fond. La soustraction obligatoire de fond est réalisée à l’aide de l’algorithme rolling-ball implémenté dans le package Scikit-image, tandis que des filtres optionnels de réduction du bruit et de netteté sont disponibles via un filtrage gaussien basé sur SciPy. Après le traitement de l’image, les somas microgliales sont sélectionnés manuellement et identifiés par des marqueurs rouges de sélection (Figure 2B). Les frontières de Soma sont ensuite délimitées manuellement pour les calculs morphologiques en aval (Figure 2C).

Figure 1 : Aperçu graphique du modèle et du traitement de la neuroinflammation. Les rats ont été injectés avec LPS ou PBS et ont été recueillis 24 heures avec une perfusion cardiaque suivie d’une décapitation. Les cerveaux ont été extraits et découpés en sections de 30 μm pour être ensuite utilisés dans le FI pour le marqueur microglial Iba1, qui ont ensuite été traités avec MMPS. Créé avec Biorender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Aperçu de l’utilisation des MMPS. (A) Exemple d’image de microglie corticale (rouge, Iba1) avec noyaux cellulaires (bleu, DAPI) à référencer dans MMPS (barre d’échelle = 75 μm, 40x). Après le traitement de l’image avec MMPS, le fond sera réduit et des morphologies précises évaluées (B) Après le traitement de l’image en MMPS, les somas sont sélectionnés manuellement avec un cercle rouge pour être utilisés aux étapes suivantes détaillées dans les méthodes (barre d’échelle = 75 μm, 40x). (C) Deux microglies représentatives ont été esquissées manuellement, et les images de contour soma sauvegardées sont montrées ci-dessous. (D) La génération de masques de cellules sélectionnées trace automatiquement les branches microgliales jusqu’à 800^μm2, mais nécessite une assurance qualité manuelle. Ici, nous affichons le masque inexact de 800^{μm 2} suivi du masque plus précis de 700^{μm 2}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Après le plan de la SOMA, le MMPS génère des masques itératifs sur une plage de taille de 200 à 800^{μm 2} en utilisant un seuil adaptatif contraint par des seuils d’intensité minimale définis par l’utilisateur. Les masques plus petits suivent de plus près le seuil défini par l’utilisateur, tandis que les masques plus grands assouplissent progressivement les restrictions de seuil pour maximiser l’incorporation de succursales. Les masques générés font l’objet d’un contrôle qualité manuel afin d’éviter l’inclusion de cellules voisines, l’incorporation excessive de fonds ou la troncature par les bordures d’image ou les barres d’échelle. Comme montré à la Figure 2D, le masque de 800^{μm 2} pour une cellule microgliale représentative s’étendait dans une cellule voisine. Le rejet du masque de 800^μm2 et la sélection du masque de 700^μm2 corrigeaient l’erreur de segmentation tout en préservant une délimitation précise des microglies cibles.

Après le traitement MMPS, l’activation microgliale a été évaluée à l’aide du plus grand masque accepté pour chaque cellule, car ces masques capturaient le plus précisément la branche distale tout en minimisant l’incorporation de fond. Les paramètres morphologiques calculés sont résumés dans le tableau 1 et représentés à la figure 3. L’administration du SPL a significativement diminué la distance moyenne du centroïde et le périmètre cellulaire par rapport aux témoins traités par véhicule (p < 0,05 ; Figure 3A,B), cohérente avec la rétraction des processus microgliales lors de l’activation. Aucune différence significative n’a été observée dans la surface du masque, sa rondeur ou l’excentricité entre les groupes de traitement (Figure 3C–E), malgré des rapports antérieurs associant ces paramètres à des phénotypes microgliaux^{activés 3,23}. La présente étude n’a pas été statistiquement validée pour détecter des différences subtiles dans la forme du soma ou la zone du masque, et les sous-populations microgliales peuvent adopter des morphologies inflammatoires hétérogènes qui ne suivent pas uniformément ces^{tendances 3}. En revanche, la zone de soma a été significativement augmentée chez les animaux traités par LPS par rapport aux témoins véhicules (p < 0,01 ; Figure 3F), soutenant également le remodelage morphologique associé à^{l’activation 22}.

Figure 3 : Comparaison des paramètres morphologiques microgliaux. Pour tous les panels, des tests de normalité ont été réalisés (Shapiro-Wilk et Levene) avec des valeurs non significatives trouvées dans tous les cas (p>0,05), ce qui a conduit à l’utilisation des tests t de Student. Les points représentent des animaux individuels (n=5 par traitement) (A) La distance moyenne du centroïde était significativement plus élevée dans le groupe véhicule que dans le groupe de traitement LPS. (B) Le périmètre des cellules microgliennes était significativement plus important dans le groupe véhicule comparé au groupe traité par le LPS. (C) Il n’y avait pas de différence significative dans la surface du masque entre les groupes de traitement. (D) Il n’y avait pas de différence significative d’excentricité des soma entre les groupes. (E) Il n’y a pas de différence significative dans la rondeur du soma entre les groupes de traitement. (F) Il y a eu une augmentation significative de la zone soma dans le groupe LPS * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Paramètre	Définition	Lien avec l’activation microgliale
Distance moyenne du centroïde	Distance moyenne de la branche la plus éloignée en haut, droite, bas et gauche	Diminutions
Périmètre	Mesure du périmètre de la cellule	Diminutions
Zone masque	La zone réelle de la cellule, pas la zone cible du masque	Diminutions
Excentricité	Mesure de l’allongement approximatif du soma cellulaire (0 : circulaire, 1 : très allongé)	Diminutions
Rondeur	Une mesure de la circularité approximative du soma cellulaire (0 : allongé, 1 : circulaire)	Augmentations
Taille Soma	La zone de la cellule soma	Augmentations

Tableau 1 : Paramètres calculés à partir de MMPS et changements prédits dans la réponse à l’activation de la microglie. Le tableau résume les paramètres morphologiques calculés par le logiciel de cartographie des paramètres microgliales (MMPS), incluant le périmètre, la distance moyenne du centroïde, la surface du masque, l’excentricité, la rondeur et la surface du soma.

La reproductibilité inter-utilisateurs a ensuite été évaluée en fournissant le même ensemble d’images à des utilisateurs aveuglés et non entraînés pour une analyse indépendante (Figure supplémentaire 2). Aucune différence statistiquement significative n’a été détectée entre les utilisateurs, et tous ont reproduit des tendances morphologiques compatibles avec une activation microgliale chez les animaux traités par LPS.

MMPS supporte également des analyses morphologiques avancées en aval. L’analyse corrélative des paramètres générés à partir de la Figure 3 a démontré des relations entre des caractéristiques morphologiques distinctes. Les rats traités en véhicule n’ont montré qu’une faible corrélation entre la rondeur des microglies et le périmètre (R² = 0,17), tandis que les rats traités par LPS ont montré une corrélation plus forte (R² = 0,64), suggérant qu’une activation microgliale accrue était associée à des réductions simultanées de rondeur et de périmètre (Figure 4A). De plus, la zone du masque a montré de fortes corrélations positives avec la distance moyenne du centroïde dans les groupes traités par véhicule et traités par LPS (R² = 0,71 et 0,88, respectivement), ce qui correspond à des changements de complexité de branchement associés à l’activation microgliale (Figure 4B).

Figure 4 : Analyse avancée des paramètres microgliaux. Tous les panneaux sont des droites au niveau animal de meilleur ajustement, calculées par la méthode des moindres carrés ordinaires, affichées avec leur coefficient de détermination (R²) et ombrées avec leur intervalle de confiance à 95 %. (A) La rondeur du soma microglial et la tendance de la longueur totale du périmètre dans la microglie forment le groupe du véhicule (R² = 0,17) mais présentent une corrélation plus forte après exposition au LPS (R² = 0,64). (B) La distance moyenne du centroïde est corrélée à la surface des microglies dans les groupes du véhicule (R² = 0,71) et LPS (R² = 0,88). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Validation du protocole FI par contrôle négatif. Une tranche cérébrale de la même région pour chaque rat a suivi le protocole FI sans ajout primaire d’anticorps pour confirmer l’absence d’autofluorescence (barre d’échelle = 75 μm) (A) Image représentative du tissu coloré par véhicule pour DAPI (bleu). (B) Image représentative du tissu coloré par véhicule pour Iba1 (rouge). (C) Image représentative du tissu coloré par véhicule pour DAPI (bleu) et Iba1 (rouge). (D) Image représentative du tissu coloré à la LPS pour DAPI (bleu). (E) Image représentative du tissu coloré à LPS pour Iba1 (rouge). (F) Image représentative du tissu coloré à LPS pour DAPI (bleu) et Iba1 (rouge). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Évaluation de la variation inter-utilisateurs de la MMPS. Plusieurs utilisateurs aveugles ont utilisé le MMPS sur les mêmes échantillons de la Figure 3 et les résultats au niveau animal ont été comparés. Pour tous, les tests de normalité (Shapiro-Wilk et Levene) étaient non significatifs (p>0,05), ce qui a conduit à l’utilisation d’une ANOVA à moyennes répétées avec un test t par paires corrigé post-hoc (p>0,05). (A) Il n’y avait pas de différence significative dans chaque groupe entre les utilisateurs pour la distance moyenne du centroïde (p>0,05). (B) Il n’y avait pas de différence significative dans chaque groupe entre les utilisateurs pour le périmètre (p>0,05). (C) Il n’y avait pas de différence significative dans chaque groupe entre les utilisateurs pour la surface du masque (p>0,05). (D) Il n’y avait pas de différence significative dans chaque groupe entre les utilisateurs pour l’excentricité (p>0,05). (E) Il n’y avait pas de différence significative dans chaque groupe entre les utilisateurs en termes de rondeur (p>0,05). (F) Il n’y avait pas de différence significative entre chaque groupe entre les utilisateurs de la zone Soma (p>0,05). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’objectif principal de cette méthodologie est d’élargir l’accessibilité à l’analyse de la morphologie microgliale en réduisant les barrières techniques courantes tout en préservant les forces des approches d’évaluation morphologique établies. MMPS permet de détecter des altérations morphologiques microgliales subtiles tout en maintenant la compatibilité avec des analyses avancées, y compris les analyses fractales, squelettiques, coques et de Sholl. Comparé aux approches publiées précédemment, MMPS offre une interface graphique accessible, des calculs intégrés pour les paramètres morphologiques couramment utilisés, et l’élimination des exigences de codage tout en conservant la compatibilité avec des analyses plus avancées en aval.

Plusieurs étapes méthodologiques cruciales influencent fortement la précision analytique et la reproductibilité. Une imagerie immunofluorescence (FI) de haute qualité est essentielle pour la génération fiable de masques et les calculs morphologiques. La spécificité des anticorps représente un facteur majeur de la qualité de l’image, car le marquage non spécifique augmente la fluorescence de fond et réduit la séparation du signal entre la microglie et les tissus environnants. De même, des concentrations d’anticorps sous-optimales peuvent réduire l’intensité de fluorescence et diminuer la résolution de l’image. L’acquisition d’images Z-stack est également cruciale, car l’omission de l’imagerie Z-stack peut modifier artificiellement la complexité apparente de branchement microglial et la propagation du processus, biaisant ainsi les calculs morphologiques.

Plusieurs autres considérations sont importantes lors du traitement MMPS. Bien que MMPS prenne en chargement le traitement d’image en lot, l’optimisation individuelle de l’image est souvent préférable car les caractéristiques de fond et la qualité de coloration peuvent varier considérablement d’une image à l’autre. La qualité de l’image influence directement la précision de la génération du masque ; par conséquent, l’optimisation lors du prétraitement de l’image améliore considérablement la reproductibilité et la robustesse des analyses en aval. Une sélection soigneuse des microglials somas est également importante, notamment l’évitement des cellules de contact avec les bordures de l’image, car la sélection partielle des cellules peut réduire artificiellement les mesures des somas et déformer la génération du masque. Lors de la vérification de la qualité des masques, les masques incorporant des cellules voisines, un arrière-plan excessif ou des bordures d’images doivent être rejetés. Inversement, les masques plus petits ne doivent pas être rejetés uniquement parce qu’ils ne capturent pas tous les processus distals, car l’algorithme itératif de génération de masques ajuste intentionnellement les paramètres locaux de seuil selon la taille du masque et l’intensité régionale des pixels.

Cette méthodologie est très adaptable et peut être modifiée pour répondre à des exigences expérimentales spécifiques. Parce que MMPS est open source, la plateforme peut être étendue pour analyser des trames Z-stack individuelles ou intégrer des algorithmes automatisés de détection cellulaire afin de générer un pipeline d’analyse morphologique entièrement automatisé. De plus, les masques générés et les contours soma restent compatibles avec les flux de travail basés sur ImageJ pour les analyses fractales, coques, squelettes et Sholl. Parce que MMPS a été développé en Python 3.11, des analyses supplémentaires peuvent également être intégrées directement dans le logiciel à l’aide de paquets scientifiques Python couramment disponibles, sans nécessiter de plateformes logicielles externes.

Malgré ces avantages, plusieurs limites doivent être prises en compte. La MMPS a été validée à l’aide d’un modèle de neuroinflammation dans une région cérébrale spécifique de rats mâles de Sprague-Dawley, et différentes régions cérébrales, modèles de maladies, espèces ou sexes biologiques peuvent influencer les résultats morphologiques. L’applicabilité de la MMPS à des paradigmes expérimentaux alternatifs doit donc être validée par des études pilotes ou soutenue par des comparaisons de littérature antérieure. De plus, l’imagerie basée sur le FI capture incomplètement les structures à branchement tridimensionnelles car les processus s’étendant directement au-dessus ou en dessous du plan focal peuvent ne pas être détectés dans les images à projection maximale. Augmenter le nombre de cellules analysées peut aider à atténuer cette limitation. MMPS reste également dépendant de la qualité d’acquisition d’image et nécessite donc une optimisation pour les systèmes d’imagerie individuels, les protocoles de coloration et les préparations d’anticorps. Les images à basse résolution peuvent gonfler artificiellement la taille du masque en raison de frontières floues entourant les somas et de branches très serrées. Pour cette raison, le protocole actuel intègre des méthodes IF flottantes et plusieurs options de traitement d’image pour maximiser la qualité de l’image.

MMPS conserve également un certain potentiel de variabilité dépendante de l’utilisateur, car les utilisateurs sélectionnent manuellement les cellules et dessinent les somas. Cependant, l’utilisation de la colocalisation DAPI et Iba1 réduit considérablement l’ambiguïté lors de la sélection des cellules. De plus, l’analyse inter-utilisateurs aveugle a montré une variabilité minimale entre des utilisateurs auparavant non formés, favorisant la reproductibilité du flux de travail analytique.

Contrairement à plusieurs plateformes de morphologie microgliale publiées auparavant, MMPS n’est pas entièrement automatisée. Cependant, ce design a été choisi pour privilégier la précision de segmentation et l’assurance qualité du masque. Des flux de travail automatisés pourraient être intégrés par modification du code source Python pour permettre la détection automatisée de la colocalisation DAPI/Iba1, le contour soma basé sur les contours, et l’acceptation ou le rejet du masque basé sur l’apprentissage automatique. De plus, MMPS nécessite une capacité de stockage disque importante car les masques générés et les contours soma sont automatiquement sauvegardés sous forme de fichiers .tiff pour les analyses en aval et l’assurance qualité. Les besoins de stockage pourraient être réduits en modifiant le logiciel pour générer des masques séquentiellement cellule par cellule, suivis d’une évaluation immédiate de la qualité et d’une extraction des paramètres.

En conclusion, MMPS élargit l’accès à l’analyse quantitative de la morphologie microgliale en fournissant une plateforme standardisée et open source qui ne nécessite aucune expertise en codage ni capacités d’imagerie in vivo . La plateforme facilite l’analyse reproductible de la morphologie microgliale basée sur le FI tout en maintenant la compatibilité avec les approches analytiques avancées en aval.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Plaque utilisée pour l'incubation et le lavage des sections de tissus.
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-101	Utilisé pour protéger les échantillons fluorescents de l'exposition à la lumière.
Antigen Retrieval Buffer (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Utilisé pour améliorer l'accessibilité aux antigènes lors de la coloration immunofluorescence.
Anti-Iba1 primary antibody	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Anticorps primaire utilisé pour le marquage immunofluorescent de la microglie.
Cryostat	Fisher Scientific	95-710-0L	Instrument utilisé pour découper le tissu cérébral congelé à des épaisseurs définies.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Anticorps secondaire fluorescent utilisé pour la visualisation des anticorps primaires de lapin.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	Réactif de blocage utilisé pour réduire la liaison non spécifique des anticorps.
EVOS FL Auto 2 Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscope à fluorescence utilisé pour l'acquisition d'images.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Plateforme de traitement d'images utilisée pour les analyses morphologiques en aval et les plugins.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Médium de montage utilisé pour préserver la fluorescence et fixer les lamelles.
Isoflurane	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Anesthésique par inhalation utilisé pendant les procédures animales.
Lipopolysaccharide	Millipore Sigma	L2630	Utilisé pour induire une neuroinflammation systémique et une activation microgliale chez les rongeurs.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Bibliothèque de tracé Python utilisée pour la visualisation des données et la génération de figures.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	This work	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Plateforme logicielle open-source développée pour l'analyse de la morphologie microgliale.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Inserts utilisés pour maintenir les sections de tissus en suspension libre pendant les procédures de coloration.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Bibliothèque Python utilisée pour les calculs numériques au sein de MMPS.
Objective lens (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Objectif à faible grossissement utilisé pour l'orientation anatomique et l'identification des régions.
Objective lens (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Objectif à fort grossissement utilisé pour l'imagerie de la morphologie microgliale.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Bibliothèque de vision par ordinateur utilisée pour les fonctions de traitement d'image au sein de MMPS.
Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	169650025	Fixatif utilisé pour la perfusion et la préservation des tissus avant le découpage.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Médium de montage permanent utilisé pour la préservation des lames.
Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP3991	Solution tampon utilisée pour le lavage des tissus et la préparation des réactifs.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Bibliothèque d'imagerie Python utilisée pour les opérations de traitement d'image.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Cadre GUI Python utilisé pour générer l'interface utilisateur graphique de MMPS.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Environnement de langage de programmation utilisé pour développer et exécuter MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Logiciel statistique utilisé pour l'analyse des données et la génération de graphiques.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Bibliothèque d'analyse d'image Python utilisée pour le traitement d'image et la segmentation.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Package de calcul scientifique Python utilisé pour le filtrage et les opérations de traitement d'image.
Sprague-Dawley Rats	Evingo	002	Animaux expérimentaux utilisés pour la validation du modèle de neuroinflammation.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	Cryoprotecteur utilisé avant la congélation du tissu cérébral.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Package Python utilisé pour la lecture et l'écriture de fichiers d'images TIFF.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Médium d'incorporation utilisé pour la cryosection des échantillons de tissus congelés.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Détergent utilisé pour la perméabilisation membranaire pendant l'immunofluorescence.