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Article de méthode

Préparation de greffons de nerfs périphériques humains décellularisés à l'aide d'hydroxyde de sodium et de désoxycholate de sodium

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DOI :

10.3791/71578

⸱

1 septembre 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode normalisée de décellularisation assistée par alcalin qui combine un traitement à l'hydroxyde de sodium avec un système d'échange de solution entraîné par une pompe péristaltique, afin de produire des greffons de nerf périphérique humain décellularisés présentant une élimination cellulaire efficace et une préservation de l'architecture native de la matrice extracellulaire.

Résumé

Les lésions des nerfs périphériques nécessitent souvent des matériaux de greffe qui offrent un guidage structural pour la régénération axonale. Bien que la greffe nerveuse autologue reste la référence clinique, son utilisation est limitée par la morbidité du site donneur et la disponibilité restreinte du tissu. Ces limitations ont accru l'intérêt pour les greffes de nerfs périphériques humains décellularisés en tant que biomatériau alternatif pour la régénération nerveuse. Toutefois, les protocoles de décellularisation couramment utilisés, basés sur des détergents, peuvent perturber l'architecture de la matrice extracellulaire (ECM) et laisser des résidus cytotoxiques susceptibles de compromettre la qualité de la greffe. Dans cet article, un protocole standardisé est décrit pour la préparation de greffes de nerfs périphériques humains décellularisés, en utilisant une méthode de décellularisation assistée par alcalin. La procédure commence par un traitement à l'hydroxyde de sodium (NaOH) afin de favoriser une disruption cellulaire efficace, suivi d'une étape douce au dodécylsulfate de sodium (SDC) qui élimine les composants cellulaires et immunogènes résiduels tout en préservant l'organisation native de la matrice extracellulaire. Cette stratégie limite l'exposition aux détergents tout en favorisant la préservation de l'architecture native de la matrice extracellulaire. Le flux opératoire comprend la préparation du nerf donneur, un traitement contrôlé au NaOH, un traitement subséquent doux au SDC, et des lavages intensifs avec renouvellement continu de solution à l'aide d'un système entraîné par une pompe péristaltique, facilitant ainsi l'élimination des agents résiduels de transformation. Des étapes supplémentaires de post-traitement sont mises en œuvre pour maintenir l'intégrité structurelle et préparer les greffes pour l'emballage final et la stérilisation. L'efficacité de la décellularisation est évaluée par analyse histologique et quantification de l'ADN résiduel, tandis que la préservation de la structure de la matrice extracellulaire est examinée par microscopie électronique à balayage. L'absence de SDC résiduel et la biocompatibilité des greffes traitées ont été confirmées par des tests de cytotoxicité. Ce protocole fournit une méthode pratique pour produire des greffes de nerfs périphériques humains décellularisés destinées à la recherche sur la régénération nerveuse périphérique et à des applications translationnelles.

Introduction

Les lésions des nerfs périphériques peuvent entraîner une altération fonctionnelle sévère et restent un défi clinique majeur en médecine régénérative et en chirurgie reconstructive. La régénération de défauts nerveux segmentaires nécessite des matériaux de greffe qui non seulement franchissent l'intervalle lésé, mais offrent également un guidage structural et des signaux biochimiques favorisant la régénération axonale et la réinnervation. La greffe nerveuse autologue est largement considérée comme le standard clinique de référence, car elle préserve l'architecture native de la matrice extracellulaire (ECM) et fournit un microenvironnement propice à la régénération nerveuse1,2. Toutefois, son utilisation clinique est limitée par la disponibilité restreinte de tissu donneur, la nécessité de procédures chirurgicales supplémentaires et la morbidité au site donneur3,4. Ces limitations ont stimulé le développement de matériaux de greffe alternatifs, notamment des greffes de nerfs périphériques décellularisés qui conservent l'architecture native de la matrice extracellulaire tout en minimisant les composants cellulaires immunogènes5,6,7,8.

Les performances des greffons nerveux décellularisés dépendent fortement du processus de décellularisation. Les méthodes conventionnelles reposent généralement sur des réactifs à base de détergents, tels que le Triton X-100 et le dodécylsulfate de sodium (SDC), qui éliminent les composants cellulaires en solubilisant les membranes lipidiques9,10,11. Toutefois, une exposition prolongée à ces détergents peut perturber la microstructure de la matrice extracellulaire (MEC) et laisser des substances cytotoxiques résiduelles qui affectent négativement la viabilité cellulaire et les résultats régénératifs12,13. En conséquence, des stratégies alternatives de décellularisation permettant une élimination efficace des cellules tout en préservant l'intégrité de la MEC font actuellement l'objet de recherches intensives14. La décellularisation alcaline à l'hydroxyde de sodium (NaOH) s'est imposée comme une approche alternative potentielle, car des conditions de pH extrême peuvent dégrader efficacement les composants cellulaires, les acides nucléiques et les lipides15,16,17. Néanmoins, une exposition non contrôlée à des conditions fortement alcalines peut compromettre l'intégrité de la MEC, soulignant ainsi l'importance d'un contrôle précis des conditions de traitement16,18.

Ici, un protocole standardisé de décellularisation assistée par alcalin pour des greffons de nerfs périphériques humains est présenté, intégrant un système dynamique d'échange de solution entraîné par une pompe péristaltique. Comparé aux méthodes classiques d'immersion statique, ce procédé dynamique permet un renouvellement continu de la solution, facilitant l'élimination des débris cellulaires et des agents résiduels de traitement. Cet article fournit une démonstration visuelle étape par étape de l'ensemble du flux de travail, incluant la préparation du nerf du donneur, la décellularisation assistée par alcalin contrôlée et l'échange continu de solution à l'aide d'un système entraîné par pompe péristaltique. Les greffons obtenus ont été évalués par analyse histologique, quantification de l'ADN résiduel et microscopie électronique à balayage (SEM) afin de confirmer une décellularisation efficace et la préservation de l'ultrastructure de la matrice extracellulaire (ECM). En permettant une visualisation claire des étapes techniques critiques, cet article établit un cadre bien défini pour la préparation de greffons de nerfs décellularisés et pour l'optimisation future du procédé.

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Protocole

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

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Résultats

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

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Discussion

Cette étude présente un protocole standardisé de décellularisation assistée par alcalin pour la fabrication de greffons de nerf périphérique humain décellularisés destinés à la régénération du nerf périphérique. Le protocole intègre un traitement préalable du nerf donneur, une décellularisation chimique contrôlée et un système d'échange de solution entraîné par une pompe péristaltique au sein d'un flux de travail clairement défini, permettant ainsi une élimination efficace des composants cellulaires et immunogènes tout e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d'intérêts.

Remerciements

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BT100-1L Pompe péristaltique multicanalPompe plus longueBT100-1LUtilisée pour assurer une circulation continue et un renouvellement de solution pendant la délipidation, la décellularisation et les lavages.
Colonne de chromatographie Econo-Column, 2,5 × 10 cmBio-Rad737-2512Utilisée pour contenir des segments de nerf périphérique pendant le renouvellement continu de solution.
Alcool isopropylique (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Utilisé pour la délipidation du tissu nerveux périphérique.
Tube de pompe Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16Utilisé pour relier la pompe péristaltique, la colonne de chromatographie et les réservoirs de solution afin d’assurer une circulation continue de la solution.
Désoxycholate de sodium (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GUtilisé comme détergent lors de la deuxième étape de décellularisation pour éliminer les composants cellulaires résiduels.
Hydroxyde de sodium, NaOHDuksan1636Pour la rupture cellulaire.

Références

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

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