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Article de recherche

Identification de biomarqueurs candidats liés aux mitochondries du Ligustri Lucidi Fructus dans la néphropathie diabétique

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DOI :

10.3791/71592

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15 septembre 2026

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1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

Dans cet article

Résumé

La néphropathie diabétique (ND) implique un dysfonctionnement mitochondrial. À l'aide de la transcriptomique, de la pharmacologie par réseaux et de l'apprentissage automatique, nous avons identifié CAT, FABP1, MAOA et MAOB comme biomarqueurs mitochondriaux candidats pour la Ligustri Lucidi Fructus. Chez les souris db/db, le LLF a augmenté l'expression de CAT et MAOA, soutenant des investigations mécanistiques supplémentaires.

Résumé

Le dysfonctionnement mitochondrial et le stress oxydatif excessif au sein des mitochondries sont des facteurs pathologiques clés responsables des lésions tubulaires rénales dans la néphropathie diabétique (ND). Bien que Ligustri Lucidi Fructus (LLF) est traditionnellement utilisée pour traiter la néphropathie diabétique (DN), mais les mécanismes impliqués, en particulier ceux relatifs aux gènes et voies mitochondriales, restent mal compris. Cette étude a utilisé une analyse d'expression différentielle du jeu de données GSE142025 afin d'identifier les gènes différentiellement exprimés (DEG) associés à la DN. Les gènes caractéristiques ont été sélectionnés par recoupement des résultats provenant de quatre modèles d'apprentissage automatique. Les gènes présentant une expression différentielle significative et des profils d'expression cohérents dans les deux jeux de données ont été évalués ultérieurement par analyse de la courbe ROC (courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur). Ceux dont l'aire sous la courbe (AUC) > 0,7 dans les deux jeux de données ont été définis comme des biomarqueurs candidats. Des analyses d'enrichissement fonctionnel, d'infiltration immunitaire, de construction de réseaux et de docking moléculaire ont été réalisées. Un modèle murin de DN a été utilisé pour évaluer la glycémie, la microalbuminurie urinaire, l'histopathologie et l'expression par RT-qPCR des biomarqueurs candidats. CAT et MAOA étaient significativement surexprimés in vivoLes biomarqueurs candidats étaient enrichis dans des voies liées à la fonction des ribosomes, à la dégradation de la valine, de la leucine et de l'isoleucine, aux interactions cytokines-récepteurs de cytokines et aux peroxysomes. Ils étaient négativement corrélés aux cellules T CD8+ et aux mastocytes activés, et positivement corrélés aux cellules NK activées et aux lymphocytes B naïfs. La taxifoline, le bêta-sitostérol et l'ériodictyol présentaient des énergies de liaison inférieures à -5 kcal/mol avec les biomarqueurs candidats. CAT et MAOA constituent des candidats prometteurs qui justifient des investigations mécanistiques supplémentaires.

Introduction

La néphropathie diabétique (ND), la principale cause d'insuffisance rénale terminale dans le monde, est l'une des complications les plus fréquentes du diabète sucré. Sur le plan histopathologique, elle se caractérise par une accumulation excessive de matrice extracellulaire dans les compartiments glomérulaires et tubulaires, ainsi que par un épaississement et une sclérose des vaisseaux sanguins intrarénaux2. La ND est couramment associée à une protéinurie et à une hypertension artérielle3. Son développement est étroitement lié à des lésions des cellules endothéliales vasculaires, à une réponse inflammatoire exacerbée et à un stress oxydatif accru résultant d'une hyperglycémie prolongée4. L'incidence de la ND augmente dans le monde entier, en particulier chez les personnes diabétiques d'âge moyen et âgées. À mesure que la maladie progresse, elle peut entraîner une insuffisance rénale terminale et même des complications cardiovasculaires, altérant considérablement la qualité de vie et le pronostic des patients5. Malgré les progrès réalisés dans les approches diagnostiques et thérapeutiques de la ND, des biomarqueurs candidats précoces et précis pour le diagnostic restent à identifier, et des stratégies thérapeutiques efficaces permettant d'inverser les processus pathologiques font encore défaut. Par conséquent, il existe un besoin urgent de développer de nouveaux médicaments ciblés contre la ND.

Les mitochondries sont essentielles pour la bioénergétique cellulaire, la synthèse des précurseurs métaboliques, l'homéostasie du calcium, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), la signalisation immunitaire et l'apoptose, tous des processus indispensables au maintien de la stabilité cellulaire et de l'organisme6. En tant que centrales énergétiques de la cellule, les mitochondries jouent un rôle central dans des processus fondamentaux tels que la glycolyse, le cycle de l'acide tricarboxylique et la phosphorylation oxydative7. L'obésité perturbe le cycle de Krebs et la chaîne respiratoire mitochondriale, entraînant un dysfonctionnement mitochondrial et une augmentation de la production de ROS. Des niveaux élevés de ROS dans la chaîne respiratoire mitochondriale peuvent induire un stress oxydatif, ce qui aggrave la réponse inflammatoire associée à l'obésité et favorise l'apoptose8. Des recherches récentes ont mis en évidence le rôle important du dysfonctionnement mitochondrial dans la pathogenèse et la progression de la néphropathie diabétique (DN), notamment par des troubles du métabolisme énergétique, une production excessive de ROS et une activation accrue de la signalisation apoptotique9. Un dysfonctionnement mitochondrial chronique accélère la progression de la maladie rénale10. Ainsi, l'amélioration de la fonction mitochondriale pourrait représenter une stratégie protectrice cruciale contre la DN.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF) est un fruit séché et mûr appartenant à la famille des Luteaceae, réputé pour ses propriétés nutritives pour le foie et les reins, ainsi que pour sa capacité à assombrir les cheveux et améliorer la vision. Un hétéropolysaccharide naturel extrait du LLF a été identifié, révélant son potentiel à protéger les reins contre la fibrose11. Ces dernières années, l'utilisation du LLF dans le traitement de la néphropathie diabétique (DN) a suscité un intérêt croissant, avec des effets reno-protecteurs notables démontrés11,12,13. En outre, la relation complexe entre le LLF et les mitochondries a fait l'objet de recherches approfondies et a été validée. Notamment, une étude a montré que le LLF exerce ses effets bénéfiques en modulant la fonction mitochondriale par l'activation de la voie de signalisation AMPK14. Ce mécanisme protège efficacement les mitochondries des dommages causés par le stress oxydatif. Ces découvertes soulignent davantage le rôle essentiel du LLF dans le maintien du métabolisme énergétique cellulaire et dans l'amélioration de la résilience des cellules face au stress oxydatif. Toutefois, le mécanisme thérapeutique précis, notamment en ce qui concerne la récupération de la fonction mitochondriale, reste mal compris.

L'objectif de cette étude était d'élucider les mécanismes biologiques sous-jacents à l'effet thérapeutique de LLF sur la fonction mitochondriale dans le DN. Des bases de données publiques ont été explorées à l'aide d'outils de bio-informatique afin d'identifier des biomarqueurs candidats associés aux effets réno-protecteurs de LLF, en intégrant des données transcriptomiques et des informations sur les principes actifs. Des analyses supplémentaires, incluant l'infiltration immunitaire, l'association avec les caractéristiques cliniques, la modification de l'ARN par m6A, l'enrichissement fonctionnel, la construction de réseaux régulateurs et le dockage moléculaire, ont suggéré que ces biomarqueurs candidats jouent un rôle clé dans la régulation de la fonction mitochondriale au cours du traitement du DN. Une validation in vivo a de plus confirmé leur importance. Cette analyse complète approfondit notre compréhension des mécanismes par lesquels LLF traite le DN et fournit une base solide pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques fondées sur la dysfonction mitochondriale.

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Protocole

Collecte des données
La matrice d'expression génique et les données cliniques correspondantes pour les jeux de données GSE142025 et GSE96804, associés à la néphropathie diabétique (DN), ont été extraites de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)15. Le jeu d'apprentissage (GSE142025) comprenait des échantillons de tissu rénal provenant de 27 patients atteints de DN et de neuf témoins, séquencés à l'aide de la plateforme GPL20301. Le jeu de validation (GSE96804) comprenait des données de séquençage de 41 patients atteints de DN et de 20 témoins, traitées à l'aide de la plateforme GPL17586. Les deux jeux de données portent sur le tissu rénal ; le jeu de données GSE96804 examine spécifiquement le glomérule, unité principale de filtration du rein (Figure 1). Le jeu de données GSE142025 (jeu d'apprentissage) comprend des échantillons de tissu rénal entier et fournit un aperçu complet du paysage transcriptomique de la DN. Le jeu de données GSE96804 (jeu de validation), en revanche, se concentre spécifiquement sur le tissu glomérulaire, qui est le site principal des lésions de filtration glomérulaire. Étant donné que ces deux jeux de données n'ont pas été directement fusionnés en raison de différences de plateforme et de tissu, aucune correction des effets de lot n'a été appliquée. À la place, une validation croisée entre jeux de données a été effectuée indépendamment. Les gènes présentant des variations directionnelles cohérentes et une aire sous la courbe (AUC) supérieure à 0,7 dans les deux jeux de données ont été sélectionnés comme candidats robustes, soutenant ainsi leur généralisabilité à travers les différents compartiments rénaux.

Un total de 1 136 gènes liés aux mitochondries (MRG) a été extrait de la base de données MitoCarta3.0 (https://www.broadinstitute.org/mitocarta). Les principes actifs du LLF ont été prédits à l'aide de la base de données de pharmacologie systémique de la médecine traditionnelle chinoise (TCMSP) (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php), selon un seuil de biodisponibilité orale (OB) ≥30 % et un seuil de similitude aux médicaments (DL) ≥0,18. Par la suite, les gènes cibles potentiels des constituants actifs ont été prédits à l'aide de la base de données Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/).

Analyse de l'expression différentielle
L'analyse de l'expression différentielle de GSE142025 (DN par rapport au témoin) a été réalisée à l'aide du package limma (v3.54.1), avec des critères de significativité fixés à P.adj < 0,05 et |log2FoldChange| > 0,516. Les diagrammes en volcan et les cartes thermiques ont été visualisés à l'aide des packages ggplot2 (v 3.3.6) et ComplexHeatmap (v 2.14.0)17,18, respectivement. Les gènes à expression différentielle (DEGs), les gènes liés aux métaux (MRGs) et les gènes cibles potentiels des principes actifs ont été croisés, et les gènes communs ont été définis comme des gènes candidats. Le réseau reliant les principes actifs aux gènes candidats a été construit à l'aide du logiciel Cytoscape (v 3.9.0)19.

Analyse d'enrichissement fonctionnel et construction du réseau d'interactions protéine-protéine (PPI)
Des analyses d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) et de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) ont été réalisées sur les gènes candidats à l'aide du package clusterProfiler (v 4.6.2) afin d'explorer leurs fonctions biologiques et les voies de signalisation associées (P.adjust < 0,05). Les gènes candidats ont ensuite été saisis dans la base de données STRING (https://cn.string-db.org/) pour récupérer les interactions PPI (niveau de confiance ≥ 0,4), puis un réseau PPI a été construit à l'aide de Cytoscape (v 3.9.0)20.

Apprentissage automatique
Quatre algorithmes d'apprentissage automatique, notamment la forêt aléatoire (RF), les k-plus proches voisins (KNN), les moindres carrés partiels (PLS) et la machine à vecteurs de support avec un noyau radial (SVM), ont été mis en œuvre à l'aide du package caret (v6.0-93) en se basant sur le jeu de données GSE142025. Les gènes candidats identifiés dans l'analyse précédente ont été utilisés comme variables prédictives, et l'état de la maladie (DN ou témoin) a été utilisé comme critère de jugement. Pour le modèle KNN, une validation croisée à 10 plis a été mise en œuvre à l'aide de la fonction trainControl, avec tuneLength = 10. Le modèle RF a été ajusté avec 20 arbres (ntree = 20) ; les modèles PLS et SVM ont été ajustés en utilisant les paramètres définis dans le flux de travail caret d'origine.

Les distributions des résidus du modèle ont été évaluées à l'aide du package DALEX (v2.4.3). Une évaluation des variables basée sur la permutation a ensuite été réalisée à l'aide de la fonction variable_importance de DALEX, la racine de l'erreur quadratique moyenne (RMSE) étant spécifiée comme fonction de perte. Le dropout_loss résultant représente le RMSE obtenu après permutation de la variable correspondante21,22. Dans le flux analytique initial, les variables présentant un dropout loss < 0,281 dans tous les modèles ont été conservées, et les gènes communs aux quatre modèles ont été définis comme gènes caractéristiques de consensus pour la validation ultérieure.

Les quatre modèles d'apprentissage automatique ont été utilisés principalement pour la priorisation des caractéristiques plutôt que pour la construction d'un classificateur clinique final. En conséquence, la discrimination diagnostique a ensuite été évaluée au niveau du gène individuel à l'aide d'une analyse ROC sur les jeux de données de découverte et de validation.

Identification de biomarqueurs candidats
Dans les jeux de données GSE142025 et GSE96804, les différences d'expression des gènes caractéristiques entre les échantillons DN et les témoins ont été évaluées à l'aide du test de Wilcoxon. Seuls les gènes présentant une expression différentielle significative (P < 0,05) et des tendances d'expression concordantes dans les deux jeux de données ont été sélectionnés pour une analyse des courbes ROC (caractéristique de fonctionnement du récepteur). Le package pROC (v1.18.0) a été utilisé pour générer les courbes ROC et calculer l'aire sous la courbe (AUC), les gènes présentant une AUC > 0,7 dans les deux jeux de données étant classés comme biomarqueurs candidats23.

Analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA)
Les fonctions biologiques et les voies de signalisation associées aux biomarqueurs candidats ont été davantage explorées à l'aide de l'analyse d'enrichissement génique (GSEA) sur le jeu de données GSE142025. Premièrement, une analyse de corrélation de Spearman entre les biomarqueurs candidats et tous les autres gènes a été réalisée à l'aide du package psych (v2.2.9).24. Les coefficients de corrélation ont été calculés et classés par ordre décroissant. L'ensemble de gènes de référence utilisé était c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt, provenant de la base de données Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Une analyse GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) a ensuite été réalisée afin d'évaluer l'enrichissement des gènes classés dans l'ensemble de gènes de référence, à l'aide du package clusterProfiler (v4.6.2). Une correction pour tests multiples a été appliquée. via la méthode FDR et ajusté P-valeurs (désignées par) P.ajust.) ont été considérés comme significatifs si < 0.05.

Analyse des modifications m6A
Pour étudier les modifications de méthylation de l'ARN des biomarqueurs candidats, la base de données SRAMP (http://www.cuilab.cn/sramp/) a été utilisée afin de prédire les sites de modification m6A sur les biomarqueurs candidats, en se concentrant sur les positions à haute confiance au sein de leurs structures secondaires. La base de données ENCORI (https://starbase.sysu.edu.cn/) a ensuite été utilisée pour identifier les protéines modifiées par m6A interagissant avec les biomarqueurs candidats, en appliquant le paramètre |HepG2 (shRNA)| > 1 pour sélectionner les protéines clés. La base de données RPISeq (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) a ensuite été utilisée pour prédire la probabilité d'interactions entre les protéines clés et les biomarqueurs candidats. Les séquences d'ARN des deux ont été téléchargées en format texte brut afin de générer des scores de prédiction à partir des classificateurs RF et SVM. Une interaction était considérée comme significative lorsque le score dépassait 0,525. L'analyse SRAMP a été réalisée avec le seuil défini sur « Élevé » pour la prédiction des sites m6A, en mode « Transcrit » et avec les paramètres par défaut. L'analyse ENCORI a utilisé la fonction d'interaction « miRNA-mRNA » avec le paramètre « HepG2 (shRNA) » > 1. L'analyse RPISeq a utilisé le classificateur RF avec les paramètres par défaut ; des scores > 0,5 indiquaient une interaction positive. Il s'agit de prédictions informatiques, et non de preuves expérimentales de modifications m6A ou d'interactions ARN-protéine dans le tissu rénal. Le critère HepG2 shRNA provient des jeux de données précalculés d'ENCORI et pourrait ne pas refléter une régulation spécifique au rein.

Analyse de l'infiltration immunitaire
L'algorithme CIBERSORT a été appliqué pour estimer les proportions de 22 types de cellules immunitaires dans les échantillons témoins et DN issus de GSE142025, avec une visualisation sous forme de carte thermique générée à l'aide du package ggplot2 (v3.3.6).26. CIBERSORT a été exécuté en utilisant la matrice de signature LM22, avec 1 000 permutations et la normalisation par quantiles désactivée (comme recommandé pour les données de puces à ADN). Les échantillons dont la valeur p de CIBERSORT était inférieure à 0,05 ont été conservés pour les analyses ultérieures. < 0,05 ont été conservées pour une analyse ultérieure. Les estimations obtenues par CIBERSORT fournissent les fractions des cellules immunitaires à partir de l'expression tissulaire rénale globale, ce qui ne permet pas de distinguer une infiltration spécifique à un compartiment donné (par exemple, glomérulaire par rapport à tubulo-interstitielle) ni de différencier les leucocytes infiltrants des cellules immunitaires résidentes. Ainsi, les corrélations rapportées sont établies au niveau tissulaire et doivent être validées par des méthodes spatiales. Une analyse de corrélation de Spearman entre les cellules immunitaires différemment abondantes et les biomarqueurs candidats a été réalisée à l'aide du package psych.

Construction de réseaux et docking moléculaire
Les microARN (miARN) interagissant avec les biomarqueurs candidats ont été prédits à l'aide de la base de données miRNet (https://www.mirnet.ca). Par la suite, les ARN non codants longs (lncARN) ciblant les miARN identifiés ont été prédits à partir des bases de données TarBase (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) et starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/). Les lncARN communs aux deux bases de données ont été sélectionnés pour la construction du réseau. Un réseau régulateur lncARN-miARN-mARN a ensuite été établi à l'aide du logiciel Cytoscape. Des ingrédients actifs potentiels ciblant les biomarqueurs candidats ont été choisis afin de construire un réseau ingrédient actif-biomarqueur. De plus, les ingrédients actifs, les biomarqueurs candidats et les voies identifiées dans l'analyse d'enrichissement des ensembles de gènes (GSEA) ont été intégrés dans Cytoscape pour créer un réseau ingrédient actif-biomarqueur-voie métabolique.

Une analyse de docking moléculaire a été réalisée afin d'évaluer l'affinité de liaison entre les ingrédients actifs potentiels et les biomarqueurs candidats. Les structures 3D des protéines biomarqueurs ont été obtenues à partir de la base de données du Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb) au format de fichier PDB. Les structures 2D des ingrédients actifs potentiels ont été récupérées au format SDF à partir de la base de données PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Le docking moléculaire a été effectué à l'aide de la plateforme CB-Dock (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php). Une énergie de liaison inférieure à -5 kcal/mol indiquait une forte affinité de liaison27.

Préparation et authentification du Ligustri Lucidi Fructus
Ici, le Ligustri Lucidi Fructus (LLF) désigne le fruit séché et mûr de Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae). Le matériel botanique a été authentifié conformément à la Pharmacopée chinoise, et un spécimen-témoin n° 20240506,20240911,20241103 a été déposé à l'Université du Shanxi de médecine traditionnelle chinoise.

Pour la préparation de la décoction, 200 g de tranches de LLF sélectionnées ont été macérées dans 1 000 mL d'eau distillée pendant 30 min à température ambiante. Le mélange a été porté à ébullition puis maintenu à feu doux pendant 60 min. Le filtrat a été recueilli, et les résidus végétaux ont été soumis à une seconde décoction avec 1 000 mL d'eau distillée supplémentaire pendant 60 min. Les deux filtrats ont été combinés, filtrés, centrifugés, puis concentrés sous pression réduite afin d'obtenir une solution mère finale à 1 g de médicament brut/mL (volume total de 100 mL). La décoction préparée a été conservée à 4 °C pour une utilisation à court terme ou à −20 °C pour une conservation à long terme. La qualité du LLF et de sa décoction a été rigoureusement identifiée et vérifiée conformément aux normes de la Pharmacopée chinoise afin d'assurer la fiabilité et la reproductibilité des expériences.

Pour l'identification qualitative, une chromatographie sur couche mince a été réalisée. Brièvement, un volume approprié de décoction préparée a été centrifugé, et le surnageant a été extrait au méthanol. Après filtration, la solution échantillon et la solution standard de référence de specnuezhenide ont été déposées sur la même plaque de gel de silice G. Après élution, séchage et observation sous lumière ultraviolette, la tache de la solution échantillon présentait une couleur et une position identiques à celles du composé de référence, confirmant ainsi la présence du composant bioactif caractéristique du LLF.

Pour le contrôle qualité quantitatif, une détection par chromatographie liquide à haute performance a été réalisée. L'analyse a été effectuée à l'aide d'une colonne C18 utilisant un mélange méthanol-eau comme phase mobile. La longueur d'onde de détection a été fixée à 224 nm. La teneur en specnuezhenide dans la décoction a été déterminée à partir de la courbe standard. Les résultats ont démontré une composition chimique stable et homogène de la décoction préparée, garantissant une qualité constante du médicament tout au long de l'expérience d'intervention animale.

Expériences animales
Douze souris mâles db/db de qualité SPF (8 à 9 semaines d'âge) et six souris db/m témoins de même âge ont été maintenues dans l'installation animale SPF de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Shanxi. Avant les expériences, les animaux ont été acclimatés pendant 7 jours dans un cycle lumière/obscurité de 12 heures/12 heures avec à discrétion accès à la nourriture et à l'eau. L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Shanxi (n° d'approbation : 2022DW167). Les animaux présentant >Une perte de poids corporel de 20 %, un état moribond ou l'incapacité d'accéder à la nourriture ou à l'eau entraînait une euthanasie précoce avant la fin prévue de l'étude. À la fin de l'étude, tous les souris restants ont été euthanasiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique suivie d'une dislocation cervicale, conformément aux protocoles institutionnels.

Après la période d'acclimatation, l'établissement d'un modèle de DN chez les souris db/db a été confirmé par un taux de glucose sanguin au niveau de la veine caudale ≥ 16 mmol/L et une microalbuminurie, indiquée par un test urinaire positif à la bandelette pour la microalbumine. Une fois le modèle de DN correctement établi, les souris db/db ont été réparties aléatoirement en deux groupes (n = 6 par groupe) : le groupe modèle de DN (DN) et le groupe traité au LLF (Traitement). Par ailleurs, des souris db/m (n = 6) ont été utilisées comme groupe témoin (Témoin). La dose a été choisie en se basant sur des études pharmacodynamiques antérieures du LLF chez des rats diabétiques et a été convertie en dose équivalente pour l'homme à l'aide d'une normalisation par surface corporelle28. Les groupes Témoin et DN ont reçu de l'eau distillée, tandis que le groupe traité a reçu 3,5 g/kg de LLF pendant 8 semaines. Après 8 semaines de traitement, toutes les souris ont été sacrifiées afin de prélever du sérum, des urines et du tissu rénal pour des analyses ultérieures.

Indicateurs sanguins et urinaires
Les taux de glucose sérique ont été analysés à l'aide d'un analyseur de biochimie sanguine entièrement automatique. La concentration urinaire en microalbumine a été mesurée conformément aux instructions du kit (Fichier supplémentaire 1).

Observation pathologique des tissus rénaux de souris
Les tissus rénaux ont été préparés pour un examen histopathologique. Après fixation dans du paraformaldéhyde à 4 %, les tissus ont été lavés, déshydratés, inclus en paraffine et coupés en sections. Une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) a ensuite été réalisée, et les coupes colorées ont été examinées au microscope optique afin d'évaluer les modifications pathologiques.

PCR quantitatif en temps réel après transcription inverse (RT-qPCR)
Le RT-qPCR a été utilisé pour déterminer l'expression des biomarqueurs candidats dans le tissu rénal de souris. L'ARN total a été extrait conformément aux instructions du fabricant, puis la concentration et la qualité de l'ARN ont été évaluées (Tableau 1). La synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) a été réalisée à partir de l'ARN extrait à l'aide d'un kit de synthèse d'ADNc. L'amplification a été effectuée avec les paires d'amorces indiquées dans le Tableau 1, en utilisant GAPDH comme gène de référence. Les niveaux d'expression relatifs ont été calculés selon la méthode 2−ΔΔCt13,26.

Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel R (version 4.2.2) ainsi que des logiciels requis pour les procédures expérimentales correspondantes. Sauf indication contraire, tous les tests statistiques étaient bilatéraux, et les différences ont été considérées comme statistiquement significatives pour une valeur P < 0,05. L'analyse différentielle de l'expression transcriptomique a été réalisée à l'aide du package limma. Les gènes présentant une valeur P ajustée < 0,05 et une variation absolue du log2 supérieur à 0,5 ont été définis comme étant différentiellement exprimés.

Pour les comparaisons de l'expression des gènes candidats entre les échantillons DN indépendants et les échantillons témoins, des tests non paramétriques de Wilcoxon ont été utilisés là où cela était indiqué dans le protocole analytique initial. Les corrélations entre les biomarqueurs candidats et les fractions de cellules immunitaires ont été évaluées à l'aide du coefficient de corrélation de Spearman.

Les données expérimentales sont présentées comme moyenne ± écart-type (ET). Les comparaisons entre les trois groupes indépendants d'animaux ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance à un facteur lorsque les hypothèses d'une analyse paramétrique étaient satisfaites. Pour les comparaisons a posteriori, le test de la différence minimale significative a été utilisé lorsque les variances étaient homogènes, tandis que le test de Dunnett T3 a été utilisé lorsque les variances étaient inégales. Les mesures pharmacodynamiques de la ligne de base et de la semaine 8 ont été analysées et présentées séparément ; aucune inférence concernant une interaction groupe-par-temps n'a été faite. Les scripts R et les données brutes utilisés pour les analyses bioinformatiques et d'apprentissage automatique sont fournis dans le Fichier supplémentaire 1.

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Résultats

Afin d'étudier de manière systématique d'éventuels biomarqueurs mitochondriaux candidats associés au LLF dans le traitement de la DN, nous avons conçu un flux de travail analytique en quatre phases (Figure 1). Dans la phase I, nous avons intégré des données transcriptomiques provenant des jeux de données GSE142025 (ensemble d'apprentissage, rein entier, n=36) et GSE96804 (ensemble de validation, glomérule, n = 61) avec 1 136 gènes mitochondriaux provenant de la base de données MitoCarta 3.0 et 517 cibles...

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Discussion

Le LLF est un médicament traditionnel chinois couramment utilisé, principalement destiné à nourrir le foie et les reins, ainsi qu'à traiter le diabète et ses complications. À l'heure actuelle, aucun médicament ni traitement spécifique n'existe pour la néphropathie diabétique (DN), et sa prise en charge repose principalement sur des traitements hypoglycémiants, hypolipémiants et antihypertenseurs30,31,32. Toutefois, ces traitemen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude à toutes les personnes et organisations qui nous ont soutenus et aidés tout au long de cette recherche. Cette étude a été financée par le Fonds national des sciences naturelles de Chine (n° 81973486 et 82173974), les projets de recherche de l'Administration de la médecine traditionnelle chinoise de la province du Shanxi (n° 2024ZYYA021), le projet disciplinaire de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Shanxi (n° 2026XK24), ainsi que le projet de financement de la recherche scientifique de l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Shandong (n° KYZK2024Q13). Nous remercions Qinqing Li, professeur adjoint à l'Université de médecine traditionnelle chinoise du Shanxi, qui a authentifié le matériel botanique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution fixative de paraformaldéhyde à 4 %Saiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Éthanol absoluSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
GlucomètreSinocare Inc.GA-3
Kit de dosage de l'azote uréique sanguin (BUN)Institut d'ingénierie biochimique de Nanjing JianweiC03-2-1
Souris C57BLKS/J db/dbChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
Souris C57BLKS/J db/mChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
CentrifugeuseHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
Hydrate de chloralShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
Base de données pour la prédiction de la modification m6Ahttp://www.cuilab.cn/sramp/
Base de données des ingrédients actifs de la médecine traditionnelle chinoisehttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gene Expression Omnibus (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Kit de coloration à l'hématoxyline-éosine (HE)Servicebio C0105S
Centrifugeuse haute vitesseLabnet, USAC2500-R-230V
Outil d'analyse de l'infiltration immunitairehttps://cibersort.stanford.edu/
Ligustri Lucidi FructusSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Agitateur magnétiqueJintan Zhongtian Instrument Factory, JiangsuT8-1
MicroscopeOlympusBX53
MicrotomeLeica, GermanyRM 2016
Spectrophotomètre microvolumeHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-300
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
Paquet R pour l'interprétation de modèleshttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Plateforme de docking moléculairehttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
Kit ELISA de microalbuminurie murineFine TestEM0632
Bandelette de test de microalbuminurie murineGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
Kit ELISA de créatinine sérique murineAbmartAB5990A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
Cycleur thermique PCRRocheRoche LightCycler 480
Logiciel R (v4.2.2) + paquets Rhttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
Kit d'extraction d'ARNBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
Kit RT-qPCRBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
SalidrosideSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Kit de dosage de la créatinine sériqueInstitut d'ingénierie biochimique de Nanjing JianweiC011-2-1
Installation animale SPFUniversité de médecine traditionnelle chinoise du Shanxi
SRAMPhttp://www.cuilab.cn/sramp/
STRINGhttps://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
Tezhi PiganSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20210602
Bain flottant pour tissusWuhan JunjieJK-6

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