Cette étude introduit des stratégies chimiogénétiques et basées sur la lumière violette pour permettre un décalage de phase circadien fiable en journée.
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Article de méthode
Induire les décalages de phase circadiens diurnes à l’aide d’approches chimiogénétiques et spectrales
Dans cet article
Résumé
Résumé
Chez les mammifères, le décalage de phase circadien pendant la journée est limité par une réponse photique réduite du noyau suprachiasmatique (NSQ), ce qui limite la capacité à manipuler expérimentalement l’horloge circadienne durant cette phase. Des méthodes fiables pour induire des décalages de phase diurnes sont donc essentielles pour étudier les mécanismes de plasticité circadienne et d’entraînement photique. Des stratégies génétiques et spectrales complémentaires sont décrites pour permettre une manipulation robuste et temporellement précise de l’horloge circadienne pendant la journée. La première approche, actuellement limitée aux souris, utilise une stratégie chimiogénétique impliquant l’administration intravitréenne de récepteurs conçus exclusivement activés par des médicaments de conception (DREADDs) pour activer sélectivement les cellules ganglionnaires rétiniennes intrinsèquement photosensibles (ipRGC). Cette approche permet une activation contrôlée de la voie rétino-hypothalamique et induit des déphases diurnes reproductibles, indépendamment des conditions d’éclairage ambiant. La seconde approche utilise la stimulation optique spécifique à la longueur d’onde comme alternative non invasive. L’exposition à la lumière violette exploite la sensibilité spectrale des ipRGC pour réduire le blocage de dédépolarisation et favoriser une activation soutenue, permettant un réinitialisation de phase fiable pendant la journée subjective. Cette méthode est largement applicable à tous les systèmes mammifères et ne nécessite ni manipulation génétique ni intervention pharmacologique. Des protocoles détaillés sont fournis pour la préparation expérimentale, le timing de la stimulation, la validation des déphases via l’activité locomotrice, et l’évaluation de l’activation neuronale via l’immunohistochimie du c-Fos. Des considérations clés, notamment le timing circadien, les paramètres de stimulus et les contrôles expérimentaux, sont définies pour faciliter la reproductibilité. Ensemble, ces approches fournissent des outils polyvalents et expérimentalement manipulables pour induire les décalages de phase circadiennes diurnes et permettent une investigation directe des mécanismes sous-jacents à la réactivité circadienne diurne.
Introduction
Le noyau suprachiasmatique (NSQ), l’horloge circadienne principale du cerveau des mammifères, coordonne les rythmes quotidiens essentiels en physiologie et comportement, y compris les cycles sommeil-veille et les cycles d’alimentation. Pour maintenir l’alignement avec l’environnement externe, le NSQ reçoit une entrée photique directe de cellules ganglionnaires rétiniennes intrinsèquement photosensibles (ipRGC), qui transmettent l’information lumineuse rétinienne pour synchroniser les rythmes circadiens internes avec le joursolaire 1,2.
Une caractéristique déterminante des systèmes circadiens chez les organismes est la réactivité dépendant de la phase : le même stimulus délivré à différents moments circadiens peut produire des effets nettement différents. Chez les mammifères, la lumière nocturne induit de manière fiable des décalages de phase de l’horloge SCN, tandis que l’exposition durant la journée subjective produit peu ou pas de réinitialisation 3,4. Cette insensibilité apparente diurne a été observée de manière constante aussi bien in vivo qu’in vitro, où les tentatives d’imiter l’entrée photique échouent à provoquer des déphasements de phasesignificatifs 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .
L’insensibilité diurne a été attribuée, au moins en partie, à un manque de puissance rétinienne pour activer les mécanismes de réinitialisation de phase, ainsi que les mécanismes de verrouillage circadien au sein du SCN. Conformément à cette idée, les ipRGC ne répondent pas uniformément dans des conditions photopiques ; Un sous-ensemble entre dans le bloc de dépolarisation, limitant le potentiel d’action soutenue à17, 18, 19. Cette contrainte physiologique peut réduire l’efficacité de la stimulation photique conventionnelle durant la journée. Surmonter cette limitation permettrait d’interroger directement la plasticité des horloges de jour, une phase traditionnellement considérée comme réfractaire au réinitialisation photique.
Deux méthodologies complémentaires sont décrites pour permettre un déphasage robuste de l’horloge circadienne pendant la journée subjective. La première approche utilise une stratégie chimiogénétique pour activer sélectivement les ipRGC indépendamment des conditions d’éclairage ambiant. Plus précisément, les sourisOpn4 Cre/+ reçoivent des injections intravitréennes d’un virus adéno-associé (AAV) codant pour le récepteur excitateur Designer Exclusive Activated by Designer Drugs (DREADD), hM3Dq, de manière dépendante de Cre. L’administration de clozapine-N-oxyde (CNO) au temps circadien 4 (CT4) induit une activation rapide des ipRGC, assurant une activation soutenue de la voie rétino-hypothalamique19. Les décalages de phase sont quantifiés à l’aide d’enregistrements d’activité locomotrice, et l’activation moléculaire au sein du SCN est évaluée par l’immunohistochimie du c-Fos.
La seconde approche utilise la stimulation optique spécifique à la longueur d’onde comme stratégie non invasive pour une applicabilité plus large. Les souris sauvages sont exposées à la lumière violette (385 nm) au temps circadien 6 (CT6), au milieu de la journée subjective. La lumière violette produit un bloc de dépolarisation réduit et soutient une activation soutenue de l’ipRGC par rapport à la lumière bleueou blanche 19. Les déphases sont quantifiés comme décrit ci-dessus.
Les deux approches visent à améliorer la signalisation pilotée par l’ipRGC au SCN, surmontant ainsi la réactivité photique réduite caractéristique du jour subjectif. Ensemble, ces méthodologies fournissent des stratégies robustes et expérimentalement accessibles pour manipuler l’horloge circadienne durant une phase traditionnellement résistante au réinitialisation photique.
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Protocole
Toutes les procédures animales ont été approuvées et réalisées conformément aux directives du Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut national de la santé mentale (NIMH) (ASP-SLCR-01). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la douleur et diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les outils de recherche utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Stratégie chimiogénétique
- Injection intravitréale du virus adéno-associé chez des sourisOpn4 Cre/+
- Nettoyez et stérilisez la phase stéréotaxique ainsi que tous les instruments chirurgicaux en utilisant des procédures de stérilisation appropriées. Installez l’appareil d’injection et fixez une aiguille capillaire en verre.
- Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane. Réglez le débit d’oxygène à environ 1,5 L/min. Ajustez l’isoflurane à 3 % à 5 % pour l’induction et réduisez à 1 à 3 % pour l’entretien tout au long de la procédure.
- Vérifiez une anesthésie adéquate avec une pincée d’orteil. Considérez l’animal complètement anesthésié lorsqu’aucun retrait ou réflexe de sursaute n’est observé.
- Placez la souris sur une bouillotte pour maintenir la température corporelle tout au long de la procédure.
- Retirez des aiguilles capillaires en verre. Les aiguilles étaient marquées à ~1,5 mm de la pointe à l’aide d’un marqueur fin sous un stéréomicroscope pour garantir une délivrance de profondeur de pénétration constante.
- Appliquez doucement une pression sur la paupière inférieure avec une pince à pointe émoussée pour faire légèrement saillir le globe oculaire et exposer le limbus dorsal. En utilisant une approche dorsale, insérez l’aiguille de façon tangentielle à la surface de l’œil et pénétrez la sclère de 0,5 à 1 mm postérieure au limbus tout en évitant les régions vascularisées du limbus.
- Insérez l’aiguille dans la chambre vitrée à la profondeur prédéterminée. Retirez légèrement pour soulager la pression intraoculaire et éviter que la pointe de l’aiguille ne soit obstruée par le tissu.
- Injecter un volume total de 1,5 μL de solution AAV (à 2,4 x 1013 GC/ml), administrée sous forme de cinq injections séquentielles de 300 nL chacune (à un rythme de 50 nl/s). Faites une pause de 5 secondes entre les injections pour permettre la diffusion et minimiser le reflux. Après la dernière injection, attendez 30 secondes avant de retirer lentement l’aiguille. Répétez la même procédure dans l’œil controlatéral en utilisant les mêmes paramètres, en veillant à minimiser les traumatismes et le reflux.
- Administrer du kétoprofène (10 mg/kg, par voie sous-cutanée) immédiatement après l’opération.
- Laissez les souris récupérer pendant au moins 2 semaines afin d’assurer une expression virale adéquate avant de les transférer dans l’établissement comportemental.
- Activité de roulement de roues et administration du CNO (Figure 1A)
- Les souris d’intérieur individuellement dans des cages équipées de roues de course. Enregistrer l’activité de la roue à l’aide d’un système automatisé d’acquisition de données.
- Souris entraînées à un cycle clair-obscur de 12h12 pendant 4 à 7 jours. Confirmez l’entraînement stable puis faites passer les animaux à l’obscurité constante (DD).
- Déterminez le début de l’activité à l’aide d’un logiciel d’analyse. Définissez le début de l’activité comme le CT12 chez les rongeurs nocturnes. Calculez CT4 en conséquence.
- Au 8e jour en DD, les souris reçoivent des injections intrapéritonéales de CNO (1 mg/kg) ou de solution saline à CT4 sous une lumière rouge tamisée.
- Ramenez les animaux dans leurs cages et maintenez-les dans l’obscurité constante. Enregistrez l’activité locomotrice en continu pendant 8 jours.
- Déterminer les débuts d’activité et effectuer une analyse de régression lors des périodes pré- et post-injection. Calculer les déphases comme la différence entre le début de l’activité projeté et observé.
- Immunohistochimie du SCN c-Fos après activation chimiogénétique
- Souris entraînées à un cycle clair-obscur de 12h12 et relâchées dans une obscurité constante. Le deuxième jour en DD, administrez le CNO au CT6. Percer les animaux 30 minutes après l’injection.
Note : CT4 a été utilisé dans des expériences comportementales pour minimiser la possibilité que les effets du CNO s’étendent jusqu’à la nuit subjective, car le CNO peut rester actif pendant plusieurs heures. En revanche, CT6 a été utilisé pour des expériences d’immunocoloration afin d’évaluer les effets aigus de la CNO sur l’horloge circadienne, avec des animaux perfusés 30 minutes après l’injection. - Disséquer le cerveau et poser la fixation avec 4 % de paraformoldéhyde pendant la nuit à 4 °C. Cryoprotect à 30 % de saccharose jusqu’à ce que le tissu s’enfonce. Césarienne coronale à 40 μm.
- Incuber des sections dans une solution bloquante, suivie d’une incubation primaire par anticorps toute la nuit à 4 °C. Laver et incuber avec des anticorps secondaires pendant 1 heure. Contre-teinture avec du DAPI et fixe les sections.
- Acquérez des images en utilisant des réglages cohérents au microscope. Traiter les images à l’aide d’un logiciel d’analyse. Identifier les régions infectées par l’AAV par les cellules mCherry-positives.
- Souris entraînées à un cycle clair-obscur de 12h12 et relâchées dans une obscurité constante. Le deuxième jour en DD, administrez le CNO au CT6. Percer les animaux 30 minutes après l’injection.
2. Stratégie spectrale
- Transférer les souris sauvages dans l’établissement comportemental et les loger individuellement dans des cages équipées de roues de course, comme décrit ci-dessus. Maintenir les animaux dans l’obscurité constante (DD) pour surveiller l’activité circadienne en cours libre.
- Au jour 8 en DD, au temps circadien 6 (CT6), retirez la cage de l’armoire étanche et exposez la souris à une impulsion lumineuse de 15 minutes.
- Exposer les souris soit à une impulsion de lumière bleue (λmax = 470 nm ; 1,8 × 1014–2,2 × 1014 photons/cm 2/s) soit à une impulsion de lumière violette (λmax = 385 nm ; 1,45 × 1014–3,3 × 1014 photons/cm 2/s), avec une intensité mesurée au centre et dans les quatre coins de la cage au niveau des yeux des animaux.
- Pour les deux conditions de longueur d’onde, gardez les souris dans leurs cages domestiques sans le dessus de la cage. Placez les cages directement sous une source lumineuse fixe de sorte que le centre du faisceau lumineux soit aligné avec le centre de la cage afin d’assurer une illumination uniforme.
- Remet immédiatement les cages à leur position d’origine sous une obscurité constante après exposition à la lumière. Poursuivez l’enregistrement de l’activité de roulement des roues sans interruption pour l’analyse des décalages de phase.
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Résultats
Les sourisOpn4 Cre/+ exprimant AAV-DREADD ayant reçu du sérum physiologique à CT4 n’ont pas montré de décalage de phase significatif dans l’activité de roulement des roues (n = 5 ; Figure 1B). En revanche, l’administration du CNO à CT4 a entraîné un retard de phase significatif dans le début de l’activité (moyenne ± MEB : 5,03 ± 0,48 h ; n = 5 ; Figure 1C, D), démontrant que l’activation de DREADD à c...
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Discussion
Les résultats démontrent que l’activation des ipRGC pendant la journée subjective peut induire des décalages de phase circadiennes chez la souris, une période généralement caractérisée par une sensibilité réduite à la stimulation photique. Une approche chimiogénétique a permis l’activation sélective des ipRGC indépendamment de la lumière extérieure et a produit de robustes retards de phase dans le comportement de la roulée des roues. Cette activation a également induit une expression aig...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Vecteur viral dépendant de Cre codant pour DREADD excitateur (hM3Dq) fusionné à mCherry pour l'activation sélective des ipRGC |
| Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 2250S | Anticorps primaire utilisé pour détecter c-Fos comme marqueur d'activation neuronale |
| Anti-tdTomato antibody (goat) | LSBio | LS-C340696 | Anticorps primaire utilisé pour détecter l'expression du rapporteur mCherry/tdTomato |
| Blue LED driver | Thorlabs | LEDD1B | Alimentation pour contrôler l'intensité et la sortie du LED bleu |
| Blue LED light source | Thorlabs | M470L5 | Source LED émettant une lumière bleue (λmax ≈ 470 nm) pour la stimulation photique |
| ClockLab software | Actimetrics | Version 6.0.53 | Logiciel pour l'acquisition et l'analyse des données d'activité locomotrice circadienne |
| Clozapine-N-oxide (CNO) | Sigma-Aldrich | C0832-5MG | Ligand utilisé pour activer les récepteurs hM3Dq DREADD in vivo |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | Coloration nucléaire fluorescente pour le marquage des noyaux cellulaires |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21432 | Anticorps secondaire fluorescent pour la détection d'anticorps primaires de chèvre |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Anticorps secondaire fluorescent pour la détection d'anticorps primaires de lapin |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | Milieu de montage utilisé pour préserver la fluorescence dans les sections tissulaires |
| ImageJ (Fiji) software | NIH | Version 2.16.0/1.54g | Logiciel open-source pour le traitement d'images et l'analyse quantitative |
| Opn4cre Mice | The Jackson Laboratry | RRID:IMSR_JAX:035925 | Souris utilisées pour l'activation chémogenétique |
| Violet LED driver | Mightex | SLA-1000-2 | Alimentation pour contrôler la sortie du LED violet |
| Violet LED light source | Mightex | BLS-LCS-0385-04-22 | Source LED émettant une lumière violette (λmax ≈ 385 nm) pour la stimulation spécifique de la longueur d'onde |
| Wild-type mice | The Jackson Laboratry | Jackson strain #101043 | Souris utilisées pour l'expérience de lumière violette |
Références
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Réimpressions et autorisations
