Analyse par Western Blot de la protéine associée aux microtubules et à la chaîne légère 3 pour surveiller la dynamique autophagosomale dans des cellules de cancer du pancréas dérivées de souris

Résumé

L'immunotransfert avec LC3 est une méthode largement utilisée pour surveiller l'autophagie, mais nécessite une optimisation minutieuse. Ce protocole décrit une approche fiable pour la détection et la quantification de LC3-II dans des cellules cancéreuses pancréatiques dérivées de KPC, incluant des considérations techniques essentielles et un flux de travail standardisé pour l'analyse densitométrique à l'aide de Fiji.

Résumé

L'autophagie joue un rôle complexe dans l'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC), contribuant à la progression tumorale, à l'adaptation au stress et à la résistance aux traitements. Une évaluation précise de la dynamique des autophagosomes est donc essentielle pour les études en biologie du cancer. Parmi les méthodes disponibles, le dosage immunologique de la protéine légère de la microtubule (LC3) est largement utilisé pour surveiller la dynamique des autophagosomes, en distinguant les formes cytosoliques (LC3-I) et lipidées, associées aux autophagosomes (LC3-II). Toutefois, la faible masse moléculaire de LC3 et la différence minime de mobilité électrophorétique entre ces isoformes posent des défis techniques nécessitant une optimisation rigoureuse. Nous présentons ici un protocole reproductible d'analyse semi-quantitative des niveaux de LC3-II par immunotransfert (Western blot) dans des cellules cancéreuses pancréatiques murines dérivées de KPC. La méthode intègre des conditions optimisées de lyse cellulaire, d'électrophorèse, de transfert protéique et de détection par anticorps afin d'assurer une séparation et une détection fiables des isoformes de LC3. En outre, un flux de travail standardisé pour l'analyse densitométrique des bandes LC3-II à l'aide de Fiji (ImageJ) est fourni. La sensibilité de la méthode est démontrée par la détection de niveaux accrus de LC3-II dans des conditions d'induction de l'autophagie (traitement au gemcitabine) et de flux autophagique altéré (inhibition de VMP1). Les paramètres techniques critiques influant sur l'interprétation des données, notamment la composition du tampon de lyse et la spécificité des anticorps, sont également examinés, ainsi que les pièges expérimentaux courants. Bien que le dosage immunologique de LC3 ne suffise pas à définir complètement le flux autophagique, combiné à des essais complémentaires, il constitue une approche robuste et accessible pour surveiller l'activité autophagique. Ce protocole peut être adapté à d'autres contextes expérimentaux, facilitant ainsi les études mécanistiques de l'autophagie dans les modèles de cancer.

Introduction

La macroautophagie (désormais appelée autophagie) est une voie dégradative régulée par laquelle les cellules dégradent des éléments cytoplasmiques, notamment des protéines et des organites dysfonctionnels. Un critère caractéristique de l'autophagie est la formation d'une structure à double membrane appelée autophagosome, qui isole le matériel cellulaire puis le transporte vers les lysosomes pour sa dégradation^1,2,3. Dans les cellules normales, l'autophagie participe au renouvellement contrôlé des protéines et des organites, limitant ainsi le stress oxydatif et réduisant le ri....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le comité institutionnel de soins aux animaux et d'utilisation (IACUC) du Massachusetts General Hospital selon le protocole n°2019N000111. La lignée cellulaire de cancer du pancréas dérivée de KPC utilisée dans cette étude a été précédemment établie dans le laboratoire Mostoslavsky selon ce protocole approuvé. La liste des réactifs, produits chimiques et informations sur l'équipement est fournie dans le Tableau des matériaux.

1. Préparation des cellules

1. Ensemencez des ce....

Résultats

Ce protocole décrit le transfert Western permettant de suivre la dynamique de LC3 dans une lignée cellulaire de cancer pancréatique dérivée de KPC sous différentes conditions expérimentales. Le protocole permet d'obtenir des images chimiluminescentes de LC3 et d'un témoin de charge. Dans cette étude, l'actine a été utilisée comme témoin de charge.

Deux applications représentatives du protocole sont présentées. Premièrement, des cellules KPC témoins ont été comparées à des cellules KPC traitées.......

Discussion

Cet article décrit l'optimisation technique et la standardisation d'un protocole classique d'immunotransfert de LC3 dans des cellules de cancer du pancréas dérivées de KPC. Compte tenu du rôle de plus en plus reconnu de l'autophagie et des protéines liées à l'autophagie dans le développement et la progression du cancer du pancréas²³, ce protocole standardisé offre une méthode fiable pour surveiller la dynamique de LC3. Le protocole peut être appliqué pour évaluer le pool d'autophagosomes dans dive.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Scanner C-DiGit Blot	LI-COR BioScience	3600	Utilisé pour la détection chimiluminescente à l'étape 5.6
Solution saline tamponnée au phosphate 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Utilisée pour préparer du PBS 1x stérile afin de laver les cellules avant le repiquage à l'étape 1.1.
2-Mercaptoéthanol (β-mercaptoéthanol)	Sigma-Aldrich (Merck)	M3148	Utilisé pour préparer le tampon d'échantillonnage Laemmli 4× pour la préparation des échantillons SDS-PAGE à l'étape 3.8.
Agitateur 3D	DLAB	SK-D1807-E	Utilisé pour l'incubation des membranes dans les solutions de blocage, d'anticorps primaires et secondaires, ainsi que pendant les étapes de lavage (étapes 4.6, 4.8, 4.9, 4.11, 4.12 et 4.13).
Plaque de culture cellulaire 6 puits	SORFA	SCP-11-006	Utilisée pour ensemencer les cellules à l'étape 1.1.
Acrylamide	Sigma-Aldrich (Merck)	A8887	Utilisée pour préparer le gel SDS-PAGE 15 % requis aux étapes 4.2–4.5.
Anti-Glyceraldehyde-3-Phosphate Déshydrogénase, monoclonal souris, clone 6C5	Merck Millipore	MAB374	RRID:AB_2107445 Réactivité : humain, félin, porcin, souris, lapin, poisson, canin, rat. Utilisé comme contrôle de chargement pour évaluer l'efficacité de l'extinction (Figures 2C et 2D).
Anticorps secondaire anti-IgG de souris, conjugué à la peroxydase (HRP)	Cell Signaling Technology	7076	RRID: AB_330924. Utilisé pour préparer la solution d'anticorps secondaire à l'étape 4.10.
Anticorps secondaire anti-IgG de lapin, conjugué à la peroxydase (HRP)	Cell Signaling Technology	7074	RRID: AB_2099233. Utilisé pour préparer la solution d'anticorps secondaire à l'étape 4.10.
Anticorps anti-β-Actine (ACTB), monoclonal souris, AC-15	Sigma-Aldrich (Merck)	A1978	RRID:AB_476744 Réactivité : mouton, carpe, félin, poulet, rat, souris, Hirudo medicinalis, lapin, canin, porcin, humain, bovin, cobaye. Utilisé comme contrôle de chargement dans les Figures 2A, 2B, 2E, 2F, 2G et 2H.
Bleu de bromophénol	Sigma-Aldrich (Merck)	B0126	Utilisé pour préparer le tampon d'échantillonnage Laemmli 4× pour la préparation des échantillons SDS-PAGE à l'étape 3.8.
Acide Éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma-Aldrich (Merck)	E9884	Utilisé pour préparer le tampon de lyse à faible détergent (Figures 2G et 2H).
Sérum de veau fœtal	NATOCOR	Lintc-634	Utilisé pour préparer le milieu complet pour la culture cellulaire (étapes 1 et 2).
Fiji	Logiciel open-source	N/A	Logiciel d'analyse d'images
Glycérol	Sigma-Aldrich (Merck)	G5516	Utilisé pour préparer le tampon d'échantillonnage Laemmli 4× pour la préparation des échantillons SDS-PAGE à l'étape 3.8.
Glycine	Sigma-Aldrich (Merck)	G7126	Utilisée pour préparer le tampon de transfert à l'étape 4.5.
Mémoire Immun-Blot PVDF, rouleau, 0,2 µm, 26 cm x 3,3 m	Bio-Rad	1620177	Utilisée pour le transfert à l'étape 4.5.
Tampon de blocage Intercept (TBS)	LI-COR BioScience	927-60001	Utilisé pour le blocage à l'étape 4.6, et pour préparer les solutions d'anticorps primaires et secondaires aux étapes 4.7 et 4.10.
Anticorps monoclonal de lapin LC3 A/B (D3U4C)	Cell Signaling Technology	12741	RRID: AB_2617131 Réactivité : humain, souris, lapin. Utilisé pour préparer la solution d'anticorps primaire à l'étape 4.7.
Anticorps monoclonal de lapin LC3B (D11)	Cell Signaling Technology	3868S	RRID: AB_2137707 Réactivité : humain. Utilisé comme anticorps primaire LC3 dans la Figure 2H.
Méthanol	Anedra	6197	Utilisé pour activer la membrane PVDF et préparer le tampon de transfert à l'étape 4.5.
Unité de filtration par seringue Millex-HV, 0,45 μm PVDF	Merck Millipore	SLHV033RS	Utilisée pour filtrer le milieu contenant le lentivirus (étape 1.1).
Bain-marie sec numérique mini	Labnet International, Inc.	D 5060075	Utilisé pour chauffer les échantillons à l'étape 4.1.
Système d'électrophorèse Mini-PROTEAN Tetra	Bio-Rad	1658025FC	Utilisé pour la SDS-PAGE et le transfert aux étapes 4.2, 4.3 et 4.5.
MISSION shRNA ciblant la souris Vmp1 (TRCN0000279038)	Sigma-Aldrich (Merck)	SHCLND-NM_029478	Utilisé pour générer des lignées cellulaires stables avec extinction de VMP1 (étape 1.1).
N,N'-Méthylènebisacrylamide (Bis-acrylamide)	Sigma-Aldrich (Merck)	M7279	Utilisée pour préparer le gel SDS-PAGE 15 % requis aux étapes 4.2–4.5.
Nabigem 1g Gemcitabine	Microsules Argentina	M3060584-3	Utilisé pour le traitement au gemcitabine à l'étape 2.
Solution de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep)	Sartorius	03-031-1B	Utilisée pour préparer le milieu complet pour la culture cellulaire (étapes 1 et 2).
Kit d'analyse protéique Pierce BCA	Thermo Fisher Scientific	23227	Utilisé pour la quantification des protéines (étape 3.7).
Comprimés inhibiteurs de protéase Pierce	Thermo Fisher Scientific	A32953	Utilisés pour préparer le tampon de lyse à l'étape 3.2.
Polyéthylènimine HCl MAX, linéaire (PEI MAX), PM 40 000	Polysciences	24765-1	Utilisé pour la transfection avec des plasmides lentiviraux (étape 1.1).
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich (Merck)	P9333	Utilisé pour préparer le PBS à l'étape 3.1.
Phosphate monobasique de potassium (KH2PO4)	Sigma-Aldrich (Merck)	P5655	Utilisé pour préparer le PBS à l'étape 3.1.
Alimentation électrique PowerPac Basic	Bio-Rad	1645050	Utilisée pour la SDS-PAGE et le transfert aux étapes 4.2, 4.3 et 4.5.
Marqueur protéique pré-étalonné	Genbiotech	PM201	Utilisé pour la SDS-PAGE aux étapes 4.2 - 4.4.
Puromycine (solution à 10 mg/mL)	InvivoGen	ant-pr-1	Utilisée pour la sélection des cellules transduites de manière stable (étape 1.1).
RPMI 1640	Genbiotech	MC2012L	Utilisé pour préparer le milieu complet pour la culture cellulaire (étapes 1 et 2).
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich (Merck)	S9888	Utilisé pour préparer le PBS à l'étape 3.1, les tampons de lyse à l'étape 3.2, et le TBS à l'étape 4.9.
Sulfate de dodécylsodium (SDS)	Sigma-Aldrich (Merck)	L3771	Utilisé pour préparer le tampon de lyse à l'étape 3.2 et le gel SDS-PAGE 15 % requis aux étapes 4.2–4.5.
Fluorure de sodium (NaF)	Sigma-Aldrich (Merck)	S7920	Utilisé pour préparer le tampon de lyse à faible détergent (Figures 2G et 2H).
Phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich (Merck)	S9763	Utilisé pour préparer le PBS à l'étape 3.1.
Centrifugeuse Sorval ST 16R	Thermo Fisher Scientific	75004380	Utilisée pour centrifuger les cellules à l'étape 1.1 et les lysats à l'étape 3.5.
Substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico PLUS	Thermo Fisher Scientific	34577	Utilisé pour la détection chimiluminescente à l'étape 5.1.
Cabinet de sécurité de classe II, type A2, série 1300 A2 Thermo Scientific	Thermo Fisher Scientific	1386	Utilisé pour la manipulation stérile des cultures cellulaires aux étapes 1.1, 1.3 et 2.1.
Incubateur CO2 Thermo Scientific BB 150	Thermo Fisher Scientific	BB150-2TCS-L	Utilisé pour la culture cellulaire aux étapes 1.2 et 2.2.
Anticorps monoclonal de lapin TMEM49/VMP1 (D1Y3E)	Cell Signaling Technology	12929	RRID: AB_2714018 Réactivité : humain, souris, rat. Utilisé comme anticorps primaire pour vérifier l'efficacité d'extinction de VMP1 dans les Figures 2C et 2D.
Tris base	Sigma-Aldrich (Merck)	T1503	Utilisé pour préparer le tampon de transfert à l'étape 4.5.
Chlorhydrate de Tris (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich (Merck)	T3253	Utilisé pour préparer les tampons de lyse à l'étape 3.2, le tampon d'échantillonnage Laemmli 4× à l'étape 3.8, le gel SDS-PAGE 15 % requis aux étapes 4.2–4.5, et le TBS à l'étape 4.9.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (Merck)	T8787	Utilisé pour préparer les tampons de lyse à l'étape 3.2.
Trypsine EDTA	Gibco	11570626	Utilisée pour le repiquage des cellules à l'étape 1.1.