Génération trans-mitochondriale de cybrides à partir de plaquettes de patients en ADNmt : un protocole efficace optimisant la sélection des colonies et la validation fonctionnelle

Résumé

Nous décrivons un protocole optimisé de génération de cybrides transmitochondriaux à partir de plaquettes de patients atteints d’ADNmt, en mettant l’accent sur les paramètres de croissance et l’isolement des colonies. Cette approche permet d’étudier des variantes de l’ADN mitochondrial à des niveaux variables d’hétéroplasmie dans un fond nucléaire commun afin de quantifier leur importance fonctionnelle sur la chaîne de transport électronique, les activités enzymatiques et la capacité respiratoire intégrée.

Résumé

La génération de lignées cellulaires cybrides trans-mitochondriales représente la méthode de référence pour déterminer la pathogenicité en permettant des analyses biochimiques d’une variante spécifique de l’ADN mitochondrial (ADNmt) d’intérêt à des pourcentages élevés et faibles (niveaux d’hétéroplasmie) au sein d’un fond d’ADNmt et de génome nucléaire par ailleurs identiques. Historiquement, le processus de génération des cybrides a été fastidieux et peu efficace. Ici, nous décrivons un protocole très efficace et performant pour générer des lignées cellulaires cybrides transmitochondriales en fusionnant des plaquettes humaines avec une lignée cellulaire standard d’ostéosarcome 143B afin de fournir un fond nucléaire isogène appauvri en cellules mtDNA (Rho⁰ ). Les isolats cellulaires capturent un génome d’ADNmt donné d’intérêt pour établir des lignées cellulaires stables abritant différents degrés d’hétéroplasme, ou pour comparer les effets divergents d’haplogroupes mitochondriaux distincts. Comme les cybrides de patients mitochondriaux peuvent être plus difficiles à établir avec des protocoles standards, cette méthodologie actuelle se concentre sur l’isolement des variants de l’ADNmt où l’activité de la chaîne de transport électronique est affectée. Nous démontrons ici que les techniques de sélection de colonie réduisent le temps et améliorent le rendement de la génération de lignées cybrides mutantes à l’hétéroplasmie de haut niveau. Une étude de cas est fournie de la génération de cybrides pour une variante d’importance inconnue chez MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K). Nous analysons l’efficacité du processus de génération des cybrides en utilisant ce protocole et réalisons des études fonctionnelles réalisées par respirométrie haute résolution. Les mutants cybrides hétéroplasmiques de haut niveau MT-ND1 m.3985G>A générés par ce protocole présentent une respiration mitochondriale complexe dépendante de l’I-dépendante altérée par rapport au contrôle de type sauvage, démontrant que le m.3985G>A est probablement pathogène.

Introduction

L’établissement de la pathogénicité des mutations de l’ADN mitochondrial (ADNmt) est difficile en raison de leur rareté, de leur hétéroplasmie impliquant des niveaux variables de génomes d’ADNmt mutés et de type sauvage dans différents tissus, de divers mécanismes physiopathologiques et d’interactions complexes avec les fondements du génome^nucléaire 1,2,3,4 . Pour ces raisons, les lignées cellulaires cybrides transmitochondriales restent la méthode de référence pour établir la pathogénicité des variants de l’ADNmt, où les « cybrides » représentent la fusion du noyau d’une cellule avec les mitochondries^{d’une autre cellule} 5,6,7,8,9,10 (Figure 1). Les lignées cellulaires cybrides contiennent un fond nucléaire isogène et des mitochondries avec un pourcentage spécifié d’hétéroplasmie pour le variant de l’ADNmt^{étudié 11,12}. Ainsi, des tests fonctionnels tels que la respirométrie (par polarographie) ou les tests d’activité enzymatique de transport électronique (par spectrophotométrie) peuvent être réalisés dans des lignées cybrides variant entre 0 % et 100 % d’hétéroplasmie afin de déterminer les effets pathogènes potentiels d’une variante d’ADNmt donné, ainsi que l’influence relative des haplogroupes mitochondriaux pouvant différer entre les lignées^{cybrides 1}. D’autres types cellulaires peuvent être utilisés pour étudier la pathogénicité et sont mieux utilisés pour compléter la génération de cybrides et l’analyse fonctionnelle, car chaque type cellulaire présente ses propres avantages et inconvénients. Les fibroblastes du patient proviennent directement du patient mais sont limités dans l’hétéroplasmie héréditaire et manquent d’un contrôle nucléaire isogénique permettant d’éliminer les effets des gènes nucléaires. L’édition mtDNA devient de plus en plus populaire mais souffre d’un montage hors cible et de sites modifiables limités dans l’ADN^{mt 13}. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) peuvent être différenciées pour étudier l’effet d’une mutation sur différents types cellulaires, tels que les neurones et les cellules ganglionnaires rétiniennes, mais l’induction de pluripotence peut entraîner la perte du variant d’ADNmt d’intérêt ou entraîner des variants de novo ^{supplémentaires 14}. L’étude Cybride consiste à créer un système plus artificiel basé sur un fond nucléaire de lignée cellulaire cancéreuse (classiquement 143B ostéosarcome), mais qui se développe classiquement bien, ce qui le rend accessible à des études de dépistage à haut débit d’interventions candidates. Les limites à la génération de cybrides à haut niveau d’hétéroplasmie incluent la qualité des plaquettes, l’hétéroplasmie initiale et les désavantages sélectifs des mitochondries mutantes, qui sont longuement discutés dans ce protocole.

Bien que la génération de cybrides soit la référence pour la détermination fonctionnelle de la pathogenicité des variants de l’ADNmt, peu de laboratoires génèrent des cybrides pour l’étude des maladies mitochondriales 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Au contraire, davantage de cybrides sont générés pour étudier le cancer et le^{vieillissement 28,29}. Ici, nous utilisons une étude de cas sur un patient suspecté de maladie mitochondriale pour démontrer des stratégies d’optimisation développées afin de faciliter la génération de cybrides à partir de plaquettes de patients en ADNmt, incluant les processus de sélection et les préparations cellulaires nécessaires pour établir des lignées cellulaires cybrides avec des niveaux d’hétéroplasmie élevés versus faibles pour le variant cible de l’ADNmt. Plus précisément, nous démontrons la méthodologie pour générer des lignées cellulaires cybrides pour un variant MT-ND1 de la sous-unité complexe I (CI) m.3985G>A, dans laquelle nous réalisons des études biochimiques démontrant la nature pathogène de ce variant. La figure 2 illustre la chronologie de la génération des cybridés, où les principales étapes méthodologiques incluent la fusion, la sélection et l’isolation pour obtenir des colonies distinctes.

Protocole

Les plaquettes sanguines ont été obtenues selon l’étude IRB 08-6177 du Children’s Hospital of Philadelphia (CHOP).

1. Préparation des plaquettes

1. Jour 1 : Prélève le sang dans des tubes acide-citrate-dextrose lors de la prélève.
   REMARQUE : Le sang doit être appliqué immédiatement sur le rotateur. Les plaquettes sont idéalement prélevées au maximum 4 heures après la prise de sang.
2. Notez le volume du sang. Un volume de 5 à 6 mL de sang est recommandé.
3. Centrifugez le sang à 200 × g pendant 20 minutes à 12 °C.
   REMARQUE : La centrifugation à 12 °C préserve l’intégrité de l’échantillon et empêche l’activation des plaquettes.
4. Transférez le surnageant (plasma) dans un nouveau tube centrifugeuse.
5. Notez le volume du plasma.
6. Centrifugez le plasma à 1500 × g pendant 20 minutes à 12 °C.
7. Notez le volume estimé de granulés de plaquettes.
   REMARQUE : Trop de plaquettes peuvent être fastidieuses dans ce protocole. Après fusion, lors du plaquage des cellules Rho⁰ et des plaquettes, un excès de plaquettes peut s’accumuler au fond de la fiole et empêcher l’adhésion des cellules Rho⁰ . Il est recommandé d’utiliser moins de 50 μL du volume de plaquettes pour la fusion. Les plaquettes en excès peuvent être congelées en les séparant aux étapes suivantes.
8. Retirez le surnageant.
   REMARQUE : Si le pellet est volumineux, son retrait peut être effectué par aspiration. Les plaquettes des patients sont parfois fortement réduites en nombre et ne sont pas très collantes. Si c’est le cas, utilisez une pipette pour retirer lentement le plasma.
9. Si vous continuez avec des plaquettes fraîches, resuspendez la pellete dans 1 mL de modification spinner du milieu Minimum essentiel d’Eagle (SMEM), puis transférez dans un tube microcentrifuge.
10. En cas de congélation, remettez le pellet (plaquettes) dans 1,05 mL de SMEM et 450 μL de solution de congélation plaquetaire (350 μL de sérum bovin fœtal [FBS] + 100 μL de diméthylsulfoxyde [DMSO]).
    REMARQUE : Certaines plaquettes de patients ne sont pas stables pendant la procédure de congélation, et un cybride mutant élevé ne peut pas être obtenu après la congélation. Il est recommandé d’utiliser la préparation fraîche.
11. Si les cellules Rho⁰ ne sont pas prêtes à temps, placez les plaquettes à 37 °C avec un léger secouement à 60 tr/min.
    REMARQUE : En fin de compte, il est préférable de synchroniser les plaquettes et les cellules Rho⁰ pour qu’elles soient prêtes en même temps. Il n’est pas conseillé d’attendre plus de 2 heures.

2. Préparation des cellules Rho ⁰

1. Utilisez^{soit des cellules} Rho 0 de l’ostéosarcome 143B fraîchement décongelées, soit des cellules Rho⁰ qui croissaient presque à la confluence.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des cellules Rho⁰ qui croissaient dans l’incubateur jusqu’à presque la confluence. Des cellules Rho⁰ fraîchement décongelées peuvent être utilisées, et il est recommandé d’utiliser un flacon congelé de cellules Rho⁰ avec une densité cellulaire élevée. Laissez les cellules s’attacher pendant deux heures ou plus avant la fusion.
2. Lavez la fiole T75 avec 5 mL de PBS.
3. Ajoutez 1 mL de Trypsine-EDTA 0,25 % pour couvrir les cellules Rho⁰ .
4. Incubez pendant 5 minutes à 37 °C.
5. Après avoir fait osciller la fiole, lavez le fond de la fiole avec 5 mL de SMEM.
6. Collectez les cellules Rho⁰ dans un tube conique de 15 mL.
7. Centrifugeuse à 200 × g pendant 5 minutes pour concentrer afin de mesurer le nombre cellulaire.
8. Retirez le surnageant et remettez 1 mL de SMEM.
9. Compte les cellules.
   REMARQUE : Idéalement, il devrait y avoir 1,5 million de cellules pour chaque fusion ; cependant, des fusions réussies ont été réalisées avec seulement 30 000 cellules.
10. Aliquote 1,5 million de cellules dans 1,5 tube microcentrifuge et porte le volume à 1 mL.
    REMARQUE : Assurez-vous d’avoir un tube supplémentaire en « simulation de fusion ». Ce tube ne contiendra que des cellules Rho⁰ et servira à guider le processus de sélection.
11. Centrifugez les plaquettes à 1700 × g pendant 15 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : Les cellules Rho⁰ sont sensibles au froid.
12. Retirez le surnageant des plaquettes.
13. Ajoutez 1 mL de cellules Rho⁰ par-dessus la granule de plaquettes.
14. Centrifugez les cellules Rho⁰ et les plaquettes à 200 × g pendant 5 minutes à température ambiante.

3. Fusion

1. Retirez le surnageant des cellules Rho⁰ et du pellet de plaquettes.
2. Ajoutez 150 μL de tampon de fusion (50 % de polyéthylène glycol [PEG]/10 % DMSO) et triturez pendant 90 secondes pour la resuspension.
   REMARQUE : Certains granulés sont assez collants et doivent être remués et brisés manuellement, en plus de la pipetage vers le haut et le bas. Notez si la pastille était collante.
3. Ajoutez 12 mL de milieu Cybrid (DMEM) + 10 % de FBS + 50 μg/mL d’uridine dans un flasque T75.
4. Ajoutez 1 mL de plaquettes fusionnées et les cellules Rho⁰ dans la fiole.
5. Les cellules sont incubées à 37 °C avec 5 % de_CO2 en haute humidité.
   REMARQUE : Toutes les étapes de croissance cellulaire se font dans ces conditions.

4. Croissance

1. Jour 2 : Retirez le substrat Cybrid et ajoutez 12 mL frais de substrat Cybrid + 10 % FBS + 50 μg/mL d’uridine.
   REMARQUE : Les cellules Rho⁰ mettent environ une semaine à incorporer l’ADNmt.
2. Jour 5 : Retirez le substrat Cybrid et ajoutez 12 mL frais de substrat Cybrid + 10 % FBS + 50 μg/mL d’uridine.
   REMARQUE : Si les cellules Rho⁰ sont à 80 % de confluence, séparez les cellules en deux flasques.

5. Sélection

1. Jour 8 : Retirez le substrat et lavez les cellules avec 5 mL de PBS.
2. Retirez le PBS et ajoutez 1 mL de trypsine.
3. Couvrez le fond de la fiole de trypsine et incubez pendant 5 minutes à 37 °C.
4. Ajoutez 5 mL de milieu cybride + 10 % de FBS + 50 μg/mL d’uridine.
5. Compte les cellules.
   REMARQUE : La sélection doit commencer à 10 % de confluence, soit 125 000 cellules dans une boîte de Pétri traitée en culture T75. Il est recommandé d’utiliser des boîtes de Petri si la méthode de cueillette en colonie est préférée. Utilisez un T75 si vous utilisez la méthode de dilution.
6. Ajoutez 125 000 cellules dans le contenant approprié et ajoutez le reste du volume jusqu’à 12 mL avec un média de sélection (DMEM).
   REMARQUE : Les milieux de sélection sont conçus pour séparer les cellules 143B fusionnées avec les mitochondries des cellules Rho⁰ . Les cellules Rho⁰ nécessitent du pyruvate et de l’uridine pour survivre. Le FBS dialysé ne contient ni pyruvate ni uridine et doit être utilisé uniquement pour la sélection. Utilisez deux supports de sélection différents si possible. L’un devrait être à 10 % de dialyse de la Neige de Neige, et l’autre de moins restriction à la croissance, comme 20 % de Parasite de Bleu dialysé + 50 μg/mL d’uridine. Un milieu de sélection moins restrictif est suggéré en parallèle pour les mutants sévères.
7. Congèler les cellules restantes dans deux cryovials avec 1 mL de solution congelante chacun.
   REMARQUE : Ce sont des cellules de présélection, et différentes sélections peuvent être testées plus tard.
8. Changez de média un jour sur deux pendant environ une semaine.
   REMARQUE : Les cellules Rho⁰ flotteront lorsqu’elles meurent et seront emportées après le changement du milieu. Utilisez les cellules de fusion « fictives » pour déterminer quand la sélection est terminée (plus de cellules dans la fiole). Cette fiole sera complètement vide car toutes les cellules Rho⁰ auront été emportées. Il est judicieux d’attendre un jour de plus, même lorsque la fiole fictive est vide, car les cellules fusionnées peuvent fournir les nutriments du milieu pour aider d’autres cellules Rho⁰ à persister dans la fiole. Si les cellules atteignent une confluence supérieure à 20 %, se diviser et se replacer. Plus de croissance masquera la sélection.

6. Méthode de sélection de la colonie

1. Faites croître les colonies jusqu’à ce qu’elles soient visibles à l’œil nu, avec un milieu cybride + 20 % FBS + 50 μg/mL d’uridine.
   REMARQUE : Inclinez la plaque et tenez-la vers la lumière. Les colonies apparaissent sous forme de cercles nuageux. Au microscope, il ne devrait pas y avoir beaucoup de cellules de fond entre les colonies.
2. Encerclez les colonies indépendantes et non chevauchantes avec un marqueur au bas de la fiole tout en les tenant vers la lumière.
3. Utilisez un P20 pour gratter (perturber mécaniquement les cellules fixées au fond du flasque) et aspirer 20 μL simultanément dans le cercle tracé afin de placer les cellules de la colonie sélectionnée dans la pointe du P20.
   REMARQUE : Le grattage manuel détache les cellules et en tirant 20 μL vers le haut, il faut recueillir les cellules de la pointe de la pipette.
4. Placez chaque colonie dans son propre puits dans une plaque à 96 puits.
   REMARQUE : L’avantage de cette méthode est que les cellules 143B ont tendance à bien croître ensemble, donc on ne devrait pas avoir de problème de croissance et obtenir des résultats plus rapides. L’inconvénient est que la population pourrait être mixte.

7. Méthode de croissance par dilution

1. Lorsque les cellules atteignent 75 % de confluence dans le milieu cybride + 20 % de FBS + 50 μg/mL d’uridine, lavez les cellules avec 5 mL de PBS.
2. Retirez le PBS et ajoutez 1 mL de trypsine.
3. Couvrez le fond de la fiole de trypsine et incubez pendant 5 minutes à 37 °C.
4. Ajoutez 5 mL de milieu Cybride + 20 % de FBS + 50 μg/mL d’uridine.
5. Compte les cellules.
6. Ajoutez 1 × 10^{cellules de 5} cellules dans 20 mL de milieu cybride + 20 % FBS + 50 μg/mL d’uridine à 50 mL de tube conique 1.
   REMARQUE : Il s’agit de 5000 cellules/mL, ce qui correspond à 500 cellules en 100 μL lorsqu’elles sont placées dans une plaque à 96 puits.
7. Préparez un tube conique de 50 mL avec une dilution de 100 fois (200 μL du tube 1 dans 20 mL de milieu Cybrid + 20 % FBS + 50 μg/mL d’uridine).
   REMARQUE : Cela représente environ 5 cellules par puits.
8. Préparez un tube conique 3 de 50 mL avec une dilution 1:1 (10 mL du tube 2 dans 10 mL de milieu Cybride + 20 % FBS + 50 μg/mL d’uridine).
   REMARQUE : Cela représente environ 2,5 cellules par puits.
9. Préparez un tube conique 4 de 50 mL avec une dilution 1:1 (10 mL du tube 3 dans 10 mL de milieu cybride + 20 % FBS + 50 μg/mL d’uridine).
   REMARQUE : Cela représente environ 1 cellule par puits.
10. Les tubes de plaques 2, 3 et 4 dans des plaques à 96 puits de 100 μL chacune.
    REMARQUE : Assurez-vous de mélanger les cellules avant de plaquer. Il est difficile de vérifier le jour même s’il y a une cellule dans chaque puits car les cellules doivent couler au fond et se fixer. L’avantage de cette méthode est qu’une seule cellule se développe en colonie, assurant l’absence d’un fond mixte. L’inconvénient est que les mutants sévères peuvent ne pas survivre s’ils sont isolés.
11. Le lendemain, barrez les puits qui ont clairement plus d’une cellule par puits.
12. Après quelques jours, vérifiez à nouveau les puits.
    REMARQUE : Il devrait y avoir des colonies, et c’est plus évident s’il y a des cellules uniques près des bords des puits. S’il y a plus d’une colonie, enlevez ces puits. S’il n’y a pas de cellule, retirez le puits.

8. Croissance

1. Commencez par la plaque à 96 puits et transférez les cellules sur des plaques plus grandes étape par étape selon les besoins.
   REMARQUE : Ces cellules aiment mieux se développer avec une densité cellulaire élevée, et ne pas transférer assez de cellules pourrait entraîner la mort. Gardez toujours la plaque précédente avec quelques cellules et marquez d’où vient le puits afin de pouvoir toujours revenir en arrière si besoin. Il est important de noter que les cellules 143B meurent et se détachent si elles sont surconfluentes, donc vérifiez ces cellules chaque jour.

9. Confirmation génétique

1. Centrifugez les cellules aliquotées à 450 ×g pendant 5 minutes.
2. Retirez les médias.
3. Ajoutez 5 μL de tampon d’extraction d’ADN (50 mM NaOH).
   REMARQUE : Ce chiffre peut changer s’il y a beaucoup de cellules. Les granulés cellulaires importants peuvent se trouver dans 10 μL de tampon.
4. Incubez à 95 °C pendant 30 minutes.
5. Ajouter un volume équivalent de tampon de stabilisation de l’ADN (0,1 M Tris-HCl ; pH 8) au tampon d’extraction.
6. Effectuez la réaction en chaîne par polymérase (PCR) selon les directives de l’enzyme.
   REMARQUE : Certains mutants ponctuels peuvent utiliser des enzymes de restriction pour distinguer les cellules témoins des cellules patientes. Les autres mutations ponctuelles ne peuvent pas être distinguées et nécessitent un séquençage. Dans ce cas, il est important d’utiliser des mélanges PCR sans colorants pour obtenir des résultats de haute qualité. Le séquençage Sanger et le séquençage de nouvelle génération peuvent être utilisés. 2,5 μL d’ADN suffisent pour une réaction de 25 μL.
7. Utilisez des amplicons PCR spécifiques à cette mutation pour le séquençage de Sanger.
   REMARQUE : Les amplicons PCR ont été envoyés pour le séquençage de Sanger. Le niveau d’hétéroplasmie de mutation a été confirmé à la fois après expansion du clone et après analyse fonctionnelle.

10. Respirométrie haute résolution utilisant la respirométrie haute résolution

1. Effectuez l’étalonnage de l’air selon les directives du respiromètre (par exemple, Oroboros Instruments).
2. Laver les cybrides dans une fiole T75 avec du PBS.
   REMARQUE : Les cellules ne doivent pas être surconfluentes ; Un confluent de 70 % à 80 % est idéal.
3. Ajoutez 1 mL de trypsine et faites couver pendant 4 minutes.
4. Ajoutez 5 mL de milieu cybride et comptez les cellules.
5. Ajoutez 500 000 cellules dans un tube pour centrifuger à 450 × g pendant 5 minutes.
   REMARQUE : Le nombre de cellules et les volumes du respiromètre sont dans la chambre de 0,5 mL.
6. Laver les cellules par resuspension avec du PBS puis centrifuger à nouveau.
7. Resuspendez les cellules dans 510 μL de tampon MiR05 et ajoutez-les dans une chambre vide.
8. Après la stabilisation, ajoutez 0,65 μL de digitonine (50 mg/mL), 0,8 μL de malate (2,5 M) et 2 μL de pyruvate (2,5 M).
   REMARQUE : Avant l’ajout de la digueline, c’est là que la mesure de la respiration basale est effectuée. Chaque étape suivante doit être effectuée après la stabilisation.
9. Ajoutez 12 μL d’adénosine diphosphate (ADP) (0,25 M).
10. Ajoutez 4 μL de glutamate (2,5 M).
11. Ajoutez 12 μL de succinate (1,25 M).
12. Ajoutez 1 μL d’oligomycine (1 mg/mL).
13. Ajoutez 1 μL de cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone [FCCP] (0,2 mM).
    REMARQUE : Titrez avec plusieurs ajouts jusqu’à ce qu’aucune augmentation supplémentaire ne soit observée (généralement 3–5).
14. Ajoutez 1 μL de roténone (2 mM).
15. Ajoutez 1 μL d’antimycine A (1 mg/mL).
16. Ajoutez 0,5 μL d’ascorbate (0,8 M) et 0,5 μL de tétramétylphénylénediamine [TMPD] (0,2 M).
17. Ouvrez la chambre avec un entretoise pendant 20 minutes.
18. Fermez la chambre et stabilisez pendant 5 minutes.
19. Ajoutez 22,5 μL d’azide (4 M).
20. Collectez des cellules pour la quantification des protéines à l’aide d’un kit de test à base d’acide bicinchoninique (BCA).
21. Effectuer des calculs après stabilisation du taux de consommation d’oxygène et normaliser par protéine. La respiration basale est le taux de consommation d’oxygène stabilisé après l’ajout de cellules dans la chambre.
    REMARQUE : Toutes les autres mesures sont prises après le substrat ou l’inhibiteur indiqué.
22. Calculer_l’IC d’OXPHOS : (Glutamate-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
23. Calculer_{OXPHOS CI+CII} : (Succinate-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
24. Calculer ETS_CI+CII : (FCCP-Antimycine A).
25. Calculer ETS_CII : (Roténone-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
26. Calculer CI₊CII de fuite : (Oligomycine-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
27. Calculer_{OXPHOS CIV} : (TMPD/ASC-Azide)/(FCCP-Antimycine A).
28. Utilisez au moins 4 à 6 répliques biologiques pour les mesures respirométriques.

Résultats

Pour démontrer les différences méthodologiques et le chemin vers l’optimisation du protocole, nous présentons les résultats de la génération de cybrides chez un patient suspecté de maladie mitochondriale, présentant une variante de signification inconnue (EVV) dans le MT-ND1 du complexe I (IC) dans la chaîne de transport électronique. Après un séquençage clinique de nouvelle génération du génome d’ADNmt dans plusieurs tissus dans deux laboratoires diagnostiques cliniques différe...

Discussion

Ici, nous présentons un protocole très efficace pour la génération de lignées cellulaires cybrides transmitochondriales à partir de plaquettes de patients en ADNmt. Nous démontrons l’applicabilité par une étude de cas d’une variante MT-ND1 de signification incertaine, ainsi que l’importance de considérer soigneusement les paramètres de croissance et de sélection. Une fois ces problèmes majeurs optimisés, la sélection réussie des cybrides abritant des variants de l’ADNmt pouvant ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbate	Sigma Aldrich	11140-250G
Azide	Sigma Aldrich	S2002-100G
Dialyzed FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonin	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Média Cybrid
DMEM	Corning	10-017-CM	Média de sélection
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamate	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	tampon de fusion
Malate	Sigma Aldrich	M1000-100G
MiR05 buffer	Oroboros Instruments	60101-01
O2K respirometor	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomycin	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pyruvate	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinate	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsin-EDTA 0,25%	Thermo Scientific	25200056
Uridine	Sigma Aldrich	U3750-25G