Article de méthode

Un modèle cardio-oncologique murin de cardiotoxicité induite par les anthracyclines chez des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs mammaires

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DOI :

10.3791/71633

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1 octobre 2026

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1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Les modèles murins cliniquement pertinents de cardiotoxicité induite par les anthracyclines sont rares. Ici, un modèle utilisant des souris immunocompétentes porteuses d'une tumeur recevant un traitement anticancéreux est proposé, imitant les protocoles cliniques des patients atteints de cancer.

Résumé

La récente mise à jour de la Société européenne de cardiologie concernant les modèles précliniques de dysfonction cardiaque liée aux thérapies anticancéreuses souligne un besoin critique de modèles plus représentatifs et translationnels in vivo des modèles. Il met en évidence la nécessité de développer des modèles utilisant des animaux immunocompétents porteurs de tumeurs, intégrant plusieurs souches et les deux sexes, afin de reproduire plus fidèlement l'hétérogénéité observée dans les populations cliniques. Ainsi, un modèle cliniquement pertinent de cardiotoxicité induite par les anthracyclines (AIC) a été établi chez des animaux porteurs de tumeurs mammaires. Selon le fond génétique des souris, des cellules 4T1Luc (200 000 cellules) ou des cellules PY8119 (200 000 cellules) ont été injectées respectivement chez des souris Balb/c ou C57Bl/6J, par voie sous-cutanée dans la glande mammaire inférieure, chez les mâles et les femelles. La croissance tumorale a été suivie par bioluminescence et palpation. Dès que la masse tumorale est devenue détectable par palpation, deux semaines après l'injection des cellules tumorales, les animaux ont reçu un traitement anticancéreux par doxorubicine. La tolérance des souris à la doxorubicine dépendait de la souche. La fonction cardiaque a été évaluée avant le début du protocole (valeur de base) puis hebdomadairement par échographie cardiaque chez des souris anesthésiées à la kétamine. La cardiotoxicité a été définie par une diminution d'au moins 10 % de la fraction d'éjection ventriculaire gauche par rapport à la valeur de base, ou par une valeur absolue <50 %, et une fréquence cardiaque >300 BPM. Le protocole s'est révélé reproductible, avec un taux de succès de 99 % pour le développement de tumeurs, et un >Taux de survie des souris de 80 %. Une cardiotoxicité a été observée chez >90 % des souris traitées présentant une tumeur et ayant reçu de la doxorubicine.

Introduction

La cardio-oncologie vise à améliorer les résultats cardiovasculaires chez les patients atteints de cancer avant, pendant et après une chimiothérapie. Les modèles précliniques ont joué un rôle majeur dans la compréhension approfondie des interactions entre ces deux maladies. Récemment, une étude marquant un tournant a observé que des souris naturellement prédisposées à développer des polypes intestinaux spontanés développaient davantage de ces tumeurs après un infarctus du myocarde et une période d'insuffisance cardiaque (IC), démontrant ainsi l'impact direct d'un événement cardiovasculaire sur la croissance tumorale1. Depuis lors, de nombreuses études ont rapporté des résultats concordants pour divers types de tumeurs et souches murines, impliquant fréquemment des voies moléculaires ou des protéines spécifiques, renforçant ainsi l'idée que la progression du cancer est déclenchée par des maladies cardiovasculaires (MCV)2,3,4,5.

Inversement, l'impact du cancer sur le risque de développer des maladies cardiovasculaires (MCV) fait l'objet d'études depuis plusieurs décennies. Des données épidémiologiques montrent que les survivants du cancer souffrent davantage de MCV, à la fois en raison des facteurs de risque communs à ces deux maladies et des diverses toxicités connues des traitements anticancéreux. traitements6,7,8,9,10. Les études précliniques ont couramment utilisé des modèles de cachexie induite par le cancer afin d'identifier des cibles spécifiques pouvant être modulées chez l'humain pour améliorer les résultats cardiovasculaires à long terme11,12,13,14Cependant, on pourrait faire valoir que ces modèles reflètent difficilement une situation clinique courante, puisque les patients sont souvent traités avant d'atteindre ce stade avancé du syndrome cancéreux, mais la cachexie globale est néanmoins soupçonnée de contribuer largement au décès lié au cancer15.

Dans les premières lignes directrices en cardio-oncologie de la Société européenne de cardiologie (ESC), il est conclu que des recherches supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre la relation entre le cancer et les maladies cardiovasculaires16. Plus précisément, dans une mise à jour récente du groupe de travail de l'ESC sur la cardio-oncologie, il a été indiqué que la recherche préclinique revêt une importance capitale pour combler cette lacune de connaissances, en particulier à l'aide de modèles utilisant des animaux porteurs de tumeurs17. Par ailleurs, une meilleure corrélation entre les études précliniques et cliniques est nécessaire, car la plupart des études cliniques actuelles portent sur des traitements anticancéreux peu étudiés dans des contextes précliniques18.

Les anthracyclines (AC), telles que la doxorubicine (Dox), sont couramment utilisées en chimiothérapie pour un grand nombre de tumeurs solides et hématologiques. Même si des thérapies plus modernes sont disponibles aujourd'hui, leur faible coût, leurs effets secondaires bien documentés et leur efficacité évidente entraîneront une utilisation prolongée de ces médicaments pendant de nombreuses années encore19,20. Un grand nombre de données indiquent que les AC provoquent une cardiotoxicité dépendante de la dose, principalement observée sous forme de dysfonction ventriculaire gauche, qui constitue l'un des principaux facteurs limitant leur utilisation clinique actuelle et qui représente souvent une préoccupation majeure pour le cardio-oncologue21,22. Cette littérature provient principalement d'études sur le cancer du sein en raison de son incidence élevée chez l'humain, mais des études cliniques sur les lymphomes, le cancer du poumon et les leucémies rapportent des observations similaires23. Par conséquent, des recherches précliniques ont été menées depuis plusieurs décennies afin de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la cardiotoxicité induite par les anthracyclines (AIC), qui ont montré que le stress oxydatif, les lésions directes et indirectes de l'ADN, la férroptose et les dommages mitochondriaux sont fréquemment impliqués23,24.

Néanmoins, les données probantes sur la prévention ou le traitement de la CIA sont en réalité limitées. Les médicaments couramment utilisés contre l'insuffisance cardiaque ont été évalués dans des essais cliniques avec des résultats mitigés, et le moment optimal pour utiliser les rares candidats prometteurs s'est révélé difficile à déterminer21,23,25,26,27,28. La dextrazoxane, un médicament modulant le fer, a montré des résultats prometteurs pour la prévention de la CIA, mais n'est pas utilisée systématiquement aujourd'hui21. L'administration des AC sous des formes autres que libres dans le sang, par exemple encapsulées dans des liposomes, a également donné des résultats encourageants, mais peine encore à remplacer les AC conventionnels, en partie en raison de leur coût21.

Une explication à cette situation est le manque de modèles animaux cliniquement pertinents pour l'étude de l'AIC17Chez l'homme, la doxycycline est administrée sur une période prolongée. via injections répétées, et la majeure partie de l'AIC est observée durant la première année suivant le traitement. Toutefois, une grande variabilité dans les protocoles animaux est observée dans la littérature, comme le montre une revue récemment publiée29Un exemple classique de modèle de cardiotoxicité aiguë est constitué de souris sans tumeur recevant une injection unique de 20 mg/kg de doxorubicine30Dans un modèle typique de cardiotoxicité chronique, de nombreuses études décrivent des souris sans tumeur recevant une injection par semaine de 5 mg/kg de doxorubicine, pour une dose cumulée totale de 20 mg/kg.29,31Ce modèle de cardiotoxicité chronique peut également être observé chez des animaux porteurs de tumeur à la même dose de Dox ; toutefois, cela reste très peu fréquent dans la littérature29,32.

Afin de contribuer à combler ce manque de connaissances, un modèle pragmatique et cliniquement pertinent de souris immunocompétentes porteuses de tumeurs mammaires a été mis au point pour étudier l’ICPA, notamment chez des souris Balb/c porteuses de la lignée 4T1, et sa robustesse a été confirmée chez des souris C57Bl/6J porteuses de la tumeur PY8119, ce qui constitue, à la connaissance des auteurs, la première fois qu’un modèle cardio-oncologique est établi avec un cancer du sein triple négatif sur une souche C57Bl/6J. Une bonne détection de la croissance tumorale via la quantification de la bioluminescence a été obtenue avant le traitement des animaux par la doxorubicine, qui a démontré une cardiotoxicité, et un protocole de prélèvement d’organes a été mis en œuvre afin d’étudier le microenvironnement tumoral simultanément à l’expérience cardio-oncologique. De plus, des résultats similaires à ceux décrits dans la littérature concernant la sensibilité selon la souche et le sexe ont été observés. Ce travail devrait contribuer à la standardisation et à l’amélioration des protocoles animaux dans les futures études cardio-oncologiques, les souris C57Bl/6J étant particulièrement précieuses en raison de leur taux de survie élevé dans les expériences d’ICPA29.

L'avantage de la méthode proposée réside dans l'utilisation de la souche C57Bl/6J, qui est facile à manipuler génétiquement, possède un génome bien caractérisé, est peu coûteuse à acquérir et tolère des doses cumulées élevées d'AC29,33,34. Si l'inactivation d'un gène est nécessaire pour une étude spécifique avec des AC, ce modèle convient parfaitement à cette finalité. De plus, l'utilisation d'un cancer du sein triple négatif dérivé de cette souche présente un intérêt translationnel, car les femmes atteintes d'un cancer du sein triple négatif sont les patientes les plus susceptibles de recevoir des AC et celles qui ont le pronostic le plus sombre35. L'utilisation de ce modèle devrait améliorer spécifiquement les connaissances sur les IAC chez ces patientes.

La force de ce modèle réside également dans le fait que les souris sont préconditionnées avec une tumeur, ce qui peut réellement influencer le remodelage cardiovasculaire36,37. De plus, ce modèle se situe entre les modèles aigus et les modèles entièrement chroniques d’ICa, avec la possibilité d’étendre la durée de surveillance des animaux en raison de leur taux de survie élevé, ce qui peut s’avérer très utile si d’autres cycles d’AC sont envisagés.

Cependant, ce modèle n'est probablement pas le mieux adapté à la caractérisation spécifique de la tumeur à la fin du protocole, en raison de son approche pragmatique de l'inoculation tumorale. Une version adaptée de l'injection tumorale devrait être réalisée si cela est central dans l'hypothèse scientifique. De plus, l'injection de cellules 4T1 chez des souris Balb/c constitue un modèle bien établi pour une approche plus oncologique, par exemple pour l'étude des métastases, ce qui n'est pas décrit ici et devrait être pris en compte si les métastases sont essentielles à la question scientifique38. Ce modèle est réalisé chez des souris adultes ; toutefois, si l'objectif est d'étudier l'AIC dans un contexte pédiatrique, des souris plus jeunes devraient être envisagées, pour lesquelles la réponse au protocole n'a pas été étudiée dans ce travail.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux directives du comité local d'éthique sur l'expérimentation animale (Lariboisière-Villemin) et ont été approuvées par le ministère français de l'Enseignement supérieur et de la Recherche (MESRI) sous le numéro de protocole APAFIS 46086. Les règles des 3R ont été prises en compte lors de la conception du protocole. Des souris Balb/c et C57Bl/6J ont été achetées auprès d'un fournisseur d'animaux de laboratoire tel que Janvier Labs ou Envigo. Pour ce protocole, les souris avaient entre 10 et 18 semaines au moment de l'inclusion, correspondant à des adultes jeunes, similaires aux femmes atteintes d'un cancer du sein triple négatif. Les animaux ont été maintenus par groupes de 2 à 5 individus dans une pièce avec un cycle clair-obscur de 12 heures, une température ambiante comprise entre 20 °C et 24 °C, et une humidité relative comprise entre 30 % et 70 %. L'eau et la nourriture ont été fournies ad libitum. Pendant le protocole, des précautions ont été prises pour respecter des critères d'euthanasie prédéfinis avant le début du protocole, comme décrit dans le tableau supplémentaire 1. Veillez à utiliser un filtre à isoflurane afin de recueillir les gaz résiduaires pour la sécurité de l'utilisateur. Manipulez les animaux avec précaution, en portant des gants et des lunettes à chaque étape de ce protocole. Tous les matériaux dangereux doivent être éliminés conformément à la réglementation institutionnelle locale ; ici, tous les échantillons contaminés (sang, aiguilles, flacons contenant de la dox, etc.) ont été jetés dans des bacs de déchets biomédicaux. L'aperçu du protocole est présenté dans la figure 1A. Les réactifs et l'équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Semaine 0 : Préparation des cellules et injection dans l'animal

REMARQUE : Les étapes suivantes sont décrites pour les cellules 4T1Luc et étaient identiques pour l'utilisation des cellules PY8119. Toutefois, cela doit être adapté à chaque lignée cellulaire, en fonction des recommandations du fabricant. Pour optimiser le protocole, une personne peut s'occuper de la préparation des cellules, tandis que l'autre s'occupe de la préparation des animaux.

  1. Lorsque vous obtenez un flacon de culture cellulaire confluent (confluence de 80 % à 90 %), ajoutez 3 mL de trypsine pendant 5 min à 37 °C et 5 % de CO2.
  2. Tapotez doucement le flacon pour détacher toutes les cellules, évitez les agrégats cellulaires et resuspendez-les dans le milieu de culture.
  3. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Malassez (ou d’une autre technique, selon ce qui est disponible).
  4. Centrifugez les cellules à 300 × g pendant 5 min, puis resuspendez-les dans un volume équivalent de PBS afin d’injecter 200 000 cellules en 100 µL.
    NOTE : Le nombre de cellules a été choisi après une revue de la littérature (voir Tableau supplémentaire 2).
  5. Aspirez délicatement 500 µL de la suspension cellulaire à l’aide d’une seringue de 26 G. Pour éviter de laisser la suspension cellulaire trop longtemps dans la seringue, il est recommandé de remplir la seringue avec un volume inférieur à celui nécessaire pour 5 animaux.
  6. Placez simultanément (si possible) les souris dans une chambre à isoflurane et induisez rapidement l’anesthésie avec 3 % d’isoflurane à 1 L/min dans l’air ambiant. Dès que l’animal est endormi, placez-le en position dorsale avec le museau dans un entonnoir contenant 1 % d’isoflurane.
  7. Appliquez une crème dépilatoire douce à l’aide d’un coton-tige sur la paroi thoracique et la paroi abdominale inférieure gauche de l’animal pendant 1 min. Retirez les poils et la crème à l’eau, puis séchez la peau avec un mouchoir.
  8. Vérifiez l’anesthésie suffisante par un pincement de l’orteil.
  9. Repérez le mamelon mammaire gauche supérieur de l’abdomen. Saisissez-le délicatement avec une pince et soulevez-le vers le haut (voir Figure 1B).
  10. Introduisez l’aiguille de la seringue sous-cutanément et faites-la progresser jusqu’à ce qu’elle se trouve sous la glande mammaire.
  11. Injectez 100 µL de la suspension cellulaire. Une bulle sous-cutanée doit se former sous le mamelon (voir Figure 1C). Les animaux témoins doivent recevoir du PBS. La randomisation peut être effectuée à l’aide d’un logiciel de randomisation (comme RandoMice, un outil en ligne gratuit) ou en attribuant le traitement aux souris selon un ratio prédéfini de 1:1 ou 2:2 (ou supérieur).
  12. Retirez délicatement l’aiguille et relâchez le mamelon tenu par la pince.
  13. Pesez l’animal afin d’obtenir un poids de base pour le protocole.
  14. Laissez l’animal se réveiller dans l’air ambiant avant de le remettre dans sa cage.

2. Semaine 1 : Contrôle de la croissance tumorale par bioluminescence

REMARQUE : Ceci peut être effectué n'importe quel jour après l'injection afin de contrôler la croissance. En outre, cela pourrait être réalisé à plusieurs points temporels si la vitesse de croissance tumorale présente un intérêt. Toutefois, après 10 à 14 jours, le signal peut s'atténuer en raison de la sélection naturelle des cellules tumorales durant la croissance du cancer. De plus, la repousse des poils ne devrait pas poser de problème pour une capture adéquate des photons si le protocole est correctement réalisé au départ. Voir Figure 2A,B pour des résultats représentatifs de la quantification de la bioluminescence aux jours 2, 5, 8 et 11 après l'injection de la tumeur.

  1. Placer les animaux dans une chambre à isoflurane et induire rapidement l'anesthésie avec 3 % d'isoflurane.
  2. Une fois les animaux endormis, injecter 10 µL/g de poids corporel de luciférine par voie intrapéritonéale (IP) à l’aide d’une seringue de 26 G. Éviter d’injecter la luciférine du côté gauche en raison de la présence de la tumeur, qui peut parfois déjà être palpable après quelques jours.
  3. Placer les souris dans l’imageur de photons en position dorsale afin d’optimiser la capture des photons, car la tumeur se situe du côté abdominal. Introduire le museau dans le cône nasal et réduire l’isoflurane à 1 %.
    REMARQUE : Placer correctement 5 animaux dans un capteur de photons prend un certain temps ; commencer à les positionner au moins 2 min avant le début de l’acquisition.
  4. Démarrer l’acquisition de l’activité de bioluminescence 10 min après l’injection de luciférine, et la poursuivre pendant 5 min (voir Figure 2A). Le mode d’acquisition pour l’appareil utilisé ici était l’imagerie de bioluminescence (BLI) à 89 ms par image, avec une taille d’image de 220 mm x 165 mm et une taille de pixel BVR de 153 µm.
  5. Lorsque l’acquisition est terminée, laisser l’animal se réveiller dans l’air ambiant avant de le remettre dans sa cage.
  6. Utiliser un logiciel de quantification adapté à l’imageur de photons, conformément aux recommandations du fabricant.

3. Semaine 2 : traitement par la doxorubicine

REMARQUE : L'évaluation échocardiographique doit être effectuée avant le début des injections de Dox. Par conséquent, utilisez l'anesthésie induite après l'échocardiographie pour administrer l'injection pendant que l'animal est endormi, afin de minimiser le stress lié à la première injection de Dox. En outre, la dose cumulative doit être adaptée à chaque souche de souris. Ici, une dose de 16 mg/kg pour les souris Balb/c et de 24 mg/kg pour les souris C57Bl/6J a été utilisée, en se basant sur des données internes antérieures et la littérature29 (voir Figure 3A–C).

  1. Resuspendre et diluer la poudre de doxorubicine avec une solution saline. La dilution doit être préparée de sorte que 4 mg/kg de Dox correspondent à un volume de 240–360 µL. Ainsi, il est recommandé de préparer une solution à 2 mg/mL, puis de réaliser une dilution 6 fois avec la solution saline (concentration finale 0,33 mg/mL).
  2. Deux semaines après l'injection de la tumeur, s'assurer que la tumeur est palpable dans la partie inférieure gauche de l'abdomen, mais qu'elle mesure moins de 1 cm.
  3. Peser l'animal afin de surveiller la perte de poids après le traitement par Dox.
  4. À l’aide d’une seringue de 26 G, injecter le volume correspondant pour atteindre 4 mg/kg par voie intrapéritonéale dans la partie inférieure droite de l’abdomen. Les animaux témoins doivent recevoir une solution saline. La randomisation peut être effectuée comme à l’étape 1.11.
  5. Répéter cette procédure quotidiennement pendant 4 jours afin d’atteindre une dose cumulée de 16 mg/kg (ajouter 2 jours pour atteindre 24 mg/kg chez les souris C57Bl/6J).

4. Semaines 2 à 5 : Surveillance de la cardiotoxicité

REMARQUE : Ceci peut être effectué sur une base hebdomadaire. Une évaluation plus fréquente nécessitera de la prudence, car les animaux sont souvent les plus vulnérables aux semaines 3 et 4 du protocole, et parce que certaines souches de souris sont sensibles à l'anesthésie générale, ce qui pourrait entraîner une mortalité accrue. L'échocardiographie est réalisée sous anesthésie à la kétamine afin d'optimiser les chances d'enregistrer une dysfonction cardiaque, puisque l'isoflurane induit une dépression myocardique, avec une dose de 40 mg/kg pour les souris Balb/c et de 80 mg/kg pour les souris C57Bl/6J39. Il est recommandé de réaliser une échographie avant le début de l'injection de tumeur afin de quantifier l'effet potentiel de la croissance tumorale sur la fonction cardiaque avant l'initiation de la chimiothérapie.

  1. Peser l'animal. En cas de perte de poids importante observée, suivre le Tableau supplémentaire 1.
  2. Anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 26 G de kétamine à 40 mg/kg (souris Balb/c) ou 80 mg/kg (souris C57Bl/6J) afin d’obtenir une anesthésie légère.
  3. Placer l’animal sur un tapis chauffant afin d’éviter l’hypothermie.
  4. Une fois l’animal endormi, raser l’animal comme décrit au point 1.7 afin d’obtenir une zone thoracique dépourvue de poils.
  5. Dix minutes après l’injection de kétamine, réaliser une échocardiographie pendant un maximum de 5 min. Utiliser un gel échographique préchauffé. Selon l’appareil utilisé, se concentrer sur le mode M et/ou effectuer une quantification de la déformation.
  6. Si le mode M est utilisé, enregistrer des sections médio-ventriculaires en vue para-sternale long-axe, pendant au moins 4 s, au minimum 3 fois, afin d’obtenir une moyenne représentative de la fonction cardiaque de la souris (voir Figure 4A,B). Ici, la fréquence d’images était réglée à 100 images/s, la fréquence d’émission à 38,4 MHz à 100 % de puissance, la fréquence de réception à 96 MHz, la vitesse du son à 1538 m/s et la vitesse de balayage à 1200 Hz.
  7. Après environ 5 min, l’animal sera trop éveillé pour permettre l’échocardiographie. Le replacer dans sa cage après avoir nettoyé le gel utilisé pour l’échographie.
  8. Quantifier de manière aveugle la fonction cardiaque39,40. Une dysfonction pertinente dans ce modèle est définie comme étant 10 % en dessous de la valeur de base et une valeur absolue <50 % de la fraction d’éjection ventriculaire gauche (FS), tandis que la fréquence cardiaque reste >300 BPM. Si la valeur de FS pré-traitement est trop faible, envisager d’exclure l’animal de l’analyse.
    REMARQUE : Au moins 3 cycles cardiaques sont nécessaires pour chaque quantification à partir des extraits de 4 s, mais davantage de cycles peuvent être utilisés lorsque possible. Si possible, utiliser le même expérimentateur pour toutes les échocardiographies et une personne différente pour la quantification afin de garantir l’aveugle de l’analyse. Des recommandations concernant le contrôle qualité de l’échocardiographie sont publiées ailleurs40.
  9. Réaliser l’analyse statistique (voir étape 6). Le test recommandé pour analyser deux groupes sur l’ensemble du protocole est une ANOVA à deux facteurs, puisque deux facteurs sont comparés : le temps et le traitement.
  10. Réaliser cela de manière hebdomadaire. La dysfonction apparaît après seulement 1 semaine de traitement à la doxorubicine.
    REMARQUE : Si un prélèvement sanguin est nécessaire à un moment donné après la Dox, par exemple pour mesurer des biomarqueurs cardiaques, prélever le sang immédiatement après l’échocardiographie afin d’éviter une nouvelle injection d’anesthésique, minimiser le stress de l’animal et optimiser le temps.

5. Semaine 5 : Procédure de sacrifice

REMARQUE : idéalement, ce protocole de prélèvement d'organes devrait être réalisé par deux personnes.

  1. Après la dernière échocardiographie à la semaine 5, réinjecter les animaux par voie intrapéritonéale avec du kétaamine à 100 mg/kg. Appliquer une anesthésie locale avec une goutte de Tétracaïne à 1 % sur l’œil qui sera utilisé pour le prélèvement sanguin.
  2. À l’aide d’un capillaire hépariné, effectuer un prélèvement rétro-orbitaire pour recueillir le plus de sang possible dans un tube hépariné (ou un capillaire EDTA dans un tube EDTA).
  3. Lorsqu’aucun sang supplémentaire ne peut être obtenu, pratiquer une dislocation cervicale conformément aux protocoles approuvés par l’établissement. Placer immédiatement le sang recueilli sur de la glace jusqu’à son traitement ultérieur, tout en poursuivant le protocole de sacrifice décrit à l’étape 5.5.
  4. Centrifuger le sang à 2000 x g pendant 10 min à 4 °C afin de séparer les cellules sanguines et le plasma. Congeler rapidement le tube de plasma à l’azote liquide et le conserver à -80 °C jusqu’à analyse ultérieure.
  5. Placer l’animal sur un couvercle en mousse de polystyrène recouvert de papier absorbant, et fixer les quatre pattes à l’aide d’épingles.
  6. La tumeur doit être de taille importante (au moins 2 cm). Effectuer une résection avec une marge suffisante autour de la tumeur pour la détacher. Une dissection plus poussée peut être réalisée après la collecte des organes restants décrite à l’étape 5.15.
  7. Dans un espace dédié, disséquer délicatement la tumeur à l’aide de petites ciseaux pointus tout en la maintenant avec une pince. Pour augmenter la tension sans endommager la tumeur, épingler l’excès de peau sur le couvercle. Cela facilitera la dissection.
  8. Une fois la tumeur bien disséquée, la nettoyer délicatement au PBS pour éliminer le sang, les poils et tous les débris non attachés. Peser la tumeur.
  9. Placer une maille en nylon de 22 µm dans un tube de centrifugation de 5 mL, poser délicatement la tumeur dessus, et maintenir le tout sur glace jusqu’à la centrifugation.
  10. Centrifuger le tube à 100 x g pendant 10 min à 4 °C pour recueillir le liquide interstitiel (voir Figure 5A). Le volume obtenu varie de 1 à 20 µL, souvent de couleur rougeâtre (Figure 5B). Transférer ce liquide dans un tube microcentrifuge de 200 µL et le conserver à -80 °C jusqu’à analyse ultérieure.
    NOTE : Le reste de la tumeur peut être découpé en morceaux plus petits, placé dans des tubes de stockage, congelé instantanément à l’azote liquide, puis conservé à –80 °C jusqu’à analyse ultérieure.
  11. Pour recueillir la moelle osseuse, couper la patte droite avec des ciseaux, puis disséquer au scalpel et à la pince le fémur et le tibia afin d’éliminer tous les muscles, tissus conjonctifs et graisses. Couper les épiphyses des deux extrémités des deux os au scalpel. Placer les os nettoyés dans du PBS dans des plaques de culture à 12 puits, tout en terminant la collecte des organes des souris comme décrite à l’étape 5.15.
    NOTE : Des protocoles plus détaillés d’isolement de la moelle osseuse sont publiés ailleurs41.
  12. Perforer le fond de tubes microcentrifuges de 500 µL à l’aide d’une aiguille de 18 G, y insérer les deux os, puis placer ce tube dans un tube de centrifugation de 1,5 mL contenant 400 µL de PBS.
  13. Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 1 min à 4 °C. Un culot cellulaire apparaît au fond du tube de 1,5 mL ; il contient toutes les cellules de la moelle osseuse, tandis que le stroma de la moelle osseuse se trouve en suspension dans le PBS. Aspirer tout le surnageant (stroma de la moelle osseuse) dans un tube de stockage séparé, congeler rapidement le matériel à l’azote liquide, puis le conserver à -80 °C.
  14. Au-dessous du thorax, au niveau diaphragmatique, pratiquer une incision transversale à l’aide de ciseaux, puis couper le sternum selon son axe longitudinal afin d’exposer les poumons et le cœur.
    NOTE : Si nécessaire pour des analyses ultérieures, une élimination complète du sang à l’aide d’une solution saline peut être effectuée à ce stade.
  15. Recueillir tous les organes nécessaires aux analyses biomoléculaires et histologiques. Les peser et les découper en morceaux plus petits afin de faciliter les analyses biomoléculaires futures. Congeler instantanément tous les tubes à l’azote liquide dès que l’organe est découpé, puis les conserver à -80 °C.
  16. Pour le cœur, séparer l’apex de la partie supérieure du cœur et le placer sur des moules en plastique remplis de OCT. Une fois dans le OCT, le plonger dans de l’isopentane froid avant de le congeler instantanément à l’azote liquide et de le stocker à -80 °C.

6. Analyse statistique

REMARQUE : Toutes les analyses statistiques et les graphiques ont été réalisées à l'aide de logiciels statistiques et de tracé graphique, en suivant les recommandations du guide statistique42.

  1. Les données présentées sont exprimées en moyenne ± erreur type de la moyenne (ETM).
  2. Utiliser la même échelle pour tous les graphiques de la fraction d'éjection.
  3. Afficher chaque unité expérimentale (souris) individuelle sur chaque graphique.
  4. Réaliser le test de Shapiro-Wilk pour évaluer la normalité des distributions de chaque groupe expérimental, avec un seuil de significativité alpha fixé à p = 0,05.
  5. Pour la comparaison entre deux groupes, utiliser le test de Welch ou celui de Mann-Whitney selon la normalité de la distribution (test de Welch pour des distributions normales dans les deux groupes, test de Mann-Whitney si l'un ou les deux groupes présentent des distributions non normales). Choisir les options bilatérales, avec un niveau de confiance fixé à 95 %.
  6. Pour la comparaison entre plus de deux groupes à un moment précis, déterminer à nouveau si les distributions des groupes sont normales comme indiqué à l'étape 6.4. Réaliser une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d'une correction de Holm-Sidak pour les comparaisons multiples si la distribution est normale.
    REMARQUE : Si la distribution n'est pas normale, il convient de réaliser un test de Kruskal-Wallis avec correction de Dunn pour les comparaisons multiples. Le seuil alpha global est fixé à 0,05 pour déterminer la significativité.
  7. Pour les données longitudinales, une ANOVA à deux facteurs avec mesures répétées suivie d'une correction de Sidak pour les comparaisons multiples a été utilisée afin d'examiner les différences entre groupes à un moment précis. Le seuil alpha global est fixé à 0,05 pour déterminer la significativité.

Résultats

Ce protocole, tel qu'illustré dans Figure 1A, est un protocole de 5 semaines conduisant aux groupes expérimentaux suivants : souris non porteuses de tumeur sans doxycycline, souris non porteuses de tumeur traitées à la doxycycline, souris porteuses de tumeur sans doxycycline et souris porteuses de tumeur traitées à la doxycycline. Ces groupes peuvent être doublés selon que les deux sexes sont utilisés ou non. Les deux premières semaines de croissance tumorale, avant le début du traitement à la doxycycline, suffisent pour que la tumeur se développe après l'injection de 200 000 cellules dans le 4th glande mammaire gauche des animaux (Figure 1B). La confirmation de l'injection sous-cutanée doit être obtenue par l'apparition d'une bulle sous le mamelon lors de l'injection douce de la suspension de cellules tumorales (Figure 1C). Tableau 1 résume brièvement les paramètres clés du protocole pour chaque souche de souris, ainsi que les principaux résultats qui seront discutés ci-dessous.

Figure 2A est une image représentative du signal bioluminescent obtenu lorsqu'une souris sans tumeur (à gauche) et une souris avec une tumeur (à droite) sont injectées avec de la luciférine, et que les photons sont collectés pendant 5 min. Cette analyse nécessite que les tumeurs expriment le gène de la luciférase afin de produire des photons après l'injection de luciférine. Au total, 33 souris Balb/c ayant reçu une injection de cellules 4T1Luc ont été suivies pendant 11 jours par bioluminescence, tandis que 9 témoins ont été utilisés. Figure 2B confirme que la tumeur croît rapidement, mais que l'intensité du signal commence à stagner après le jour 8, et qu'il semble y avoir une croissance initialement plus rapide de la tumeur chez les femelles par rapport aux souris mâles Balb/c, comme illustré dans Figure 2C. Une seule souris sur 45 de souche Balb/c n'avait pas de tumeur après 5 semaines, tandis que toutes les souris C57Bl/6J présentaient une tumeur après 5 semaines (Figure 2D).

Figure 3A  et Figure 3B démontrer que la réduction cumulative de la dose de Dox conduit à une amélioration de la survie 3 semaines après le début du traitement par la Dox : alors qu'aucune souris Balb/c porteuse de tumeur n'a survécu à une dose de 24 mg/kg, 50 % ont survécu à une dose de 16 mg/kg. Toutefois, les souris C57Bl/6J porteuses de tumeur sont plus résistantes, même à une dose de 24 mg/kg de Dox, puisque >80 % d'entre eux survivent 3 semaines après le début de la chimiothérapie (Figure 3D). Le sexe a eu un impact important sur le résultat : les femelles présentaient une survie nettement meilleure que celle des mâles chez les souris Balb/c (16 femelles sur 29 ont survécu contre 3 mâles sur 16). Figure 3C démontre les différences liées au sexe chez des souris Balb/c ayant reçu 16 mg/kg de Dox (aucun test statistique n’a été effectué en raison du faible nombre de mâles). Chez les souris C57Bl/6J, aucune différence statistiquement significative n’a été observée entre les deux sexes concernant la survie (voir Figure 3E).

Une image représentative de la fonction cardiaque normale chez la souris, évaluée par échocardiographie avant le traitement à la doxorubicine, est présentée dans la Figure 4A, et une image correspondant à une souris présentant une dysfonction cardiaque après traitement à la doxorubicine est montrée dans la Figure 4B. La fraction d'éjection, quantifiée en mode M chez 17 souris C57Bl/6J porteuses de tumeurs traitées avec 24 mg/kg de doxorubicine, diminue de manière significative deux semaines plus tard (59,3 % avant le traitement contre 44,3 % après le traitement, p < 0,0001, Figure 4C). Un seul des 12 souris survivantes (8 %) ne répondait pas aux critères prédéfinis de cardiotoxicité. La fréquence cardiaque diminue légèrement mais significativement, passant de 623 BPM avant le traitement à 569 BPM après le traitement (p < 0,05, Figure 4D). Tous les paramètres quantifiés en mode M sont disponibles dans le Tableau supplémentaire 3.

La confirmation de l'effet cardiotoxique de la doxorubicine est obtenue par analyse macro- et microscopique. Figure 6A,B démontre que le poids absolu du cœur est significativement réduit après le traitement à la doxorubicine chez les rares souris femelles Balb/c porteuses de tumeur ayant survécu, mais la normalisation du poids cardiaque par rapport au poids corporel total ne montre qu'une tendance. Dans une expérience menée sur des souris C57Bl/6 non porteuses de tumeur, 24 mg/kg de doxorubicine ont induit les modifications attendues dans l'ARNm cardiaque des gènes suivants une semaine après le début du traitement : Atrogin et Murf1 augmentés, en faveur de l'atrophie ; NQO1 augmenté, en faveur du stress oxydatif ; et Bax augmenté, en faveur d'un état pro-apoptotique (Figure 6C–F).

Figure 5A est une représentation schématique du protocole de fluide interstitiel tumoral. Une image représentative du fluide recueilli est présentée dans Figure 5B : le volume obtenu est faible.

figure-results-1
Figure 1 : Illustrations représentatives du protocole expérimental. (A) Aperçu schématique du protocole expérimental. Créé avec BioRender (licence n° JE29USE7LU). (B) Représentation schématique de l'inoculation tumorale sous-cutanée. Créé avec BioRender (licence n° SO29JHW7R6). (C) Représentation schématique d'un implantation tumorale sous-cutanée réussie. Créé avec BioRender (licence n° SO29JHW7R6). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Imagerie par bioluminescence et taux d'implantation tumorale. (A) Images représentatives de bioluminescence d'une souris témoin (à gauche) et d'une souris porteuse de tumeur (à droite). (B) Signal de bioluminescence en fonction du temps (moyenne ± erreur standard de la moyenne [ESM] ; analyse de variance à deux facteurs avec mesures répétées [ANOVA] ; *P < 0,05). (C) Comparaison des signaux de bioluminescence entre les souris Balb/c mâles et femelles (moyenne ± ESM). (D) Taux de réussite de l'implantation tumorale chez les deux souches de souris. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Analyse de survie de souris porteuses de tumeurs. (A) Courbe de survie de Kaplan-Meier de souris Balb/c traitées avec 24 mg/kg de doxorubicine (Dox). (B) Courbe de survie de Kaplan-Meier de souris Balb/c traitées avec 16 mg/kg de Dox. (C) Courbe de survie de Kaplan-Meier comparant les souris mâles et femelles Balb/c traitées avec 16 mg/kg de Dox. Aucune analyse statistique n’a été effectuée en raison du nombre limité de souris mâles. (D) Courbe de survie de Kaplan-Meier de souris C57BL/6J traitées avec 24 mg/kg de Dox. (E) Courbe de survie de Kaplan-Meier comparant les souris mâles et femelles C57BL/6J traitées avec 24 mg/kg de Dox (test du log-rank, P = 0,86). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Évaluation échocardiographique de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. (A) Échocardiogramme en mode M représentatif d'une souris saine. (B) Échocardiogramme en mode M représentatif d'une souris présentant une cardiotoxicité induite par la doxorubicine. (C) Fraction de raccourcissement (FS) chez des souris C57BL/6J avant et 14 jours après le traitement à la doxorubicine. (D) Fréquence cardiaque (HR) chez des souris C57BL/6J avant et 14 jours après le traitement à la doxorubicine. Les données sont présentées pour n = 17 souris. Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide du t-test de Welch. *P < 0,05 ; ****P ≤ 0,0001. Abréviations : FS, fraction de raccourcissement ; HR, fréquence cardiaque. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Protocole de prélèvement d'organes. (A) Représentation schématique du protocole de collecte du liquide interstitiel tumoral. Créé avec BioRender (licence n° HV29USD91R). (B) Image représentative montrant la collecte du liquide interstitiel tumoral lors du prélèvement d'organes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Figure 6: Cardiotoxicité induite par la doxorubicine. (APoids du cœur mesuré 3 semaines après l'initiation d'un traitement par la doxorubicine à 16 mg/kg chez des souris Balb/c porteuses de tumeur.BPoids cardiaque normalisé par rapport au poids corporel total, mesuré 3 semaines après l'initiation d'un traitement par la doxorubicine à 16 mg/kg chez des souris Balb/c porteuses de tumeur.CExpression de l'ARNm d'Atrogin dans le myocarde de souris C57BL/6J une semaine après le début d'un traitement à la doxorubicine à 24 mg/kg.DExpression de l'ARNm de Murf1 dans le myocarde de souris C57BL/6J une semaine après le début d'un traitement par 24 mg/kg de doxorubicine.EExpression de l'ARNm de la NQO1 dans le myocarde de souris C57BL/6J une semaine après le début d'un traitement par la doxorubicine à 24 mg/kg.F) Expression de l'ARNm de BAX dans le myocarde de souris C57BL/6J une semaine après le début d'un traitement à la doxorubicine à 24 mg/kg. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du test de Welch test-t ou le test de Mann-Whitney U, selon la distribution des données. ns, P > 0.05; *P < 0,05 ; **P < 0.01. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Souche de sourisBalb/cC57Bl/6J
Ligne cellulaire utilisée4T1LucPY8119
Quantité de cellules injectées200 000200 000
Sexe utiliséMâle et femelleMâle et femelle
Nombre de jours d'injection46
Dose quotidienne4 mg/kg4 mg/kg
Dose cumulative de doxorubicine16 mg/kg24 mg/kg
Dose de kétamine40 mg/kg80 mg/kg
Incidence de la cardiotoxicité>90%>90%
Taux de survie19/4516/19

Tableau 1 : Paramètres clés du protocole pour chaque souche de souris. Comparaison des principales variables expérimentales et des concentrations de réactifs utilisées dans les protocoles appliqués aux souris de souche Balb/c et C57BL/6J.

Tableau supplémentaire 1 : Critères d'évaluation du bien-être animal. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Aperçu de la littérature sur les protocoles expérimentaux utilisant la lignée 4T1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 3 : Paramètres échocardiographiques mesurés en mode M chez 17 souris C57BL/6J porteuses de tumeurs traitées avec 24 mg/kg de doxorubicine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ici, un modèle de cardiotoxicité induite par la doxorubicine chez des souris porteuses de tumeur mammaire a été développé et est considéré comme fortement pertinent sur le plan clinique pour les futures études en cardio-oncologie. L'objectif était de reproduire la situation clinique du parcours d'un patient, depuis son arrivée à l'hôpital avec un cancer diagnostiqué jusqu'au traitement par une chimiothérapie potentiellement cardiotoxique. Le protocole suit une conception pragmatique et utilise des souris immunocompétentes disponibles dans le monde entier, permettant ainsi à d'autres équipes de le reproduire dans d'autres laboratoires. Son taux élevé de réussite d'implantation tumorale en fait un candidat solide pour de futures études toxicologiques en cardio-oncologie.

Les écueils courants dans ce protocole incluent la réalisation d'une échocardiographie sur des souris présentant une fréquence cardiaque basse, ce qui peut entraîner une fraction d'éjection (FE) artificiellement réduite. Permettre aux souris de se remettre des effets chronotropes négatifs initiaux des anesthésiques avant l'évaluation échocardiographique contribue à garantir des mesures précises de la FE. Chez les souris Balb/c, une réduction supplémentaire de la dose d'anesthésique peut être nécessaire si la mortalité reste élevée. Le même expérimentateur doit effectuer toutes les évaluations échocardiographiques au cours de l'étude, car la variabilité inter-observateur peut être importante43. Pour l'implantation tumorale, retirer la seringue pendant l'injection peut produire une tumeur en forme de ligne, qui pourrait croître davantage que les tumeurs générées par une injection correcte. L'injection dans le bon mamelon mammaire est également essentielle, car un positionnement dans le mamelon abdominal supérieur peut interférer avec l'évaluation échocardiographique lors des stades ultérieurs du développement tumoral. Le comptage manuel des cellules en suspension et un mélange minutieux avant l'injection sont recommandés afin de s'assurer que chaque souris reçoit un nombre comparable de cellules, réduisant ainsi la variabilité de la taille tumorale à la fin du protocole. Lorsque des prélèvements sanguins hebdomadaires sont requis, le volume prélevé doit être soigneusement contrôlé, car les souris deviennent plus fragiles après un traitement à la doxorubicine. Un volume sanguin total maximal de 50 µL à chaque prélèvement est recommandé, car des volumes plus importants peuvent augmenter la mortalité durant le protocole. La fréquence et le volume des prélèvements sanguins doivent également respecter les exigences locales en matière d'éthique animale et les directives de l'installation animale institutionnelle. Le remplacement du volume sanguin prélevé par un volume équivalent de solution saline administrée par voie sous-cutanée peut aider à compenser la perte de liquide après le prélèvement sanguin.

Pour comparer cette procédure à la doxorubicine, une revue récemment publiée sur les modèles animaux de cardiotoxicité induite par les chimiothérapies (AIC) a observé que la majorité des modèles précliniques (88 %) utilisaient des injections répétées de Dox et des mesures des résultats (souvent par échocardiographie) plusieurs semaines plus tard29. La plupart des articles ont signalé l'utilisation de la souche C57Bl/6J (73,8 %), probablement en raison de sa robustesse et de son faible coût29. Malheureusement, un nombre significatif d'études ont négligé l'impact d'une tumeur sur la biologie de l'animal avant l'injection des agents chimiothérapeutiques17,29. Seulement 46 études sur 736 ont décrit des modèles porteurs de tumeurs, dont 12 ont utilisé la lignée cellulaire 4T1 (cancer du sein de type triple négatif) chez des souris Balb/c, et une seule constituait un modèle de cancer du sein chez des souris C57Bl/6J (plus précisément un cancer du sein de type positif pour EGFR2)29. Une autre étude a utilisé des souris C57Bl/6J présentant un cancer du sein de type positif pour EGFR-2, mais n'a pas permis la croissance tumorale avant le début de la chimiothérapie, ce qui limite l'aspect translationnel de ce modèle32.

Les modèles de xénogreffe utilisant des souris immunodéficientes permettent l'utilisation de lignées cellulaires tumorales humaines, mais ils manquent d'un système immunitaire fonctionnel, ce qui limite l'étude des mécanismes de cardiotoxicité immédiate et constitue une limitation majeure compte tenu de l'importance croissante de la cardiotoxicité liée aux inhibiteurs des points de contrôle immunitaire. Les modèles sur grands animaux émergent dans le domaine de la cardio-oncologie, mais ils présenteront toujours les inconvénients d'un coût élevé et de capacités limitées en matière d'ingénierie génétique44. Les systèmes in vitro et les modèles cellulaires humains en 2D/3D (par exemple, les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines, les organoïdes cardiaques) permettent un criblage mécanistique et toxicologique à haut débit, mais ne peuvent pas recréer la physiologie intégrée de l'organisme entier (hémodynamique, régulation neurohormonale, interactions immunitaires) que captent les modèles in vivo. Par rapport à ces approches, ce modèle syngénique, immunocompétent et porteur de tumeur offre un contexte plus cliniquement pertinent pour étudier l'interaction entre la charge tumorale et la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie, au prix d'une variabilité biologique accrue, d'une mortalité plus élevée dans certaines souches et d'un débit inférieur à celui des modèles in vitro plus simples ou des modèles in vivo sans tumeur.

Les modèles de cardiotoxicité sans tumeur, utilisés principalement jusqu'à présent, offrent une forte reproductibilité, un faible coût et des évaluations plus simples de l'échocardiographie et de la survie, mais ne tiennent pas compte des effets systémiques de la charge tumorale, de l'inflammation associée au cancer et de la cachexie sur le cœur, qui sont de plus en plus reconnus comme des facteurs de confusion pertinents dans la cardiotoxicité chez les patients17,45. De plus, le reprogrammation métabolique du cœur, et par conséquent sa fonction contractile, peut être modifiée par des oncométabolites sécrétés, tels que le D-2-hydroxyglutarate ou le succinate14. Par conséquent, si l'on souhaite établir un modèle cardio-oncologique destiné à l'analyse biochimique cardiaque à l'aide de diverses approches « omiques » (protéomique et métabolomique, par exemple), la présence de la tumeur avant la chimiothérapie est essentielle. Des données suggèrent également que la tumeur elle-même peut induire une dysfonction cardiaque manifeste, bien que cette observation ne soit pas constante dans la littérature. Alors que certains modèles ont mis en évidence un effet délétère de l'inoculation tumorale sur la fraction d'éjection (FS) ou sur les paramètres de conduction électrique, d'autres ont montré que la présence de la tumeur protégeait les souris du remodelage induit par une constriction aortique transverse11,13,46. Des animaux sans tumeur sont également nécessaires, selon l'hypothèse préliminaire. Ils constituent le seul contexte dans lequel l'effet cardiotoxique direct de l'agent chimiothérapeutique peut être isolé de l'influence perturbatrice de la tumeur elle-même, condition essentielle pour établir une relation de causalité et élucider les mécanismes d'action spécifiques au médicament. Ces animaux serviront de témoins pour l'effet du traitement anticancéreux et de son interaction avec la tumeur en matière de cardiotoxicité. En l'absence de ce groupe comparateur, il serait impossible de distinguer quelle composante du phénotype cardiaque observé est attribuable au médicament, à la tumeur ou à leur interaction. Cette distinction est cruciale non seulement pour la compréhension mécanistique, mais aussi pour la conception rationnelle de stratégies cardioprotectrices. Il est donc important de reconnaître que chacun de ces modèles répond à des questions scientifiques distinctes et complémentaires, et qu'aucun modèle pris isolément ne suffit à reproduire entièrement la complexité de la cardio-oncologie clinique ; une utilisation combinée ou séquentielle des deux modèles est souvent nécessaire pour tirer des conclusions mécanistiques et translationnelles solides.

Dans ce protocole, la cardiotoxicité a été définie selon les lignes directrices de 2022 de l'ESC en cardio-oncologie, qui définissent une dysfonction cardiaque liée au traitement anticancéreux modérée et asymptomatique par une réduction de la fraction d'éjection du ventricule gauche (FEVG) de >10 %, avec une FEVG comprise entre 40 % et 49 %16. Toutefois, une quantification précise de la FEVG nécessite un module 3D sur l'échographe39. Afin d'éviter une évaluation incorrecte de la fonction cardiaque systolique et de conserver un protocole simple pouvant être mis en œuvre dans des laboratoires utilisant des échographes moins récents, il a été préféré d'utiliser la fraction de raccourcissement (FS) comme marqueur de la dysfonction cardiaque, qui peut être correctement et facilement obtenue par analyse en mode M chez la souris, selon les mêmes critères imposés par l'ESC. En utilisant ce protocole, 90 % des souris survivantes répondent aux critères de cardiotoxicité, ce qui en fait un candidat solide pour de futures études translationnelles. L'effet cardiotoxique de la doxorubicine (Dox) a été confirmé par évaluation macroscopique (diminution du poids cardiaque) chez des souris Balb/c. Aucun groupe témoin sans tumeur chez des souris C57Bl/6 n'a été inclus ici ; par conséquent, aucune comparaison dans cette souche n'est encore disponible. De plus, chez des souris C57Bl/6 non porteuses de tumeur, la dose de Dox a induit des modifications conformes à la littérature précédente sur les mécanismes de la cardiotoxicité des anthracyclines : augmentation de l'atrophie, du stress oxydatif et de l'apoptose19,20.

Cependant, des variables plus récentes utilisées chez les patients, telles que la déformation longitudinale globale par suivi de taches (GLS), n'ont pas été quantifiées ici pour des raisons techniques. Si cela est faisable localement, il serait intéressant de quantifier la GLS, car elle est généralement considérée comme plus sensible pour détecter les lésions cardiaques précoces23. Des biomarqueurs cardiaques circulants, tels que la troponine, peuvent également être évalués afin d'améliorer la certitude de la détection d'une cardiotoxicité ; toutefois, la quantité de plasma traditionnellement nécessaire pour ces analyses chez la souris peut constituer un facteur limitant en raison du faible volume sanguin total de ces animaux. De plus, la fragilité de ces animaux après un traitement à la doxorubicine peut augmenter les taux de mortalité pendant ou après le prélèvement sanguin. Un dernier facteur limitant est la sensibilité de ces tests pour de tels biomarqueurs, ce qui peut souvent entraver l'interprétation.

Bien que le même expérimentateur expérimenté ait effectué toutes les acquisitions échographiques, une forte variation d'une semaine à l'autre a été observée chez les souris Balb/c identiques, même sans traitement. Ceci peut s'expliquer par la sensibilité de cette souche à l'anesthésie au kétagène47. En effet, des taux de mortalité élevés pendant les procédures sous anesthésie, entraînant un faible nombre d'animaux atteignant la fin du protocole, ont été initialement constatés, ce qui a conduit à réduire la dose de kétagène utilisée, passant de 80 mg/kg à 40 mg/kg pour les souris Balb/c. En examinant les courbes de survie des souris Balb/c traitées au Dox, on observe que certains décès surviennent au moment de l'anesthésie (échocardiographie hebdomadaire), mais que la majorité des décès surviennent dans l'élevage, sans procédure active, soulignant que le Dox est le principal facteur de mortalité chez ces souris. Néanmoins, il est important de garder à l'esprit la mortalité liée à l'anesthésie lors de l'interprétation des courbes de survie pour ce modèle, notamment lors de la comparaison de deux souches ou plus. Pour réduire le risque de décès lié à l'anesthésie, on pourrait également réaliser l'échocardiographie sur des souris éveillées, mais cela nécessite un entraînement et une acclimatation préalables avant l'inclusion des souris dans le protocole. En ce qui concerne le Dox, même à doses réduites, près de la moitié des souris Balb/c n'ont pas atteint la fin du protocole. L'induction de cardiotoxicité avec des doses encore plus faibles de Dox pourrait être tentée, au risque de réduire le nombre d'animaux remplissant les critères de cardiotoxicité. Une autre stratégie pourrait consister à laisser plus de temps aux animaux pour récupérer après chaque injection de Dox, ce qui n'a pas été fait ici, mais qui est soutenu par des preuves dans la littérature29.

Les observations faites lors de la construction de ce modèle, selon lesquelles les souris Balb/c sont plus sensibles à la doxorubicine que les souris C57Bl/6J, et que les femelles sont plus résistantes à la doxorubicine que les mâles, sont en accord avec la littérature antérieure29. De plus, les résultats similaires et reproductibles obtenus chez les deux souches de souris confirment davantage la robustesse de ce modèle proposé. En atteignant des doses cumulées élevées grâce à des doses quotidiennes modérément élevées sur une courte période, des taux élevés de cardiotoxicité associés à une forte survie ont été obtenus. La mise en place d'un modèle de cancer du sein (PY8119 est un cancer du sein de type triple négatif) chez des souris C57Bl/6J sera très utile pour des études ultérieures, car ces souris représentent l'un des principaux fonds génétiques pour les modèles transgéniques34. Le taux de réussite élevé des inoculations tumorales, qui témoigne de l'efficacité de la méthode d'injection choisie, est également prometteur pour ce modèle. En outre, la forte tolérance à la doxorubicine de ces souris ouvre la voie à des études plus longues avec des réadministrations de doxorubicine, permettant de reproduire la situation clinique fréquente d'un cancer secondaire ou de métastases. Enfin, le protocole de prélèvement d'organes permet la collecte de tous les organes solides, des tumeurs et de leur liquide interstitiel, ainsi que de la moelle osseuse et de son stroma, ce qui autorise une analyse très approfondie du modèle.

Ce modèle présente certaines limites. En raison de sa conception pragmatique et afin d'éviter une chirurgie invasive, l'emplacement précis de la tumeur (c'est-à-dire la glande mammaire correcte plutôt que la graisse sous-cutanée) ne peut pas être contrôlé avec précision par une injection sous-cutanée, ce qui peut être très important selon la question scientifique étudiée48. Si une injection au site cancéreux précis est nécessaire, une chirurgie plus étendue pourrait être plus adaptée pour réaliser une injection orthotopique, bien que cela ne semble réellement important que si une analyse biochimique de la tumeur est prévue, puisque le volume, la latence et l'incidence donnent des résultats similaires quelle que soit la méthode d'injection48. On pourrait également faire valoir que l'utilisation exclusive d'ACs ne reflète pas parfaitement la situation clinique, où les patients reçoivent souvent des régimes combinés, par exemple du cyclophosphamide ou du cisplatine. Cela pourrait effectivement constituer la prochaine étape dans l'amélioration de ce protocole ; toutefois, l'adaptation de la dose pour chaque chimiothérapie utilisée devrait être soigneusement réalisée. Par ailleurs, un taux de mortalité supérieur à 50 % chez les souris Balb/c trois semaines après le début du traitement par la Dox reste très élevé ; une réduction de la dose pourrait améliorer la survie, peut-être au détriment d'une cardiotoxicité moins marquée. En outre, concernant les doses utilisées dans ce modèle, il convient de noter qu'elles sont plus élevées que celles couramment utilisées chez l'humain aujourd'hui, ce qui pourrait limiter le potentiel translationnel de ce modèle.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts concernant le manuscrit.

Remerciements

Nous remercions l'équipe de l'établissement animalier pour son aide dans la surveillance quotidienne du bien-être animal. Nous remercions Léanne Borges, Elias Ait Assa et Clémence Chabaud pour leur aide dans l'élaboration du protocole animal. Nous remercions chaleureusement le Dr Julie Helft de l'unité Inserm 932 pour le don des cellules PY8119. Remerciements particuliers au Dr Sylvain Provost et à son étudiante Mel Gavens pour leur aide concernant la bioluminescence.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules 4T1LucATCCCRL-2539
Poudre de doxorubicineCliniscience23214-92-8
ÉchographeVisual SonicsVEVO LT-200
LuciférinePerkin Elmer E1605
Maille en nylonMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
Cellules PY8119Don du Dr Julie Helft

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