Protocole pour l’évaluation standardisée de la fonction microvasculaire systémique dans la microcirculation cutanée humaine utilisant l’imagerie par contraste de speckles au laser

Summary

Ce protocole décrit une méthode standardisée et non invasive pour évaluer la fonction microvasculaire systémique dans la microcirculation cutanée humaine en utilisant l’imagerie par contraste de taches laser combinée à l’iontophorèse pharmacologique et aux stimuli physiologiques pour évaluer la réactivité microvasculaire en milieu de recherche clinique.

Abstract

L’imagerie par contraste de taches laser (LSCI) est une technique optique à haute résolution et non invasive qui permet la visualisation en temps réel et sur champ complet de la perfusion sanguine microvasculaire. Ce protocole présente une méthodologie standardisée pour évaluer la fonction microvasculaire systémique dans la microcirculation cutanée humaine à l’aide de l’ICL. Parce que les mesures obtenues avec cette technique sont très sensibles aux facteurs de confusion environnementaux et physiologiques, le protocole met l’accent sur des procédures de normalisation strictes afin d’améliorer la reproductibilité et la fiabilité expérimentale. Le protocole détaille les contrôles environnementaux essentiels, notamment la stabilisation à température ambiante à 23°C ± 1°C, le positionnement des participants, les procédures d’acclimatation et la minimisation des interférences extérieures lors de l’acquisition de l’image. La méthodologie intègre les LSCI à deux manœuvres provocatrices complémentaires pour évaluer la réactivité microvasculaire cutanée. L’hyperémie réactive post-occlusive est utilisée pour évaluer la réactivité microvasculaire intégrée, tandis que les défis pharmacologiques liés à l’iontophorèse sont utilisés pour évaluer la fonction endothéliale. Plus précisément, l’acétylcholine est administrée pour évaluer la vasodilatation dépendante de l’endothélium, et le nitroprusside sodique est administré pour évaluer la vasodilatation endothélium-indépendante. Ce protocole visualisé étape par étape vise à faciliter l’adoption de méthodologies LSCI standardisées dans les milieux de recherche clinique et translationnelle. Cette approche a été appliquée avec succès pour identifier les insuffisances microvasculaires dans plusieurs affections cliniques, notamment l’hypertension résistante, le diabète et la maladie coronarienne. En permettant une évaluation reproductible et non invasive de la réactivité microvasculaire, cette méthodologie constitue un outil précieux pour étudier la santé vasculaire systémique, surveiller la progression de la maladie et évaluer l’efficacité des interventions ciblant la microvascularisation.

Introduction

L’objectif principal de ce protocole est de fournir une méthodologie standardisée et reproductible pour évaluer la fonction microvasculaire systémique et la réactivité à l’aide de l’imagerie à contraste au laser (LSCI) couplée à des manœuvres physiologiques et pharmacologiques provocantes. La microcirculation, composée de vaisseaux sanguins terminaux — artérioles, capillaires et venules — d’environ 100 μm de^{diamètre 1}, constitue le principal site d’échange métabolique et un déterminant critique de la résistance vasculaire^{périphérique 2}. Le dysfonctionnement endothélial de ces petits vaisseaux précède souvent les altérations macrovasculaires et constitue un biomarqueur précoce des maladies cardiovasculaires, notamment l’hypertension, le diabète et la maladie^{coronarienne 3}. Il est important de noter que, bien que l’altération microvasculaire contribue significativement aux dommages aux organes finaux, elle agit en conjonction avec l’athérosclérose macrovasculaire et l’inflammation chronique systémique au sein d’un processus pathologique multifactoriel. Par conséquent, l’évaluation non invasive de la réactivité microvasculaire est essentielle tant pour un diagnostic précoce que pour le suivi de l’efficacité thérapeutique en recherche^{translationnelle 4}.

La raison d’être de l’utilisation de la microcirculation cutanée comme substitut de la santé vasculaire systémique réside dans son accessibilité et son rôle de fenêtre représentative sur la fonction endothéliale^{mondiale 5,6}. Traditionnellement, la fluidométrie Doppler au laser (LDF) est considérée comme la référence pour l’évaluation cutanée^{non invasive 7}. Cependant, la LDF est limitée par une faible résolution spatiale car elle fournit des mesures ponctuelles très sensibles à l’hétérogénéité inhérente de la perfusion^{cutanée 8}. En revanche, le LSCI offre des avantages significatifs en fournissant une visualisation en temps réel et en champ complet de la perfusion tissulaire avec une haute résolution temporelle^{et spatiale 9}. En analysant le motif d’interférence généré par la diffusion de la lumière laser, le LSCI permet une évaluation simultanée de plusieurs régions vasculaires sans nécessiter de contact physique ni de colorants^{exogènes 10,11}.

Dans la littérature plus large, l’intégration des LSCI avec des provocations pharmacologiques entraînées par l’iontophorèse, telles que l’acétylcholine (ACh) et le nitroprusside sodique (SNP), a été validée comme une approche robuste pour évaluer les voies vasodilatatoires dépendantes et indépendantes de l’endothélium^12,13. De plus, l’hyperémie réactive post-occlusive (PORH) offre une évaluation intégrée de la réactivité microvasculaire impliquant les médiateurs endothéliaux, les nerfs sensoriels neurogènes et la fonction du muscle lisse^{vasculaire 12}. Malgré ses avantages, la grande sensibilité des LSCI à la variabilité environnementale et physiologique nécessite des procédures de normalisation strictes. Ce protocole répond à ces défis en détaillant des contrôles environnementaux critiques, incluant la stabilisation à température ambiante à 23°C ± 1°C et le positionnement standardisé des participants, afin d’améliorer la reproductibilité intrasujet et^{intersujet 10}. Cette méthodologie convient aux chercheurs cliniques et translationnels recherchant une approche méthodologiquement fondée et non invasive pour étudier la physiopathologie microvasculaire à travers des populations de patients diverses.

Protocol

Toutes les interventions impliquant des participants humains ont été réalisées conformément aux normes éthiques de l’Institut National de Cardiologie (Ministère de la Santé, Brésil), en conformité avec les réglementations nationales (Comité national d’éthique pour la recherche – INAEP – conformément à la Loi n° 14 874, mai 2024) et à la Déclaration d’Helsinki (révisée en 2024).

1. Préparation des participants et contrôle environnemental

1. Stabiliser l’environnement d’examen
   1. Stabiliser la température de la salle d’examen (RT ; 23°C ± 1°C) à l’aide d’un thermostat dédié pour maintenir un environnement thermique stable.
   2. Surveillez la RT toutes les 10 minutes à l’aide d’un thermomètre numérique calibré (précision de ±0,1°C).
      REMARQUE : La fonction microvasculaire cutanée est très sensible aux fluctuations de température.
2. Préparez le participant avant l’évaluation
   1. Demandez aux participants de s’abstenir de fumer, de consommer de la caféine ou de l’alcool, et de faire de l’exercice vigoureux pendant 24 heures avant l’évaluation.
   2. Demandez aux participants de jeûner pendant au moins 2 heures avant l’évaluation tout en permettant l’apport en eau.
      REMARQUE : L’abstinence de caféine et un exercice vigoureux minimisent les interférences externes avec le tonus vasculaire cutané. La caféine, en tant qu’antagoniste des récepteurs de l’adénocine, et l’exercice, grâce à des effets sur la pulsion sympathique et la thermorégulation, peuvent induire des altérations soutenues de la réactivité microvasculaire qui persistent pendant plusieurs heures après l’exposition ^4,14.
3. Positionner le participant pour l’acquisition de l’image
   1. Positionnez le bras non dominant du participant au niveau du cœur à l’aide de coussins corporels pour maintenir l’avant-bras dans une position horizontale et stable.
   2. Utilisez la surface ventrale de l’avant-bras comme site d’évaluation.
      REMARQUE : L’avant-bras non dominant minimise l’influence du remodelage vasculaire latéralisé associé aux activités quotidiennes. L’avant-bras ventral offre des caractéristiques anatomiques favorables à l’imagerie optique, notamment une densité de poils plus faible et une épaisseur de peau réduite, minimisant ainsi les artefacts de signaux et améliorant la reproductibilité de l’administration de médicaments iontophorétiques.
4. Permettre la stabilisation cardiovasculaire
   1. Maintenez le participant au repos pendant au moins 20 minutes avant de commencer les enregistrements microvasculaires.
   2. Restreignez le participant de parler, de bouger le membre évalué ou d’utiliser des appareils électroniques pendant la période de repos.
      REMARQUE : La période de stabilisation minimise les fluctuations autonomes et cardiovasculaires avant l’acquisition initiale.
5. Minimiser les artefacts de mouvement
   1. Placez l’avant-bras non dominant du participant sur un système de coussin sous vide.
   2. Ajustez le coussin pour maintenir la surface ventrale de l’avant-bras dans une position horizontale stable tout au long de l’acquisition de l’image.
6. Préparez la surface de la peau
   1. Sélectionnez les zones de peau sans poils visibles pour toutes les mesures.
   2. Enlever les poils à l’aide d’une tondeuse chirurgicale 24 heures avant l’évaluation, si nécessaire.
      ATTENTION : N’utilisez pas de rasoir pour l’épilation, car une irritation cutanée pourrait interférer avec les mesures microvasculaires.
7. Mesurer la tension artérielle
   1. Sélectionnez la taille des poignets en fonction du tour du bras du participant.
   2. Effectuez trois mesures consécutives de la pression artérielle à l’aide d’un dispositif oscillométrique automatisé calibré, avec un intervalle de 1 minute entre les mesures.
   3. Écartez la première mesure et calculez la moyenne des deux dernières mesures pour déterminer la pression artérielle moyenne (MAP), selon les directives cardiovasculaires ESC/ESH et AHA.

2. Configuration du système LSCI et logiciel

1. Préparez le système LSCI
   1. Allumez le système LSCI au moins 10 minutes avant l’acquisition de l’image pour permettre la stabilisation de la source laser.
   2. Vérifiez la stabilisation laser à l’aide de l’indicateur d’état logiciel avant de commencer l’enregistrement.
2. Positionnez la tête laser
   1. Positionnez la tête laser directement au-dessus de l’avant-bras du participant.
   2. Ajustez la tête laser à une distance exacte de 15 cm de la surface de la peau à l’aide de l’outil de mesure de distance fourni par le fabricant (Figure 1A)
      REMARQUE : Maintenir une distance d’acquisition fixe garantit une mise au point optimale de l’image et un champ de vision cohérent entre les participants.
3. Configurez le logiciel d’acquisition
   1. Lance le logiciel d’acquisition d’images et crée un nouveau fichier d’étude.
   2. Entrez les informations démographiques du participant et la MAP précédemment calculée.
      REMARQUE : Incluez des instructions détaillées de fonctionnement du logiciel et des captures d’écran représentatives comme matériel complémentaire lorsque cela est pertinent.
4. Configurez les paramètres d’acquisition
   1. Réglez la fréquence d’échantillonnage d’acquisition à 1 image/s (1 Hz).
   2. Ajustez la résolution spatiale à environ 0,1 mm/pixel pour la zone d’acquisition de la cible.
      REMARQUE : Une fréquence d’échantillonnage de 1 Hz offre un équilibre approprié entre la résolution temporelle et le rapport signal/bruit tout en capturant adéquatement la cinétique hyperémique et pharmacologique de la réponse.
5. Minimiser les interférences de lumière ambiante
   1. Effectuer une vérification du bruit de fond ou une soustraction d’images sombres selon les exigences du système avant l’acquisition de l’image.
   2. Tamisez les lumières de la pièce et bloquez la lumière extérieure du soleil à l’aide de rideaux occultants lors de tous les enregistrements lorsque la soustraction par l’image sombre n’est pas disponible.
      REMARQUE : L’éclairage ambiant standardisé minimise les interférences optiques et améliore la reproductibilité du signal.
6. Définir les régions d’intérêt (ROI)
   1. Créez au moins trois ROI circulaires d’environ 80^mm2 sur l’écran de prévisualisation en direct dans le logiciel d’acquisition.
   2. Positionnez deux ROI sur les sites d’électrodes d’iontophorèse et un ROI sur le site d’évaluation du PORH.
   3. Placez tous les ROI sur l’avant-bras ventral à environ 5 cm de distal de la fosse antécubitale tout en évitant les veines superficielles visibles.
      REMARQUE : La standardisation de la zone ROI minimise l’influence de l’hétérogénéité spatiale dans la perfusion cutanée et réduit les artefacts de bord associés aux chambres de délivrance de médicaments.
7. Acquérez l’enregistrement de perfusion de base
   1. Enregistrer une perfusion sanguine cutanée au repos continue pendant 5 minutes avant la stimulation vasculaire.
   2. Surveillez le signal de perfusion en temps réel et confirmez l’absence de pics induits par le mouvement lors de l’acquisition de base.
   3. Définissez la stabilité de base comme une variation du signal de perfusion de <10 % pendant un intervalle continu de 2 minutes.
8. Permettre l’analyse de conductance vasculaire cutanée (CVC)
   1. Saisissez la MAP du participant dans le logiciel d’acquisition.
   2. Activez le calcul automatique de CVC dans les paramètres du logiciel.
9. Enregistrer les données de perfusion et de conductance
   1. Configurez le logiciel pour qu’il calcule automatiquement la CVC en divisant les valeurs de perfusion en temps réel (APU) par la MAP.
   2. Enregistrer simultanément les deux unités de perfusion brutes (PU) et les valeurs CVC calculées tout au long du protocole.
      
      REMARQUE : L’expression de la perfusion microvasculaire sous forme de CVC minimise l’influence confuse des fluctuations systémiques de la pression artérielle et permet des comparaisons plus fiables entre participants ayant des profils hémodynamiques différents.

Figure 1. Installation expérimentale pour l’évaluation de la perfusion microvasculaire cutanée utilisant l’imagerie laser par contraste de speckles (LSCI) combinée à l’iontophorèse. (A) Installation expérimentale représentative utilisée pour l’évaluation microvasculaire cutanée utilisant l’imagerie par contraste de speckles au laser et l’iontophorèse des agents vasodilatateurs. (B) Réponse représentative à la perfusion microvasculaire lors de la délivrance transdermique iontophorétique de doses cumulatives d’acétylcholine (ACh). (C) Image représentative de l’iontophorèse ACh. (D) Image représentative d’une électrode de commande contenant un véhicule. Les labels indiquent les composants suivants : (1) tête d’imagerie ; (2) électrodes de délivrance de médicaments à l’iontophorèse ; et (3) électrode dispersive. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Iontophorèse et provocation pharmacologique

1. Préparez la peau à l’iontophorèse
   1. Nettoyez les zones cutanées ventrales sélectionnées à l’aide d’une solution saline sans alcool ou d’un doux nettoyant pour la peau.
   2. Séchez doucement la peau avant de placer les électrodes.
      REMARQUE : Évitez une stimulation mécanique excessive lors de la préparation de la peau, car la vasodilatation induite mécaniquement peut interférer avec les mesures de base.
2. Positionner les électrodes de délivrance du médicament
   1. Fixez deux électrodes d’administration du médicament aux sites cutanés préparés à l’aide de disques adhésifs double face (Figure 1A).
   2. Maintenir une distance inter-électrodes d’environ 5 cm pour éviter les interférences de courant électrique.
3. Préparez la solution ACh
   1. Remplir la première chambre d’électrodes avec 200 μL d’une solution à 2 % d’ACh préparée dans une solution^14,15 % de solution à 0,9 ^%.
   2. Utilisez l’électrode ACh pour évaluer la vasodilatation dépendante de l’endothélium.
      REMARQUE : La concentration sélectionnée du médicament a été optimisée pour induire une réponse microvasculaire doso-dépendante robuste tout en minimisant l’irritation non spécifique et les artefacts galvaniques.
4. Préparer la solution SNP
   1. Remplir la seconde chambre d’électrodes avec 200 μL d’une solution SNP à 2 % préparée dans une solution de solution saline à 0,9 %.
   2. Utilisez l’électrode SNP pour évaluer la vasodilatation endothélium-indépendante.
      ATTENTION : SNP est sensible à la lumière. Protégez la solution de l’exposition à la lumière à l’aide de papier aluminium et utilisez la solution dans les 4 heures suivant la préparation pour maintenir la stabilité pharmacologique.
      REMARQUE : La concentration sélectionnée de SNP facilite une vasodilatation stable au plateau tout en minimisant les effets électriques non spécifiques.
5. Enlever les bulles d’air piégées
   1. Inspectez les chambres d’électrodes pour détecter des bulles d’air piégées avant l’attache de la peau.
   2. Éliminez les bulles d’air visibles en tapotant doucement la chambre d’électrodes ou en utilisant une pointe de seringue en plastique stérile.
      REMARQUE : Les bulles d’air peuvent obstruer le flux de courant et provoquer une délivrance non homogène de médicaments.
6. Positionnez l’électrode de référence
   1. Fixez l’électrode de référence (neutre) à environ 15 cm proximal des électrodes de délivrance du médicament à l’aide d’un gel conducteur ou d’un adhésif (Figure 1A).
   2. Confirmez le contact stable des électrodes avant d’initier l’iontophorèse.
      REMARQUE : La séparation spatiale entre les régions pharmacologiques et celles d’évaluation PORH minimise les interactions de confusion et évite le chevauchement de l’éruption axonique réflexe induite par l’ACh avec la zone de mesure du PORH.
7. Connecter le système d’iontophorèse
   1. Connectez toutes les électrodes à l’unité de délivrance de l’iontophorèse avant l’application actuelle.
   2. Confirmez la polarité de l’électrode avant de commencer le protocole (anodale pour ACh ; cathodal pour SNP).
      ATTENTION : Une polarité incorrecte de l’électrode peut altuer l’efficacité de l’administration du médicament et modifier les réponses vasculaires.
8. Administrez le protocole actuel d’iontophorèse
   1. Administrez six doses incrémentales de courant de 30, 60, 90, 120, 150 et 180 μA pour les deux agents pharmacologiques.
   2. Appliquer chaque dose actuelle pendant 10 s.
      REMARQUE : Le protocole de courant incrémental permet de construire une courbe dose-réponse et facilite l’évaluation de la sensibilité microvasculaire et des réponses au^{plateau 11}. La combinaison de faibles amplitudes de courant et d’intervalles de stimulation courts minimise la vasodilatation galvanique non spécifique.
9. Maintenez l’intervalle entre les stimulations
   1. Maintenir un intervalle de 60 s entre les applications consécutives de courant.
   2. Surveillez le signal de perfusion pendant la période de stabilisation entre les doses.
      REMARQUE : L’intervalle sélectionné permet de stabiliser la réponse microvasculaire tout en maintenant une administration locale du médicament sans effets systémiques.
10. Enregistrez la réponse microvasculaire
    1. Enregistrez en continu le signal de perfusion microvasculaire tout au long de toutes les stimulations de l’iontophorèse.
    2. Poursuivez l’enregistrement pendant au moins 10 minutes après la dernière application courante pour capturer la réponse maximale au plateau. Une réponse représentative dépendante de la dose est présentée à la Figure 2A.

Figure 2. Enregistrements représentatifs de la perfusion microvasculaire cutanée lors de l’iontophorèse et de l’hyperémie réactive post-occlusive (PORH). (A) Enregistrement représentatif du flux sanguin microvasculaire cutané obtenu à l’aide de LSCI lors de l’iontophorèse de 2 % d’ACh délivré par des courants anodaux croissants de 30, 60, 90, 120, 150 et 180 μA pour des intervalles de 10 s séparés de 1 min. (B) Enregistrement représentatif obtenu lors de l’évaluation du PORH. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Hyperémie réactive post-occlusive (PORH)

1. Positionnez le brassard d’occlusion
   1. Placez un brassard pneumatique standard (largeur d’environ 12 cm) sur le bras supérieur du même membre utilisé pour l’enregistrement LSCI.
   2. Placez le brassard proximal du site d’évaluation microvasculaire sélectionné.
2. Définir la région d’évaluation PORH
   1. Créer un troisième ROI sur l’avant-bras ventral, adjacent aux sites de l’électrode d’iontophorèse.
   2. Placez le ROI dans une zone cutanée sans traitement pour éviter toute interférence pharmacologique.
      REMARQUE : Maintenir la séparation spatiale entre les sites de stimulation pharmacologique et la région d’évaluation du PORH afin de préserver les réponses vasculaires indépendantes.
3. Acquérir l’enregistrement de base PORH
   1. Enregistrer une perfusion cutanée au repos continue pendant 5 minutes avant l’occlusion artérielle.
   2. Surveillez le signal de perfusion de base pour confirmer la stabilité du signal avant le gonflage de la brassette.
4. Induire une occlusion artérielle
   1. Gonflez rapidement le brassard pneumatique en < 5 secondes à l’aide d’un gonfleur automatique ou d’une ampoule de gonflage manuelle.
   2. Augmenter la pression du brassard à 50 mmHg au-dessus de la pression systolique (SBP) précédemment mesurée par le participant.
      ATTENTION : Confirmez l’occlusion artérielle complète avant d’initier la période d’occlusion car une occlusion incomplète peut compromettre la réponse hyperémique.
5. Maintenir la période d’occlusion
   1. Maintenez l’occlusion artérielle en continu pendant exactement 3 minutes.
   2. Vérifiez l’occlusion complète en confirmant que le signal LSCI diminue jusqu’à un plateau biologique zéro (< 10 APU).
      REMARQUE : Le signal biologique zéro reflète le mouvement résiduel des cellules sanguines indépendant du flux sanguin dirigé, y compris le mouvement brownien.
6. Relâchez le brassard d’occlusion
   1. Relâchez instantanément la pression du brassard à l’aide de la valve d’échappement rapide.
   2. Permettre une restauration immédiate du flux sanguin pour déclencher la réponse hyperémique réactive.
7. Enregistrer la réponse hyperémique
   1. Continuez l’enregistrement LSCI pendant au moins 5 minutes après la libération de la manche.
   2. Capturez la réponse de perfusion maximale et le retour ultérieur vers les niveaux de perfusion de base. Une réponse représentative du PORH est représentée à la Figure 2B.
8. Quantifier la réponse PORH
   1. Calculez le pic de CVC dans le logiciel d’acquisition d’images.
   2. Calculez l’aire sous la courbe (AUC) du signal de réponse hyperémique à l’aide du logiciel d’analyse.

5. Extraction de données et analyse statistique

1. Ouvrez et vérifiez les données enregistrées
   1. Ouvrez les fichiers d’acquisition enregistrés avec le logiciel d’analyse d’images.
   2. Vérifiez que tous les ROI prédéfinis restent correctement positionnés sur les sites de mesure correspondants.
      REMARQUE : Repositionner les ROI uniquement lorsque les artefacts de mouvement ou la dérive d’acquisition compromettent le placement initial.
2. Définissez les intervalles d’analyse
   1. Identifier les intervalles d’analyse spécifiques sur les graphiques de tendance de perfusion et CVC.
   2. Sélectionnez un intervalle de base continu de 60 s immédiatement avant le premier stimulus vasculaire.
   3. Sélectionnez les 30 derniers s de chaque intervalle de 60 s après la stimulation de l’iontophorèse pour capturer la réponse microvasculaire du plateau.
      REMARQUE : Définir la stabilité de base comme un coefficient de variation (CV) < 5 % dans le signal de perfusion afin de minimiser l’influence des oscillations vasomotrices et des artefacts de mouvement avant l’analyse des données.
3. Identifier les variables de réponse PORH
   1. Identifier le signal biologique zéro pendant la phase d’occlusion artérielle du protocole PORH.
   2. Identifiez la valeur maximale du CVC immédiatement après la libération de la coiffe.
4. Calculer les valeurs moyennes des intervalles
   1. Calculez la valeur moyenne CVC pour chaque intervalle d’analyse prédéfini à l’aide du logiciel d’analyse d’image.
   2. Vérifiez l’absence d’artefacts de mouvement avant de confirmer les valeurs finales calculées.
5. Organiser les données extraites
   1. Exportez ou transcrivez manuellement les valeurs brutes moyennes de PU et CVC dans un tableau structuré.
   2. Organiser le jeu de données selon les groupes d’étude et les stimuli vasculaires, y compris l’acétylcholine, le nitroprusside sodique et les réponses au PORH.
      REMARQUE : Maintenir une cohérence des noms de fichiers et des codes d’identification des participants tout au long du traitement des données afin de minimiser les erreurs de transcription.
6. Calculer les résultats vasculaires secondaires
   1. Calculer le pourcentage d’augmentation par rapport aux valeurs de perfusion ou CVC de base pour déterminer la réactivité vasculaire.
   2. Calculer l’AUC lorsque nécessaire pour l’analyse du point final secondaire.
7. Effectuer une analyse statistique
   1. Analysez les données à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique.
      REMARQUE : Inclure des captures d’écran représentatives ou des instructions de flux de travail pour les analyses logicielles comme matériel complémentaire lorsque cela est pertinent.
   2. Évaluer la distribution des données
      1. Évaluer la normalité des données à l’aide du test de Shapiro-Wilk.
      2. Exprimez les données distribuées normalement en moyenne ± écart-type (DE).
      3. Exprimez les données anormalement distribuées sous forme de médiane et d’intervalle interquartile (IQR).
   3. Comparer les réponses microvasculaires
      1. Comparez les ensembles de données à deux groupes à l’aide d’un test t indépendant lorsque les hypothèses de normalité sont satisfaites.
      2. Comparez plusieurs groupes en utilisant l’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Tukey.
   4. Définir les critères de signification statistique
      1. Définissez la signification statistique comme p < 0,05.
      2. Gérer les données manquantes causées par des artefacts de mouvement en utilisant la suppression ou l’exclusion par paires de l’analyse concernée.
         REMARQUE : Appliquer la même stratégie de données manquantes de manière cohérente à tous les groupes d’étude afin de préserver l’intégrité analytique.

Results

Une application réussie de ce protocole permet d’obtenir une base de base stable suivie de réponses microvasculaires claires et distinctes à chaque stimulus vasculaire. Dans une expérience techniquement réussie, l’enregistrement de base démontre un signal de perfusion stable avec des fluctuations minimales, défini comme un DE de < 10 % du signal moyen. Lors de l’iontophorèse de l’ACh et du SNP, une augmentation progressive de l’APU est attendue, reflétant une vasodilatation dépendante de la dose. Une réponse PORH réussie se caractérise par une réduction rapide de la perfusion vers un zéro biologique stable lors de l’occlusion artérielle, suivie d’un pic hyperémique brusque immédiatement après la libération de la manche, atteignant généralement des valeurs plusieurs fois supérieures aux niveaux de base chez les sujets sains. La figure 1A illustre le dispositif expérimental utilisé pour l’évaluation microvasculaire cutanée utilisant LSCI et iontophorèse. Les figures 1B–1D montrent des réponses représentatives à l’iontophorèse et le positionnement des électrodes. La figure 2A présente une réponse microvasculaire représentative et doso-dépendante lors de l’iontophorèse ACh, tandis que la figure 2B montre une réponse représentative de PORH.

Les enregistrements sous-optimaux ou techniquement infructueux sont souvent caractérisés par une instabilité du signal ou des artefacts liés au mouvement. Des pics de haute fréquence ou des fluctuations brusques de la ligne de base indiquent généralement un mouvement des participants ou une stabilisation insuffisante du système de soutien sous vide. Une réponse vasodilatatrice réduite ou absente lors de l’iontophorèse chez un participant autrement en bonne santé indique souvent un mauvais contact électrode-peau ou des bulles d’air piégées dans la chambre d’électrodes, entraînant une altération de la distribution de courant électrique. La figure 3 présente un exemple représentatif d’un enregistrement inacceptable caractérisé par une instabilité du signal liée au mouvement.

Figure 3. Exemple représentatif d’un enregistrement inacceptable de perfusion microvasculaire lors de l’iontophorèse. Enregistrement représentatif du flux sanguin microvasculaire cutané obtenu à l’aide de LSCI lors de l’iontophorèse ACh, démontrant l’instabilité du signal et les artefacts liés au mouvement inadaptés à une analyse quantitative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

L’échec à atteindre un zéro biologique stable pendant la phase d’occlusion PORH indique une occlusion artérielle incomplète, souvent causée par un positionnement incorrect de la manche ou une pression de gonflage insuffisante. Dans ces conditions, la réponse hyperémique qui suit devient atténuée et inadaptée à une interprétation fiable.

Les protocoles exécutés avec succès génèrent des courbes de perfusion reproductibles et CVC. Le plateau maximal du CVC observé lors de l’iontophorèse SNP reflète la capacité vasodilatoire totale et l’intégrité structurelle vasculaire, tandis que la réponse médiée par ACh reflète principalement une fonction microvasculaire endothéliale dépendante. La comparaison standardisée de ces réponses vasculaires permet de différencier les schémas compatibles avec une fonction microvasculaire préservée et altérée. Des paramètres microvasculaires quantitatifs représentatifs obtenus chez des sujets jeunes en bonne santé et des patients présentant une hypertension artérielle résistante sont présentés dans le tableau 1.

Paramètre microvasculaire	Unité	Contrôles jeunes en bonne santé (n = 25)	Patients atteints d’hypertension artérielle résistante (n = 50)	valeur p
CVC de référence	APU/mmHg	0,37 ± 0,13	0,29 ± 0,12	0.01
Crête CVC induite par l’ACh	APU/mmHg	0,67 ± 0,23	0,51 ± 0,19	0.004
Crête CVC induite par SNP	APU/mmHg	0,60 ± 0,21	0,41 ± 0,17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0,87 ± 0,18	0,60 ± 0,16	< 0,0001

Tableau 1 : Paramètres représentatifs de la réactivité microvasculaire chez les jeunes sujets en bonne santé et les patients présentant une hypertension artérielle résistante. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart-type (DE). Les valeurs p ont été calculées à l’aide d’un test t indépendant pour les comparaisons entre groupes. Abréviations : ACh, acétylcholine ; SNP, nitroprusside sodique ; PORH, hyperémie réactive post-oclusive ; CVC, conductance vasculaire cutanée ; APU, unités de perfusion arbitraires. Les données représentent des résultats non publiés du laboratoire des auteurs.

Discussion

L’ICS propose une approche standardisée et non invasive pour évaluer la fonction microvasculaire systémique avec une haute résolution spatiale et temporelle. Comparé au LDF, qui est limité à des mesures en point unique et très sensible à l’hétérogénéité spatiale de la perfusion cutanée, le LSCI permet l’imagerie en champ complet et l’évaluation simultanée de multiples ROI. Cette caractéristique améliore considérablement la reproductibilité des mesures et réduit le coefficient de variation dans les études microvasculaires cliniques. De plus, la nature sans contact des LSCI minimise les artefacts de pression locale couramment associés aux techniques basées sur la sonde, améliorant ainsi son adéquation pour des évaluations répétées en milieu de recherche translationnelle et clinique.

Un élément critique de ce protocole est la normalisation des données de perfusion en MAP pour calculer la CVC. Parce que la perfusion sanguine cutanée est fortement influencée par la pression systémique de perfusion, l’interprétation seule de l’APU brute peut entraîner une confusion significative, en particulier chez les populations présentant des profils hémodynamiques modifiés tels que l’hypertension ou la dyslipidémie. Pour cette raison, le protocole recommande de rapporter à la fois les valeurs de PU brute et les valeurs normalisées de CVC afin d’améliorer l’interprétation de la fonction microvasculaire sous différentes conditions physiologiques et pathologiques. Un autre aspect crucial du protocole est la stabilisation stricte de l’environnement et des participants, incluant le contrôle de la température ambiante, la minimisation des artefacts de mouvement et la positionnement standardisé des participants, autant d’éléments essentiels pour obtenir des enregistrements reproductibles.

Plusieurs limitations de la LSCI doivent également être prises en compte. La technique évalue principalement la microcirculation cutanée superficielle à une profondeur d’environ 0,5 à 1 mm et peut donc ne pas représenter entièrement des lits vasculaires plus profonds. De plus, la pigmentation de la peau et les interférences lumineuses ambiantes peuvent affecter le rapport signal/bruit, renforçant l’importance des contrôles environnementaux décrits dans ce protocole. Une autre limitation est l’utilisation d’une seule mesure MAP de référence pour le calcul du CVC tout au long de la procédure. Bien que la pression artérielle systémique puisse fluctuer pendant la période d’enregistrement d’environ 40 minutes, le gonflement répété du brassard a été intentionnellement évité car les mesures récurrentes de la pression artérielle peuvent induire une activation sympathique et des artefacts de mouvement qui interfèrent avec le signal du speckle laser. De futures études intégrant une surveillance hémodynamique continue non invasive pourraient encore améliorer l’interprétation physiologique des mesures de conductance microvasculaire.

Les étapes clés du protocole incluent la stabilisation environnementale, le contrôle du mouvement, le positionnement des électrodes et l’occlusion artérielle complète lors de la PORH. Les enregistrements de base instables sont généralement causés par des mouvements des participants ou des périodes de repos insuffisantes et peuvent être minimisés en restabilisant le système de coussin sous vide et en prolongeant la période d’acclimatation. Des réponses iontophorétiques émoussées indiquent souvent un mauvais contact électrode-peau ou des bulles d’air emprisonnées dans la chambre de distribution ; Un remplissage soigneux de la chambre et un repositionnement des électrodes résolvent généralement ces problèmes. L’échec à atteindre un zéro biologique pendant la phase d’occlusion PORH reflète généralement une occlusion artérielle incomplète causée par un gonflement insuffisant de la coiffe ou une mauvaise positionnement. Dans ces conditions, la réponse hyperémique résultante devient atténuée et inadaptée à une interprétation fiable.

L’intégration des provocations physiologiques et pharmacologiques représente une force majeure de ce protocole car ces approches évaluent les aspects complémentaires de la régulation microvasculaire. Le PORH fournit une évaluation physiologique intégrée de la réactivité microvasculaire impliquant les mécanismes musculaires lisses endothéliaux, neurogéniques et vasculaires déclenchés par une ischémie transitoire et une contrainte de^{cisaillement 16}. En revanche, l’iontophorèse permet une évaluation sélective des voies vasodilatatoires endothéliales dépendantes et endothéliales¹⁵. L’ACh évalue la vasodilatation médiée par l’oxyde nitrique endothélial, tandis que le SNP, donneur direct d’oxyde nitrique, évalue la réactivité du muscle lisse vasculaire indépendamment de la signalisation^{endothéliale 15}. L’interprétation comparative de ces réponses permet de différencier entre l’altération endothéliale fonctionnelle et le remodelage microvasculaire structurel. Cette distinction est particulièrement pertinente dans le vieillissement, l’hypertension résistante, le diabète et les maladies métaboliques chroniques, où une signalisation endothéliale altérée et une raréfaction microvasculaire peuvent^{coexister 14,17}.

En résumé, ce protocole LSCI standardisé fournit une méthode reproductible et pertinente pour la traduction pour l’évaluation non invasive de la santé microvasculaire humaine. La combinaison de l’iontophorèse pharmacologique avec le test physiologique d’ischémie-reperfusion permet une caractérisation détaillée de la fonction endothéliale et vasculaire structurelle tout en minimisant la variabilité expérimentale grâce à une standardisation rigoureuse de l’environnement et de l’hémodynamique. Compte tenu de sa sensibilité à la détection précoce des dysfonctionnements microvasculaires dans divers troubles cardiovasculaires et métaboliques, cette approche représente un outil précieux pour la recherche clinique, le suivi longitudinal et l’évaluation thérapeutique en médecine vasculaire translationnelle.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Équipement
Moniteur BP oscillométrique automatisé	Omron Healthcare	HEM-7120	Utilisé pour l’évaluation de la pression artérielle moyenne (MAP) de base (3 mesures)
Thermomètre numérique calibré	Delta OHM	HD2301.0	Précision & plusmn ; 0,1 & deg ; C pour la surveillance de la température ambiante
Électrode dispersive (de référence)	AB périmé	PF 384	Grande électrode neutre à surface
Électrodes d’administration de médicaments	AB périmé	PF 383 / LI 611	Chambres d’iontophorèse non invasives (environ 80 mm² ;)
Contrôleur de puissance à iontophorèse	AB périmé	Système de diagnostic microvasculaire Periont	Contrôleur de courant à double canal (jusqu’à 200 & micro ; A)
Système d’imagerie par contraste par taches laser (LSCI)	AB périmé	PériCam PSI NR	Imageur de perfusion sanguine haute résolution
Coussin à vide de qualité médicale	AB Germa	N/A	Utilisé pour une position stable de l’avant-bras au niveau du cœur
Pompe à vide à commande manuelle unique	AB Germa	N/A	Utilisé pour l’évacuation des coussins à vide
Gonfleur rapide de manchette	D.E. Hokanson, Inc.	Gonfleur rapide de manchette E20	Utilisé pour l’occlusion artérielle standardisée de 3 minutes
Réactifs et Consommables
Chlorure d’acétylcholine (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Vasodilatateur endothélique dépendant préparé à 2 %
Serviettes de préparation à l’alcool	Becton Dickinson	326895	Compresses à 70 % d’alcool isopropylique pour la préparation de la peau
Eau déionisée	Sigma-Aldrich	38796	Utilisé pour le rinçage final des électrodes
Chlorure de sodium (0,9 % de solution saline)	Fournisseur local	N/A	Solvant pour la préparation de médicaments et le nettoyage de la peau
Nitroprusside de sodium (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Vasodilatateur endothélium indépendant préparé à 2 %
Gaze stérile	Fournisseur local	N/A	Utilisé pour sécher la surface de la peau après nettoyage
Logiciel
Logiciel d’analyse de perfusion	AB périmé	PIMSoft	Logiciels pour l’acquisition de données LSCI et l’analyse du ROI
Logiciels d’analyse statistique	Logiciel GraphPad	Prisme 10	Utilisé pour l’ajustement de la courbe dose-réponse et le calcul de la surface sous la courbe (AUC)