Ce protocole démontre l’ablation transvésicale au laser Ho :YAG pour créer un modèle reproductible chez le rat de la fibrose du cou de la vessie, afin d’étudier le remodelage fibreux induit par une blessure thermique et les interventions thérapeutiques.
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Article de méthode
Induction assistée par laser par holmium YAG de la contracture du cou de la vessie dans un modèle de rat
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La contracture du cou de la vessie (CNB) est un rétrécissement fibreux de la sortie de la vessie et une complication complexe après une résection transurétrale de la prostate (RTUP). Les modèles animaux existants reposent souvent sur la ligature extravésicale ou la cautérisation chimique, qui ne reproduisent pas adéquatement la fibrose causée par une lésion thermique qui se développe après une chirurgie endoscopique et peuvent présenter une reproductibilité limitée. Ici, nous décrivons un modèle de rat de fibrose du cou de la vessie induite par une ablation transvésicale au laser Holmium :YAG (laser Ho :YAG) du col de la vessie. Après une petite laparotomie de la ligne médiane inférieure et une cystotomie, une fibre laser Ho :YAG de 200 μm est introduite dans la lumière de la vessie sous visualisation directe. L’énergie laser est délivrée en mode contact à 1,0 J et 10 Hz pendant 5 s par point aux positions 3 et 9 heures du cou de la vessie, correspondant à 50 J par point et 100 J par animal. Quatre semaines plus tard, les animaux traités présentent un grossissement de la vessie, un rétrécissement du cou de la vessie, un épaississement de la paroi de la vessie, ainsi que des signes histologiques de remodelage fibreux, notamment une augmentation du dépôt de collagène et une expression accrue de collagène de type I et III. Ce protocole fournit un modèle pratique qui imite les cicatrices localisées induites par une blessure thermique à la sortie de la vessie. Comme des rats femelles sont utilisés et que des tests urodynamiques fonctionnels n’ont pas été réalisés dans la présente étude, le modèle est mieux adapté à l’étude de la fibrose du cou de la vessie et du remodelage structurel plutôt qu’à la reproduction complète de BNC masculin après chirurgie prostatique. Le modèle peut être utile pour étudier les mécanismes fibrotiques de la BNC et pour l’évaluation préclinique d’interventions anti-fibrotiques ou reconstructives.
Introduction
La contracture du cou de la vessie (BNC) est un rétrécissement fibreux du cou de la vessie qui survient fréquemment après des procédures transurégraphiques, en particulier la RTUP 1,2,3. Sa base pathologique est la formation excessive de cicatrices et le dépôt de collagène après une lésion tissulaire et une cicatrisation anormale des plaies 4,5,6. Parce que la BNC peut entraîner des dysfonctions persistantes de la vacuité, des interventions récurrentes et une morbidité importante, un modèle expérimental reproductible est nécessaire pour étudier sa pathogenèse et sontraitement 7.
Plusieurs modèles animaux ont été utilisés pour étudier l’obstruction de la sortie de la vessie ou la fibrose péri-urétrale, notamment la ligature extravésicale de l’urètreproximal 8 et d’autres approches chirurgicalesouvertes 9. Bien que ces modèles puissent induire une obstruction urinaire et une hypertrophie détrusive, ils ne reproduisent pas spécifiquement la lésion thermique localisée qui serait supposée initier la BNC postopératoire après une chirurgie endoscopique. De plus, la cible anatomique et le degré de lésion sont souvent difficiles à standardiser, ce qui peut augmenter la variabilité entre les animaux.
Un modèle idéal lié à la CNB doit répondre à trois critères : cibler le cou anatomique de la vessie, reproduire une lésion thermique contrôlée similaire à celle produite par les dispositifs énergétiques endoscopiques, et générer de manière fiable un rétrécissement fibreux avec une complexité chirurgicale acceptable. Pour répondre à ces besoins, nous avons développé un protocole transvésical Ho :YAG basé sur le laser chez les rats femelles. Des femelles ont été sélectionnées pour faciliter l’exposition chirurgicale et isoler les lésions thermiques spécifiques au cou de la vessie ainsi que le remodelage fibrosique sans interférence du tissu prostatique. Grâce à la visualisation intravésicale directe, cette méthode permet une livraison précise de l’énergie laser à la vessie, au cou, à la muqueuse et à la sous-muqueuse et produit un rétrécissement fibreux reproductible de la sortie vésique.
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Protocole
Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité d’éthique des soins et d’utilisation des animaux du Comité d’éthique du bien-être animal expérimental de l’Institut de médecine traditionnelle chinoise de Pékin (Approbation n° BJTCM-R-2025-03-02). Les animaux étaient hébergés dans des conditions standard avec un accès à la nourriture et à l’eau à la libitum. Dans le protocole actuel, un total de 16 rats ont été utilisés, dont 8 rats dans le groupe témoin sans chirurgie et 8 rats dans le groupe traité au laser Ho :YAG. Deux animaux du groupe traité au laser Ho :YAG sont décédés postopératoirement. Aucun animal supplémentaire n’a été exclu en raison de perforations, de saignements sévères ou d’une induction du modèle ratée.
1. Préparation préopératoire
- Préparez du méloxicam de qualité pharmaceutique pour l’analgésie périopératoire (Figure 1A), le système d’anesthésie inhalatoire pour petits animaux (Figure 1B), le système laser Ho :YAG avec une fibre laser de 200 μm (Figure 1C), des instruments microchirurgicaux stériles (Figure 1D), 8-0 Sutures tressées absorbables (acide polyglycolique revêtu, PGA) pour la fermeture des cystotomies, sutures polyglactine 910 tressées résorbables 4-0 pour la fermeture de la peau, sérum physiologique stérile, drapeaux stériles, cotons-tiges stériles et lubrifiant stérile (Figure 1E).
- Induire une anesthésie avec 3 % à 4 % d’isoflurane en oxygène dans une chambre d’induction, et maintenir l’anesthésie avec 1,5 % à 2,5 % d’isoflurane à travers un cône nasal lors de l’opération.
- Ajustez la concentration selon la fréquence respiratoire et le protocole institutionnel approuvé pour les animaux. Confirmez une profondeur anesthésique suffisante en l’absence du réflexe pincé de l’orteil avant l’incision et réévaluez la profondeur de l’anesthésie tout au long de la procédure.
- Coupez largement la fourrure à partir du bas de l’abdomen afin que le drapeau couvre tout reste de poils et empêche le contact entre instruments et poils non coupés.
- Désinfecter le champ chirurgical avec des gommages alternant povidone-iode et alcool isopropylique à 70 % ; effectuer trois applications de chaque solution avant le drapage.
- Placez l’animal sur position couchée sur une bouillotte réglée à 37 °C et maintenez des conditions stériles tout au long de la procédure.
- Si un remplissage de la vessie ou une identification intraopératoire du col de la vessie est nécessaire, lubrifier un petit cathéter urétral stérile ou une canule avec un lubrifiant stérile, insérez-le doucement à travers le méat urétral dans la vessie, puis injectez lentement une solution saline stérile. Évitez l’insertion forcée ou le surremplissage. Retirez ou sécurisez le cathéter selon l’exposition chirurgicale prévue.
2. Exposition de la vessie
- Réaliser une incision cutanée de 3 à 4 cm sur la ligne médiane inférieure en conditions stériles (Figure 2A).
- À l’aide de pinces à extrémité fine et de microciseaux, divisez le tissu sous-cutané et ouvrez la ligne alba pour pénétrer dans la cavité péritonéale.
- Externaliser doucement la vessie urinaire avec des pinces atraumatiques (Figure 2B).
- Identifiez le col de la vessie comme la jonction entre la base de la vessie et l’urètre proximal.
- Placez une sonde émoussée sous le col de la vessie pour fournir un soutien doux et stabiliser la zone cible (Figure 2C).
3. Ablation laser transvésicale Ho :YAG
- Tendez la vessie avec du sérum stérile jusqu’à ce que la paroi de la vessie devienne modérément tendue. Évitez la surdistension, qui pourrait masquer les repères anatomiques ou augmenter la tension au niveau du site de cystotomie.
- Réaliser une cystotomie longitudinale de 0,5 cm au niveau du dôme antérieur de la vessie à l’aide de microciseaux fins (Figure 2D).
- Introduisez la fibre laser Ho :YAG préparée à 200 μm à travers la cystotomie dans la lumière de la vessie.
- Avancez la fibre sous visualisation directe vers le col de la vessie.
- Placez doucement la pointe de fibres en contact direct avec la muqueuse du cou de la vessie. Maintenir le mode contact sans indentation visible du tissu ; Assurez-vous que la distance entre la pointe et le tissu soit d’environ 0 mm lors de la délivrance d’énergie.
- Livrez l’énergie laser à 1,0 J et 10 Hz pendant 5 s à la position 9 heures (Figure 3A) et répétez à la position 3 heures (Figure 3B). Ce réglage délivre 50 J par point et 100 J par animal, avec une puissance fixée à 10 W pour chaque animal.
REMARQUE : Une ablation réussie est indiquée par un blanchiment uniforme de la muqueuse et la formation d’un cratère peu profond de la muqueuse à la sous-muqueuse sans carbonisation. - Gardez la fibre stable pendant les 5 secondes d’application et évitez de la pousser contre le mur. Évitez la formation de cratères profonds ou la perforation à pleine épaisseur. Ne dirigez pas les fibres vers les orifices urétéraux ou l’urètre distal.
- Retirez les fibres et irriguez la lumière de la vessie avec un sérum stérile pour enlever les débris et confirmer l’hémostasie.
- Fermez la cystotomie avec 2–3 8-0 interrompu Des sutures tressées absorbables (PGA recouvertes) étanches.
- Remplissez la vessie avec 0,5 à 1,0 mL de solution saline stérile pour confirmer l’absence de fuite à partir de la ligne de fermeture (Figure 3C).
- Fermez la paroi abdominale et la peau en couches (Figure 3D).
4. Soins postopératoires
- Gardez le rat sur une bouillotte jusqu’à ce qu’il soit complètement remis de l’anesthésie.
- Administrez du méloxicam à 1 mg/kg par voie sous-cutanée pour l’analgésie postopératoire et continuez une fois par jour pendant 1 à 3 jours, ou selon le protocole animal approuvé.
- Surveillez l’animal quotidiennement pendant au moins 7 jours pour détecter des signes de douleur, de détresse, d’hématurie, de rétention urinaire, de déhiscence de plaie ou d’infection.
- Apportez un soutien à l’hydratation et des aliments ramollis selon les besoins pendant la période de récupération précoce.
5. Évaluation de la contracture du cou de la vessie
- Laissez les animaux récupérer pendant 4 semaines après l’opération afin de permettre un remodelage fibreux au niveau du cou de la vessie.
- À l’étape finale, euthanasiez les animaux par surdose de pentobarbital sodique (150 mg/kg, intrapéritonéale) ou une autre méthode approuvée par le protocole institutionnel animal, et confirmez la mort avant la prélèvement des tissus. Prélève en bloc la vessie, le cou de la vessie et l’urètre proximal.
- Ouvrez le spécimen longitudinalement et photographiez le col de la vessie pour documenter le rétrécissement grossier.
- Fixer le tissu dans un paraformoldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 24 heures, déshydrater par de l’éthanol gradué, clarifier dans le xylène, l’intégrer dans la paraffine, et obtenir des sections transversales sérieuses de 4 μm dans la région du cou de la vessie.
- Sécures de coloration contenant de l’hématoxyline et de l’éosine, le trichrome de Masson et le rouge picrosirius selon les protocoles histologiques standards ou les instructions du fabricant pour évaluer le rétrécissement de la lumière, l’épaississement de la paroi du cou de la vessie et le dépôt de collagène.
- Pour l’immunohistochimie, déparaffinez les sections, effectuez la récupération d’antigènes, bloquez la peroxydase endogène et la liaison non spécifique, incubez des sections avec des anticorps contre le collagène de type I et de type III, appliquez l’anticorps secondaire approprié, développez avec du chromogène et contre-coloration avec de l’hématoxyline.
REMARQUE : Les anticorps sont dilués selon les recommandations du fabricant. - Quantifiez la surface luminaire et la zone positive au collagène à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image ImageJ/Fiji équivalent.
- Calibrez l’échelle pixel-micromètre à l’aide de la barre de la balance du microscope, délimitez manuellement la région luminaire et tissulaire de la vessie et tissulaires d’intérêt, et mesurez la surface luminaire.
- Pour la coloration trichrome de Masson, appliquez un seuil de couleur constant afin d’identifier les pixels bleus positifs au collagène dans la région d’intérêt.
- Calculez la fraction de surface positive au collagène comme une surface positive au collagène divisée par la surface totale des tissus.
- Effectuez des mesures sur des sections et champs comparables de chaque animal, et analysez les images de manière aveugle.
REMARQUE : L’induction réussie du modèle est soutenue par un rétrécissement macroscopique de la vessie, accompagné de preuves histologiques de mucoviscidose concentrique et d’augmentation du dépôt de collagène au site de la lésion. Le taux de réussite opérationnelle était de 6/8 dans le groupe traité au laser Ho :YAG, basé sur le développement du phénotype global et histologique attendu.
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Résultats
Quatre semaines après l’opération, les rats traités au laser Ho :YAG ont montré des modifications globales et histologiques reproductibles compatibles avec un rétrécissement fibrosatique du cou de la vessie. Dans cette étude, le groupe témoin sans chirurgie comprenait 8 rats, et le groupe traité au laser Ho :YAG comprenait 8 rats. 6/8 des animaux traités ont développé le phénotype attendu ; l’attrition a constaté 2 décès postopératoires dans le groupe traité au laser Ho :YAG, sans exclus...
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Discussion
Dans cette étude, nous avons établi un modèle de rat de rétrécissement fibreux du cou de la vessie à l’aide d’une ablation laser transvésicale Ho :YAG. La principale force de cette méthode est qu’elle provoque une lésion thermique contrôlée au niveau du cou anatomique de la vessie, suivie d’un remodelage fibrosique progressif. Cela diffère des modèles traditionnels de ligature extravésique, qui génèrent principalement une obstruction par compression externe plutôt que par formation intri...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82474255 pour les ressources humaines) et du programme de recherche de l’administration provinciale du Hebei de la MTC (B2025018 pour les ressources humaines).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, Chine | R831 | |
| Anticorps monoclonal de souris anti-collagène I | Proteintech Group, Inc., Wuhan, Chine | 66761-1-Ig | |
| Anticorps monoclonal de souris anti-collagène III | Proteintech Group, Inc., Wuhan, Chine | 68320-1-Ig | |
| Suture Vicryl Plus enrobée (polyglactine 910), 4-0 | Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson) | VCP773D | Aiguille de pointe violette tressée SH 26 mm et demi-cercle ; absorbable ; Lot : RLMCJX |
| Kit de coloration hématoxyline et éosine (HE) | Servicebio, Wuhan, Chine | 2310005 | |
| Système de laser Holmium-YAG (LITHO) | Quanta System S.p.A, Italie | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J, 10 Hz, 10 W, fibre de 200 μm |
| Anticorps secondaire IgG anti-souris conjugué à la HRP | Boster, Wuhan, Chine | BA1050 | |
| Isoflurane | RWD | 2025010601 | |
| Kit de coloration trichrome de Masson | Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, Chine | BA4079B | |
| Meloxicam Injection | Qilu Animal Health, Shandong, Chine | E135H003 | |
| Paraformaldéhyde (4%) | Servicebio, Wuhan, Chine | 2510H0070148 | |
| Kit de coloration au rouge picrosirius | Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, Chine | 20250228 | |
| Cathéter intraveineux de sécurité, 24 G | Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, Chine | AD4-240827 | |
| Système d'anesthésie par inhalation pour petits animaux | RWD Life Science, Shenzhen, Chine | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | Induire avec 3 %–4 % d'isoflurane dans l'oxygène |
Références
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Réimpressions et autorisations
