Article de méthode

Déclenchement anticipé de vocalisations ultrasoniques appétitives chez les rats et souris de laboratoire

635 vues

⸱

DOI :

10.3791/71661

⸱

3 juillet 2026

 ,  , 
1Department of Speech, Language, and Hearing Sciences, Purdue University

Dans cet article

Résumé

Les vocalisations ultrasoniques de rat et souris de laboratoire (USV) sont utiles pour étudier les fonctions vocales et neuronales. Ce protocole décrit un paradigme nourriture-récompense qui provoque de manière fiable des USV appétitifs sans confusion liée à l’accouplement. Il détaille le conditionnement animal, la présentation des stimulus, l’enregistrement et l’analyse acoustique, fournissant une méthode reproductible pour étudier la fonction affective-motivationnelle et sensorimo-motrice crânienne.

Résumé

Les vocalisations ultrasoniques (USV) chez les rats et souris de laboratoire fournissent un modèle précieux pour étudier la fonction vocale, le comportement affectif et les mécanismes neuronaux sous-jacents qui entraînent la vocalisation. De nombreux paradigmes d’électrice de l’USV couramment utilisés reposent sur l’accouplement ou l’interaction sociale, ce qui peut introduire des confondus hormonaux et comportementaux compliquant l’interprétation dans les études sur le vieillissement, la neurodégénérescence et la modulation endocrinienne. Pour répondre à ces limites, cet article décrit un paradigme d’électrice USV à récompense alimentaire qui évoque de manière fiable des vocalisations appétitives à 50 kHz en prévision d’un aliment agréable au goût. Il comprend des procédures standardisées pour la manipulation, l’acclimatation et le conditionnement comportemental des animaux afin d’établir des réponses anticipatoires cohérentes à une récompense agréable. Les animaux subissent une exposition répétée à l’environnement d’enregistrement suivie d’une récompense pour favoriser une sortie vocale stable sur plusieurs sessions. Les USV sont enregistrés dans des chambres atténuées par le son dans des conditions environnementales contrôlées afin d’assurer un rapport signal/bruit élevé et une reproductibilité. Un flux de travail structuré pour la détection et la classification automatisées est fourni, permettant d’extraire les principaux paramètres acoustiques, y compris le nombre total de USV, le débit, la plage de fréquences, la durée, la puissance maximale et la complexité. Le protocole inclut des étapes de contrôle qualité pour vérifier la précision de la détection et minimiser les artefacts. En éliminant les variables liées à l’accouplement et en standardisant les conditions d’enregistrement, cette méthode offre une approche contrôlée pour provoquer et quantifier les vocalisations appétitives à 50 kHz sur plusieurs sessions. Ce paradigme est bien adapté à l’étude des processus affectifs-motivationnels et de la fonction sensorimo-motrice crânienne, et peut être adapté à divers contextes expérimentaux, y compris des études sur les maladies neurologiques, la neurodégénérescence et la manipulation hormonale, avec une validation spécifique à chaque étude.

Introduction

Les vocalisations ultrasoniques (USV) chez les rats et souris de laboratoire sont largement utilisées comme mesures expérimentales du comportement vocal et de l’état affectif, et fournissent un modèle précieux pour étudier la communication vocale dans des conditions contrôlées. Les rats et les souris produisent des signaux vocaux ultrasoniques à portée dans divers contextes biologiquement pertinents, notamment l’accouplement, la signalisation de détresse, le jeu et la communicationsociale 1,2,3,4,5. Comme les USV reflètent à la fois des états physiologiques et comportementaux, ils fournissent une mesure sensible et quantifiable dans les études sur l’émotion, le comportement social et les relations cerveau–comportement. Les rats et souris de laboratoire produisent des USV communicatifs à des fréquences élevées allant de 30 à 90 kHz chez les rats et de 40 à 120 kHz chez les souris, souvent appelées « USV 50 kHz ». Chez les rats, les VS-V à 50 kHz sont couramment associés à des états affectifs positifs, à l’anticipation de la récompense et à des comportements d’approchesociale 2,5,6,7. Les souris produisent des VSL à 50 kHz dans des contextes sociaux et affectifs comparables, mais présentent une plus grande variabilité structurelle et dépendent fortement du contexte comportemental et des signauxsociaux 8,9,10,11,12. Ainsi, les VSU ont été largement utilisés dans la recherche psychosociale et psychobiologique pour étudier le traitement émotionnel, les interactions sociales, les paradigmes d’apprentissage et les effets des manipulations pharmacologiques sur le systèmenerveux 5,11,13,14,15,16,17 . Plus récemment, les USV ont également été adoptés comme critères de jugement dans des études portant sur les maladies neurologiques, la neurodégénérescence, les troubles du développement et les dysfonctionnements sensorimoteurs crâniens pertinents pour les troubles de la communicationhumaine 5,18,19,20,21,22.

La production de VSU se fait au sein du larynx et nécessite une coordination neuromusculaire précise des muscles laryngés intrinsèques logés dans un cadre cartilagineux 23,24,25. Les schémas moteurs contrôlant les muscles tels que la thyroyténoïde et la cricothyroïde régulent la position des cordes vocales et la configuration glottale lors de la productionsonore 26. Contrairement à la phonation humaine, qui repose sur l’oscillation des cordes vocales induite par le flux, les USV sont produites par un mécanisme de sifflement aérodynamique dans lequel un flux d’air à grande vitesse sort de la glotte et interagit avec les structures laryngées pour générer un sonultrasonore 23,24,25,27. Par conséquent, les caractéristiques acoustiques des VSU reflètent un contrôle neuromusculaire coordonné du larynx, de la configuration des voies vocales et de l’apport en pression sous-glottale plutôt qu’une biomécanique vibratoire de la muqueuse des cordes vocales. Pour la mesure expérimentale, les USV sont principalement définis et analysés en fonction des caractéristiques acoustiques capturées lors des enregistrements. Ces caractéristiques acoustiques de l’USV, incluant la fréquence, la durée et l’intensité, peuvent être extraites à l’aide d’un pipeline d’analyse automatisé ou semi-automatisé, qui constitue la base des comparaisons quantitatives entre conditionsexpérimentales 5.

Un nombre important de littératures ont utilisé les VS-E-S pour examiner les influences hormonales sur le comportement vocal chez les rats de laboratoire et les souris. De nombreuses études ont démontré que les hormones reproductrices (par exemple, œstrogènes et progestérone) modulent la production de VSU et les caractéristiques acoustiques, en particulier dans les contextes d’accouplement 4,28,29. Par exemple, le stade du cycle œstral, l’ovovecctomie et le remplacement hormonal ont montré qu’ils modifient les taux de VSU et les caractéristiques acoustiques tant chez les rats que chez les souris, y compris la modulation par l’état œstral et les signaux hormonaux reproducteurs chezles souris 28,30,31,32,33. Cependant, ces recherches se sont largement appuyées sur des paradigmes basés sur l’accouplement, comme la présentation d’une femelle œstrale à un rat ou une souris mâle, qui provoque robustement des vocalisations mais introduit une variabilité substantielle liée à la motivation sexuelle, à l’expérience sociale et à l’état endocrinien. Bien que ces paradigmes soient très efficaces pour provoquer un grand nombre d’USV, la complexité comportementale et hormonale inhérente aux contextes reproductifs peut compliquer l’interprétation dans les études axées sur la sortie vocale quantifiable ou la manipulation expérimentale contrôlée. Ainsi, les différences d’interaction sociale, de réceptivité sexuelle et d’état de motivation peuvent influencer indépendamment la production de VSUS, rendant difficile l’isolement des variables physiologiques étudiées.

En dehors des contextes d’élicitation reproductive du VUS, il existe moins d’approches standardisées pour examiner la production d’USV dans des conditions contrôlées et non sociales, tant chez les rats que chez les souris. Des travaux émergents suggèrent que le statut hormonal peut influencer la production de VSU même dans des contextes non reproductifs. Par exemple, le remplacement de l’estradiol a été rapporté pour modifier les caractéristiques acoustiques et les taux de l’USV selon le contexte social dans lequel les vocalisations sontenregistrées 28,30. Dans une étude portant sur les VSU en dehors des paradigmes d’accouplement, le stade du cycle œstral influençait les paramètres acoustiques tant dans l’isolement social que dans les conditions d’interactiondyadique 28. Cependant, la variabilité selon le contexte d’enregistrement, les conditions environnementales et les paradigmes d’elicitation reste un défi majeur pour la reproductibilité et la comparaison croisée.

Compte tenu de ces limitations, des paradigmes expérimentaux qui minimisent les confusions sociales et reproductives sont importants pour étudier les VSU de manière contrôlée et reproductible. Les paradigmes de récompense liés à la nourriture offrent une approche alternative utile pour susciter des USV appétitifs à 50 kHz. Les rats, et dans une moindre mesure les souris, produisent des USVs anticipés en réponse aux signaux associés à la récompense, notamment l’accès à une nourriture appétissante, ce qui reflète des états de motivation et l’espérance de récompense 6,9,34. Dans cette approche, les animaux sont acclimatés à l’environnement d’enregistrement et conditionnés à associer l’exposition de chambre à une récompense alimentaire agréable, ce qui permet une sortie vocale cohérente sur les séances. Comparée aux paradigmes basés sur l’accouplement, l’électation basée sur la récompense permet une standardisation précise des conditions environnementales, réduit la variabilité liée à l’interaction sociale ou au statut reproducteur, et peut être appliquée à tous les sexes et aux modèles expérimentaux. De plus, cette approche est compatible avec une gamme de systèmes d’enregistrement ultrasonique et supporte des conceptions de mesures répétées. Ces caractéristiques rendent ce paradigme particulièrement adapté aux études nécessitant une éduction cohérente de l’USV et une comparaison quantitative entre les conditions. Cette approche devient particulièrement importante lorsqu’on tente d’isoler des changements relativement subtils dans la sortie vocale qui seraient autrement masqués par la variabilité des comportements sociaux ou reproductifs.

L’objectif global de la méthode actuelle est de fournir un protocole détaillé et reproductible pour provoquer et quantifier les vocalisations ultrasoniques appétitives en utilisant un paradigme anticipatoire conditionné nourriture-récompense. Le protocole définit les procédures pour la manipulation, l’acclimatation et le conditionnement comportemental des animaux, suivies d’enregistrements standardisés USV réalisés dans des chambres atténuées par le son sous conditions environnementales contrôlées. Un flux de travail structuré pour la détection et la classification automatisées est également décrit, permettant l’extraction des paramètres acoustiques de niveau USV à partir de chaque enregistrement, y compris le nombre total d’USV, le débit, la plage de fréquences, la durée, la puissance maximale et la complexité. Ce cadre axé sur les méthodes met l’accent sur la reproductibilité, la standardisation et l’adaptabilité à travers les milieux de laboratoire et les espèces, offrant un pipeline pratique pour l’acquisition et l’analyse cohérente des données USV.

Ce protocole propose une approche standardisée et reproductible pour l’extraction et l’enregistrement des USV appétitifs en utilisant un paradigme anticipé nourriture-récompense, permettant une analyse détaillée du comportement vocal dans des conditions expérimentales. Bien que ce protocole s’applique aussi bien aux rats de laboratoire qu’aux souris, des différences importantes spécifiques à chaque espèce doivent être prises en compte. Chez les rats, les VS-V à 50 kHz sont bien caractérisés et sont souvent associés à des états affectifs positifs et à l’anticipation de la récompense. Chez la souris, les VSU sont plus variables tant dans leur structure que dans leur interprétation comportementale, ne sont pas fiables pour indiquer des états affectifs positifs, et ne doivent pas être interprétés comme des substituts directs de la valenceémotionnelle 8,9. De plus, des caractéristiques acoustiques telles que la durée du USV, la plage de fréquences et les schémas de modulation diffèrent selon les espèces, ce qui peut nécessiter un ajustement des paramètres de détection et de classification. Les réponses comportementales au conditionnement peuvent également varier, les rats manifestant généralement une vocalisation appétitive plus robuste et cohérente dans des paradigmes basés sur la récompense. Plusieurs étapes de ce protocole sont cruciales pour une élicitation fiable de la VSN (par exemple, la durée de l’acclimatation, l’appariement récompense et la cohérence de l’enregistrement), tandis que d’autres paramètres (par exemple, type de récompense, type de chambre et paramètres d’acquisition) peuvent être ajustés en fonction de l’espèce, de la souche ou du plan expérimental, à condition que la validation et l’optimisation des paramètres soient réalisées lors de l’adaptation de ce protocole chez les rats et les souris de laboratoire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux suivent les directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Purdue et respectent les normes nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles IACUC de Purdue suivants ont été approuvés : 2008002069 (souris A53TSynGFP), 0722002290 (rat Sprague-Dawley), 2111002220 (rat Long-Evans).

1. Préparation et hébergement des animaux

  1. Sélection animale
    1. Sélectionnez des rats ou souris adultes âgés d’au moins 3 mois ou plus de la souche, du sexe et de la condition expérimentale souhaités. Assurez-vous que les animaux sont appariés selon l’âge et le sexe entre groupes lorsque possible.
    2. Les animaux d’intérieur dans des cages standard sous un cycle inversé de 12 heures lumière/obscurité avec température et humidité contrôlées.
      REMARQUE : Un cycle lumineux inversé est recommandé pour aligner les tests comportementaux avec la phase active (sombre) des animaux, favorisant ainsi un engagement et une vocalisation constants. Cependant, l’enregistrement peut également être réalisé selon un cycle standard lumière/obscurité si les tests sont effectués de manière cohérente et si le timing est maintenu sur toutes les sessions.
    3. Fournir un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, sauf indication contraire pour le conditionnement et la manipulation expérimentale.
    4. Animaux d’habitation en groupe, lorsque possible. Si le logement social n’est pas envisageable, il faut offrir un enrichissement supplémentaire dans la cage et/ou programmer du temps de socialisation pour réduire le stress chez les animaux en logementunique 35.
      REMARQUE : Des animaux adultes ont été utilisés dans des ensembles de données représentatifs afin d’assurer des réponses comportementales stables et des schémas cohérents de VUS. Ce protocole peut être adapté pour des animaux plus jeunes ou plus âgés ; Cependant, les différences liées à l’âge dans le comportement vocal et la réponse au conditionnement doivent être prises en compte et validées dans le cadre spécifique de l’étude. Ce protocole n’est pas recommandé pour les souris et les rats en âge de pré-sevrage.
  2. Manipulation et socialisation des animaux
    1. Manipulez les animaux quotidiennement pendant 5 à 7 jours consécutifs dans la salle d’hébergement sous une station de transfert d’animaux. Effectuer toute manipulation en utilisant un équipement de protection individuelle approprié (par exemple, blouse et gants).
    2. Acclimater les animaux à l’interaction avec les chercheurs en utilisant des procédures de manipulation standardisées. Des méthodes de manipulation à faible stress (par exemple, la manipulation en tunnel ou en tube) peuvent être utilisées pour minimiser le stress, en particulier chez la souris, à condition que la méthode choisie soit appliquée de manière cohérente entre les animaux et les sessions. Si une manipulation directe est utilisée, soulevez doucement et tenez chaque animal pendant plusieurs minutes pour l’habituer au chercheur et à la manipulation de routine.
    3. Utilisez une procédure de manipulation standardisée pour tous les animaux afin d’assurer la régularité (par exemple, introduire les mains dans la cage et laisser l’animal renifler pendant 30 secondes, soulever et tenir doucement l’animal pendant 10 secondes, répéter la prise trois fois).
    4. Intégrer toutes les techniques de manipulation spécifiques à chaque expérience utilisées pour l’expérience, telles que soulever l’animal dans la cage d’essai ou le maintenir sur le dosé pour des injections, dans la procédure de socialisation afin d’habituer les animaux à l’ensemble du flux de travail expérimental et de minimiser la variabilité liée au stress lors des séances d’enregistrement.

2. Acclimatation à l’environnement de test et conditionnement comportemental

  1. Préparation des séances d’acclimatation
    1. Allumez toutes les chambres d’enregistrement et équipements avant utilisation. Nettoyez les cages comportementales en polycarbonate avec 70 % d’éthanol et essuyez soigneusement, en veillant à ce que toutes les surfaces soient sèches avant utilisation.
    2. Transférez les animaux de la salle de logement vers la salle d’enregistrement à l’aide d’un chariot recouvert d’un rideau ou d’une feuille occultante pour maintenir l’éclairage et minimiser le stress environnemental.
  2. Acclimatation de chambre
    1. Placez une cage en polycarbonate propre sans litière dans une chambre d’enregistrement. Transférez chaque animal dans une cage, avec un seul animal par cage par chambre d’enregistrement. Ferme la porte de la chambre solidement.
    2. Laissez l’animal dans la chambre pendant 10 minutes pour correspondre à la durée des futures sessions d’enregistrement.
  3. Association nourriture-récompense
    1. Retirez l’animal de la chambre après la séance de 10 minutes et ramenez-le dans sa cage d’origine.
    2. Offrez une nouvelle récompense alimentaire appétissante pesant environ 0,1 à 0,4 g immédiatement après son retour dans la cage à domicile.
    3. Alternez entre 1 à 2 types de récompenses sur plusieurs jours (par exemple, 1 à 2 morceaux de Loops ou de Chouffs, une demi-pièce de paille de légumes de jardin, une arachide décortiquée) pour maintenir la nouveauté et la motivation entre les séances.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser les récompenses alimentaires choisies dans d’autres contextes afin de préserver le conditionnement anticipatoire d’élicitation de l’USV. Assignez différents aliments savoureux pour d’autres tâches, si nécessaire. Les animaux ne sont pas soumis à des restrictions alimentaires selon ce paradigme. L’alimentation standard à volonté est maintenue dans la cage à domicile en dehors de la récompense.
  4. Programme de conditionnement
    1. Répétez l’acclimatation et récompensez l’association une fois par jour pendant au moins 3 à 5 jours consécutifs.
    2. Effectuez des séances de conditionnement et d’enregistrement de 10 minutes à la même heure chaque jour (par exemple, pendant le cycle sombre entre 09h00 et 12h00) en utilisant un personnel régulier.
      REMARQUE : Les animaux présenteront une réduction des comportements de stress (par exemple, une diminution de la défécation/miction de 50 % à 100 %) et l’apparition de VUS-V anticipés à 50 kHz sur les jours de conditionnement. Les souris peuvent nécessiter plus de jours de conditionnement que les rats.

3. Installation d’enregistrement de vocalisation ultrasonique

  1. Conditions d’équipement
    1. Réalisez des enregistrements dans une pièce sombre ou sous un éclairage rouge pour s’aligner avec le cycle d’éclairage inversé des animaux.
    2. Limitez l’entrée dans la salle et restez dans un espace adjacent pendant les séances afin de minimiser les perturbations acoustiques.
  2. Installation de la chambre d’enregistrement
    1. Utilisez des chambres d’enregistrement atténuées par le son (à l’extérieur : 60 cm × 60 cm × 82 cm ; à l’intérieur : 56 cm × 53 cm × 60 cm) conçues pour minimiser le bruit externe et les interférences électroniques.
    2. Utilisez plusieurs chambres (par exemple, quatre au total) et assignez les animaux à des chambres en utilisant un calendrier aléatoire et contrebalancé sur les jours d’enregistrement et les conditions expérimentales.
      REMARQUE : Les affectations de chambre sont structurées de manière à ce que les animaux de chaque groupe expérimental soient répartis dans toutes les chambres, et que chaque animal soit enregistré dans plusieurs chambres lors des sessions d’enregistrement lorsque cela est possible. Cette approche minimise les biais potentiels spécifiques à la chambre et évite la confusion systématique entre les conditions de chambre et les conditions expérimentales.
    3. Notez l’affectation de la chambre pour chaque session (par exemple, identification animale, groupe, numéro de chambre, date, type de session) dans un carnet de laboratoire ou un tableau Excel (par exemple, Excel). Incorporez ces métadonnées dans les analyses statistiques en aval (par exemple, sous forme d’effet aléatoire ou de covariable) afin de tenir compte de la variabilité potentielle liée à la chambre.
      REMARQUE : Si vous utilisez plusieurs chambres d’enregistrement, mettez en place des stratégies pour minimiser le bruit électrique et la diaphonie entre les canaux (par exemple, séparation spatiale des chambres, mise à la terre cohérente et utilisation de câbles blindés le cas échéant). La chambre atténuante du son aide également à réduire le bruit acoustique et ultrasonore environnemental, ainsi que les interférences externes.
  3. Préparation de la cage
    1. Utilisez des cages en polycarbonate propres dans chaque chambre d’enregistrement. N’ajoutez pas de literie aux cages pour minimiser le bruit lié aux mouvements.
    2. Nettoie soigneusement chaque cage avec 70 % d’éthanol entre les animaux et laisse-la sécher complètement avant le prochain enregistrement.
  4. Configuration du système d’enregistrement
    1. Allumez l’ordinateur d’enregistrement et lancez le logiciel d’acquisition. Assurez-vous que l’interface d’enregistrement multicanal est connectée et reconnue.
    2. Créez une nouvelle expérience en cliquant sur Fichier/Expérience, puis sur Nouveau et en saisissant les métadonnées requises, y compris le nom de l’expérience, l’espèce et le nombre de canaux d’enregistrement (par exemple, jusqu’à quatre). Voir le fichier supplémentaire 1 pour des captures d’écran de l’interface logicielle.
    3. Effectuez un enregistrement de test bref en cliquant sur Enregistrer des échographies, puis sur Échographies en aperçu, et sur le bouton d’enregistrement circulaire avant chaque séance pour vérifier l’intégrité du signal, la fonction du canal et les niveaux de bruit de fond acceptables (Fichier Supplémentaire 2).
    4. Créez une session de test en cliquant sur Session de Test de conception, puis sur Nouvelle session de test, et réglez la durée d’enregistrement à 10 minutes en changeant le minuteur (par exemple, 00:10:00 pendant 10 minutes). Attribuez les pièces d’identité des animaux aux canaux de chambre appropriés (Fichier Supplémentaire 3).
    5. Vérifiez toutes les informations de la session avant de commencer l’enregistrement, car les réglages ne peuvent pas être modifiés après la fin de l’enregistrement.
      REMARQUE : Tous les paramètres d’acquisition sont définis par le système dans Sonotrack et ne sont pas ajustés manuellement par l’utilisateur entre les animaux ou les sessions. Maintenir la configuration des chambres et les paramètres d’enregistrement identiques pour tous les animaux et les sessions afin d’assurer la cohérence des données. Les paramètres d’acquisition suivants sont préconfigurés avec le système :
      Fréquence d’échantillonnage : ≥250 kHz
      Plage de détection de fréquence : 15–125 kHz
      Type de microphone : microphones à condensation ultrasonique
      Placement du microphone : fixé au-dessus du centre de chaque cage (~13–100 cm de l’animal)
      Gain : Non ajustable par l’utilisateur ; Contrôlé automatiquement par le système et maintenu constant sur tous les enregistrements
      Plage dynamique d’entrée : ~10 mV (signal minimum détectable) à 10 V (entrée maximale) selon les spécifications du fabricant
      Format de fichier : Enregistrements continus exportés sous le nom de . Fichiers WAV et métadonnées sous forme de . Fichiers DAT
      Bien que ce protocole soit mis en œuvre à l’aide d’un système USV intégré, le flux de travail ne dépend pas d’une seule plateforme commerciale. Le paradigme peut être adapté à d’autres systèmes d’enregistrement ultrasonique à condition que des paramètres d’acquisition comparables soient utilisés, incluant la fréquence d’échantillonnage et la plage de fréquences appropriées pour les USV de rats ou souris de laboratoire. De même, d’autres chambres atténuées par le son peuvent être utilisées si elles minimisent efficacement les interférences acoustiques et soutiennent des conditions de test comportementales stables.

4. Procédure d’enregistrement USV

  1. Initiation de la session
    1. Placez les animaux dans des chambres d’enregistrement en suivant la même procédure que lors de l’acclimatation. Assurez-vous d’avoir une attribution correcte de la chambre.
    2. Fermez les portes de la chambre et ouvrez la session de test correspondante en cliquant sur Session de test de conception, puis ouvrez la session de test dans le logiciel d’enregistrement (Fichier supplémentaire 4).
  2. Exécution de l’enregistrement
    1. Commencez l’enregistrement via l’interface logicielle en cliquant sur Enregistrer des échographies, puis sur Exécuter la session de test, et en encerclant le bouton d’enregistrement (Fichier supplémentaire 5). Surveillez les signaux en temps réel si désiré.
    2. Laissez le logiciel enregistrer en continu pendant 10 minutes.
  3. Fin de la session
    1. Autorisez le logiciel à arrêter automatiquement l’enregistrement à la fin de la session. Sauvegardez immédiatement l’enregistrement pour éviter la perte de données en cliquant sur le bouton X, puis en enregistrant (Fichier supplémentaire 6).
    2. Retirez les animaux des chambres et remettez-les dans leurs cages domestiques.
  4. Livraison de récompenses
    1. Offrez une récompense alimentaire standardisée et savoureuse immédiatement après avoir remis chaque animal dans sa cage d’origine.
    2. Maintenez une constance dans le timing des récompenses à travers toutes les séances.
  5. Calendrier d’enregistrement
    1. Effectuez des séances d’enregistrement une fois par jour pendant 3 à 5 jours consécutifs après la condition.
    2. Maintenez le même timing, les procédures de manipulation et les conditions environnementales pour toutes les séances.
      POINT DE PAUSE : Stockez et sauvegardez les fichiers enregistrés après chaque session pour une analyse ultérieure.

5. Nettoyage post-séance et arrêt

  1. Nettoyage de chambres et d’équipements
    1. Retirez les cages et nettoyez toutes les cages, couvercles et inserts avec du savon et de l’eau après les séances. Séchez soigneusement avant de le stocker.
    2. Nettoyez l’intérieur et les surfaces des chambres avec 70 % d’éthanol selon les besoins.
  2. Arrêt des équipements
    1. Fermez toutes les sessions d’enregistrement et quittez le logiciel d’acquisition.
    2. Désactivez les chambres d’enregistrement et assurez-vous que toutes les portes de la chambre sont fermées.
  3. Transport animalier
    1. Couvrez les cages d’un drap ou d’un rideau occultant et transportez les animaux vers la zone d’hébergement.
    2. Remis les animaux dans leurs cages et assure-toi d’avoir accès à la nourriture et à l’eau.

6. Détection, classification et exportation de données par vocalisation ultrasonique avec logiciel

  1. Charger les fichiers d’enregistrement USV
    1. Ouvre le logiciel de classification des appels et autorise le téléchargement du menu principal.
    2. Sélectionnez Charger les fichiers USV et choisissez soit de télécharger des fichiers natifs d’expériences Sonotrack via Charger les données USV (fichiers Sonotrack) ou des fichiers audio en forme d’onde compatibles via Import des données USV (fichiers WAV).
    3. Naviguez dans le répertoire de l’ordinateur jusqu’au dossier de fichiers contenant les enregistrements et sélectionnez l’expérience/session souhaitée en cliquant sur Accepter.
    4. Dans le logiciel de classification des appels, sélectionnez le nom approprié de l’expérience, la ou les sessions de test et les canaux microphone correspondants, puis chargez les données dans l’espace de travail en cliquant sur OK.
    5. Vérifiez que l’enregistrement est correctement affiché dans le menu principal du logiciel avec le nom du fichier, le numéro de session et les informations du canal.
  2. Initialisation des paramètres de classification
    1. Ouvrez l’interface de classification dans le logiciel en cliquant sur Classificateur USV.
    2. Sélectionnez le fichier de paramètres de valeurs par défaut pour les paramètres de classification par défaut fournis dans l’environnement logiciel ou modifiez et créez des paramètres de classification personnalisés via le menu USV Explorer & Paramètres sur la page principale de l’interface logicielle.
    3. Confirmez que les filtres de détection avec les paramètres suivants sont listés dans la liste des paramètres :
      Plage de fréquences : 25 000–99 990 Hz (optimisé pour la vocalisation rat à 50 kHz). Pour les enregistrements souris, des plages ultrasoniques plus larges (~40 000–120 000 Hz) peuvent être nécessaires pour capturer l’ensemble du répertoire vocalisé, selon la tension et le contexte.
      Durée minimale de l’appel : 4 ms (les USV plus courts sont automatiquement supprimés)
      Seuil de classification des appels courts : 4 ms
      Détection harmonique : activée
    4. Confirmez que les paramètres de classification basés sur la modulation de fréquence sont les suivants :
      Chevron et facteur en forme de U : 4 kHz
      Facteur de modulation ascendante et descendante : 2 kHz
      Facteur de retrait : 2 kHz
      Tolérance décentrée de la fréquence maximale : 0,4
      Seuils de détection par étapes :
      Différence de fréquence gauche/droite : 35 kHz
      Différence de fréquence gauche vs. moyenne : 32 kHz
    5. Confirmez que les paramètres temporels et de segmentation sont listés comme suit :
      Fusionner les composantes si elles sont séparées par <5 ms (temps) ou <6 kHz (fréquence)
      Supprimez les composants qui se chevauchent si le chevauchement dépasse 75 %
      Facteur de retard : 17
      Facteurs seuils de classification USV non définis :
      Court : 1
      Long : 7
    6. Confirmez que les règles de prétraitement et de gestion des artefacts sont activées :
      Supprimer les composants courts : ON
      Fusionner les composants proches : ON
      Supprimer les composants qui se chevauchent : ON
      Supprimer les mauvais appels : ON
    7. Confirmez que le résumé d’exportation et les formats de données détaillés sont listés comme suit :
      Format du tableau des résultats : CSV + Excel
      Format des images des résultats : uniquement jpg
      Enregistrement du fichier sonore : ON
      Harmoniques : Avec harmoniques
    8. Vérifiez que tous les paramètres de détection et de classification sont correctement appliqués comme indiqué ci-dessus, puis cliquez sur OK.
      REMARQUE : Consultez https://www.metris.nl/en/products/sonotrack/CallClassification pour des liens vers un tutoriel vidéo de l’interface logicielle de classification des appels fourni par le fabricant. Les réglages par défaut sont dérivés de la littérature établie et sont appropriés pour la plupart des applications36. Ces paramètres ont été utilisés pour toutes les analyses représentatives. Des réglages personnalisés peuvent être créés pour des conditions expérimentales spécialisées. Lorsque des réglages personnalisés sont utilisés, toutes les valeurs des paramètres (par exemple, limites de fréquence, seuils de durée, critères de modulation et règles d’artefacts) doivent être rapportées aux côtés des résultats afin d’assurer la reproductibilité entre les études.
  3. Exécuter une détection et une classification automatisées
    1. Sélectionnez la fonction Classification de démarrage pour lancer un traitement automatisé.
    2. Laissez le logiciel scanner l’enregistrement complet, détecter les vocalisations ultrasoniques et classifier chaque USV.
    3. Surveillez les indicateurs de progression en temps réel, y compris les graphiques de classification (Figure 1) et les tableaux qui apparaissent pendant le traitement.
    4. Autorisez le programme à terminer le traitement de tous les USV dans l’enregistrement.
      REMARQUE : Le processus automatisé de détection et de classification peut prendre plusieurs heures. Le logiciel détecte les USV, extrait les caractéristiques acoustiques et les classe selon les schémas de modulation de fréquence (par exemple, vers le haut, plat, complexe).
  4. Résumé des exportations et données détaillées
    1. Une fois le traitement terminé, sélectionnez Quitter le classeur USV et naviguez dans le répertoire de l’ordinateur jusqu’au dossier de fichiers contenant les données de classification afin de consulter les résultats des tableurs.
    2. Ouvrez à la fois les fichiers de tableaux résumé et détaillé des ensembles de données (par exemple, Excel ou CSV) pour chaque expérience, session et canal.
    3. Ouvrez les résultats résumés pour confirmer l’inclusion du total des USV, des distributions par catégorie et des valeurs en pourcentage (Figure 2).
    4. Ouvrez la sortie détaillée pour vérifier les données par USV, y compris l’heure de début, l’heure de fin, la durée et les paramètres acoustiques.
    5. Sauvegardez tous les fichiers exportés et les données associées à l’aide d’une convention de nommage standardisée, incluant l’identification animale, la session et l’état pour les analyses statistiques en aval.
  5. Contrôle qualité
    1. Lors de la validation initiale, sélectionnez aléatoirement 10 % à 20 % des enregistrements entre les conditions représentatives (par exemple, groupes de traitement et séances d’enregistrement) pour une revue manuelle.
    2. Effectuer une inspection manuelle des spectrogrammes et de la lecture audio afin de confirmer les benchmarks de performance définis ci-dessous :
      Détection précise des USV (présence de vrais positifs et absence de USV manqués)
      Précision de détection d’au moins 90 % d’accord avec l’identification manuelle
      Segmentation appropriée des USV individuels (bruit ou artefacts détectés à tort comme USV)
      Taux de faux positifs ne dépassant pas 10 %
      Classification correcte des types USV basée sur les schémas de modulation de fréquence
      Accord de classification d’au moins 85 % entre l’attribution automatisée et manuelle de type USV
    3. Identifier et documenter toutes les erreurs courantes, y compris le bruit de fond ou les artefacts électriques détectés comme les USV, la sur-segmentation ou la fusion des USV adjacents, et la mauvaise classification des USV.
    4. Si la performance ne répond pas aux critères de validation, ajustez les seuils de détection, les limites de fréquence ou les paramètres de classification, relancez la détection et la classification automatisées pour les enregistrements affectés, puis répétez la validation jusqu’à ce que la performance soit atteinte.
    5. Une fois validé, stockez le paramètre défini pour toutes les expériences suivantes. Les procédures de contrôle qualité de routine se limitent ensuite à des vérifications ciblées des enregistrements lorsque cela est nécessaire (par exemple, mises à jour logicielles, ajustements de paramètres, ou des données ou des schémas d’enregistrement inattendus).
    6. Stockez les ensembles de paramètres validés, les jeux de données exportés et la documentation de contrôle qualité dans un format sécurisé pour garantir la reproductibilité.
      REMARQUE : Un contrôle qualité complet n’est requis que lors de la mise en place initiale de la chaîne de détection et de classification. Une fois validés, les paramètres établis sont appliqués de manière cohérente entre les expériences, le contrôle qualité ne se répétant que si des modifications méthodologiques surviennent. L’analyse USV ne se limite pas à une seule plateforme logicielle et peut être mise en œuvre à l’aide de systèmes alternatifs, à condition que les critères de détection et de classification soient clairement définis et appliqués de manière cohérente.

7. Considérations de sécurité

  1. Manipulation des animaux
    1. Manipuler les animaux en utilisant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des gants et une blouse.
    2. Suivez les directives institutionnelles pour une manipulation et une élimination sûres de tout déchet animal.
  2. Sécurité chimique
    1. Utilisez de l’éthanol à 70 % dans un endroit bien ventilé. Évitez l’inhalation et le contact visuel.
    2. Laissez l’éthanol s’évaporer complètement avant de placer les animaux en cage.
  3. Sécurité des équipements
    1. Assurez-vous que tout le matériel électrique est correctement mis à la terre avant utilisation.
    2. Éloignez les liquides des équipements d’enregistrement pour éviter les dommages ou les risques électriques.

8. Analyse statistique

  1. Effectuer toutes les analyses statistiques dans R (v4.3.2) et GraphPad Prism (v10). Définissez l’unité expérimentale comme l’animal individuel. Pour les analyses longitudinales de vocalisation ultrasonique (USV), il faut obtenir les résultats à partir d’enregistrements répétés collectés à travers des moments expérimentaux. Présentez toutes les données comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (MEB), avec les valeurs animales individuelles affichées dans toutes les figures. Effectuer tous les tests statistiques en deux queues sauf indication contraire. Définissez la signification statistique comme α = 0,05.
  2. Pour l’étude sur l’hormone et l’hydratation chez le rat, analysez les résultats du VSU à l’aide de modèles généralisés linéaires à effets mixtes (GLMM) afin d’évaluer les effets de l’état hormonal, de l’état d’hydratation, du temps et de leurs interactions (Figure 3). Inclure des interceptions aléatoires pour l’identification animale imbriquées au sein de la cohorte afin de tenir compte des mesures répétées et des effets de lot. Sélectionnez les distributions des modèles selon les caractéristiques des résultats : utilisez des distributions gamma pour la durée et la plage de fréquences, des modèles linéaires à effets mixtes pour la puissance maximale, et des modèles binomiaux négatifs pour les décomptes des USV afin de traiter la surdispersion. Évaluer les effets fixes à l’aide de tests de type III Wald chi-carré (χ2). Suivez les effets significatifs avec des comparaisons post-hoc planifiées en utilisant des moyennes marginales estimées (emmeans) avec correction de Tukey pour les comparaisons multiples, en restreignant les analyses à des hypothèses a priori. Définissez la signification statistique comme α = 0,05 (à deux queues).
  3. Pour le pilote d’entraînement vocal de souris A53T α-synucléine (Figure 4), évaluez les différences de groupe entre les conditions témoins et d’entraînement à l’aide de tests t à échantillons indépendants à deux queues pour chaque caractéristique USV, incluant le nombre total, la durée, la plage fréquentielle et l’intensité maximale. Analysez séparément les types de USV simples, complexes et combinés. Appliquer la correction de Welch lorsque les hypothèses de variance sont violées. N’appliquez pas de corrections par comparaison multiple en raison du caractère exploratoire du jeu de données pilote et de la taille limitée de l’échantillon. Définissez la signification statistique comme α = 0,05.

Résultats

La mise en œuvre réussie de ce protocole d’enregistrement et d’analyse des USV permet d’obtenir des enregistrements de haute qualité avec un bruit de fond minimal, des conditions expérimentales optimisées, permettant une visualisation et une extraction fiables des USV individuels. Dans ces conditions, les animaux produisent des USV mesurables pendant la période d’enregistrement de 10 minutes, clairement visibles sur des spectrogrammes, détectables et classifiés à l’aide d’un logiciel de classification des appels. Les enregistrements représentatifs démontrent des contours USV distincts avec des contours acoustiques bien définis, incluant des structures USV plates et modulées en fréquence, permettant une extraction précise des paramètres acoustiques (Figure 1).

Les résultats quantitatifs des expériences réussies incluent le nombre total de USV, le taux USV (USV/min), la plage de fréquences, la durée, la puissance maximale et le rapport de complexité USV (simple vs. complexe). Chez les animaux bien conditionnés, les taux totaux de VSL sont constants sur les jours d’enregistrement, et les taux d’USV restent stables chez les individus. Les paramètres de plage de fréquences et de durée se situent dans des plages spécifiques à chaque espèce attendues (par exemple, bande 30–90 kHz pour les USV de rats et bande 40–120 kHz pour les USV de souris) et dans un paradigme avec une séparation claire entre vocalisations simples et complexes. Le ratio de complexité fournit une mesure supplémentaire du comportement vocal, avec des déplacements vers des USV simples ou complexes qui peuvent refléter les effets des manipulations expérimentales. La figure 2 présente des résultats représentatifs d’une seule session d’enregistrement afin d’illustrer la classification et la distribution des USV entre types simples et complexes de VS, les schémas de modulation de fréquence et les bins de durée, et pour démontrer la détection et l’analyse réussies du comportement vocal à l’aide de cette méthode d’élicitation. Plus précisément, la Figure 2A montre le nombre total de VSV identifiés classés en différents types simples et complexes ; La figure 2B montre la distribution des USV à travers les schémas de modulation de fréquence (profils plats, ascendants, descendants et complexes) ; et la Figure 2C présente la distribution des VSU regroupées par durée totale.

Les ensembles de données représentatifs issus d’expériences réussies démontrent la variabilité entre les animaux au départ et entre groupes expérimentaux ou moments temporels. Les données présentées à la Figure 3 proviennent d’un ensemble de données indépendant publié utilisant des rats Long-Evan âgés de 5 à 7 mois et démontrent comment l’état physiologique (par exemple, manipulations hormonales ou d’hydratation) peut se refléter dans des caractéristiques acoustiques quantifiables de l’USV, telles que la durée, la puissance ou la plage defréquences 37. Ces résultats sont présentés comme des exemples de la manière dont le protocole permet l’extraction et l’analyse des jeux de données USV exportés à partir du logiciel, plutôt que comme des preuves définitives d’effets biologiques. En revanche, la Figure 4 présente des données pilotes non publiées d’une seule souche de souris (souris A53T alpha-synucléine surexpressée) et d’une tranche d’âge (3 à 5 mois) subissant un paradigme d’entraînement vocal, dans lequel aucune différence significative n’a été observée entre les groupes témoins et entraînés. Cet exemple démontre la capacité du protocole à capturer à la fois des résultats variables et nuls, ce qui souligne l’importance d’une optimisation et d’une validation spécifiques à l’étude. Ensemble, ces ensembles illustrent les résultats analytiques générés par le protocole chez les rats et souris de laboratoire.

En revanche, les enregistrements sous-optimaux se caractérisent par un bruit de fond excessif, une netteté du spectrogramme réduite ou une détection incohérente du VUS. Pour ce protocole, les enregistrements sont considérés comme sous-optimaux lorsque l’inspection visuelle du spectrogramme indique un bruit de fond qui masque considérablement la structure du VSU dans la plage de 20 à 100 kHz, ou lorsque des artefacts de bruit (par exemple, le bruit à large bande ou les signaux liés au mouvement) entraînent des faux positifs dépassant ~10 % des événements totaux détectés lors de la revue manuelle. Les enregistrements sont également considérés comme sous-optimaux lorsque les conditions signal-rapport bruit empêchent une discrimination visuelle claire des USV de l’activité de fond (c’est-à-dire l’incapacité à distinguer de manière fiable les contours des USV du bruit de base sur la majeure partie de l’enregistrement). Dans ces cas, les sessions sont exclues ou réanalysées après ajustement des paramètres de détection. Un conditionnement comportemental sous-optimal peut entraîner un nombre faible ou très variable de VSN entre les séances. Les enregistrements produisant une production de VSN nettement réduite (par exemple, un nombre total de VSV >50 % inférieur par rapport à la médiane de cohorte au début pour une condition expérimentale donnée) sont examinés pour détecter d’éventuels problèmes d’acclimatation ou déviation procédurale. Dans ces cas, le nombre total de USV et le taux USV sont souvent réduits, et les paramètres acoustiques extraits peuvent sortir des plages attendues ou présenter une grande variabilité. D’autres indicateurs de résultats sous-optimaux incluent une classification incomplète ou inexacte des USV, souvent résultant de paramètres de détection inappropriés ou d’une mauvaise qualité d’enregistrement. Une mauvaise classification peut être présente par une surreprésentation des types simples ou courts de VSL ou par une incapacité à détecter les vocalisations multi-éléments (complexes). Les enregistrements sont signalés pour réanalyse lorsque la classification automatisée montre un accord de <85 % avec l’inspection manuelle dans les sous-ensembles examinés. Ces problèmes peuvent être identifiés lors du contrôle qualité en comparant les caractéristiques du spectrogramme avec des classifications assignées et en examinant les résultats résumés pour les distributions atypiques dans les motifs au niveau des cohortes.

L’application réussie de ce protocole est confirmée par (1) une visualisation claire des VSU dans les spectrogrammes, (2) une détection et une classification cohérentes entre les séances, et (3) une variation stable ou biologiquement interprétable des mesures de résultats quantitatives. Lorsque ces critères sont remplis, la méthode propose une approche sensible et reproductible pour évaluer les changements du comportement vocal et de la fonction laryngée à travers les conditions expérimentales.

figure-results-1
Figure 1 : Exemples de spectrogrammes bruts et traités de VSU représentatifs utilisés pour l’analyse acoustique. Cette figure présente des données pilotes non publiées issues d’une étude sur le vieillissement des rats. Des spectrogrammes bruts et traités représentent un USV simple (supérieur) et complexe (inférieur) produit par une rat ovariectomisée Sprague-Dawley de 15 mois, généré à l’aide d’un logiciel de classification des appels. Axe des X = temps (ms) ; Axe Y = fréquence (kHz) ; gradient de couleur = puissance (dB), avec le jaune/vert indiquant une puissance plus élevée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-2
Figure 2 : Exemples de résumés USV à partir d’une seule session d’enregistrement. Cette figure présente des données pilotes non publiées issues d’une étude de faisabilité sur l’entraînement vocal. La classification représentative résulte d’un enregistrement de 10 minutes au départ d’un souris transgénique mâle de 3 mois surexprimant de l’alpha-synucléine à partir d’un jeu de données pilote d’entraînement vocal. (A) Total des USV identifiés catégorisés par type de classification, démontrant la répartition des USV simples et complexes au sein de la session (total des USV = 42). (B) Distribution des USV regroupés par modulation de fréquence (ΔF, kHz), incluant des schémas de modulation plats (ΔF ~0), ascendants, descendants et complexes. (C) Répartition des USV regroupées par durée totale (Td, ms). La détection et la classification des USV étaient réalisées à l’aide d’un logiciel avec des paramètres (y compris les seuils de détection et les règles de classification) définis dans la section Méthodes/Protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-3
Figure 3 : Résultats représentatifs de l’USV lors des manipulations hormonales et d’hydratation chez Long-Evans. Ce chiffre est reproduit à partir de données publiées dans le Journal of Speech, Language, and HearingResearch 37. Les mesures du VSS sont montrées avant et après l’hydratation dans trois groupes hormonaux (Témoin ; OVX + Estradiol [OVX + E2] ; OVX + Placebo [OVX + PL]) et deux états d’hydratation (euhydratation [EUHY] ; déshydratation [DEHY]) avec N = 8 animaux par groupe (âge : 5–7 mois). Les métriques USV simples (colonne de gauche) et complexes (colonne de droite) sont représentées : nombre total d’USV (A,B), durée (C,D), plage de fréquences (E,F) et puissance maximale (G,H). Les graphiques à barres représentent les moyennes de groupe ± SEM, et les points individuels représentent les valeurs de chaque animal. Les motifs de remplissage des barres indiquent le groupe hormonal : solide = Témoins, barre = OVX + E2, hachuré = OVX + PL. Des analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de modèles généralisés linéaires à effets mixtes (GLMM) avec des tests de Wald de type III afin d’évaluer les effets du groupe hormonal, le statut d’hydratation et leur interaction. Des comparaisons post hoc ont été réalisées à l’aide de moyennes marginales estimées (moyens) avec correction de Tukey pour plusieurs tests. Les astérisques indiquent des différences statistiquement significatives (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-4
Figure 4 : Résultats représentatifs de l’USV sur la surexpression d’A53T alpha-synucléine chez les souris suivant un paradigme pilote d’entraînement vocal. Cette figure présente un ensemble de données pilote non publié généré pour une étude de faisabilité sur l’entraînement vocal. Les données proviennent de 8 souris au total (âge : 3–5 mois), réparties uniformément entre les groupes (Témoin : n = 4 ; Entraînement : n = 4) avec une représentation équilibrée par sexe (deux femelles et deux mâles par groupe) et une distribution génotypée (témoin : TG+ = 3, TG− = 1 ; Entraînement : TG+ = 2, TG− = 2). Les indicateurs USV sont présentés en pourcentage de variation entre la pré- et la post-formation pour chaque génotype, regroupés entre sexes. Les USV simples (rangée du haut) et complexes (rangée du bas) sont tracés séparément pour le nombre total de USV, la durée, la plage de fréquences et l’intensité maximale. Les graphiques à barres représentent les moyennes de groupe ± SEM, et les points individuels représentent les valeurs de chaque animal. La formation consistait en un paradigme de conditionnement vocal eau-récompense de 5 jours, dans lequel les souris subissaient une légère restriction d’eau et étaient entraînées à émettre des USV en réponse à la délivrance de récompense d’eau dans la chambre d’enregistrement. Les différences de groupe entre les conditions témoins et d’entraînement ont été évaluées à l’aide de tests t à échantillons indépendants à deux queues (correction de Welch appliquée lorsque cela est approprié) sur les scores de changement normalisés pour chaque caractéristique USV. Aucune différence significative n’a été observée entre les groupes témoins et entraînés dans ce jeu de données pilote. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : Configuration logicielle de vocalisation ultrasonique (USV).Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Logiciel de vocalisation ultrasonique (USV) - Enregistrement de test.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Logiciel de vocalisation ultrasonique (USV) - Session de test de création.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Logiciel de vocalisation ultrasonique (USV) - session de test ouverte.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : Logiciel de vocalisation ultrasonique (USV) - Enregistrement exécuté.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Logiciel de vocalisation ultrasonique (USV) - Fin de la session de test.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole actuel propose une approche reproductible pour susciter des vocalisations ultrasoniques appétitives à 50 kHz (USV) en utilisant un paradigme nourriture-récompense, avec plusieurs étapes critiques nécessaires pour garantir des résultats cohérents et interprétables. Avant tout, la manipulation et l’acclimatation des animaux sont essentielles pour réduire la variabilité liée au stress dans la productionvocale 13. La manipulation quotidienne dans des conditions contrôlées et l’habituation systématique à la chambre d’essai favorisent un comportement anticipatoire fiable et une production stable de VSN sur plusieurs sessions. Le conditionnement comportemental à la récompense alimentaire est une autre étape clé ; un conditionnement incohérent ou insuffisant peut entraîner de faibles taux de vocalisation ou une forte variabilitéinter-animale 6,34. Maintenir des conditions de personnel et de test cohérentes, y compris l’enregistrement pendant le cycle sombre ou sous la lumière rouge, l’élimination des sources de bruit environnemental et la standardisation de la configuration des chambres, est tout aussi crucial pour optimiser la qualité du signal et minimiser lesartefacts 5. Sans ces contrôles, il devient difficile de déterminer si les changements dans les USV reflètent un comportement ou simplement du bruit introduit par l’environnement d’enregistrement.

Ce protocole est conçu avec flexibilité pour accommoder des modifications basées sur des besoins expérimentaux spécifiques. Par exemple, le type et la nouveauté des récompenses alimentaires appétissantes peuvent être ajustés pour maintenir la motivation au fil des séances répétées, en particulier dans les études longitudinales ou sur modèles de maladies. La durée des sessions d’acclimatation et d’enregistrement peut également être modifiée en fonction de l’espèce, de la souche ou des contraintes expérimentales. Le dépannage des problèmes courants consiste principalement à traiter une faible puissance USV ou un bruit excessif. De faibles taux de vocalisation peuvent souvent être améliorés en prolongeant les périodes de conditionnement, en augmentant la saillance de la récompense ou en confirmant que les animaux sont testés pendant leur phase active. Les artefacts acoustiques peuvent être minimisés en assurant un nettoyage adéquat des chambres entre les animaux, en éliminant la litière et les matériaux superflus, et en vérifiant la cohérence des paramètres de positionnement et d’enregistrement des microphones. De plus, la randomisation des animaux entre les chambres d’enregistrement aide à réduire la variabilité potentielle spécifique à chaque chambre et améliore la rigueur expérimentale.

Une force majeure de cette méthode réside dans son alignement avec les efforts récents de standardisation des méthodologies de VUSV chez rats et souris de laboratoire, comme le soulignent Shembel et al. (2025)5. La standardisation à travers les paradigmes d’élicitation, les environnements d’enregistrement et les pipelines d’analyse est essentielle pour améliorer la reproductibilité et permettre des comparaisons croisées. Ce protocole répond directement à ces priorités en mettant en œuvre des procédures d’acclimatation structurées, une présentation contrôlée des stimuli et des conditions d’enregistrement cohérentes. L’utilisation d’un paradigme nourriture-récompense favorise une élicitation fiable et reproductible des VSU et réduit la variabilité comportementale associée aux paradigmes sociaux ou basés sur l’accouplement 5,28. L’enregistrement pendant la phase active des animaux et la minimisation du bruit environnemental correspond également aux recommandations des meilleures pratiques visant à optimiser la qualité du signal et la pertinence biologique5. De plus, l’utilisation de mesures acoustiques définies des résultats, incluant le nombre USV, le débit, la plage de fréquences, la durée, la puissance maximale et le rapport de complexité, soutient des pratiques d’analyse transparentes et standardisées, qui sont cruciales compte tenu de la variabilité des approches de classification dans le champ5.

L’interprétation des VSU diffère également de manière significative entre rats et souris et doit être prise en compte lors de l’application de ce protocole entre espèces. Chez les rats, les vocalisations ultrasoniques à 50 kHz sont des marqueurs bien établis d’états affectifs positifs et liés à la récompense. En revanche, les VS-e-fus chez la souris sont plus hétérogènes tant dans leur structure acoustique que dans le contexte comportemental, et les VS-e-fus situées dans des plages de fréquences hautes similaires ne correspondent pas aussi directement à la valence affective. Au contraire, les USV de souris peuvent refléter une combinaison de communication sociale, d’excitation et d’états comportementaux dépendants du contexte. En conséquence, le protocole actuel considère les USV comme des relevés comportementaux spécifiques à chaque espèce plutôt que comme un marqueur affectif unique chez les rats de laboratoire et les souris. Malgré ses forces, plusieurs limites doivent être prises en compte lors de l’application de cette méthode. Bien que le paradigme nourriture-récompense réduise les confusions hormonales et sociales, il capture spécifiquement les vocalisations appétitives et axées sur la récompense et peut ne pas se généraliser à d’autres contextes comportementaux tels que la détresse ou la communication sociale. La motivation pour les récompenses alimentaires peut également varier selon les animaux, les conditions expérimentales ou les états pathologiques, pouvant potentiellement influencer la sortie vocale indépendamment de la fonction motricevocale 6,34. Il est important de noter que les ensembles de données représentatifs présentés ici proviennent d’une seule souche de rats de laboratoire et d’une seule souche de souris de laboratoire, ce qui limite la généralisabilité. Bien que le protocole soit conçu pour être applicable aux rats et souris de laboratoire, des différences spécifiques à chaque espèce et souche dans le comportement vocal, la réponse au conditionnement et les caractéristiques acoustiques doivent être attendues, et une validation plus large entre souches et contextes expérimentaux est justifiée. De plus, bien que les logiciels de classification automatisés facilitent une analyse à haut débit, la variabilité des seuils de détection et des algorithmes de classification peut affecter la comparabilité entre les études. Le protocole est présenté à l’aide d’un système intégré de reproductibilité, mais il est conçu pour être largement adaptable sur plusieurs plateformes d’enregistrement ultrasonique avec des spécifications équivalentes. Une validation minutieuse des paramètres d’analyse et un rapport cohérent des caractéristiques acoustiques sont donc nécessaires pour garantir la fiabilité des données. Enfin, le besoin d’équipements spécialisés d’enregistrement ultrasonore et de chambres atténuantes peut limiter l’accessibilité pour certains laboratoires.

Il est important de noter que les résultats représentatifs inclus dans ce protocole intègrent une combinaison d’ensembles de données hétérogènes, incluant des exemples d’une seule session, des données d’entraînement pilote et des résultats expérimentaux illustratifs. Ces exemples visent à démontrer la gamme des résultats attendus et des approches analytiques courantes, plutôt qu’à fournir des conclusions biologiques définitives. Ainsi, ces ensembles de données doivent être interprétés comme des démonstrations méthodologiques plutôt que comme des résultats basés sur des hypothèses. De plus, des références à des ensembles de données publiés ou non publiés sont incluses pour illustrer les applications potentielles du protocole, mais ne doivent pas être interprétées comme des résultats validés dans le contexte de ce rapport axé sur les méthodes.

L’importance de cette méthode réside dans sa capacité à fournir un paradigme contrôlé et non social pour l’étude du comportement vocal tout en respectant les normes émergentes de rigueur méthodologique et de reproductibilité. En éliminant les variables liées à l’accouplement et en standardisant les conditions d’elicitation et d’enregistrement, cette approche offre des avantages évidents par rapport aux paradigmes traditionnels, notamment lorsque l’objectif est d’isoler les influences physiologiques sur la production vocale indépendamment du contexte social. Le protocole est particulièrement adapté aux applications dans les modèles de maladies neurodégénératives, les études de manipulation endocrinienne et les études sur la fonction sensorimo-mère crânienne, où la minimisation des variables de confusion est cruciale. Plus largement, cette méthode contribue aux efforts continus d’harmonisation des pratiques de recherche sur les VSU et fournit un cadre standardisé pour susciter et quantifier le comportement vocal. Bien qu’une telle standardisation soit une étape nécessaire pour évaluer le potentiel des VSU en tant que biomarqueurs translationnels de la fonction affective et sensorimotrice, le protocole actuel n’établit pas, en soi, la validité des biomarqueurs. Au contraire, elle permet l’acquisition et l’analyse cohérentes des données nécessaires pour que les études futures testent rigoureusement leur pertinence translationnelle.

Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de conflits d’intérêts pertinents.

Remerciements

Les travaux inclus dans cet article ont été partiellement soutenus par le National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD) des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de subvention R01DC0020179, une subvention de recherche New Investigators (A.J.S.) de l’American Speech-Language Hearing Foundation, des subventions Collins Medical Trust (A.J.S.) et des fonds de démarrage accordés à A.J.S. par l’Université Purdue.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
70% ethanolFisher ScientificBP28184Utilisé pour nettoyer la chambre entre les animaux
Traits supplémentaires appétissants (par exemple, cacahuètes décortiquées)Bio-ServF6711Variation de récompense facultative pour maintenir l'engagement
Station de transfert d'animaux (si utilisé)NUAIREAllerGard NU-621Fournit un environnement de manipulation contrôlé pendant la socialisation de l'expérimentateur (si applicable à votre protocole)
Rideau/nappe occultantMainstays (Walmart)https://www.walmart.com/ip/Mainstays-Super-Soft-Brushed-Microfiber-Bed-Sheet-Set-Rich-Black-King-4-Piece/12946065251Utilisé pour éliminer la lumière ambiante et les perturbations sonores externes pendant le transfert
Chariot (transport)Metro13-460-126Soutient les cages pendant le transfert
Interface d'acquisition/ordinateurWindows10 Professional 64bitDoit répondre aux exigences du logiciel Sonotrack; utilisé pour l'enregistrement et le stockage des données
Périphérique de stockage de données (disque dur externe/serveur)GlyphBBPR4000Pour le stockage sécurisé de grands fichiers acoustiques
Fruit LoopsKellogg's4119210032Récompense alimentaire appétissante pour maintenir la nouveauté et la motivation
Garden Veggie StrawsSensible Portions829515300494Récompense alimentaire appétissante pour maintenir la nouveauté et la motivation
Détergent de laboratoire (savon doux)Dawn91064Utilisé pour le nettoyage post-session des cages et des inserts
Serviette en papierToolBox5520208Utilisé avec de l'éthanol pour le nettoyage
Cages d'enregistrement en polycarbonate (sans litière)UNO Life Science Solutions31200260Utilisé avec la chambre d'enregistrement pour minimiser les artefacts de bruit
EPI : blouse de laboratoire jetableFisherbrand12-893-005XXLPrévient la contamination et le transfert d'odeurs
EPI : gants en nitrileAnsell19-168-967DPrévient la contamination et le transfert d'odeurs
Système d'éclairage rougeKenallhttps://kenall.com/Animal-Research-Lab-Lighting#:~:text=Red%20LED%20lighting%20is%20ideal%20for%20animal%20research,for%20nocturnal%20animals%20such%20as%20mice%20and%20rats.Éclairage à faible visibilité pour maintenir le cycle de lumière inverse tout en permettant la visibilité de l'expérimentateur
Reese's PuffsGeneral Mills10016000275666Récompense alimentaire appétissante pour maintenir la nouveauté et la motivation
SmartChamber pour souris et ratsMetrisSC-B100Chambre d'atténuation sonore pour l'enregistrement des vocalisations ultrasonores
Logiciel de classification automatisée des appels Sonotrack (v1.4)MetrisST-S400Utilisé pour la détection, la classification et l'exportation des paramètres acoustiques des USV
Configuration de base SonotrackMetrisST-R2P0-MMatériel d'acquisition de données pour l'enregistrement ultrasonore
Microphone à ultrasons haut de gamme SonotrackMetrisST-B200Gamme de fréquences ~15-125 kHz pour la détection des USV des rongeurs
Cages domestiques standardInnoviveM-BTM (Souris); R-BTM-H (Rat)Cages de logement/transfert standard
MinuteurFisherbrand06-664-251Assure des sessions d'enregistrement standardisées de 10 minutes

Références

  1. Brudzynski SM. Principles of rat communication: Quantitative parameters of ultrasonic calls in rats. Behav Genet. 2005;35(1):85-92.
  2. Johnson AM et al. Ultrasonic output from the excised rat larynx. J Acoust Soc Am. 2010;128(2):EL75-EL79.
  3. Kelm-Nelson CA, Lenell C, Johnson AM, Ciucci MR. Laryngeal activity for production of ultrasonic vocalizations in rats. In: Brudzynski SM, ed. Handbook of Behavioral Neuroscience. Vol 25. Elsevier; Amsterdam, Netherlands; 2018:37-43.
  4. Lenell C, Broadfoot CK, Schaen-Heacock NE, Ciucci MR. Biological and acoustic sex differences in rat ultrasonic vocalization. Brain Sci. 2021;11(4):4.
  5. Shembel AC et al. The role of ultrasonic vocalizations in rat laryngological investigations. Physiol Behav. 2025;294:114887.
  6. Brenes JC, Schwarting RKW. Individual differences in anticipatory activity to food rewards predict cue-induced appetitive 50-kHz calls in rats. Physiol Behav. 2015;149:107-118.
  7. McGinnis MY, Vakulenko M. Characterization of 50-kHz ultrasonic vocalizations in male and female rats. Physiol Behav. 2003;80(1):81-88.
  8. Chabout J et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PLoS One. 2012;7(1):e29401.
  9. Mun HS, Lipina TV, Roder JC. Ultrasonic vocalizations in mice during exploratory behavior are context-dependent. Front Behav Neurosci. 2015;9.
  10. Simola N, Granon S. Ultrasonic vocalizations as a tool in studying emotional states in rodent models of social behavior and brain disease. Neuropharmacology. 2019;159:107420.
  11. Premoli M et al. Mouse and rat ultrasonic vocalizations in neuroscience and neuropharmacology: State of the art and future applications. Eur J Neurosci. 2023;57(12):2062-2096.
  12. Scattoni ML, Crawley J, Ricceri L. Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders. Neurosci Biobehav Rev. 2009;33(4):508-515.
  13. Venkatraman A et al. Stress-induced ultrasonic vocalization in laboratory rats and mice: A scoping review. Brain Sci. 2024;14(11):1109.
  14. Johnson AM, Ciucci MR, Connor NP. Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats. J Gerontol Ser A. 2013;68(12):1458-1468.
  15. Lenell C, Newkirk B, Johnson AM. Laryngeal neuromuscular response to short- and long-term vocalization training in young male rats. J Speech Lang Hear Res. 2019;62(2):247-256.
  16. Shembel AC, Lenell C, Chen S, Johnson AM. Effects of vocal training on thyroarytenoid muscle neuromuscular junctions and myofibers in young and older rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 2021;76(2):244-252.
  17. Brudzynski SM. Pharmacology of ultrasonic vocalizations in adult rats: Significance, call classification and neural substrate. Curr Neuropharmacol. 2015;13(2):180-192.
  18. Kelm-Nelson CA, Brauer AFL, Ciucci MR. Vocal training, levodopa, and environment effects on ultrasonic vocalizations in a rat neurotoxin model of Parkinson disease. Behav Brain Res. 2016;307:54-64.
  19. Grant LM et al. Noradrenergic receptor modulation influences the acoustic parameters of pro-social rat ultrasonic vocalizations. Behav Neurosci. 2018;132(4):269-283.
  20. Rudisch DM et al. Early ultrasonic vocalization deficits and related thyroarytenoid muscle pathology in the transgenic TgF344-AD rat model of Alzheimer’s disease. Front Behav Neurosci. 2024;17:1294648.
  21. Rodgers B, Schaser A. Alpha-synuclein overexpression does not cause vocalization deficits in a mouse model of Parkinsonism. Biol Open. 2025;14(9):bio062120.
  22. Caruso A, Ricceri L, Scattoni ML. Ultrasonic vocalizations as a fundamental tool for early and adult behavioral phenotyping of Autism Spectrum Disorder rodent models. Neurosci Biobehav Rev. 2020;116:31-43.
  23. Riede T. Subglottal pressure, tracheal airflow, and intrinsic laryngeal muscle activity during rat ultrasound vocalization. J Neurophysiol. 2011;106(5):2580-2592.
  24. Riede T. Stereotypic laryngeal and respiratory motor patterns generate different call types in rat ultrasound vocalization. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 2013;319(4):213-224.
  25. Riede T, Borgard HL, Pasch B. Laryngeal airway reconstruction indicates that rodent ultrasonic vocalizations are produced by an edge-tone mechanism. R Soc Open Sci. 2017;4(11):170976.
  26. Inagi K, Schultz E, Ford CN. An anatomic study of the rat larynx: Establishing the rat model for neuromuscular function. Otolaryngol Head Neck Surg. 1998;118(1):74-81.
  27. Håkansson J et al. Aerodynamics and motor control of ultrasonic vocalizations for social communication in mice and rats. BMC Biol. 2022;20(1):3.
  28. Lenell C, Johnson AM. The effects of the estrous cycle, menopause, and recording condition on female rat ultrasonic vocalizations. Physiol Behav. 2021;228:113248.
  29. Lenell C, Sandage MJ, Johnson AM. A tutorial of the effects of sex hormones on laryngeal senescence and neuromuscular response to exercise. J Speech Lang Hear Res. 2019;62(3):602-610.
  30. Garcia AN et al. The effects of long-term estradiol treatment on social behavior and gene expression in adult female rats. Horm Behav. 2017;87:145-154.
  31. Matochik JA, White NR, Barfield RJ. Variations in scent marking and ultrasonic vocalizations by Long-Evans rats across the estrous cycle. Physiol Behav. 1992;51(4):783-786.
  32. Thomas DA, Barfield RJ. Ultrasonic vocalization of the female rat (Rattus norvegicus.) during mating. Anim Behav. 1985;33(3):720-725.
  33. Hanson JL, Hurley LM. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PLoS One. 2012;7(7):e40782.
  34. Opiol H, Pavlovski I, Michalik M, Mistlberger RE. Ultrasonic vocalizations in rats anticipating circadian feeding schedules. Behav Brain Res. 2015;284:42-50.
  35. Hinchcliffe JK, Jackson MG, Robinson ES. The use of ball pits and playpens in laboratory Lister Hooded male rats induces ultrasonic vocalisations indicating a more positive affective state and can reduce the welfare impacts of aversive procedures. Lab Anim. 2022;56(4):370-379.
  36. Wright JM, Gourdon JC, Clarke PBS. Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: Effects of amphetamine and social context. Psychopharmacology (Berl). 2010;211(1):1-13.
  37.  Dwenger K et al. Impact of circulating estrogen and dehydration on ultrasonic vocalization in female rats. J Speech Lang Hear Res. 2026;1-21

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

ComportementNuméro 233MédecineNuméro 233Numéro 233Valeur videNuméroVocalisation des rongeursParadigme de récompense alimentaireConditionnement comportementalAnalyse acoustiqueContrôle moteur vocalFonction laryngéeneurodégénérescencealpha-synucléineFonction sensorimotrice crânienneHormonesHydratation
Déclenchement anticipé de vocalisations ultrasoniques appétitives chez les rats et souris de laboratoire
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.