Imagerie standardisée par immunofluorescence des nanotubes en tunnel et transfert mitochondrial entre astrocytes et neurones

Résumé

Ce protocole standardise les méthodes de fixation, de coloration et d’imagerie confocale pour visualiser les nanotubes en tunnel et le transfert mitochondrial entre astrocytes et neurones in vitro.

Résumé

Les mitochondries sont des organites essentiels qui régulent la production d’énergie, la signalisation cellulaire et l’homéostasie métabolique dans les cellules neuronales. Les nanotubes tunneliers (TNT) sont de fines structures membraneuses qui médiatisent la communication intercellulaire à longue distance et facilitent le transfert de composants cellulaires, y compris les mitochondries, entre les cellules connectées. La visualisation fiable des TNT et du transfert mitochondrial nécessite une manipulation minutieuse des échantillons car ces structures sont très fragiles et sensibles aux conditions de fixation, de lavage et d’imagerie. Ce protocole décrit des procédures standardisées pour la fixation, la coloration et l’imagerie confocale des TNT dans les astrocytes et les systèmes de coculture astrocyte–neurone. Le flux de travail comprend la coloration membranaire et cytosquelettique pour la visualisation du TNT, le marquage mitochondrial pour le suivi de la localisation mitochondriale, et la coloration par immunofluorescence pour l’analyse de la localisation Miro1. Des étapes cruciales pour préserver la morphologie du TNT, notamment un lavage doux et une manipulation à l’abri de la lumière, sont mises en avant tout au long de la procédure. Le protocole décrit également des approches d’imagerie pour la caractérisation des TNT et des mitochondries dans des préparations à cellules fixes. Ces méthodes fournissent un cadre expérimental reproductible pour étudier la formation de TNT et le transfert mitochondrial entre cellules neuronales in vitro.

Introduction

Les mitochondries servent d’usines énergétiques de la cellule, fournissant l’énergie nécessaire aux activités cellulaires grâce à la production d’adénosine triphosphate tout en jouant un rôle important dans la transduction du signal cellulaire et l’équilibre^{redox 1}. Dans le système nerveux, les métabolites mitochondriaux peuvent augmenter la complexité et l’excitabilité des processus neuronaux, soutenant ainsi la croissance et le développement^{neuronaux 2}. Les mitochondries ne sont pas des organites statiques ; ils modifient continuellement leur morphologie, leur localisation et leur distribution pour s’adapter à divers stress et exigences métaboliques intracellulaires^{et extracellulaires 3}. Le transfert mitochondrial intercellulaire contribue au maintien de l’homéostasie tissulaire et favorise le développement dans des conditions physiologiques, tandis que dans des conditions pathologiques, il participe à la réparation des dommages, à la régulation immunitaire et à la progression^{de la maladie 4,5}.

La communication intercellulaire des matériaux et de l’énergie est essentielle pour divers processus biologiques, notamment l’homéostasie cellulaire, la réparation tissulaire et la régulation des réseaux neuronaux. Des études actuelles ont révélé plusieurs modes de communication intercellulaire, parmi lesquels les nanotubes tunneliers (TNT) représentent l’un des mécanismes les plus étudiés associés au transfert mitochondrial^{intercellulaire 6}. Les TNT sont des structures membranaires en forme de pont à base de F-actine, avec une morphologie tubulaire, allant de 50 à 200 nm de diamètre et s’étendant jusqu’à plusieurs diamètres cellulaires en^{longueur 7}. Des recherches ont montré que les TNT peuvent servir de connexions physiques entre les cellules neuronales et sont étroitement associés à l’apparition et à la progression de maladies neurodégénératives, de cancers du cerveau et d’autres troubles. Par exemple, le transfert mitochondrial de la microglie vers les neurones via les TNT a été rapporté comme sauvant les cellules^{neuronales 8,9}.

La recherche actuelle sur les TNT rencontre souvent plusieurs défis, notamment la fragilité structurelle des TNT, qui les rend sujets à la casse et peuvent par conséquent affecter les résultats expérimentaux ; difficulté à distinguer les TNT des filopodies ou d’autres protubérances membranaires ; et les défis liés à la quantification précise des TNT intercellulaires. Pour améliorer la reproductibilité et la cohérence des études liées au TNT, des méthodes standardisées de lavage, fixation, coloration et imagerie des TNT sont nécessaires afin de permettre une évaluation précise de leur structure et de leur distribution tout en minimisant la variabilité expérimentale. Des facteurs tels que la densité cellulaire avant la fixation, la protection contre la lumière, l’intensité du lavage, la durée de fixation et les conditions de coloration post-fixation peuvent tous influencer la structure et la stabilité des TNT. Dans cette étude, nous décrivons les procédures de prétraitement, de coloration et d’imagerie confocale des TNT et des structures de TNT associées aux mitochondries dans les systèmes d’astrocytes et de cultures astrocytes-neurones.

Ce protocole de recherche peut généralement être appliqué à la plupart des laboratoires. La validation dans des astrocytes primaires et une lignée cellulaire neuronale hippocampique de souris a confirmé que le protocole convient à la fois aux cellules neuronales primaires et aux lignées cellulaires immortalisées. Cependant, ce protocole présente encore plusieurs limitations. La microscopie confocale offre une résolution spatiale inférieure à celle des approches d’imagerie à super-résolution pour la visualisation de TNT, et l’évaluation du transfert mitochondrial basée sur MitoTracker peut être affectée par la fuite de colorant et l’interférence du signal^{non mitochondrial 10}.

Protocole

Cette étude n’a pas impliqué de sujets humains ni d’animaux vertébrés vivants ; seules des lignées cellulaires commercialement acquises ou établies étaient utilisées, et aucune approbation éthique n’était requise.

1. Coloration pour les TNT dans les astrocytes

1. Ensemencement cellulaire
   1. Graines isolent les astrocytes primaires de rats au passage 3 (P3) dans des vases de culture à fond vitreux de 35 mm à une densité de 5 × 10⁴ cellules par plat. Ajoutez 2 mL de mélange complet F-12 (DMEM/F-12) Eagle Modified Medium Modified Dulbecco, complété avec un mélange antibiotique triple à 10 % (pénicilline G, streptomycine et amphotéricine B). Cultivez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
   2. Incubez les cellules pendant environ 24 heures jusqu’à ce que l’attache se produise.
2. Prétraitement et fixation
   1. Transférez les bolles de culture sur un établi propre sous des conditions protégées de la lumière après l’attache des cellules.
      REMARQUE : Minimisez les mouvements et vibrations inutiles lors de la manipulation afin de préserver l’intégrité du TNT.
   2. Retirez doucement le milieu de culture dans des conditions de faible luminosité.
      REMARQUE : Éviter le séchage complet de la surface cellulaire lors de l’élimination du milieu car les TNT peuvent s’effondrer et s’attacher au substrat de culture.
   3. Lavez doucement les cellules une fois avec 500 μL de solution physiologique phosphatée (PBS) sans ions calcium et magnésium (pH 7,3–7,5). Ajoutez et retirez lentement le PBS le long de la paroi de la cuve de culture pour éviter de perturber les TNT intercellulaires pendant le lavage.
   4. Retirez le PBS avec précaution.
   5. Fixez les cellules avec une solution fixative commerciale à 4 % contenant du paraformaldéhyde (pH 7,2–7,4) pendant 30 minutes à température ambiante (RT ; 20°C–25°C) dans des conditions de faible luminosité.
      ATTENTION : Manipulez les solutions fixatrices en utilisant un équipement de protection individuelle approprié et effectuez toutes les procédures conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
   6. Retirez la solution fixative.
   7. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
3. Perméabilisation cellulaire et coloration fluorescente
   1. Perméabiliser les cellules avec 500 μL de solution de perméabilisation Triton X-100 prête à l’emploi pendant 20 minutes à la RT.
      ATTENTION : Le Triton X-100 peut perturber des structures fragiles en TNT. Minimisez l’agitation excessive lors de la perméabilisation.
   2. Retirez la solution de perméabilisation.
   3. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
   4. Préparez la solution de teinture immédiatement avant utilisation. Diluez le colorant F-actine dans PBS à une concentration finale de 1 μM et utilisez 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme coloration nucléaire prête à l’emploi. Mélangez soigneusement les deux solutions de teinture avant utilisation.
      REMARQUE : Les réactifs de coloration à base de phaloïdines peuvent être utilisés comme alternatives à la visualisation de la F-actine.
   5. Mélangez la F-actine et les solutions de coloration nucléaire à un ratio 1:1 (volumes égaux) dans des conditions protégées par la lumière.
   6. Ajoutez la solution de coloration préparée aux plats de culture.
   7. Incubez les cellules pendant 30 minutes à 37°C dans le noir.
   8. Enlève la solution tachante.
   9. Lavez les cellules trois fois avec du PBS en utilisant 500 μL par lavage pendant 1 minute à chaque lavage.
   10. Ajoutez 1 mL de PBS pour empêcher les cellules de sécher lors de la préparation par imagerie.
4. Imagerie confocale
   1. Acquérez des images à l’aide d’un microscope confocal inversé Nikon équipé d’un objectif ×20. Utilisez une excitation de 405 nm pour le DAPI et une excitation de 488 nm pour la coloration en F-actine. Capturez des images à une résolution de 1024 × 1024 pixels sous des conditions protégées par la lumière à RT.
   2. Effectuer une évaluation qualitative et une quantification manuelle en utilisant au moins cinq champs de vision sélectionnés au hasard par échantillon. Quantifiez le nombre de TNT et le nombre de cellules TNT positives contenant un ou plusieurs TNT dans chaque champ de vision (Figures 1A et 1B).
      REMARQUE : Acquérir des images immédiatement après la coloration afin de minimiser la perte de fluorescence et la perturbation structurelle des TNT.

Figure 1 : Coloration par fluorescence des nanotubes en tunnel (TNT) dans les astrocytes. (A) Images représentatives de microscopie confocale montrant la coloration nucléaire et F-actine dans les astrocytes cultivés dans des vases de culture à fond de verre. (B) Vue agrandie de la région encapsulée dans le panneau A. Des flèches blanches indiquent des structures similaires à du TNT entre les cellules adjacentes. (C) Images représentatives montrant des structures de type TNT perturbées suite à une manipulation inappropriée des échantillons. (D) Vue agrandie de la région encaissée dans le panneau C. Les flèches jaunes indiquent des structures perturbées semblables à du TNT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Coloration pour le transfert mitochondrial des astrocytes vers les neurones via les TNT

1. Ensemencement des astrocytes et marquage mitochondrial
   1. Graines isolent les astrocytes primaires de rats au passage 3 (P3) dans des vases de culture à fond vitreux de 35 mm à une densité de 3 × 10⁴ cellules par plat. Ajoutez 2 mL de milieu complet DMEM/F-12 complété avec un mélange antibiotique triple à 10 % et 1 % (pénicilline G, streptomycine et amphotéricine B). Cultivez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
   2. Incubez les cellules pendant environ 24 heures jusqu’à ce que l’attache se produise.
   3. Transférez les bolles de culture sur un établi propre en conditions de faible luminosité après l’attache de la cellule.
      REMARQUE : Minimisez les mouvements et vibrations inutiles lors de la manipulation afin de préserver l’intégrité du TNT.
   4. Retirez doucement le milieu de culture dans des conditions protégées par la lumière. Évitez de perturber les TNT lors de l’extraction du substrat.
      REMARQUE : Éviter le séchage complet de la surface cellulaire lors de l’élimination du milieu car les TNT peuvent s’effondrer et s’attacher au substrat de culture.
   5. Reconstituer 50 μg de colorant MitoTracker lyophilisé dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution de 1 mM et stocker la solution à −20°C. Avant utilisation, diluez la solution d’origine dans 400 μL de milieu DMEM/F-12 complet, complétés avec un mélange antibiotique triple à 10 % et 1 % de triple antibiotique afin d’obtenir une concentration finale de MitoTracker de 50 μM.
      ATTENTION : Protégez les colorants fluorescents de l’exposition directe à la lumière lors des procédures de préparation et d’incubation.
   6. Ajoutez la solution de travail de coloration mitochondriale aux plats de culture.
   7. Incubez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ pendant 30 minutes dans des conditions à l’abri de la lumière.
   8. Retirez la solution de coloration mitochondriale dans des conditions protégées par la lumière.
   9. Lavez doucement les cellules une fois avec 500 μL de PBS sans ions calcium et magnésium (pH 7,3–7,5). Ajoutez et retirez lentement le PBS le long de la paroi de la cuve de culture pour éviter de perturber les TNT intercellulaires pendant le lavage.
   10. Retirez le PBS avec précaution.
2. Coculture astrocyte-neurone
   1. Graines immortalisées les cellules neuronales de l’hippocampe de la souris au passage 3 (P3) dans les plats de culture contenant des astrocytes à une densité de 3 × 10⁴ cellules par antenne. Ajoutez des cellules dans un volume total de 2 mL composé d’un mélange 1:1 de DMEM et de milieu complet DMEM/F-12, complété avec un mélange antibiotique à 10 % de FBS et un mélange à 1 % triple d’antibiotiques. Établir la coculture en utilisant une méthode de contact direct sans insertion Transwell. Cultivez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Ajoutez doucement les cellules neuronales pour minimiser la perturbation des structures préexistantes de TNT.
   2. Maintenir la coculture pendant 24 heures dans des conditions standard d’incubateur tout en protégeant les échantillons d’une exposition excessive à la lumière lors des procédures de manipulation.
3. Fixation et perméabilisation
   1. Retirez le milieu de culture dans des conditions protégées par la lumière.
   2. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
   3. Fixez les cellules avec une solution fixative cellulaire à 4 % contenant du paraformaldéhyde pendant 30 minutes à RT dans des conditions de faible luminosité.
      ATTENTION : Manipulez les solutions fixatrices en utilisant un équipement de protection individuelle approprié et effectuez toutes les procédures conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
   4. Retirez la solution fixative.
   5. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
   6. Perméabiliser les cellules avec 500 μL de solution de perméabilisation Triton X-100 prête à l’emploi pendant 20 minutes à RT dans des conditions de faible luminosité.
      ATTENTION : Le Triton X-100 peut perturber des structures fragiles en TNT. Minimisez l’agitation excessive lors de la perméabilisation.
   7. Retirez la solution de perméabilisation.
   8. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
4. Coloration et imagerie fluorescentes
   1. Préparez la solution de teinture immédiatement avant utilisation. Diluez le colorant F-actine dans PBS à une concentration finale de 1 μM et utilisez DAPI comme coloration nucléaire prête à l’emploi. Mélangez soigneusement les solutions de teinture avant utilisation.
      REMARQUE : Les réactifs de coloration à base de phaloïdines peuvent être utilisés comme alternatives à la visualisation de la F-actine.
   2. Mélangez les solutions de coloration F-actine et nucléaire à un ratio 1:1 (volumes égaux) dans des conditions protégées de la lumière juste avant utilisation.
   3. Ajoutez la solution de coloration préparée aux plats de culture.
   4. Incubez les cellules pendant 30 minutes à 37°C dans le noir.
   5. Enlève la solution tachante.
   6. Lavez les cellules trois fois avec du PBS en utilisant 500 μL par lavage pendant 1 minute à chaque lavage.
   7. Ajoutez 1 mL de PBS pour empêcher les cellules de sécher lors de la préparation par imagerie.
   8. Acquérez des images à l’aide d’un microscope confocal inversé Nikon équipé d’un objectif ×20. Utilisez l’excitation de 405 nm pour le DAPI, l’excitation de 488 nm pour la coloration F-actine, et l’excitation de 665 nm pour la coloration MitoTracker. Capturez des images à une résolution de 1024 × 1024 pixels sous des conditions protégées par la lumière à RT.
   9. Effectuer une évaluation qualitative en utilisant au moins cinq champs de vision sélectionnés au hasard par échantillon. Évaluer la présence de structures similaires à la TNT et de signaux de fluorescence associés aux mitochondries au sein des connexions intercellulaires de membranes (Figures 2A et 2B).
      REMARQUE : Acquérir des images immédiatement après la coloration afin de minimiser la perte de fluorescence et la perturbation structurelle des TNT.

Figure 2 : Coloration par fluorescence des mitochondries et des TNT dans un système de coculture astrocyte-neurone. (A) Images représentatives de microscopie confocale montrant la coloration nucléaire, mitochondriale et F-actine dans les astrocytes et neurones cultivés dans des plats de culture à fond de verre. Les astrocytes présentaient des morphologies irrégulières semblables à des étoiles ou polygonales avec des processus cellulaires étendus, tandis que les cellules neuronales apparaissaient rondes ou ovales avec des extensions minces semblables à des neurites. (B) Vue agrandie de la région enfermée dans le panneau A. Des flèches blanches indiquent des structures similaires à du TNT associées aux mitochondries entre les cellules. Les deux populations cellulaires ont été distinguées principalement en fonction de leur morphologie cellulaire caractéristique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Coloration par colocalisation par immunofluorescence pour les mitochondries et le Miro1 dans les TNTs

1. Ensemencement des astrocytes et marquage mitochondrial
   1. Graines isolent les astrocytes primaires de rats au passage 3 (P3) dans des vases de culture à fond vitreux de 35 mm à une densité de 3 × 10⁴ cellules par plat. Ajoutez 2 mL de milieu complet DMEM/F-12 complété avec un mélange antibiotique triple à 10 % et 1 % (pénicilline G, streptomycine et amphotéricine B). Cultivez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
   2. Incubez les cellules pendant environ 24 heures jusqu’à ce que l’attache se produise.
   3. Transférez les bolles de culture sur un établi propre en conditions de faible luminosité après l’attache de la cellule.
      REMARQUE : Minimisez les mouvements et vibrations inutiles lors de la manipulation afin de préserver l’intégrité du TNT.
   4. Retirez doucement le milieu de culture dans des conditions protégées par la lumière. Évitez de perturber les TNT lors de l’extraction du substrat.
      REMARQUE : Éviter le séchage complet de la surface cellulaire lors de l’élimination du milieu car les TNT peuvent s’effondrer et s’attacher au substrat de culture.
   5. Reconstituez 50 μg de colorant MitoTracker lyophilisé dans DMSO pour préparer une solution d’origine de 1 mM et stockez la solution d’origine à −20°C. Avant utilisation, diluez la solution d’origine dans 400 μL de milieu DMEM/F-12 complet, complétés avec un mélange antibiotique triple à 10 % et 1 % de triple antibiotique afin d’obtenir une concentration finale de MitoTracker de 50 μM.
      ATTENTION : Protégez les colorants fluorescents de l’exposition directe à la lumière lors des procédures de préparation et d’incubation.
   6. Ajoutez la solution de travail de coloration mitochondriale aux plats de culture.
   7. Incubez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂ pendant 30 minutes dans des conditions à l’abri de la lumière.
   8. Retirez la solution de coloration mitochondriale dans des conditions protégées par la lumière.
   9. Lavez doucement les cellules une fois avec 500 μL de PBS sans ions calcium et magnésium (pH 7,3–7,5). Ajoutez et retirez lentement le PBS le long de la paroi de la cuve de culture pour éviter de perturber les TNT intercellulaires pendant le lavage.
   10. Retirez le PBS avec précaution.
2. Coculture astrocyte-neurone
   1. Graines immortalisées les cellules neuronales de l’hippocampe de la souris au passage 3 (P3) dans les plats de culture contenant des astrocytes à une densité de 3 × 10⁴ cellules par antenne. Ajoutez des cellules dans un volume total de 2 mL composé d’un mélange 1:1 de DMEM et de milieu complet DMEM/F-12, complété avec un mélange antibiotique à 10 % de FBS et un mélange à 1 % triple d’antibiotiques. Établir la coculture en utilisant une méthode de contact direct sans insertion Transwell. Cultivez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Ajoutez doucement les cellules neuronales pour minimiser la perturbation des structures préexistantes de TNT.
   2. Maintenir la coculture pendant 24 heures dans des conditions standard d’incubateur tout en protégeant les échantillons d’une exposition excessive à la lumière lors des procédures de manipulation.
3. Fixation et perméabilisation
   1. Retirez le milieu de culture dans des conditions protégées par la lumière.
   2. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
   3. Fixez les cellules avec une solution fixative commerciale à 4 % de cellules tissulaires contenant du paraformaldéhyde (pH 7,2–7,4) pendant 30 minutes en RT dans des conditions de faible luminosité.
      ATTENTION : Manipulez les solutions fixatrices en utilisant un équipement de protection individuelle approprié et effectuez toutes les procédures conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
   4. Retirez la solution fixative.
   5. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
   6. Perméabiliser les cellules avec 500 μL de solution de perméabilisation Triton X-100 prête à l’emploi pendant 20 minutes à RT dans des conditions de faible luminosité.
      ATTENTION : Le Triton X-100 peut perturber des structures fragiles en TNT. Minimisez l’agitation excessive lors de la perméabilisation.
   7. Retirez la solution de perméabilisation.
   8. Lavez les cellules une fois avec du PBS.
4. Blocage et coloration par immunofluorescence
   1. Bloquez les cellules avec du sérum de chèvre à 5 % pendant 1 heure en RT dans des conditions de faible luminosité. Préparez la solution bloqueante en diluant le sérum de chèvre à 1:20 dans PBS.
   2. Retirez la solution de blocage.
   3. Diluer l’anticorps anti-Miro1 monoclonal de lapin dans PBS avec un ratio de dilution de 1:100. Ajoutez la solution primaire diluée d’anticorps aux plats de culture et incubez toute la nuit (12–16 h) à 4°C.
      REMARQUE : Protégez les échantillons marqués fluorescentement de l’exposition directe à la lumière tout au long de la procédure de coloration.
   4. Retirez la solution primaire d’anticorps.
   5. Lavez les cellules trois fois avec du PBS en utilisant 500 μL par lavage pendant 1 minute à chaque lavage.
   6. Diluez l’anticorps secondaire fluorescent anti-lapins IgG de chèvre dans PBS à un ratio de dilution de 1:100. Ajoutez 500 μL de solution secondaire diluée d’anticorps à chaque bol de culture et faites couver pendant 1 heure dans des conditions protégées par la lumière.
      REMARQUE : Un contrôle sans anticorps primaires n’a pas été inclus dans la présente étude. Les futures expériences devraient intégrer des contrôles d’immunofluorescence appropriés pour valider davantage la spécificité de la coloration.
   7. Retirez la solution d’anticorps secondaire fluorescente.
5. Contre-coloration et imagerie fluorescentes
   1. Préparez la solution de teinture immédiatement avant utilisation. Diluez le colorant F-actine dans PBS à une concentration finale de 1 μM et utilisez DAPI comme coloration nucléaire prête à l’emploi. Mélangez soigneusement les solutions de teinture avant utilisation.
      REMARQUE : Les réactifs de coloration à base de phaloïdines peuvent être utilisés comme alternatives à la visualisation de la F-actine.
   2. Ajoutez la solution de coloration aux plats de culture.
   3. Incubez les cellules pendant 30 minutes à 37°C dans le noir.
   4. Enlève la solution tachante.
   5. Lavez les cellules trois fois avec du PBS en utilisant 500 μL par lavage pendant 1 minute à chaque lavage.
   6. Ajoutez 1 mL de PBS pour empêcher les cellules de sécher lors de la préparation par imagerie.
   7. Acquérez des images à l’aide d’un microscope confocal inversé Nikon équipé d’un objectif ×20. Collectez des images en pile Z en utilisant une taille de pas de 5 μm sur une plage d’imagerie totale de 40 μm (8 sections optiques). Utilisez l’excitation de 405 nm pour le DAPI, l’excitation de 488 nm pour la coloration F-actine, l’excitation de 594 nm pour l’immunocoloration Miro1, et l’excitation de 665 nm pour la coloration MitoTracker. Capturez des images à une résolution de 1024 × 1024 pixels sous des conditions protégées par la lumière à RT.
   8. Effectuer une évaluation qualitative en utilisant au moins cinq champs de vision sélectionnés au hasard par échantillon. Évaluer les structures similaires au TNT, les signaux de fluorescence associés aux mitochondries, et la localisation apparente entre Miro1 et la coloration associée aux mitochondries au sein des connexions intercellulaires de la membrane (Figure 3A–3C).
      REMARQUE : Acquérir des images immédiatement après la coloration afin de minimiser la perte de fluorescence et la perturbation structurelle des TNT.

Figure 3 : Coloration par colocalisation des mitochondries et du Miro1 dans les TNT dans un système de coculture astrocyte-neurone. (A) Images représentatives par microscopie confocale montrant la coloration nucléaire, mitochondriale, Miro1 et F-actine dans les astrocytes et les neurones cultivés dans des plats de culture à fond de verre. Les flèches blanches indiquent des régions de localisation apparente entre les signaux associés aux mitochondries et Miro1 au sein de structures de type TNT. (B) Image tridimensionnelle reconstruite en Z-stack montrant des structures similaires à des TNT formées entre des cellules adjacentes. (C) Reconstruction en vue latérale de la même image en Z-stack montrant des structures de type TNT s’étendant entre des cellules adjacentes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Résultats

Dans les préparations en monoculture d’astrocytes, de fines protubérances membranaires reliant les cellules adjacentes ont été observées après une coloration de F-actine et nucléaire (Figures 1A et 1B). Plusieurs structures similaires à la TNT ont été détectées s’étendant entre des astrocytes voisins, et des astrocytes individuels formaient fréquemment des connexions avec plusieurs cellules environnantes. La préservation réussie des structures de type TNT était associée à une manipulation douce lors des procédures de lavage et de fixation. Une perturbation mécanique excessive lors du retrait ou du lavage du milieu a entraîné une détection réduite et une perturbation structurelle de ces connexions membranaires, comme le montre les structures de type TNT perturbées suite à une manipulation incorrecte des échantillons (Figure 1C et 1D).

Dans les préparations de coculture astrocyte-neurone, des signaux de fluorescence associés aux mitochondries ont été observés dans des structures de type TNT reliant des cellules adjacentes après la coloration MitoTracker et l’imagerie confocale (Figures 2A et 2B). Ces structures ont été visualisées avec la coloration F-actine et nucléaire pour soutenir l’évaluation morphologique des connexions de type TNT. Une protection adéquate de la lumière et une intensité de lavage réduite ont amélioré la préservation du signal de fluorescence et de la morphologie du TNT lors de la préparation à l’imagerie.

Dans des expériences de colocalisation par immunofluorescence, des signaux de fluorescence superposés correspondant à la coloration associée aux mitochondries et à l’immunocoloration Miro1 ont été observés dans des structures de type TNT dans des préparations de coculture astrocyte-neurone (Figure 3A). Ces observations suggèrent une association potentielle entre Miro1 et les mitochondries localisées dans des structures similaires à celles du TNT. L’imagerie en pile Z reconstruite en trois dimensions a également soutenu la présence de structures de type TNT s’étendant entre des cellules adjacentes (Figures 3B et 3C). La préservation du TNT, l’intensité du signal de fluorescence et la qualité de l’image ont été influencées par la fixation, la perméabilisation et les conditions d’imagerie.

Discussion

La première étape critique du protocole expérimental décrit ci-dessus est le prétraitement protégé par la lumière avant la fixation. Les structures similaires à celles du TNT sont très fragiles, et maintenir des conditions de protection contre la lumière après le retrait de l’incubateur est important pour préserver l’intensité du signal de fluorescence et l’intégrité structurelle lors de la préparation de l’échantillon. La deuxième étape critique consiste à effectuer un lavage de PBS avec une manipulation douce afin de minimiser les perturbations des structures similaires à la TNT causées par l’écoulement des fluides. Le respect de ces procédures clés de manipulation aide à préserver la morphologie et la stabilité des structures similaires au TNT et améliore la cohérence des résultats d’imagerie ultérieurs. Une aspiration excessive, un lavage prolongé ou une forte agitation du liquide peuvent entraîner l’effondrement ou la fragmentation des structures similaires à la TNT lors du traitement de l’échantillon. En raison de leur nature très dynamique, les TNT sont sensibles à la lumière. La phototoxicité induite par l’exposition à la lumière peut provoquer des perturbations du TNT, rendant ces structures difficiles à^{visualiser 11}. Par conséquent, des conditions de protection de la lumière doivent être maintenues lors des expériences liées au TNT.

Le mouvement mitochondrial intracellulaire contribue à la distribution de l’énergie cellulaire, en particulier chez les neurones. Des études ont montré que les mitochondries peuvent se déplacer le long des filaments d’actine et des^{microtubules 12}. Des études récentes ont également démontré que les TNT peuvent fonctionner comme des structures de communication intercellulaire à longue distance associées au transfert mitochondrial entre cellules^{neuronales 13}. L’approche méthodologique décrite dans cette étude permet de visualiser des structures de type TNT et des signaux de fluorescence associés aux mitochondries dans les systèmes de culture cellulaire neuronale. Des études antérieures ont montré que le transfert intercellulaire mitochondrial entre cellules neuronales pouvait contribuer à la réparation tissulaire et aux processus neuroprotecteurs dans des troubles neurologiques tels que la maladie de Parkinson et les lésions ischémiques^{cérébrales 14,15}. En utilisant les méthodes décrites dans cette étude, des structures similaires à la TNT ont été observées entre astrocytes et entre astrocytes et neurones, ainsi que des signaux de fluorescence associés aux mitochondries localisés à l’intérieur de ces structures.

Comme mentionné dans des études^{précédentes 10}, la coloration MitoTracker est sujette à des fuites de colorants et au transfert de signal non mitochondrial, ce qui peut réduire la fiabilité des données. Pour remédier à cette limitation, les futures études devraient employer des méthodes plus robustes, telles que le marquage mitochondrial codé génétiquement, afin d’obtenir des résultats plus concluants. Dans les conditions expérimentales actuelles, les deux types cellulaires ont été distingués principalement sur la base de la morphologie cellulaire, une approche qui pourrait réduire la spécificité d’identification des types cellulaires. Les études futures devraient intégrer un marquage fluorescent spécifique au type cellulaire afin d’améliorer la précision de l’analyse de la coculture. Miro1 est une protéine adaptatrice localisée à la membrane mitochondriale externe et a été impliquée dans les processus de transport mitochondrial chez les^{neurones 16,17}. En utilisant le protocole de colocalisation par immunofluorescence décrit dans cette étude, des signaux de fluorescence qui se chevauchent correspondant à la coloration associée aux mitochondries et à l’immunocoloration Miro1 ont été observés dans des structures similaires à la TNT. Ces observations suggèrent une association potentielle entre Miro1 et les mitochondries localisées dans des structures similaires à celles du TNT. Cependant, la résolution spatiale de la microscopie confocale conventionnelle peut limiter l’évaluation définitive de la colocalisation moléculaire au sein de fines protubérances membranaires.

Nous avons réalisé des images par pile Z afin de confirmer la présence de structures similaires au TNT entre les cellules, soutenant ainsi la validation structurelle de ces connexions membranaires. Bien que le protocole actuel soit adapté à la plupart des environnements expérimentaux, l’imagerie confocale des cellules fixes peut entraîner la perte de structures fragiles semblables à la TNT lors du traitement de l’échantillon par rapport à l’imagerie de cellules vivantes, limitant ainsi la quantification précise du^{TNT 18}. De plus, l’imagerie des cellules fixes ne permet pas de déterminer de manière sans ambiguïté la directionnalité du transfert mitochondrial, ce qui nécessite des recherches ultérieures dans de futures études. Ce protocole fournit un flux de travail expérimental standardisé pour colorer les structures similaires au TNT, les signaux associés aux mitochondries et les protéines apparentées dans les systèmes de culture cellulaire neuronale. Comparé aux procédures de lavage et de fixation non contrôlées, le protocole met l’accent sur la manipulation douce des échantillons et la préservation de la fluorescence lors de la préparation à l’imagerie. Ces méthodes peuvent aider à améliorer la cohérence et la reproductibilité expérimentales dans les études d’imagerie liées au TNT.

En résumé, cette étude fournit un protocole de laboratoire pratique et largement applicable pour l’évaluation qualitative des TNT et l’étude du transport mitochondrial via des structures similaires à celles des TNT. Cependant, des étapes de traitement de l’échantillon telles que la fixation et le lavage peuvent introduire une variabilité de quantification par rapport aux approches d’imagerie à cellules vivantes. De plus, la microscopie confocale offre une résolution spatiale inférieure à celle de la microscopie à super-résolution, ce qui limite la caractérisation structurelle détaillée des TNT. De plus, la coloration mitochondriale basée sur MitoTracker est affectée par la fuite de colorant et le transfert de signal non spécifique, ce qui devrait être abordé dans de futures études afin d’améliorer la précision expérimentale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1% triple antibiotic mixture	Biosharp	BL142A	Prévient la contamination bactérienne et fongique pendant la culture cellulaire
4% Tissu Fixateur Cellulaire	Solarbio	P1110	Réactif de fixation cellulaire
Anticorps anti-Miro1	Abcam	AB319154	Anticorps primaire contre Miro1
Astrocyte	Cellules primaires isolées en laboratoire	NA	Les astrocytes ont été isolés du cortex cérébral de jeunes rats SD âgés de 1–3 jours. La pureté des cellules isolées a été confirmée à >95% par coloration GFAP, et les cellules de passage 3 (P3) ont été utilisées pour toutes les expériences
Milieu de culture cellulaire pour astrocytes (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM et F-12 ont été mélangés dans un rapport 1:1 (v/v), complétés avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) et 1% d'antibiotiques triples
Microscope confocal	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Les images ont été acquises à l'aide d'un microscope confocal Nikon AX (Nikon Corporation, Japon) contrôlé par NIS-Elements (version 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Colorant de coloration nucléaire
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Solvant utilisé pour la préparation de solutions mères de colorants fluorescents
Colorant de coloration F-actine	Thermo Fisher Scientific	A57243	Réactif de coloration F-actine pour la visualisation des structures cytosquelettiques et des nanotubes tunnel
Sérum bovin foetal	ExCell Bio	FSD500	Fournit des nutriments essentiels pour la culture cellulaire
Anticorps secondaire fluorescent (Chèvre Anti-Lapin IgG)	ABclonal	AS039	Anticorps secondaire pour la coloration immunofluorescence
Plat de culture cellulaire à fond en verre	NEST	801001	Plat d'imagerie pour microscopie confocale
Sérum de chèvre	Solarbio	210C051	Réactif de blocage pour la coloration immunofluorescence
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Colorant de coloration mitochondriale
Neurones	Banque de Cellules du CAS	HT22-GNM47	Des cellules neuronales de l'hippocampe de souris immortalisées ont été maintenues dans un milieu complet DMEM. Les cellules au passage 3 (P3) ont été collectées et utilisées pour les expériences ultérieures.
Milieu de culture cellulaire pour neurones (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM complété avec GlutaPlus et pyruvate de sodium, sans HEPES, complété avec 10% de sérum bovin foetal (FBS) et 1% d'antibiotiques triples
Tampon phosphate-buffered saline (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Tampon de lavage utilisé pendant la fixation et la coloration
Triton X-100	Solarbio	P1080	Réactif de perméabilisation cellulaire