Dissection et isolement des ganglions dorsals de la souris

Résumé

Les ganglions de la racine dorsale (DRG) contiennent des corps cellulaires neuronaux sensoriels primaires et transmettent des signaux sensoriels périphériques à la moelle épinière. Ce protocole décrit une méthode de dissection de la DRG chez la souris qui soutient l’isolation standardisée des ganglions structurellement intacts, l’identification segmentaire anatomique, un accompagnement intuitif pour les utilisateurs débutants et une réduction des lésions tissulaires procédurales.

Résumé

Les ganglions de la racine dorsale (DRG), qui contiennent les corps cellulaires des neurones sensoriels primaires, servent de structures relais essentielles pour la transmission des signaux sensoriels des tissus périphériques vers la moelle épinière. Ils jouent un rôle essentiel dans les études sur la douleur, les lésions nerveuses et les maladies neurodégénératives. L’acquisition de tissu DRG intact est cruciale pour étudier les propriétés fonctionnelles, l’expression moléculaire et les altérations pathologiques des neurones sensoriels. Cependant, en raison de leur petite taille et de leur emplacement profond dans le canal vertébral, l’identification précise et l’isolement des DRG présentent d’importants défis techniques. Dans cette étude, nous avons développé un protocole standardisé pour l’isolement de la DRG chez la souris. Cette méthode fournit une description détaillée de la localisation anatomique de la DRG, de l’exposition du canal vertébral et des étapes clés impliquées dans l’isolement des ganglions. L’ensemble de la procédure est illustré par des images représentatives et des enregistrements vidéo. Cette approche permet l’acquisition d’une DRG structurellement intacte avec un guide anatomique pour l’identification segmentaire et convient à la coloration H&E et à l’analyse d’immunofluorescence. Comparée aux méthodes précédentes de dissection par DRG, cette méthode permet une récupération standardisée des ganglions segmentaires identifiés, offre un accompagnement anatomique intuitif aux utilisateurs débutants et réduit les lésions tissulaires procédurales.

Introduction

Les ganglions de la racine dorsale (DRG), qui contiennent les corps cellulaires des neurones sensoriels primaires, sont des structures essentielles pour transmettre les signaux sensoriels périphériques — y compris les stimuli mécaniques, thermiques et nociceptifs — à la moelle ^{épinière 1,2,3}. Bien que des ressources de haute qualité décrivant la DRG soient actuellement disponibles, des directives procédurales détaillées restent nécessaires pour permettre une identification précise et une isolation de la DRG du segment thoracique au sacré au sein d’un seul échantillon, tout en minimisant le risque de dommages causés par la DRG lors de la collecte des tissus.

Les neurones DRG sont des composants clés de la voie sensorielle périphérique. Leurs axones se bifurquent, une branche s’étendant vers les tissus périphériques et l’autre s’étendant dans la corne dorsale de la moelle épinière, jouant ainsi un rôle crucial dans la transmission de la douleur, les lésions nerveuses, les réponses inflammatoires et la pathogenèse de divers troubles^{neurologiques 4}. De plus, les DRG ont attiré une attention considérable dans des domaines de recherche tels que la réparation des lésions nerveuses, les mécanismes de la douleur chronique, la plasticité des neurones sensoriels et la régulation^{neuro-immunitaire 5,6}. Un large éventail d’études expérimentales nécessite un tissu DRG intact pour des applications telles que la coloration immunohistochimique, l’analyse du séquençage ARN, la culture neuronale primaire et les études^{électrophysiologiques.} Ainsi, l’acquisition de tissu DRG structurellement intact et précisément identifié par segment est fondamentale pour les études des circuits neuronaux sensoriels, des caractéristiques moléculaires neuronales et des altérations pathologiques.

Les DRG sont situés près des forames intervertébraux et sont reliés à la moelle épinière par les racines dorsales. En raison de leur petite taille, de leur enclos dans des structures osseuses et de la complexité de l’anatomie environnante, l’isolement intact présente d’importants défis techniques. De plus, l’absence de repères anatomiques clairs et de procédures standardisées augmente le risque de dommages structurels ou d’erreurs d’identification segmentaire lors de la collecte des tissus.

Comparée aux méthodes existantes de dissection DRG chez la souris, la méthode établie dans cette étude présente plusieurs avantages. Premièrement, les méthodes d’isolation des DRG chez la souris précédemment rapportées nécessitent généralement l’ablation de la colonne vertébrale de l’animal, suivie d’une segmentation et d’une ouverture médiane de la colonne isolée, après quoi les DRG sont disséqués des forames intervertébraux. Au cours de ce processus, la transection de la colonne vertébrale et des coupes répétées peuvent facilement causer des dommages mécaniques à la DRG et entraîner l’omission de certains segments ou une identification segmentaire non claire⁸. En revanche, notre méthode est réalisée directement in situ chez la souris, sans isolement préalable ni transection de la colonne vertébrale, réduisant ainsi le risque de perte de DRG lors de la collecte des tissus. Tout au long de la procédure, les instruments sont appliqués principalement sur les structures osseuses et les tissus conjonctifs entourant le DRG, plutôt que de saisir ou tirer directement le ganglion lui-même, préservant ainsi son intégrité.

Deuxièmement, les méthodes existantes manquent souvent de repères anatomiques clairs et stables pour identifier différents segments DRG. Comme les nerfs connectés au DRG sont fréquemment sectionnés lors de l’ablation de la colonne vertébrale, il devient difficile de déterminer avec précision l’origine segmentaire de chaque DRG à partir du parcours nerveux et des motifs de ramification. En revanche, notre méthode est réalisée directement in situ chez la souris et préserve ainsi les relations anatomiques naturelles entre la DRG, les nerfs connectés et les structures environnantes, permettant l’identification de différents segments DRG selon les connexions nerveuses et les repères anatomiques locaux. Nous proposons l’utilisation des caractéristiques morphologiques de L2 et L3 comme points de référence anatomiques clés, ainsi que la relation anatomique entre L3–L5 et le nerf sciatique, suivie d’une identification séquentielle des segments adjacents dans les directions rostrale et caudale.

De plus, cette méthode fournit une description relativement systématique des étapes clés, incluant l’exposition de la colonne vertébrale et du canal vertébral, l’ouverture du canal vertébral avec exposition ultérieure de la moelle épinière, l’exposition de la DRG, ainsi que la localisation et la dissection guidées par stéréomicroscope. Le flux de travail est clair et les repères anatomiques bien définis, ce qui peut améliorer la standardisation procédurale et la reproductibilité, en particulier pour les débutants. Les DRG obtenus avec cette méthode conservent une bonne intégrité tissulaire et sont donc bien adaptés aux analyses en aval, incluant l’immunofluorescence et la coloration H&E.

Dans cette étude, nous avons établi une méthode standardisée de dissection et d’isolation pour la DRG chez la souris et fourni des illustrations schématiques pour la localisation anatomique, ainsi que des images représentatives et une documentation vidéo de la procédure d’échantillonnage. Cette méthode permet d’isoler la DRG du niveau thoracique au sacré dans un seul échantillon tout en réduisant le risque de dommages au DRG lors de la collecte des tissus.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées en stricte conformité avec le protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’hôpital Shanghai Est. Les procédures de dissection décrites dans cette étude ont été réalisées sur des souris adultes C57BL/6 (mâle ou femelle, 12 semaines, 25–30 g). La figure 1 montre les instruments de dissection utilisés dans ce protocole.

1. Préparation

REMARQUE : Pour les échantillons fixés en perfusion, adoptez des mesures de protection appropriées afin d’éviter toute exposition au fixateur. Effectuez la dissection dans une hotte ou sur un établi bien ventilé, et portez un équipement de protection individuelle approprié tout au long de la procédure, y compris des gants, des vêtements de protection et des lunettes de sécurité.

1. Maintenir les souris sous un cycle de 12 h de lumière / 12 heures d’obscurité à une température ambiante d’environ 24 °C et une humidité relative de 55 %, avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau.
2. Avant de commencer la dissection, euthanasiez la souris dans une chambre de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la respiration soit complètement cessée. Confirmez la mort, puis placez l’animal en position couchée sur une planche de dissection et fixez les membres avec des épingles pour maintenir une posture stable.
3. Vaporisez le pelage sur la région thoracoabdominale avec 70 % d’éthanol pour réduire la contamination des poils et maintenir un champ opératoire propre.
4. Utilisez des ciseaux pour ouvrir la peau le long de la ligne médiane du thorax et de l’abdomen. Étendez l’incision de façon crâniale le long de la ligne médiane ventrale pour exposer complètement la cage thoracique. Élever l’extrémité inférieure du sternum et découper la paroi thoracique de chaque côté de l’arc costal pour ouvrir la cavité thoracique et exposer le cœur. Retirez une partie du sternum et des côtes si nécessaire pour obtenir une vue claire du cœur.
5. Faites une petite incision dans l’oreillette droite avec des ciseaux pour créer une sortie de sang et perfuser. Remplissez une seringue de 20 mL avec du PBS prérefroidi (4 °C), puis insérez lentement l’aiguille dans le ventricule gauche près de l’apex du cœur. Stabilisez l’aiguille et évitez de percer la paroi ventriculaire.
6. Perfusez le PBS pré-refroidi lentement et uniformément jusqu’à ce que le foie devienne pâle, que l’écoulement soit clair et que la majeure partie du sang ait été lavée. Ensuite, remplacer le PBS par 20 mL de paraformoldéhyde prérefroidi à 4 % (4 °C) et poursuivre la perfusion à un rythme lent et régulier jusqu’à ce que les membres deviennent rigides, que la queue se recroqueville et que les tissus passent du rouge au pâle, indiquant que la fixation est en grande partie complète.
7. Après la perfusion, retirez l’aiguille, retirez tout liquide résiduel de la cavité thoracique, puis procédez immédiatement à la collecte de tissus. Si un tissu non fixé est nécessaire pour les analyses en aval, perfusez uniquement avec du PBS prérefroidi et omettez l’étape de fixation à 4 % de paraformaldéhyde.
   REMARQUE : Maintenez un taux de perfusion lent, stable et uniforme tout au long de la procédure afin d’éviter une rupture cardiaque ou un gonflement des tissus causés par une pression excessive. Effectuez toutes ces procédures à température ambiante.

2. DRG et nerfs adjacents (Figure 2)

1. Exposition de la colonne vertébrale et du canal vertébral (3–5 min)
   1. Placez la souris en position couchée et fixez-la sur la planche de dissection. Réalisez une incision longitudinale le long de la ligne médiane de la peau dorsale avec des ciseaux, en prolongeant l’incision de la queue vers le cou.
   2. Utilisez des ciseaux pour séparer la peau dorsale du tissu conjonctif sous-jacent, et réfléchissez la peau latéralement des deux côtés pour exposer complètement la musculature dorsale. Essuyez les cheveux adhérant à la surface du tissu conjonctif avec du papier absorbant, ou rincez le champ chirurgical avec du sérum physiologique pour garder la zone opératoire propre.
   3. Incisez longitudinalement les muscles dorsaux et le tissu conjonctif de chaque côté de la colonne vertébrale afin d’exposer complètement les structures vertébrales.
      REMARQUE : Empêcher les ciseaux de pénétrer trop profondément dans la cavité thoracique ou abdominale lors de l’incision des tissus dorsaux, car cela peut affecter les procédures de dissection ultérieures.
   4. Dégagez soigneusement le tissu conjonctif et les muscles résiduels couvrant la colonne vertébrale avec un ronger osseux. Si le tissu résiduel gêne la visualisation, coupez-le avec des ciseaux si nécessaire pour obtenir une exposition complète de la colonne vertébrale. Ensuite, découpez les vertèbres cervicales depuis le côté dorsal avec des ciseaux pour détacher l’extrémité crânienne de la colonne vertébrale de la tête et faciliter les étapes suivantes.
2. Ouvrez le canal vertébral et exposez la moelle épinière (Figure 3 ; 8–10 min).
   1. Insérez des ciseaux micro courbés dans le canal vertébral au niveau cervical, puis coupez de chaque côté des lames pour ouvrir le canal.
      REMARQUE : Veillez à éviter toute blessure de la moelle épinière pendant la procédure.
   2. Retirez les lames dorsales pour exposer progressivement la partie dorsale de la moelle épinière.
   3. Continuez à découper les lames dorsales le long de l’axe longitudinal de la colonne vertébrale avec des ciseaux micro-courbes, en s’étendant progressivement de la région thoracique à la région sacrée pour exposer complètement la face dorsale de la moelle épinière.
3. Exposition du DRG (Figure 4 ; 8–10 min)
   1. Après avoir complètement exposé la surface dorsale de la moelle épinière, utilisez un rongeur osseux pour ouvrir doucement les structures du canal vertébral latéralement des deux côtés, et alternez la manipulation entre les côtés gauche et droit.
   2. Une fois le canal vertébral complètement séparé des deux côtés, observez la DRG située dans les forames intervertébraux au stéréomicroscope.
4. Identification du DRG (Figure 5 ; 8–10 min)
   1. Une fois que le canal vertébral a été complètement réfléchi bilatéralement et que la moelle épinière est entièrement exposée, examinez les faisceaux nerveux radiculaires dorsaux issus de la surface dorsale de la moelle épinière au stéréomicroscope. Suivez les racines dorsales latéralement et identifiez la DRG près des forames intervertébraux comme des structures ovales ou ovoïdes.
   2. Confirmez lors de l’identification que la DRG se trouve à l’interface entre la racine dorsale du nerf spinal et le foramen intervertébral, et observez qu’elle est disposée en paire bilatérale à chaque segment spinal. Identifiez la DRG comme un ganglion formé par les corps cellulaires des neurones sensoriels, un côté entrant dans la corne dorsale de la moelle épinière et l’autre s’étendant dans les tissus périphériques.
   3. Utilisez un stéréomicroscope pour identifier la DRG comme une structure jaune pâle ou gris-blanc, légèrement enflée, avec une forme plus large et des limites relativement distinctes.
5. Effectuer l’identification et la dissection segmentaires du DRG (Figure 6 ; 8–10 min)
   1. Utilisez des pinces microchirurgicales sous un stéréomicroscope pour surlever doucement le faisceau nerveux radiculaire dorsal et ainsi obtenir une exposition complète du DRG fixé.
   2. Utilisez les caractéristiques suivantes pour déterminer l’identité segmentaire de la DRG : désigner les DRG connectées aux fibres nerveuses multiplement ramifiées (>2 branches) comme L2 et plus de DRG crâniennes, et désigner les DRG connectées aux fibres nerveuses bifurquées (deux branches seulement) comme L3 et plus de DRG caudales. Ensuite, identifiez séquentiellement les segments DRG restants au-dessus et en dessous selon la localisation des forames intervertébraux.
      REMARQUE : Les fibres nerveuses issues du DRG L3–L5 fusionnent pour former le nerf sciatique.
   3. Utilisez des ciseaux courbés microchirurgicaux ou des pinces microchirurgicales pour séparer soigneusement le tissu conjonctif et les fibres nerveuses entourant la DRG, et libérer progressivement le ganglion de ses attaches aux tissus autour du foramen intervertébral.
   4. Transsectez les fibres nerveuses de la racine dorsale reliant la DRG à la moelle épinière, puis sectionnez simultanément le faisceau nerveux s’étendant vers la périphérie pour isoler le ganglion.
   5. Isolez soigneusement la DRG à l’aide de pinces microchirurgicales. Si une conservation à long terme et une analyse d’immunofluorescence ultérieure sont nécessaires, placez immédiatement le DRG isolé dans un tube centrifuge de 0,5 mL contenant 4 % de paraformodéhyde et fixez le tissu pendant 3 heures. Après fixation, lavez le tissu pendant 3 × 5 minutes avec 0,1 M PBS (composants principaux : NaCl, KCl, Na2HPO4 et KH2PO4), puis transférez le tissu dans une solution à 30 % de saccharose pour la déshydratation jusqu’à ce qu’il s’enfonce au fond. Enfin, il faut plonger le tissu dans l’OCT et le stocker à −80 °C pour une conservation à long terme.

3. Confirmez les composants ganglionnaires.

1. Résultats de coloration H&E (Figure 7)
   1. Fixez immédiatement la DRG isolée dans un fixateur histologique conventionnel, par exemple à 4 % de paraformodéhyde. Après fixation, rincez le tissu dans un tampon phosphate de 0,1 M, effectuez la déshydratation, le nettoyage et l’incrustation de paraffine selon les procédures histologiques standard, et préparez des sections de tissu de 4 à 6 μm pour une analyse de coloration en aval.
   2. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) sur les coupes afin d’évaluer la structure globale et la morphologie cellulaire du DRG. Utilisez les sections colorées pour identifier les composants cellulaires et l’organisation tissulaire du ganglion et pour déterminer la qualité du DRG prélevé.
   3. Examinez les sections colorées à H&E au microscope et confirmez que la DRG est principalement composée de nombreux corps cellulaires neuronaux sensoriels. Identifiez les neurones présentant de grands somates ronds à ovoïdes, et observez leurs noyaux clairement visibles ainsi que les nucléoles proéminents présents dans certains neurones. Confirmez également la présence de cellules gliales satellites très opposées entourant les neurones dans une disposition caractéristique en forme d’anneau.
   4. Examinez l’intérieur du ganglion et identifiez les faisceaux de fibres nerveuses et les septa du tissu conjonctif afin de confirmer que l’architecture tissulaire globale est intacte et bien organisée. Vérifiez que les frontières cellulaires sont bien définies et qu’aucune perturbation tissulaire évidente ou désorganisation structurelle n’est présente.
   5. Confirmer l’isolation réussie de la DRG sur la coloration H&E par la présence d’une structure globale préservée, d’une morphologie cellulaire bien définie et de lésions mécaniques évidentes. Détecter les dommages de l’échantillon en observant une architecture cellulaire perturbée, des marges tissulaires indistinctes ou une destruction tissulaire localisée survenant lors de la dissection ou du traitement. Utilisez ces résultats H&E comme base pratique pour évaluer la qualité de la collecte de DRG et l’intégrité du tissu.
2. Résultats de coloration par immunofluorescence TUBB3 (Figure 8)
   1. Fixez immédiatement le DRG isolé dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 3 heures. Une fois la fixation terminée, rincez le mouchoir trois fois en PBS de 0,1 M, en laissant 5 minutes à chaque lavage. Ensuite, placez le tissu dans une solution de saccharose à 30 % jusqu’à ce qu’il se dépose au fond, plongez-le dans l’OCT, puis coupez des coupes congelées à 8–12 μm pour une coloration immunofluorescente en aval.
   2. Réchauffez les sections à température ambiante, rincez-les 3 × 5 minutes dans le PBS, puis effectuez la prélèvement antigénique avec la solution de prélèvement antigénique Tris-EDTA. Laissez refroidir les sections naturellement à température ambiante, lavez-les à nouveau 3 × 5 minutes avec du PBS, puis bloquez avec 5 % de BSA pendant 30 à 60 minutes à température ambiante. Après l’étape de blocage, appliquez l’anticorps primaire TUBB3 marqué par fluorophore et incubez les sections toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, lavez les coupes trois fois avec du PBS, colorez les noyaux avec du DAPI, montez les coupes et capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence.
   3. Inspectez les sections DRG et vérifiez que les spécimens bien conservés présentent un contour ganglionnaire distinct, une structure tissulaire intacte et une disposition cellulaire ordonnée. Observez l’immunofluorescence de TUBB3 principalement dans les corps cellulaires neuronaux sensoriels et les fibres nerveuses afin de définir la distribution neuronale globale au sein du ganglion. Utilisez la contre-coloration DAPI pour identifier les cellules TUBB3 plus grandes comme neurones sensoriels, et notez que les petits noyaux DAPI positifs répartis autour de ces cellules présentent un motif morphologique cohérent avec celui des cellules gliales satellites. Identifier les dommages liés à la dissection ou au traitement par une continuité tissulaire perturbée, une localisation irrégulière du signal TUBB3, une morphologie neuronale mal définie ou des augmentations focales du signal de fond.
   4. Appliquer la coloration immunofluorescence TUBB3 comme indicateur supplémentaire de l’intégrité tissulaire DRG. Reconnaître l’isolation réussie des DRG par la présence d’un contour ganglionnaire préservé, des signaux de fluorescence distincts dans les cellules neuronales sensorielles et les fibres nerveuses, une morphologie cellulaire claire et une coloration minimale de fond.

Résultats

L’isolation réussie du DRG nécessite de préserver l’intégrité du ganglion, sans compression, écrasement ou déchirure évidents. Soulevez doucement les fibres nerveuses connectées latéralement, libérez progressivement le ganglion des tissus environnants, et ne transectez les fibres nerveuses connectées qu’après la mobilisation complète du ganglion, afin qu’elle puisse être retirée intacte. Évitez la traction directe sur le corps ganglionnaire avec des instruments pendant la procédure. Aprè...

Discussion

La DRG, en tant que composantes clés du système nerveux sensoriel périphérique, joue un rôle crucial dans la transmission des informations sensorielles mécaniques, thermiques et nociceptives au système^{nerveux central 9,10,11}. Les neurones DRG présentent une morphologie pseudounipolaire caractéristique, l’un s’étendant aux tissus périphériques et l’autre projetant dans la corne dorsale de la moel...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.5 mL centrifuge tube	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour le stockage fixe des DRG
Seringue de 20 mL	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour la perfusion cardiaque
Solution de saccharose à 30%	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour la déshydratation des tissus avant l'inclusion OCT
Paraformaldéhyde à 4%	Servicebio	G1101
BSA à 5%	Solarbio	SW3015
Éthanol à 70%	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour réduire la contamination par les poils avant la dissection
Papier absorbant	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour enlever les poils des tissus conjonctifs
Souris adultes C57BL/6	Vital River	Non spécifié	mâle ou femelle; 12 semaines d'âge; 25–30 g
IgG anti-lapin conjugué Alexa Fluor 488	Servicebio	GB25303
Anticorps anti-TUBB3	Proteintech	CL488-66375	Utilisé pour l'immunofluorescence de TUBB3
Chambre au dioxyde de carbone	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour l'euthanasie
DAPI	Servicebio	G1012
Planche de dissection	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour fixer la souris pendant la dissection
Microscope à fluorescence	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour imager les sections marquées par immunofluorescence
Rongeures osseuses Friedman-Pearson	RWD	S21022-14	Extrait du manuscrit: rongeur osseux (RWD, S21022-14)
Kit de coloration H&E	Servicebio	G1005
Ciseaux courbés microchirurgicaux	ASSI	SDCT16R8	Extrait du manuscrit: ciseaux micro courbés (ASSI, SDCT16R8)
Pinces microchirurgicales	Fine Science Tools	11254-20	Extrait du manuscrit: pinces microchirurgicales (FST, 11254-20)
Composé OCT	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
Épingles	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour fixer les membres sur la planche de dissection
Sérum physiologique	Non spécifié	Non spécifié	Utilisé pour rincer le champ opératoire
Ciseaux	Fine Science Tools	14060-09	Extrait du manuscrit: ciseaux (FST, 14060-09)
Stéréomicroscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne	10447197	Extrait du manuscrit: stéréomicroscope (Leica, 10447197)
Solution de récupération d'antigène Tris-EDTA	Solarbio	C1038