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Cette étude a été réalisée à partir de lignées cellulaires établies pour leucémie myéloïde aiguë humaine et leurs dérivés résistants à la doxorubicine. Aucun participant humain, animal ou échantillon primaire dérivé du patient n’a été impliqué. Par conséquent, l’approbation du comité d’examen institutionnel pour la recherche sur des sujets humains et l’approbation de l’éthique animale n’étaient pas requises. Les lignées cellulaires ont été obtenues auprès de l’Institut d’hématologie de l’Académie chinoise des sciences médicales, à Tianjin, en Chine, et conservées à l’Institut d’hématologie du Fujian, à l’Hôpital de l’Union de l’Université Médicale du Fujian. L’identité cellulaire a été confirmée par une évaluation caryotypée et morphologique avant l’expérimentation, et toutes les cultures cellulaires ont été testées pour une contamination par mycoplasme. Les produits chimiques, équipements et logiciels utilisés dans le protocole sont listés dans le Tableau des matériaux.
1. Culture cellulaire et confirmation du phénotype résistant
Les cellules humaines de leucémie myéloïde aiguë HL60 et K562 ainsi que leurs dérivés résistants à la doxorubicine, HL60/A et K562/A, ont été obtenus auprès de l’Institut d’hématologie de l’Académie chinoise des sciences médicales, Tianjin, Chine. Des cellules ont été cultivées dans un milieu 1640 de l’Institut Mémorial Roswell Park, complété avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de dioxyde de carbone.
Les cellules HL60/A ont été maintenues dans un milieu complet contenant 1 μg/mL de doxorubicine, et les cellules K562/A ont été maintenues dans un milieu complet contenant 5 μg/mL de doxorubicine afin de préserver le phénotype résistant. La doxorubicine a été retirée du milieu de culture un mois avant les tests expérimentaux afin d’éviter les effets aigus de sélection du médicament lors des tests thérapeutiques.
Avant les expériences, le phénotype résistant a été reconfirmé en comparant les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale de doxorubicine entre cellules parentales et résistantes. La stabilité de la résistance après un mois de culture sans médicament a été évaluée en répétant le test de sensibilité à la doxorubicine et en examinant l’expression basale de la P-glycoprotéine et de la protéine 1 associée à la résistance multimédicamenteuse. Les cultures n’ont été utilisées pour des expériences que lorsque les dérivés résistants conservaient des valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale plus élevées et une expression du transporteur plus élevée que leurs homologues parentaux.
2. Préparation des médicaments et conception du traitement
FTY720, doxorubicine et SC79 ont été préparés comme solutions d’origine selon les instructions du fabricant. FTY720 et SC79 ont été dissous dans du diméthyle sulfoxyde, et la doxorubicine a été préparée dans le solvant recommandé et protégée de la lumière lors de la manipulation. Les solutions fonctionnelles étaient fraîchement diluées dans un milieu de culture complet avant traitement. La concentration finale de diméthylsulfoxyde a été maintenue identique entre les groupes de traitement et n’a pas dépassé 0,1 %.
Les groupes témoins du véhicule ont reçu la même concentration finale de diméthylsulfoxyde que les groupes traités correspondants. Pour les expériences de traitement combiné, 5 μM FTY720 a été utilisé comme concentration sensibilisante. La doxorubicine a été utilisée à 4 μM pour les cellules HL60/A et à 8 μM pour les cellules K562/A dans les tests d’apoptose et d’accumulation intracellulaire de doxorubicine, sauf indication contraire.
3. Analyse de viabilité cellulaire et calcul de la concentration inhibitrice à demi-maximal
Les cellules ont été ensemencées en plaques de 96 puits à 1 × 104 cellules par puits dans un milieu complet de 100 μL. Pour les tests FTY720 à un seul médicament, les cellules HL60, K562, HL60/A et K562/A ont été traitées avec 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 μM FTY720 pendant 48 heures. Pour le test de sensibilité à la doxorubicine, les cellules HL60/A et K562/A ont été traitées avec des concentrations sérielles de doxorubicine en présence ou en absence de 5 μM FTY720 pendant 48 heures.
La viabilité cellulaire a été mesurée à l’aide du test Cell Counting Kit-8 selon les instructions du fabricant. Après traitement, un réactif Kit de comptage cellulaire 8 a été ajouté à chaque puits, et la plaque a été incubée à 37 °C pendant 2 heures. L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
La viabilité relative des cellules a été calculée comme suit : viabilité relative des cellules = [(absorbance des puits traités - absorbance des puits blancs) / (absorbance des puits de contrôle par véhicule - absorbance des puits vierges)] × 100 %
Les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale ont été calculées à l’aide d’une régression non linéaire avec un modèle logistique dose-réponse à quatre paramètres dans GraphPad Prism, version 9.5. Chaque expérience comprenait trois réplications biologiques indépendantes, avec trois puits techniques par condition de traitement.
4. Analyse combinaison de médicaments
Les effets de FTY720 sur la sensibilité à la doxorubicine ont été évalués en comparant les relations dose-réponse à la doxorubicine en présence ou en absence de FTY720. Les cellules HL60/A et K562/A ont été traitées avec des concentrations sérieuses de doxorubicine seule ou de doxorubicine combinées à FTY720 pendant 48 heures.
La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide du test Cell Counting Kit-8, et les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximales ont été calculées à l’aide d’une régression non linéaire avec un modèle logistique dose-réponse à quatre paramètres. Les changements de sensibilité à la doxorubicine ont été interprétés en fonction des variations des courbes dose-réponse et des différences dans les valeurs de concentration inhibitrice demi-maximale entre les groupes traités.
Comme les expériences n’ont pas été conçues comme une étude complète à rapport fixe à matrice de dose, l’analyse formelle par indice de combinaison n’a pas été réalisée. Par conséquent, les résultats ont été interprétés comme des preuves d’une altération de la sensibilité à la doxorubicine plutôt que comme une synergie pharmacologique définitive.
5. Analyse de l’apoptose par cytométrie d’écoulement à l’annexe V et à l’iodure de propidium
Les cellules HL60/A et K562/A ont été ensemencées en plaques à 6 puits à 4 × 10 cellulesde 5 mL et traitées pendant 48 heures avec véhicule, FTY720 seul, doxorubicine seule, ou doxorubicine combinée avec FTY720. Pour le traitement combiné, 5 μM FTY720 a été combiné avec 4 μM doxorubicine dans les cellules HL60/A ou 8 μM doxorubicine dans les cellules K562/A.
Après traitement, des cellules ont été prélevées, y compris celles en suspension dans le milieu de culture, et lavées deux fois avec une solution séline tamponnée phosphate à froid. Les cellules ont été resuspendues dans un tampon de liaison Annexin V à la concentration recommandée par le fabricant du kit de détection d’apoptose. Chaque échantillon a été coloré avec 5 μL d’isothiocyanate d’annexine V-fluorescéine ou d’Annexine V-allophycocyanine et 5 μL d’iodure de propidium, suivi d’une incubation de 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
Les échantillons ont été analysés immédiatement par cytométrie en flux. Des contrôles non colorés, des contrôles à coloration unique et des contrôles fluorescent moins un étaient utilisés pour définir les grilles de compensation et de quadrant. Les débris étaient exclus à l’aide de barrières de diffusion avant et latérale. Les premières cellules apoptotiques étaient définies comme des cellules V-positives à l’annexe et à l’iodure de propidium, tandis que les cellules apoptotiques tardives ou mortes étaient définies comme positives à l’annexe V et positives à l’iodure de propidium. L’apoptose totale a été calculée comme la somme des fractions cellulaires apoptotiques précoces et tardives. Au moins 10 000 événements viables de cellule unique ont été acquis pour chaque échantillon.
6. Dosage intracellulaire d’accumulation de doxorubicine
Les cellules HL60/A et K562/A ont été ensemencées en plaques à 6 puits à 4 × 10 cellulesde 5 mL et cultivées pendant la nuit. Les cellules ont ensuite été traitées avec le contrôle du véhicule, la doxorubicine seule, ou la doxorubicine combinée à 5 μM FTY720. Les cellules HL60/A ont été traitées avec de la doxorubicine à 4 μM, et les cellules K562/A à la doxorubicine à 8 μM. Les cellules ont été incubées pendant 4 heures à 37 °C et protégées de la lumière.
Après traitement, les cellules ont été prélevées et lavées deux fois avec une solution physiologique froide tamponnée au phosphate pour éliminer la doxorubicine extracellulaire. Les cellules ont été remises en suspension dans une solution saline tamponnée phosphate et analysées par cytométrie en flux en utilisant la fluorescence intrinsèque de la doxorubicine. Des cellules non traitées ont été utilisées pour définir l’autofluorescence de fond, et des cellules traitées à la doxorubicine ont servi de référence fluorescente positive. L’accumulation intracellulaire de doxorubicine a été quantifiée en intensité médiane de fluorescence après exclusion de débris et d’agrégats. Les valeurs médianes d’intensité de fluorescence ont été normalisées au groupe doxorubicine seul dans chaque expérience indépendante.
7. Analyse cytométrique en flux de l’expression de la protéine P-glycoprotéine et de la protéine associée à la résistance multimédicamenteuse 1
Les cellules HL60/A et K562/A ont été ensemencées en plaques à 6 puits à 2 × 10cellules de 6 mL et traitées avec 5 μM FTY720 ou témoin véhicule pendant 24 heures. Après traitement, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution physiologique tamponnée au phosphate glacée puis remises en suspension dans un tampon de coloration cellulaire de 100 μL.
Les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-P-glycoprotéique conjugué à la phycoérythrine et un anticorps de protéine 1 associée à la résistance multi-médicamenteuse conjugué Alexa Fluor 647 à la dilution recommandée par le fabricant. Des contrôles isotype adaptés, des contrôles non colorés, des contrôles à coloration unique et des contrôles fluorescent moins un étaient inclus pour le réglage et la compensation des portes. Les échantillons ont été incubés pendant 30 minutes à 4 °C dans l’obscurité, lavés deux fois avec un tampon de coloration cellulaire, puis resuspendus dans un tampon de coloration cellulaire de 500 μL avant l’acquisition.
La cytométrie en flux a été réalisée à l’aide d’un cytomètre en flux BD FACScan. Au moins 10 000 événements viables de cellule unique ont été acquis pour chaque échantillon. Les niveaux d’expression de la P-glycoprotéine et de la protéine 1 associée à la résistance multimédicamenteuse ont été quantifiés en intensité médiane de fluorescence après soustraction du signal isotype-contrôle correspondant. Les valeurs normalisées ont été exprimées par rapport au groupe véhicule-témoin au sein de chaque expérience indépendante.
8. Western blotting et quantification densitométrique
Après les traitements indiqués, les cellules ont été collectées et lavées deux fois avec du sérum physiologique tamponné au phosphate froid. La protéine totale a été extraite à l’aide d’un tampon de radioimmunoprécipitation complété par des inhibiteurs de protéase et de phosphatase. La concentration en protéines a été mesurée à l’aide d’un kit de test protéique à base d’acide bicinchoninique.
Un total de 30 μg de protéines par voie a été séparé par électrophorèse en gel de dodécyle de sodium et polyacrylamide et transféré sur des membranes de polyvinylidène difluorure. Les membranes ont été obstruées avec 5 % de lait écrémé ou 5 % d’albumine sérique bovine dans une solution physiologique Tween 20 contenant Tween 20 tamponnée en tris pendant 1 heure à température ambiante.
Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre la protéine kinase totale B, la protéine kinase phosphorylée B, la cible mécaniste totale de la rapamycine, la cible mécaniste phosphorylée de la rapamycine, la caspase-3 clivée, la polypoly(adénosine diphosphate-ribose) clivée, la P-glycoprotéine, la protéine 1 associée à la résistance multimédicamenteuse et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase. Après lavage, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort appropriés pendant 1 heure à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées grâce à une détection chimiluminescence améliorée.
Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ, version 1.53t. La protéine kinase phosphorylée B a été normalisée en protéine kinase B totale, et la cible mécaniste phosphorylée de la rapamycine a été normalisée en cible mécaniste totale de la rapamycine. P-glycoprotéine, protéine 1 associée à la résistance multimédicamenteuse, caspase-3 clivée et poly(adénosine diphosphate-ribose) poly(adénosine diphosphate-ribose) polymérase clivée ont été normalisées en glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase. Les valeurs normalisées étaient exprimées comme des variations de pli par rapport au groupe témoin du véhicule ou au groupe doxorubicine seul, selon la comparaison. Des analyses Western blot ont été réalisées à l’aide de trois réplications biologiques indépendantes. Les images de Western blot non recadrées étaient déposées dans le dépôt public de données ou téléchargées comme fichiers complémentaires.
9. Expérience de sauvetage SC79
Pour examiner si la signalisation de la protéine kinase B était associée aux effets observés des cellules FTY720, HL60/A et K562/A, il a été traité avec FTY720 en présence ou en l’absence de SC79, un activateur de la protéine kinase B. Les cellules ont été prétraitées avec 5 μM FTY720 pendant 12 heures puis traitées avec SC79 30 μM ou contrôle véhicule pendant 12 heures supplémentaires.
Après traitement, la protéine kinase B phosphorylée, la cible mécanistique phosphorylée de la rapamycine, de la P-glycoprotéine et des niveaux de protéine 1 associée à la résistance multimédicamenteuse ont été évalués par Western blotting. Parallèlement, l’apoptose a été évaluée par coloration à l’Annexe V et au iodure de propidium après traitement à la doxorubicine, FTY720 et SC79. Les effets de sauvetage ont été interprétés comme des preuves associées aux voies. Comme aucune expérience de surexpression génétique ou de knockdown n’a été réalisée, les conclusions causales ont été formulées avec prudence.
10. Analyse statistique et reporting des données
Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide de GraphPad Prism, version 9.5, et d’IBM SPSS Statistics, version 23.0. Les réplications biologiques étaient définies comme des expériences indépendantes réalisées à différents jours en utilisant des cellules cultivées indépendamment. Les réplications techniques étaient définies comme des puits répétés ou des mesures répétées au sein d’une même expérience biologique.
Les données étaient présentées comme moyenne ±erreur standard de la moyenne, sauf indication contraire. Des comparaisons en deux groupes ont été analysées à l’aide d’un test t de Student à deux queues non apparié lorsque les données étaient approximativement normalement distribuées. Les comparaisons entre trois groupes ou plus ont été analysées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance, suivie du test post hoc de Tukey. Des expériences impliquant deux facteurs indépendants, tels que la concentration de médicament et l’état de traitement, ont été analysées à l’aide d’une analyse bidirectionnelle de la variance suivie d’une correction par comparaison multiple appropriée.
Lorsque les hypothèses de normalité n’étaient pas prises en charge, des tests non paramétriques étaient utilisés. Les valeurs p exactes étaient rapportées dès que possible. La signification statistique a été définie comme p < 0,05 après correction pour les comparaisons multiples. Toutes les légendes de figures spécifiaient le nombre de répliques biologiques, le test statistique utilisé, la signification des barres d’erreur et le seuil de signification. Les valeurs individuelles de réplication biologique étaient indiquées dans des nuages de points ou superposées sur des graphiques à barres lorsque cela était possible.