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Article de méthode

Un système rapporteur adénoviral basé sur des fibroblastes, piloté par le promoteur du collagène de type I alpha 1 de souris, pour le criblage de médicaments antifibrotiques

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DOI :

10.3791/71678

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14 août 2026

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1Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education, Shihezi University School of Medicine, 2NHC Key Laboratory of Cardiopulmonary Rehabilitation and Functional Recovery; Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), 3School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences, 4Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, 5State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Institute of Advanced Clinical Medicine, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 7Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, 8Haihe Laboratory of Cell Ecosystem

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la mise au point d'un système rapporteur à base d'adénovirus fondé sur les fibroblastes et contrôlé par un promoteur de collagène de type I de souris, permettant une surveillance longitudinale de l'activation des fibroblastes et facilitant le criblage à haut débit de composés antifibrosiques.

Résumé

La fibrose cardiaque, caractérisée par une activation anormale des fibroblastes et un dépôt excessif de matrice extracellulaire, manque de thérapies ciblant spécifiquement les lésions, principalement en raison de l'absence de méthodes longitudinales, évolutives et non destructrices in vitro plates de criblage. Les dosages traditionnels en point final et les modèles de cellules souches intensifs en ressources excluent par nature la surveillance en temps réel de la progression de la fibrose. Pour surmonter ces limitations, ce protocole décrit la génération, l'optimisation et la validation d'un modèle murin de collagène de type I alpha 1 (Col1a1) promoteur dirigé par adénovirus mCherry système rapporteur fluorescent (Ad-mCol1a1p-mCherry) dans des fibroblastes NIH/3T3. Les étapes critiques de l’emballage du virus adénoviral recombinant, de l’optimisation de la transduction (multiplicité d'infection) afin de minimiser la cytotoxicité, ainsi que la mise en place d’un modèle solide de fibrose induite par le facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) sont détaillées. En évitant la nécessité de fixer les cellules, ce système permet une surveillance directe et longitudinale de la transcription du collagène dans des cellules vivantes. La spécificité et la fiabilité du modèle sont validées pharmacologiquement à l’aide de l’inhibiteur SB431542 du récepteur de type I du TGF-β (ALK5), les signaux fluorescents étant corrélés aux marqueurs endogènes de fibrose quantifiés par transcription inverse suivie d’une réaction de polymérase en chaîne en temps réel (RT-qPCR) et par dosage immunoenzymatique (ELISA). En définitive, cette plateforme économique constitue un outil accessible pour le criblage haut débit de nouveaux agents antifibrotiques, accélérant ainsi la recherche translationnelle en cardiologie.

Introduction

La prise en charge de la fibrose cardiaque présente des défis cliniques importants. Caractérisée par l'activation anormale des fibroblastes quiescents en myofibroblastes et par un dépôt excessif de matrice extracellulaire (ECM), elle représente une voie terminale irréversible commune à l'insuffisance cardiaque, à l'infarctus du myocarde et à d'autres maladies cardiovasculaires1,2,3. Toutefois, les stratégies thérapeutiques actuelles font face à des limitations importantes. Les interventions classiques—telles que les diurétiques, les bêta-bloquants et les inhibiteurs du système rénine-angiotensine-aldostérone—atténuent principalement le stress hémodynamique systémique et réduisent l'activation neurohumorale4,5,6,7. Ces traitements ne ciblent pas directement l'activation des fibroblastes ni n'interrompent le dépôt continu de collagène. De plus, bien que des cascades de signalisation telles que la voie TGF-β/Smad, le stress oxydatif et le reprogrammation métabolique soient à l'origine de cette pathologie, la traduction de ces connaissances en thérapies antifibrosiques directes reste difficile en raison de toxicités systémiques et de mécanismes de délivrance non spécifiques8,9,10. Il existe donc un besoin urgent de nouvelles thérapies antifibrosiques spécifiques aux cibles. Un obstacle majeur à la translation clinique est l'absence de systèmes d'évaluation fonctionnels capables de détecter de manière sensible et dynamique l'activation des fibroblastes. Les modèles expérimentaux traditionnels présentent des limitations importantes qui empêchent un criblage pharmacologique efficace11,12. Bien que les modèles animaux in vivo reproduisent la remodelage cardiaque global, ils souffrent de différences interspécifiques, de délais expérimentaux prolongés, de coûts élevés et d'un faible débit11.

Pour surmonter ces obstacles, diverses plates-formes de criblage in vitro ont été mises au point ; toutefois, des failles méthodologiques importantes persistent. Les dosages d'immunofluorescence à haut contenu nécessitent une fixation cellulaire destructive et un traitement laborieux, fournissant uniquement une image statique au lieu de capturer la cinétique en temps réel de l'activation des fibroblastes. De même, les plates-formes combinant le suivi d'impédance sans marquage avec la spectrométrie de masse (MS/MS) souffrent d'un manque de spécificité et d'une faible évolutivité, car les baisses d'impédance provoquées par une toxicité cellulaire générale peuvent facilement être confondues avec une efficacité antifibreuse réelle. En outre, les systèmes rapporteurs conçus à l'aide de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR) utilisant des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pour suivre des marqueurs du cytosquelette (par exemple, l'actine alpha du muscle lisse [α-SMA]/ACTA2) présentent des obstacles translationnels importants13. Ces modèles basés sur les iPSC sont prohibitivement coûteux, exigeants sur le plan technique et largement inaccessibles pour un criblage à haut débit courant. Par ailleurs, la dépendance à l'égard de marqueurs cytosquelettiques tels que l'α-SMA pourrait ne pas refléter fidèlement l'aboutissement pathologique, car leur expression ne corrèle pas strictement avec la sécrétion fonctionnelle et le dépôt excessif de la MEC14. Ainsi, ces systèmes sont insuffisants pour cartographier longitudinalement les réponses cellulaires précoces aux interventions pharmacologiques.

En revanche, ce protocole décrit un système rapporteur fonctionnel longitudinal contrôlé par le promoteur du gène de la collagène de type I alpha 1 (Col1a1), dans le but de mettre en place une plateforme robuste et non destructive pour surveiller l'activation des fibroblastes. Étant donné que la collagène de type I est le composant majeur de la matrice extracellulaire déposé lors du remodelage cardiaque, la détection de l'activation transcriptionnelle de son gène codant, Col1a1, constitue un indicateur direct et pathologiquement pertinent de l'activation des fibroblastes. Ce modèle basé sur le promoteur de Col1a1 permet une surveillance continue au niveau moléculaire des processus fibrotiques, offrant ainsi une plateforme sensible, longitudinale et quantifiable, optimisée pour le criblage de médicaments fondé sur les mécanismes.

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Protocole

Nous confirmons que toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices institutionnelles et nationales. Étant donné que cette étude a utilisé exclusivement la lignée cellulaire établie de fibroblastes d'embryon de souris NIH Swiss (NIH/3T3) et le système rapporteur mCol1a1p-mCherry, et qu'elle n'a impliqué aucun animal vertébré, embryon ou sujet humain, une approbation éthique par un comité d'évaluation institutionnel n'était pas requise pour les procédures décrites dans cet article.

Toutes les procédures impliquant des vecteurs viraux adénoviraux recombinants ont été réalisées conformément aux réglementations institutionnelles de biosécurité et aux pratiques standard de niveau 2 de biosécurité (BSL-2). La manipulation, la transduction, le stockage et l'élimination des déchets viraux ont été effectués à l'aide de hottes de sécurité biologique certifiées et d'équipements de protection individuelle adaptés. Les déchets liquides contenant des matériaux adénoviraux ont été décontaminés à l'aide d'une solution d'eau de Javel fraîchement préparée avant leur élimination, et les consommables contaminés ont été stérilisés en autoclave conformément aux protocoles institutionnels de biosécurité. Les déversements accidentels ont été désinfectés immédiatement à l'aide d'agents virucides approuvés, conformément aux procédures institutionnelles de gestion des déversements.

1. Aperçu du protocole expérimental

  1. Générer un adénovirus recombinant sous contrôle du promoteur murin Col1a1 comme décrit à l'étape 2.
  2. Optimiser les conditions de transduction virale dans les fibroblastes NIH/3T3 comme décrit à l'étape 3.
  3. Établir un modèle rapporteur de fibrose in vitro sensible au TGF-β comme décrit à l'étape 4.
  4. Valider la stabilité, la spécificité et la reproductibilité biologique du modèle à l’aide d’une stimulation par le TGF-β dépendante du temps et de la dose comme décrit à l’étape 4.
  5. Réaliser une inhibition pharmacologique à l’aide de SB431542 comme décrit à l’étape 5.
  6. Effectuer des analyses en aval par dosage immunoenzymatique (ELISA) et par réaction de polymérisation en chaîne en temps réel quantitative (qPCR) comme décrit à l’étape 5.
    REMARQUE : Se référer à Figure 1A pour un aperçu schématique du déroulement expérimental. Se référer au Tableau des Matériaux pour les appareils et réactifs utilisés.

schéma du rapporteur adénoviral mCol1a1p-mCherry ; PCR, clonage de plasmide, processus de criblage des fibroblastes.
Figure 1. Schéma de mise en place et de validation du système rapporteur adénoviral mCol1a1p-mCherry dans les fibroblastes. (A) Aperçu schématique de la construction du système rapporteur adénoviral (AdV) mCol1a1p-mCherry et du déroulement expérimental de la validation du modèle dans les fibroblastes NIH/3T3. Le protocole comprend le clonage du promoteur, l'assemblage d'adénovirus recombinant, l'encapsidation virale dans des cellules HEK293, l'optimisation de la multiplicité d'infection (MOI) et un criblage fluorescent à haut contenu en aval. (B) Images fluorescentes représentatives de fibroblastes NIH/3T3 infectés par l'adénovirus Ad-mCol1a1p-mCherry à des MOI de 0, 1, 10, 100 et 1000. Les noyaux ont été colorés avec l’Hoechst 33342 (en bleu), et la fluorescence de mCherry (en rouge) indique l'activité du promoteur Col1a1. L'intensité de fluorescence a été quantifiée par imagerie à haut contenu et normalisée au nombre de noyaux. Un MOI de 100 a été retenu pour les expériences ultérieures, en raison d'une expression homogène et marquée du rapporteur accompagnée de modifications morphologiques minimales. Échelles = 200 µm. Cette figure a été réalisée avec BioRender.com sous licence approuvée. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

2. Construction, conditionnement et amplification du virus adéno-associé contenant le promoteur mCol1a1

  1. Construction du vecteur adénoviral recombinant
    1. Cloner le fragment promoteur murin Col1a1 de 2354 pb (coordonnées génomiques : chr11:94824779–94827132 ; −2271 à +83 pb par rapport au site de démarrage de la transcription [TSS]) en amont du gène rapporteur mCherry dans le vecteur intermédiaire adénoviral pDC315.
      NOTE : La séquence complète du promoteur Col1a1 et la carte détaillée du plasmide pDC315-mCol1a1p-mCherry sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1 et la Figure Supplémentaire 1.
    2. Linéariser le vecteur pDC315 à l’aide de BamHI et de KpnI. Amplifier l’insert promoteur à l’aide d’amorces contenant des bras d’homologie de 15 à 25 pb.
      NOTE : Utiliser une stratégie de clonage sans suture basée sur la recombinaison homologue pour faciliter la recombinaison in vitro.
    3. Vérifier le plasmide obtenu par criblage PCR et séquençage de Sanger.
      NOTE : Examiner attentivement la séquence de jonction promoteur–rapporteur afin de s’assurer qu’aucun décalage du cadre de lecture ou codon stop prématuré n’est présent.
    4. Générer l’adénovirus recombinant à l’aide du système AdMax par recombinaison intracellulaire médiée par Cre.
      NOTE : Le plasmide squelette pBHGloxΔE1,3Cre contient un génome Ad5 non réplicatif avec des délétions E1/E3 et une cassette d’expression de la recombinase Cre qui facilite la recombinaison site-spécifique avec le site loxP sur le vecteur intermédiaire.
    5. Co-transfecter des cellules HEK293 avec le vecteur intermédiaire pDC315-mCol1a1p-mCherry validé et le plasmide squelette adénoviral pBHGloxΔE1,3Cre.
  2. Encapsidation et amplification de l’adénovirus
    1. Entretenir les cellules HEK293 dans un milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Utiliser des cellules à bas passage (<20 passages) pour l’encapsidation de l’adénovirus.
    2. Ensemencer les cellules HEK293 à une confluence de 30 % à 40 %, 24 h avant la transfection, afin d’obtenir une confluence de 50 % à 60 % au moment de la transfection.
    3. Co-transfecter les cellules HEK293 avec 5 µg de plasmide intermédiaire et 5 µg de plasmide auxiliaire pBHGloxΔE1,3Cre à l’aide du réactif de transfection Lipofectamine 2000.
      NOTE : Maintenir un rapport ADN/réactif de 1:1 (10 µg d’ADN total pour 10 µL de réactif de transfection).
    4. Cultiver les cellules transfectées à 37 °C avec 5 % de CO₂ et les surveiller quotidiennement pour détecter les effets cytopathogènes.
      NOTE : Les premiers ECP peuvent nécessiter de 7 à 14 jours pour apparaître. Si le milieu devient acide (jaune), effectuer un échange doux de moitié de milieu sans perturber les cellules.
    5. Récupérer les cellules et le surnageant lorsque des ECP typiques, caractérisés par un arrondissement et une rétraction cellulaires, sont observés et qu’au moins 50 % des cellules se sont détachées de la surface de culture.
      NOTE : Ce stade est généralement atteint 10 à 15 jours après la transfection.
    6. Effectuer trois cycles de congélation-décongélation en congelant les échantillons à −70 °C pendant 30 min, puis en les décongelant dans un bain-marie à 37 °C.
    7. Vortexer la suspension pendant 30 s après chaque étape de décongélation pour favoriser la lyse cellulaire.
      NOTE : Éviter une incubation prolongée à 37 °C pendant la décongélation afin de préserver la stabilité virale.
    8. Préparer des dilutions sérielles décimales du lysat viral (10−1 à 10−13) à l’aide de DMEM complet. Ajouter 90 µL de chaque dilution virale à des cellules HEK293 ensemencées dans des plaques 96 puits, en utilisant 10 puits réplicats par dilution.
      NOTE : Un titre viral ≥1 × 109 PFU/mL a été défini comme un point final d’amplification suffisant pour la purification ultérieure.
    9. Clarifier 10 mL de lysat viral brut à travers un filtre de 0,45 µm pour éliminer les débris cellulaires.
    10. Traiter le lysat clarifié avec la nucléase Benzonase (10 U/mL) à 37 °C pendant 30 min.
    11. Purifier l’adénovirus recombinant à l’aide du kit Adeno-X Virus Purification Kit selon les instructions du fabricant.
      NOTE : Mélanger le lysat avec du tampon de dilution 1× avant de le charger sur le filtre de purification pré-équilibré. Laver le filtre avec le tampon de lavage 1× et éluer le virus purifié à l’aide de 3 mL de tampon d’élution 1×.
    12. Incuber les plaques pendant 10 jours et évaluer les effets cytopathogènes (ECP) au microscope optique. Noter les ECP positifs en fonction de l’arrondissement et du détachement cellulaires caractéristiques. Calculer le titre viral infectieux selon la méthode de Spearman–Karber à partir des résultats de notation des ECP.
      NOTE : S’assurer que le stock viral final atteint au moins 1 × 1011 PFU/mL pour les applications ultérieures.
    13. Aliquoter l’adénovirus purifié et conserver le stock viral à −80 °C.
      NOTE : Conserver les aliquots d’adénovirus purifié à −80 °C pour une conservation à long terme. Éviter les cycles répétés de congélation-décongélation afin de préserver l’infectiosité virale.

3. Culture cellulaire et optimisation des conditions d'infection virale

  1. Entretenir les fibroblastes NIH/3T3 dans du DMEM/Milieu nutritif F-12 (DMEM/F12) supplémenté avec 10 % de SFB et 1 % de pénicilline-streptomycine.
    NOTE : Utiliser des cellules comprises entre les passages 3 et 8 ayant atteint une confluence de 70 % à 80 % dans le flacon d'origine afin d'assurer un statut cellulaire constant.
  2. Ensemencer les fibroblastes NIH/3T3 dans des plaques de 384 puits à raison de 4 × 103 cellules par puits dans 40 µL de milieu de culture complet.
  3. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 12 h pour permettre l'attachement cellulaire et l'entrée en phase de croissance logarithmique.
    NOTE : Pour minimiser la distribution inégale des cellules et les effets de bord, laisser reposer les plaques à température ambiante pendant 20 à 30 min avant l'incubation. Remplir les puits périphériques avec du tampon phosphate salin stérile (PBS) ou de l'eau stérile.
  4. Infecter les cellules avec l'adénovirus recombinant à des multiplicités d'infection (MOI) variant de 1 à 1 000, parallèlement à un témoin non infecté.
    NOTE : Calculer le volume viral requis à l'aide de la formule suivante :

    Formule de charge virale V=N×MOI/T, équation mathématique pour la recherche et l'analyse en virologie.
    Ici, V est le volume de la souche d'adénovirus (mL), N est le nombre de cellules ensemencées par puit (4 × 103), MOI est la multiplicité d'infection souhaitée, et T est le titre viral infectieux (PFU/mL). La souche virale utilisée dans cette étude présentait un titre infectieux de 1 × 1011 PFU/mL, déterminé par la méthode de Spearman-Karber décrite à l'étape 2.2.12.
  5. S'assurer que le volume ajouté de la souche virale n'excède pas 10 % du volume total du puit.
    NOTE : Des volumes excessifs de souche virale peuvent modifier le pH du milieu et induire une cytotoxicité non spécifique.
  6. Remplacer le milieu contenant le virus par 40 µL de milieu de culture complet frais 24 h après l'infection.
    NOTE : Utiliser du DMEM/F12 supplémenté avec 10 % de SFB et 1 % de pénicilline-streptomycine, conforme à l'étape 3.1.
  7. Réaliser le changement de milieu à l’aide d’un distributeur automatique à basse vitesse ou en inclinant soigneusement les embouts de pipettes multicanal contre la paroi supérieure latérale de chaque puit.
    NOTE : Éviter l’aspiration sous vide classique lors de la manipulation de plaques de 384 puits afin de minimiser le détachement cellulaire.
  8. Définir le MOI optimal comme la dose virale la plus faible produisant une fluorescence homogène et visible de mCherry, tout en maintenant la morphologie cellulaire et les comptages nucléaires comparables à ceux des cellules témoins non infectées.
    NOTE : Évaluer l'expression du gène rapporteur par comptage des noyaux colorés à l'Hoechst et par imagerie de fluorescence. Les cellules doivent conserver leur morphologie caractéristique en forme de fuseau, sans arrondissement ni détachement. Des MOI excessivement élevés peuvent induire une activation basale de mCherry par le biais de réponses cellulaires au stress. Les résultats représentatifs de fluorescence à différents MOI sont présentés dans Figure 1B.
  9. Sélectionner le MOI optimisé pour toutes les expériences ultérieures.
    NOTE : Dans cette étude, un MOI de 100 a été sélectionné pour les expériences suivantes.

4. Évaluation de la stabilité du modèle à l'aide d'une stimulation par le TGF-β

  1. Infecter les fibroblastes NIH/3T3 avec l'adénovirus recombinant à un MOI optimisé de 100, tel que déterminé à l'étape 3.9.
  2. Privés de sérum les fibroblastes dans du DMEM/F12 contenant 0,2 % de FCS pendant 12 h avant la stimulation par le TGF-β.
    NOTE : La privation de sérum a été effectuée afin de synchroniser les cellules et de minimiser l'activation basale du promoteur Col1a1.
  3. Préparer une solution mère de TGF-β humain recombinant à 100 µg/mL en utilisant de l'acide chlorhydrique 4 mM contenant 0,1 % d'albumine de sérum bovin (BSA).
    NOTE : Aliquoter la solution mère de TGF-β en petits volumes et la conserver à −80 °C afin d'éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.
  4. Traiter les cellules avec un gradient de concentration de TGF-β allant de 0 à 40 ng/mL, en six réplicats biologiques indépendants.
    NOTE : La condition à 0 ng/mL a servi de groupe contrôle non stimulé.
  5. Incuber les cellules stimulées à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24, 48 ou 72 h. Utiliser des plaques parallèles distinctes pour chaque point temporel d'imagerie afin de minimiser la phototoxicité cumulative.
  6. Colorer les cellules avec une solution de Hoechst 33342 à une concentration finale de travail de 2,5 µg/mL pendant 15 min avant l'imagerie.
    NOTE : Préparer la solution de coloration en diluant la solution mère de Hoechst 33342 à 10 mg/mL dans du PBS stérile selon un rapport de 1:4 000. Effectuer la coloration dans des conditions protégées de la lumière afin de minimiser la photodégradation.
  7. Acquérir des images de fluorescence à l'aide d'un système d'imagerie à haut contenu équipé d'un objectif sec de 10×.
  8. Capturer cinq champs non superposés par puits dans le format de plaque 384-puits pour chaque condition expérimentale.
    NOTE : Maintenir des paramètres d'imagerie identiques pour tous les groupes expérimentaux afin d'assurer la comparabilité. Utiliser un autofocus automatique basé sur laser et maintenir les conditions contrôlées d'environnement à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant l'imagerie en temps réel.
  9. Acquérir des images de fluorescence mCherry en utilisant une excitation à 561 nm, un filtre d'émission Bandpass 600/52 (BP600/52) et un temps d'exposition de 200 ms.
  10. Acquérir des images de fluorescence Hoechst en utilisant une excitation à 405 nm, un filtre d'émission BP445/45 et un temps d'exposition de 30 ms.
    NOTE : Régler le gain de la caméra à 1,0 et acquérir toutes les images à la résolution maximale de la caméra en utilisant un binnage 1 × 1 afin de maintenir une détection linéaire de la fluorescence et de maximiser la résolution spatiale.
  11. Analyser les images acquises à l'aide du logiciel d'analyse d'images CellPathfinder.
  12. Identifier les noyaux dans le canal Hoechst comme objets primaires en utilisant un diamètre nucléaire de référence de 20 µm et une plage de surface de 20 à 400 µm2.
  13. Définir les régions d'intérêt cytoplasmiques (ROIs) dans le canal mCherry en étendant à partir de la limite nucléaire en utilisant un diamètre cellulaire de référence de 60 µm.
    NOTE : Appliquer un filtre « Exclure les bords » lors de la segmentation afin d'éliminer les cellules partielles touchant les bords de l'image.
  14. Calculer l'intensité moyenne de fluorescence pour chaque cellule identifiée et déterminer l'intensité moyenne de fluorescence par puits à partir des cinq champs capturés.

5. Validation de la fiabilité du modèle à l'aide d'un ELISA et d'une réaction de polymérase en chaîne quantitative en temps réel

  1. Infecter les fibroblastes NIH/3T3 avec l'adénovirus recombinant à un MOI optimisé de 100, comme décrit à l'étape 3.9.
  2. Prétraiter les cellules avec SB431542 pendant 30 à 60 min avant la stimulation par le TGF-β.
    NOTE : Préparer une solution mère de SB431542 à 20 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et conserver les aliquots à −20 °C.
  3. Traiter les cellules avec 10 ng/mL de TGF-β et SB431542 à des concentrations finales de 1, 5, 10 et 15 µM. Inclure un groupe contrôle véhicule contenant 0,1 % (v/v) de DMSO sans traitement par SB431542.
    NOTE : Maintenir la concentration finale de DMSO à 0,1 % (v/v) dans tous les groupes de traitement.
  4. Préparer la solution de travail de TGF-β selon une méthode de dilution en deux étapes.
    NOTE : Diluer la solution mère de TGF-β à 100 µg/mL (préparée dans du HCl 4 mM contenant 0,1 % d'albumine de sérum bovin) au rapport 1:100 dans du PBS stérile avant une dilution supplémentaire dans le milieu de culture complet afin d'obtenir une concentration finale de travail de 10 ng/mL.
  5. Incuber les cellules traitées dans des plaques à 6 puits pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
  6. Recueillir 2 mL de surnageant de culture de chaque puits pour l'analyse par ELISA.
  7. Centrifuger les surnageants recueillis à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C afin d'éliminer les débris cellulaires.
  8. Aliquoter les surnageants clarifiés et les conserver à −80 °C jusqu'à l'analyse par ELISA.
    NOTE : Les surnageants clarifiés peuvent être conservés à −80 °C avant l'analyse par ELISA.
  9. Laver délicatement les cellules adhérentes avec du PBS glacé après le retrait du surnageant.
  10. Ajouter directement 1 mL de réactif TRIzol dans chaque puits pour lyser les cellules.
    NOTE : Pipeter plusieurs fois le lysat afin d'assurer une homogénéisation complète avant de transférer les échantillons dans des tubes microcentrifuges. Les lysats d'ARN peuvent être conservés à −80 °C avant l'extraction de l'ARN.
  11. Extraire l'ARN total à partir des lysats pour l'analyse par transcription inverse et réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-qPCR).
  12. Réaliser la transcription inverse à partir de 1 µg d'ARN total.
    NOTE : Effectuer la transcription inverse selon les conditions réactionnelles suivantes : 25 °C pendant 10 min, 42 °C pendant 15 min et 85 °C pendant 2 min.
  13. Réaliser la PCR quantitative à l'aide du PerfectStart Green qPCR SuperMix. Préparer chaque réaction dans un volume final de 20 µL contenant 5 µL de matrice d'ADN complémentaire (ADNc).
  14. Exécuter les réactions de qPCR selon les conditions de cyclage suivantes : dénaturation initiale à 94 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles de 94 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 15 s et 72 °C pendant 10 s.
    NOTE : Réaliser une analyse de la courbe de fusion après amplification afin de confirmer la spécificité du produit.
  15. Normaliser l'expression du gène Col1a1 à celle de l'ARNr 18S utilisé comme témoin interne.
    NOTE : Toutes les séquences d'amorces sont fournies dans le Tableau supplémentaire 1.
  16. Quantifier les niveaux de protéine Collagène I sécrétée dans les surnageants clarifiés par ELISA selon les instructions du fabricant. La gamme de la courbe standard pour le test ELISA de collagène de type I murin est de 0,78 à 50 ng/mL, avec une sensibilité de détection du test de 0,37 ng/mL.
  17. Analyser tous les standards et échantillons en doubles techniques et mesurer la densité optique (DO) à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.
    NOTE : Utiliser les surnageants clarifiés non dilués afin de maximiser la sensibilité du test pour la détection du Col1a1 sécrété.

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Résultats

Un aperçu schématique de la construction et de l'encapsidation du virus adénoviral recombinant mCol1a1p-mCherry est présenté dans la Figure 1A. Le promoteur murin Col1a1 a été cloné en amont du gène rapporteur mCherry et inséré dans un vecteur adénoviral, suivi de l'encapsidation virale et de l'amplification dans des cellules HEK293. Le flux opératoire illustre les étapes expérimentales clés, incluant l'infection virale, la stimulation fibrotique, l'interv...

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Discussion

La fibrose cardiaque contribue à la progression de l'insuffisance cardiaque, et le développement de thérapies antifibrosiques efficaces est limité par l'absence de plateformes de criblage longitudinal2,13. Les méthodes classiques d'évaluation de l'efficacité antifibrosique, telles que le Western blot, la RT-qPCR et la coloration en immunofluorescence, reposent sur des mesures ponctuelles nécessitant la lyse ou la fixation des cellules. Ces approches empêchent une...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (32371158 à H.X.), le National Key R&Programme #38;D (2023YFA1800902 attribué à H.X.), "Tianchi Talent" programme, Projet ouvert du Laboratoire national clé de l'homéostasie et de la remodelage vasculaires (Université de Pékin) (202404 à R.Z. ; 202403 à Y.M.W.), Projet ouvert du Laboratoire clé des maladies endémiques et ethniques du Xinjiang, ministère de l'Éducation (Université de Pékin) (KF202404 à H.X.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque microtitration à fond en verre, 384 puitsCellvis, États-UnisP384-1,5H-NPlaque de 384 puits avec fond en verre utilisée pour la mise en culture des cellules, l'infection virale, la coloration et l'imagerie en fluorescence.
Plasmide squelette d'adénovirusMicrobix, CanadapBHGloxΔE1,3CrePlasmide utilisé pour générer le génome adénoviral recombinant de pleine longueur.
Vecteur intermédiaire adénoviral : pDC315-mCol1a1p-mCherryGeneChem, ChineService personnaliséVecteur intermédiaire adénoviral recombinant contenant le promoteur murin de Col1a1 de 2354 pb pilotant l'expression de mCherry.
Nucléase BenzonaseMerck Millipore, États-Unis70664-3Endonucléase utilisée lors de la purification des adénovirus pour éliminer les acides nucléiques contaminants.
Périmètre de sécurité biologique (classe II)Esco Lifesciences Group, SingapourAC2-4S1Périmètre de sécurité biologique certifié utilisé pour la manipulation de l'adénovirus recombinant et les procédures de culture cellulaire stériles.
Milieu de culture cellulaire (DMEM/F12 complet)HyClone, États-Unis12800-017Milieu de culture complet utilisé pour l'entretien des cellules NIH/3T3 et HEK293.
Logiciel d'analyse d'images CellPathfinderYokogawa Electric Corporation, JaponVersion 3.08.01Logiciel d'analyse d'images utilisé pour la quantification automatisée de la fluorescence et la segmentation cellulaire.
Système de criblage à contenu élevé CellVoyager CV8000Yokogawa Electric Corporation, JaponCV8000Système d'imagerie à haut contenu utilisé pour l'acquisition de la fluorescence de mCherry et d'Hoechst.
CO2 Incubateur de culture cellulaireThermo Fisher Scientific, États-Unis3111Incubateur humidifié maintenu à 37 °C avec 5 % de CO₂2 pour la culture de cellules de mammifères.
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich, États-UnisD2650Solvant utilisé pour la préparation du SB431542.
Dulbecco’Milieu modifié de Eagle/mélange nutritif F-12 (DMEM/F-12)Servicebio, ChineG4610Milieu de culture basal utilisé pour les fibroblastes NIH/3T3.
Sérum de veau fœtal (SVF)Ausbian, AustralieVS500TSupplément sérique utilisé à 10 % (v/v) pour la préparation du milieu de culture complet.
Coloration fluorescente Hoechst 33342Invitrogen, États-UnisH3570Colorant nucléaire utilisé pour l'imagerie en fluorescence et la normalisation du nombre de noyaux.
Cellules HEK293ATCC, États-UnisCRL-1573Ligne cellulaire d'emballage utilisée pour la production et l'amplification d'adénovirus.
TGF-β recombinant humainβ1MedChemExpress, ChineHY-P78214Cytokine utilisé pour induire l'activation fibrotique dans les fibroblastes NIH/3T3.
Logiciel d'acquisition d'imagesYokogawa Electric Corporation, JaponVersion 3.08.01.03Logiciel utilisé pour l'acquisition automatisée d'images de fluorescence et la commande du microscope.
Réactif de transfection à base de lipidesInvitrogen, États-Unis11668-019Réactif de transfection utilisé pour la livraison de plasmides adénoviraux dans des cellules HEK293.
Tubes de microcentrifugeuseAxygen, États-UnisMCT-150-CTubes utilisés pour le stockage des lysats d'ARN et le traitement des échantillons.
Lecteur de microplaquesTecan, SuisseÉtincelleLecteur multimode de microplaques utilisé pour les mesures d'absorbance en ELISA.
Kit ELISA de collagène de type I chez la sourisMeike Biotechnology, ChineMK6778AKit ELISA utilisé pour quantifier le collagène de type I sécrété dans les surnageants de culture.
Fibroblastes murins NIH/3T3Procell Life Science, ChineCL-0171Ligne cellulaire de fibroblastes murins utilisée pour l'établissement et la validation du modèle rapporteur.
Enzyme de restriction PacINew England Biolabs, États-UnisR0547SEnzyme de restriction utilisé pour la linéarisation du plasmide adénoviral.
Pénicilline–Solution de streptomycineGibco, États-Unis15140-122Solution d'antibiotique supplémentée à 1 % (v/v) pour prévenir la contamination bactérienne.
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen Biotech, ChineAQ602Mix maître de qPCR à base de SYBR Green utilisé pour l'analyse de PCR quantitative.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Servicebio, ChineG4202Tampon utilisé pour le lavage des cellules et la préparation des réactifs.
Vecteur intermédiaire pDC315-EGFPGeneChem, ChineN/AVecteur intermédiaire adénoviral parent utilisé pour la construction du plasmide rapporteur.
Système de PCR quantitativeApplied Biosystems, États-UnisQuantStudio 5Système de PCR en temps réel utilisé pour l'analyse quantitative de l'expression génique.
Enzymes de restriction (BamHI et KpnI)Abclonal, ChineRK21101, RK21104Enzymes de restriction utilisés pour la linéarisation du vecteur de transfert.
Kit de transcription inverseTransGen Biotech, ChineAT311Kit de transcription inverse utilisé pour la synthèse d'ADNc avant la RT-qPCR.
Réactif de lyse de l'ARNInvitrogen, États-Unis15596026Réactif utilisé pour l'extraction d'ARN total à partir de cellules cultivées.
SB431542MedChemExpress, Chine301836-41-9TGF-β inhibiteur du récepteur de type I utilisé pour des expériences d'inhibition pharmacologique
Service/ réactifs de séquençage SangerShanghai Boshang Biotechnology Co., Ltd., ChineService personnaliséService/réactifs de séquençage utilisés pour la vérification de la séquence du plasmide.
Pipettes serologiquesCorning, États-Unis4488Pipettes stériles utilisées pour la manipulation de liquides lors des procédures de culture cellulaire.
Cyclage thermique T30LongGene Scientific Instruments, ChineT30Thermostat utilisé pour la transcription inverse et l'amplification par PCR.
Solution de trypsine-EDTAGibco, États-Unis25200-056Réactif de dissociation cellulaire utilisé pour le passage cellulaire de routine.
Kit de purification viraleTakara Bio USA631533Kit utilisé pour la purification d'adénovirus recombinants.
Bain-marieShanghai Yiheng Scientific Instruments, ChineHWS-12Bain-marie thermostaté utilisé pendant la congélation de l'adénovirus–cycles de décongélation

Références

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