FISH à réaction en chaîne d’hybridation dans le lobe optique en développement de Drosophila

Résumé

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour réaliser l’hybridation par réaction en chaîne fluorescente in situ (HCR-FISH) dans les lobes optiques larvaires de Drosophila melanogaster . Les procédures de conception de la sonde, de l’hybridation, de l’amplification et du montage tissulaire sont détaillées afin de faciliter la visualisation du lobe optique en développement.

Résumé

Comprendre le développement neuronal nécessite une caractérisation précise du moment et du lieu où les gènes sont exprimés. Des techniques telles que l’hybridation in situ permettent depuis longtemps la visualisation de l’expression génique dans les tissus en développement. Bien que l’hybridation in situ soit largement utilisée chez les embryons de Drosophila melanogaster , son application au développement du système visuel a été limitée par plusieurs défis techniques. Par exemple, les longues sondes pénètrent souvent mal dans le lobe optique, et les protocoles qui reposent sur des rapporteurs catalytiques diffusibles, tels que la peroxydase de raifort, produisent souvent de faibles rapports signal/bruit dans des préparations montées complètement. L’hybridation par réaction en chaîne fluorescente in situ (HCR-FISH) surmonte nombre de ces limitations et permet une détection du signal plus robuste. Comme dans le FISH conventionnel, les monomères de sonde d’ADN s’hybrident avec des séquences d’ARN à l’intérieur des tissus. Dans HCR-FISH, cependant, les sondes amplificatrices conjuguées fluorescentement forment des structures en épingle à cheveux stables qui déclenchent la polymérisation de monomères supplémentaires, amplifiant ainsi l’intensité du signal. L’utilisation de groupes de sondes multiplexées permet également l’utilisation d’oligonucléotides plus courts (~45 nt, contre jusqu’à 1 000 nt dans le FISH conventionnel), améliorant la pénétration de la sonde et produisant une coloration plus uniforme sur des échantillons montés entiers. Cet article décrit un protocole HCR-FISH optimisé pour le lobe optique larvaire de Drosophila . Le protocole adapte les approches existantes de HCR-FISH en optimisant les conditions de fixation et en augmentant les concentrations de sonde et d’épingle à cheveux afin d’améliorer l’intensité du signal et la pénétration tissulaire. Des listes de réactifs et des procédures étape par étape sont fournies. Des applications potentielles en neurobiologie du développement sont également présentées, notamment la visualisation de neurones nouveau-nés et la caractérisation des schémas d’expression génique dans les cas où les méthodes conventionnelles, telles que les protéines marquées endogènement ou la coloration par anticorps, ne fournissent pas suffisamment d’informations.

Introduction

Comprendre comment le cerveau est assemblé nécessite d’identifier à la fois la diversité des types cellulaires présents et les répertoires géniques exprimés dans chaque type cellulaire¹. Les avancées récentes dans le séquençage de l’ARN unicellulaire ont permis aux chercheurs de répondre à ces questions à haute^{résolution 2}. Cependant, de nombreuses approches unicellulaires ne préservent pas l’information spatiale, nécessitant des expériences supplémentaires pour cartographier les groupes cellulaires transcriptionnels à leur emplacement dans le cerveau en développement.

Les systèmes d’expression génique binaire tels que GAL4-UAS peuvent fournir des informations de position mais ne sont pas^{quantitatifs 3}. De plus, les délais entre l’expression génique et la détection par rapporteurs peuvent masquer les schémas d’expression physiologiquement pertinents lors des premiers stades du développement. L’immunocoloration est une autre approche largement utilisée pour déterminer les schémas d’expression spécifiques aux^{tissus 4}. Cependant, les protéines sécrétées sont souvent diffuses et difficiles à localiser avec précision.

Les approches de marquage nucléotide, telles que l’hybridation in situ (ISH), ont également été largement utilisées pour obtenir des informations spatiales sur l’expression^{génique 5}. Dans l’ISH, les oligonucléotides d’ADN marqués se lient aux séquences d’ARN complémentaires inverses d’intérêt. Les premières méthodes ISH utilisaient des sondes d’ADN^{radiomarquées 6}, tandis que les protocoles ultérieurs incorporaient des marquants plus sûrs tels que la digoxigénine, la fluorescéine et la rhodamine ^7,8,9. Les scientifiques ont rapidement adapté l’ISH pour une utilisation chez Drosophila melanogaster, où il a été appliqué pour caractériser l’organisation des chromosomes polytènes et cartographier les schémas d’expression des gènes de gap tels que le bossu chez les embryons montés^{entiers 10,11}.

Malgré son utilité généralisée, plusieurs limitations techniques ont freiné l’adoption de l’ISH dans des préparations plus épaisses à montage complet telles que le lobe optique larvaire. De nombreux protocoles in situ reposaient sur des rapporteurs catalytiques diffusibles, tels que la peroxydase de raifort, ce qui entraînait souvent de faibles rapports signal/^{bruit 12}. De plus, de nombreuses approches utilisaient de longues sondes ciblant des séquences uniques pour améliorer la spécificité. Bien qu’efficaces chez les embryons de Drosophila et les chromosomes polytènes, les longues sondes pénètrent mal dans le cerveau larvaire et produisent souvent un marquage inégal 10,11,13.

Le développement de l’ISH fluorescent à molécule unique (smFISH) et de l’hybridation par réaction en chaîne fluorescente in situ (HCR-FISH) a permis de répondre à nombre de ces limites^14,15. En utilisant des ensembles de petites sondes placées sur une seule région génique, smFISH réduit la longueur moyenne des sondes d’environ 1 000 nt à environ 40 nt¹⁶. Cela améliore considérablement la pénétration de la sonde tout en maintenant une forte intensité du signal. HCR-FISH améliore encore les rapports signal/bruit en utilisant des sondes amplificatrices conjuguées fluorescentement qui augmentent la précision positionnelle et amplifient la sortie du signal. Il est important de noter que cette étape d’amplification semble évoluer linéairement avec la concentration des transcrits, permettant une mesure quantitative des niveaux d’expression^{génique 17}.

HCR-FISH commence par des sondes initiatrices complémentaires à la séquence cible. Ces oligonucléotides d’ADN non marqués contiennent une séquence d’initiateur simple brin qui se lie au domaine d’entrée d’une sonde amplificatrice H1 marquée par fluorescence. Les amplificateurs H1 adoptent une structure en épingle qui maintient l’inactivité catalytique jusqu’à ce qu’elle se lie à la séquence d’initiateur. Lors de la liaison, l’amplificateur H1 s’ouvre et expose une séquence qui se lie à une sonde partenaire, H2. Cette interaction ouvre l’épingle H2, lui permettant de lier une autre sonde H1 (Figure 1)¹⁵. Des cycles répétés de liaison H1/H2 génèrent un polymère stable qui amplifie le signal de fluorescence tout en réduisant le bruit de fond. Parce que chaque séquence d’initiateur est spécifique à une paire H1/H2 correspondante, plusieurs sondes avec des séquences d’initiateur distinctes et des fluorophores peuvent être utilisées simultanément pour marquer plusieurs gènes au sein du même échantillon.

Figure 1 : Représentation graphique du flux de travail HCR-FISH. Les sondes d’ADN contenant des séquences initiatrices s’hybrident en un transcript d’ARN cible. Les épingles à cheveux amplificatrices d’ADN marquées fluorescentement se lient à la séquence initiatrice et subissent une polymérisation séquentielle pour former des chaînes d’amplification doubles et stables. La conjugaison directe du fluorophore améliore l’amplification du signal et le rapport signal/bruit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Les récentes améliorations apportées à HCR-FISH ont encore accru son utilité. La conception de sonde à initiateur séparé améliore la spécificité de l’amplificateur, et les anticorps secondaires conjugués aux initiateurs HCR permettent une immunohistochimie simultanée et^{HCR-FISH 18}. De plus, les options fluorophores élargies permettent désormais l’imagerie multiplexée de jusqu’à 10 gènes^{simultanément 19, 20}.

Bien que des premières expériences de preuve de concept pour HCR-FISH aient été réalisées sur le poisson-zèbre (Danio rerio), la méthode a été largement utilisée dans de nombreux systèmes, en particulier chez des organismes non modèles où les anticorps sont coûteux ou indisponibles¹⁵. La synthèse par sonde offre également une alternative plus rapide à la génération d’anticorps, ce qui peut nécessiter des mois de développement. Par conséquent, HCR-FISH offre une approche rapide pour valider les gènes candidats identifiés via les ensembles de données de séquençage d’ARN unicellulaire²¹. Même chez les organismes modèles génétiques établis, HCR-FISH offre une méthode précieuse pour cartographier spatialement les neurones nouvellement nés lorsque les rapporteurs GAL4 ou l’immunohistochimie ne marquent pas correctement des populations cellulaires spécifiques.

Cet article décrit un protocole HCR-FISH optimisé pour le lobe optique larvaire de Drosophila au troisième stade. Le protocole adapte des méthodes précédemment publiées chez d’autres organismes pour une utilisation dans le système visuel²² de Drosophila. Les conditions de fixation couramment utilisées pour l’immunohistochimie de Drosophila étaient optimisées pour les applications FISH. Les concentrations de sonde et d’épingle à cheveux ont été augmentées pour améliorer l’intensité du signal et la pénétration tissulaire. Des tubes PCR ont été utilisés à la place des plaques ponctuelles pour réduire la consommation de réactifs et simplifier la manipulation de petits échantillons de tissu. De plus, les temps de lavage et d’hybridation ont été raccourcis pour s’adapter à la taille plus petite du cerveau de Drosophila par rapport à d’autres systèmes insectes couramment utilisés pour HCR-FISH.

Les applications représentatives démontrent comment cette approche peut fournir des informations de position pour des populations neuronales spécifiques au cours du développement. Ces expériences indiquent que certains transcrits, comme abrupts, peuvent être détectés plus tôt avec HCR-FISH qu’avec la coloration par anticorps ou les lignes rapporteures. Les défis potentiels, les stratégies de dépannage et les applications de HCR-FISH pour étudier le développement des systèmes visuels chez Drosophila sont également abordés.

Protocole

Toutes les expériences sur Drosophila melanogaster ont été réalisées conformément aux directives du City College of New York, de l’Université Columbia et de l’Université de New York pour la prise en charge et l’utilisation des organismes de recherche. Les outils de recherche utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparer les tampons

REMARQUE : Préparez tous les réactifs dans des tubes sans nucléase à l’aide de pointes filtrantes.
REMARQUE : Portez des gants tout au long de l’intervention. Nettoyez les surfaces de travail avec une solution de décontamination RNase avant de commencer.

1. Préparer des solutions sans nucléase
   1. Préparez 1x PBS-T en diluant 20x PBS, Triton X-100 et glycine dans de l’eau sans nucléase à des concentrations finales de 1x PBS, 1 % (v/v) Triton X-100 et 1 mM de glycine.
   2. Préparez 5x SSCT en diluant 20x SSC et Tween-20 dans de l’eau sans nucléase pour préparer 5x SSC contenant 0,1 % (v/v) Tween-20.
   3. Diluez 20x PBS dans de l’eau sans nucléase pour préparer 1x PBS.

2. Sondes de conception

1. Pour concevoir des sondes commercialement, il faut sélectionner l’isoforme d’intérêt pour l’espèce d’intérêt et ordonner des sondes adaptées à l’amplificateur souhaité via l’interface web du fournisseur.
   REMARQUE : Les chimies commerciales de sondes HCR et les séquences d’initiateur sont propriétaires et brevetées par Molecular Instruments.
   1. Modifier la région cible dans l’interface web si la détection spécifique aux transcrits ou pré-ARNm est souhaitée.
   2. Commandez environ 20 sondes pour des transcriptions très expresses. Utiliser jusqu’à 40 sondes pour des transcrits à faible abondance dans des préparations de Drosophila montées entières.
      REMARQUE : Commandez des oligos spécialisés pour des transcriptions plus courtes qui conviennent à moins de sites de liaison de sonde.
2. Pour concevoir manuellement les sondes, téléchargez la séquence FASTA pour la transcription cible. Déterminez si vous ciblez une isoforme unique ou toutes les isoformes du gène.
   REMARQUE : Prioriser les exons constitutifs ou les isoformes fortement exprimées identifiées à partir des ensembles de données de séquençage ARN afin d’améliorer le signal.
   1. Si vous concevez des sondes pour la détection pré-ARNm, concevez des sondes couvrant les jonctions intron-exon. Concevoir des sondes enjambant des jonctions de stallage pour détecter les transcriptions matures. Utilisez des sondes intrôniques pour détecter les transcripts naissants à l’intérieur des noyaux.
      REMARQUE : Les sondes introniques peuvent ne pas colocaliser avec des transcriptes cytoplasmiques matures et peuvent nécessiter des marqueurs supplémentaires pour l’identification cellulaire.
   2. Déterminez la taille de l’ensemble de sonde. Utilisez au minimum environ 5 sondes pour les transcrits courts lorsque des ensembles de sondes plus grands ne peuvent pas être conçus. Utilisez 20 sondes pour les applications standards et environ 40 sondes pour une sensibilité optimale sur des échantillons montés^{entiers 18,23}.
   3. Si vous concevez vos propres sondes, utilisez des séquences de 25nt séparées par un espaceur de 2 pB et ajoutez des séquences d’initiateur divisées à l’extrémité 5' de chaque oligo.
      REMARQUE : Bien que les séquences d’initiateurs split de première génération soient publiques, les séquences commerciales de nouvelle génération sont propriétaires¹⁸.
   4. Si vous concevez vos propres sondes, validez les séquences de sonde. Assurez-vous que les sondes de chaque ensemble ont des températures de fusion similaires. Confirmez l’identité à 100 % entre les sondes.
      REMARQUE : Éviter les régions fortement riches en G et maintenir un contenu de GC similaire parmi les^{sondes 24}. Minimisez les séquences répétitives et évaluez les liaisons hors cible à l’aide de BLAST²⁵.
   5. Utilisez des logiciels de conception de sondes accessibles au public lorsque cela^{est approprié 26,27}.
      REMARQUE : Les outils de conception open source peuvent ne pas reproduire les performances optimisées des pipelines commerciaux de conception de sondes.

3. Disséquer, fixer et pré-hybrider les cerveaux

1. Amortissez l’hybridation de la sonde pré-réchauffe jusqu’à 37 °C.
   ATTENTION : Le tampon d’hybridation de la sonde contient de la formamide. Manipulez sous une hotte chimique tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
2. Diluez chaque sonde fixée à une concentration finale de 1 μM à l’aide d’eau distillée sans nucléase.
3. Aliquote environ 250 μL de PBS sans nucléase sur un plat disséquant.
4. Transférez une larve errante du troisième stade dans le PBS à l’aide de pinces. Tenez l’abdomen avec une paire de pinces et saisissez les crochets buccaux avec une seconde paire. Tirez les crochets buccaux loin du corps pour isoler le cerveau et le cordon nerveux ventral (VNC).
5. Retirez les corps graisseux et les glandes salivaires tout en conservant le VNC. Transférer les cerveaux disséqués dans un tube contenant 600 μL de PBS sans nucléase glacée.
   REMARQUE : Gardez les lobes optiques immergés tout au long de la dissection pour éviter le dessèchement des tissus.
6. Répétez la dissection jusqu’à ce qu’environ six lobes optiques aient été collectés. Faites les dissections en 20 minutes pour minimiser la dégradation des tissus.
7. Ajoutez 200 μL de paraformoldéhyde à 16 % (PFA) pour obtenir une concentration finale de 4 % de PFA. Inversez doucement le tube pour mélanger et couver pendant 15 minutes à température ambiante.
   ATTENTION : Le PFA est toxique et mutagénique. Manipulez sous une hotte chimique en portant des gants.
8. Retirez le fixateur des échantillons et déposez-le comme déchets chimiques désignés. Laver les échantillons trois fois avec 600 μL de PBS froid sans nucléase, en utilisant une plaque de dissection pour recueillir les solutions de lavage.
   REMARQUE : Inspectez les solutions de lavage pour détecter la perte de tissu et récupérez tout cerveau déplacé au microscope disséqueur.
9. Transférer les cerveaux dans un tube PCR contenant 100 μL de tampon d’hybridation de la sonde préchauffé.
   Mélangez doucement en faisant un coup sec sur le tube et faites couver pendant 10 minutes à température ambiante.
   REMARQUE : Assurez-vous que le cerveau reste immergé et ne colle pas aux parois des tubes.

4. Hybridation des sondes

1. Préparez une solution de sonde de 4 nM en ajoutant 0,4 pmol de chaque sonde placée sur le tampon d’hybridation de la sonde pour un volume final de 100 μL.
   REMARQUE : Augmentez la concentration de la sonde jusqu’à 16 nM si l’intensité du signal est faible dans les colorations initiales.
2. Retirez le tampon de pré-hybridation sans perturber le tissu. Ajoutez la solution de sonde diluée à chaque échantillon.
3. Incuber des échantillons à 37 °C sur un nutator pendant 16 à 24 heures.

5. Amplifier le signal de la sonde

1. Amenez le tampon d’amplification à température ambiante. Préparez environ 200 μL de tampon d’amplification par échantillon.
2. Équilibrez le tampon de lavage. Faites un tampon de lavage à la sonde à 37 °C à l’aide d’un bain-marie.
   ATTENTION : Le tampon de lavage de sonde contient de la formamide. Poignée sous une hotte chimique.
3. Retirez la solution de la sonde et conservez-la à -20 °C pour réutilisation.
   REMARQUE : Réutilisez les solutions de sonde jusqu’à ce que l’intensité de la coloration diminue.
4. Lavez les échantillons quatre fois pendant 10 minutes chacun dans un tampon de lavage à sonde préchauffé à 37 °C. Laver les échantillons deux fois pendant 5 minutes chacun dans un SSCT à température ambiante 5 fois.
5. Ajoutez 100 μL de tampon d’amplification sans épingles. Incubez pendant 30 minutes à température ambiante.
6. Chauffez un thermocycleur à 95 °C. Ajoutez 2 μL de chaque crosse épingle à cheveux de 3 μM dans des tubes PCR séparés. Préparez un tube pour chaque espèce d’épingle à cheveux.
   REMARQUE : Augmenter la concentration de l’amplificateur si la coloration produit des points clairsemés ou un faible rapport signal/bruit.
7. Incubez les épingles à cheveux à 95 °C pendant 90 s. Protégez les tubes de la lumière et étouffez à température ambiante pendant au moins 30 minutes.
8. Préparez la solution d’amplification. Combinez les épingles à cheveux dans le tampon d’amplification pour obtenir un volume final de 100 μL par échantillon.
9. Retirez le tampon d’amplification des échantillons. Ajoutez un tampon d’amplification contenant une épingle à cheveux.
   Incubez toute la nuit à température ambiante sur un nutator protégé de la lumière (enveloppé dans du papier aluminium).
10. Retirez la solution d’amplification. Laver les échantillons deux fois pendant 5 minutes dans 150 μL de 5x SSCT. Laver les échantillons trois fois pendant 10 minutes dans 150 μL de 5x SSCT sur un nutator. Effectuer deux lavages courts dans du PBS sans nucléase pour enlever la lessive.

6. Monter des cerveaux pour l’imagerie

1. Collez un autocollant d’imagerie sur une lame en verre. Appuyez doucement avec l’extrémité inférieure d’une pince pour enlever les bulles d’air emprisonnées.
2. Coupez le cerveau en deux à travers la moelle nerveuse ventrale à l’aide de pinces.
3. Placez le cerveau au centre de la puits d’espace. Orientez le tissu latéralement avec le lobe optique orienté vers le haut.
4. Ajoutez suffisamment de milieu de montage antidécolorant (environ 25 μL) pour remplir le puits sans introduire de bulles d’air. Répartir le support de montage uniformément à l’aide de pinces.
5. Placez une goupille sur l’échantillon et scellez avec du vernis à ongles.

Résultats

Pour les scientifiques étudiant la neurobiologie du développement, HCR-FISH offre une méthode robuste pour visualiser les schémas d’expression génique et déterminer la position spatiale des neurones en développement dans le lobe optique de Drosophila .

Dans le lobe optique de Drosophila (Figure 2A), les neurones du neuropil de la moelle almoelleuse proviennent de cellules souches neuronales (neuroblastes) dérivée...

Discussion

Cette étude décrit une adaptation de HCR-FISH pour une utilisation dans le lobe optique larvaire de Drosophila melanogaster . Les approches conventionnelles d’hybridation in situ fonctionnent souvent mal dans le tissu cérébral larvaire monté entier en raison d’une pénétration limitée de la sonde et d’une faible intensité du signal. Le protocole présenté ici optimise plusieurs étapes critiques pour améliorer la qualité de coloration dans le lobe optique en développement....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10% Tween-20	Bio-Rad Laboratories	1662404	NA
20x PBS, pH7.4	Growcells.com	MRGF-6396	2,74M NaCl, 53,7 mM KCl, 20,3 mM Na2HPO4, 29,4 mM KH2PO4
20x SSC	Quality Biological	351-003-131	3M NaCl, 0,3M Sodium Citrate
37 °C incubator	Fisher Scientific (Isotemp)	15-015-2633	NA
37 °C water bath	Fisher Scientific	FSGPD15D	NA
Aluminum foil	Reynolds Wrap/Fisher Brand	15-078-291	NA
Antibody: Mouse-anti-Abrupt	DSHB	Abrupt; RRID: AB_528344	Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	Catalog# 06-896; RRID: AB-619712	Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFP	Life Technologies	#11122; RRID: AB_221569	Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-Dll	Genscript/Desplan lab	-	Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherin	DSHB	DN-Ex #8, RRID: AB_528121	Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxN	Genscript/Desplan lab	-	Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jam	Gift from D. Godt	-	Dilution: 1:2 000
Antibody: Donkey anti-Rat 405	Jackson ImmunoResearch	Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680	Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488	Jackson ImmunoResearch	Code #703-545-155; RRID: AB_2340375	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488	Jackson ImmunoResearch	Code #715-545-151; RRID: AB_2341099	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488	Jackson ImmunoResearch	Code #711-545-152; RRID: AB_2313584	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555	Thermo Scientific	Catalog #A-31572; RRID: AB_162543	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunoResearch	Code #712-165-153; RRID: AB_2340667	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647	Jackson ImmunoResearch	Code #706-605-148; RRID: AB_2340476	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647	Jackson ImmunoResearch	Code #712-605-153; RRID: AB_2340694	Dilution: 1:200
Antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	S36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)	D'autres antifades fonctionneront également, y compris ceux avec DAPI (S36936)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM-880	NA
Cover slips (22 x 30)	VWR	16004-332	NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG	BDSC	38626; RRID: BDSC_38626	NA
Fly: D. melanogaster: Canton S	BDSC	64349; RRID: BDSC_64349	NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4	BDSC	1553; RRID: BDSC_1553	NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB	BDSC	83660; RRID: BDSC_83660	NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;	BDSC	32198; RRID: BDSC_32198	NA
Fly: D. melanogaster: UAS-Stinger	BDSC	84277; RRID: BDSC_84277	NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4	BDSC	600136; RRID: BDSC_600136	NA
Forceps	Dumont	#5 ou #55s	NA
Glass slides	VWR	16005-106	NA
Glycine	Millipore Sigma	G7126-10MG	NA
HCR Amplification buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR-Gold Amplifiers	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR HiFi Probes	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contient du formamide
HCR Probe Wash Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contient du formamide
Nail polish (clear)	Electron Microscopy Sciences	72180	NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9937	NA
Nutating mixer	Corning/Fisher Scientific	10-320-100	NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)	Electron Microscopy Sciences	15710	Toxique
PCR Machine/Thermal Cycler	Bio-Rad	1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)	NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0,2 mL)	USA Scientific	#1402-2400	NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	FB0875714	NA
RNase ZAP	ThermoFisher Scientific	AM9780	NA
Slide spacer stickers	SUNJin	IS016 (iSpacer stickers (0,2 mm deep))	NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	NC9285739	NA
Triton X-100	Merck Millipore Sigma	X100	NA