Plateforme de nano-actionnement magnétique pour la mécanostimulation contrôlée et à distance de cellules de Schwann avec imagerie confocale en temps réel

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

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Article de méthode

Plateforme de nano-actionnement magnétique pour la mécanostimulation contrôlée et à distance de cellules de Schwann avec imagerie confocale en temps réel

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DOI :

10.3791/71685

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8 septembre 2026

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin University, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une plateforme d'activation magnétique à base de nano-aimants, compatible avec le microscope, intégrant des nanoparticules superparamagnétiques fluorescentes, un électroaimant étalonné et une imagerie confocale en temps réel, permettant de stimuler à distance et de manière contrôlée les cellules de Schwann et d'en surveiller dynamiquement les réponses mécanosensorielles.

Résumé

Les forces mécaniques régulent de façon critique le comportement cellulaire, mais de nombreuses méthodes existantes de stimulation mécanique reposent sur un contact physique direct ou sur des environnements extracellulaires artificiellement conçus, ce qui limite leur souplesse dans les études dynamiques sur cellules vivantes. Nous présentons ici une plateforme de nano-activation magnétique permettant une mécanostimulation à distance, sans contact et contrôlable des cellules de Schwann in vitro. Ce dispositif intégré permet une stimulation magnétique à distance et un imagerie en temps réel synchronisée sur cellules vivantes au cours d'une même session expérimentale. Ce manuscrit décrit la préparation de nanoparticules superparamagnétiques fluorescentes (SPIONs), éventuellement fonctionnalisées ciblant l'actine (f-SPIONs), la conception et l'étalonnage d'un dispositif électromagnétique compatible microscope, l'estimation des forces magnétiques au niveau individuel de la particule et de la cellule, ainsi que l'intégration de l'activation magnétique à une imagerie confocale en temps réel. Les cellules de Schwann sont des cellules gliales fortement mécanosensibles qui jouent des rôles essentiels dans le développement, le maintien et la réparation des nerfs périphériques. La surveillance en temps réel de leurs réponses à la stimulation mécanique est cruciale pour comprendre comment les forces mécaniques influencent l'organisation du cytosquelette et le comportement cellulaire. Cette plateforme fournit un protocole reproductible pour l'étude de la mécanobiologie des cellules de Schwann et pourrait être adaptée à d'autres types cellulaires mécanoréactifs ainsi qu'à des systèmes multicellulaires.

Introduction

Les stimuli mécaniques régulent un large éventail de processus cellulaires, notamment l'adhésion, la migration, la prolifération, la différenciation et la plasticité phénotypique¹^,²^,³. Des études en mécanobiologie ont montré que les neurones et les cellules gliales présentent une mécanosensibilité marquée et une réponse prononcée tout au long du développement⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Pour étudier la manière dont les cellules détectent et répondent aux forces mécaniques, plusieurs approches expérimentales ont été mises au point, notamment la microscopie à force atomique (AFM), l'aspiration par micropipette, les pinces optiques, les systèmes de culture basés sur l'étirement et les plateformes microfluidiques⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Ces techniques ont considérablement fait progresser l'étude de la mécanotransduction. Toutefois, beaucoup exigent un contact physique direct avec les cellules ou dépendent d'environnements mécaniques artificiels prédéfinis, ce qui les rend moins adaptées à une stimulation à distance, dynamiquement contrôlable et compatible avec l'imagerie.

La livraison de forces par nanoparticules magnétiques offre une stratégie alternative pour la mécanostimulation à distance¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Étant donné que la plupart des tissus biologiques présentent une faible susceptibilité magnétique, les champs magnétiques appliqués de l'extérieur peuvent pénétrer les échantillons biologiques sans contact direct et agir sélectivement sur des particules sensibles au champ magnétique introduites dans les cellules ou les tissus. En présence d'un gradient de champ magnétique, ces particules subissent des forces directionnelles qui peuvent être utilisées pour induire des perturbations mécaniques au niveau subcellulaire, cellulaire ou tissulaire⁸^,⁹. Cette approche est intéressante car elle est sans contact, ajustable, compatible avec l'imagerie en temps réel et potentiellement applicable à des systèmes biologiques plus complexes.

Les cellules de Schwann sont des cellules gliales très mécanosensibles¹⁹^,²⁰ qui jouent un rôle essentiel dans le développement, le maintien et la réparation des nerfs périphériques²¹^,²². L’observation dynamique des réponses des cellules de Schwann à une stimulation physique est importante pour comprendre comment les forces régulent l’organisation du cytosquelette et le comportement cellulaire. Toutefois, de nombreux systèmes classiques de transmission de force ne sont pas facilement compatibles avec la microscopie en temps réel à haute résolution. Pour pallier cette limitation, nous avons mis au point une plateforme de nano-activation magnétique combinant des superparticules magnétiques fluorescentes ciblant l’actine du cytosquelette (f-SPIONs), un dispositif électromagnétique sur mesure compatible avec la platine d’un microscope confocal, et un cadre quantitatif pour l’estimation des forces. Ce dispositif intégré permet une stimulation magnétique à distance et une imagerie en direct synchronisée au cours de la même session expérimentale.

Le protocole décrit ici comprend la préparation de superparticules magnétiques fluorescentes (SPIONs), une fonctionnalisation ciblant l'actine à base de phalloïdine facultative pour générer des f-SPIONs, la caractérisation des nanoparticules, la construction d'un dispositif électromagnétique et l'étalonnage du champ, l'estimation de la force magnétique, ainsi que la stimulation magnétique combinée à une imagerie confocale en temps réel. Bien qu'optimisé ici pour les cellules de Schwann, cette plateforme pourrait fournir un cadre pratique pour des études connexes sur d'autres systèmes vivants mécaniquement sensibles.

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Protocole

Les expériences décrites dans ce protocole ont utilisé une lignée cellulaire établie de cellules de Schwann de rat (RSC96) et n'ont pas impliqué de participants humains ni d'animaux vivants. Cette étude a été menée dans le cadre d'un projet de recherche plus vaste impliquant des expériences sur des animaux, approuvé par le Comité de bien-être et d'éthique animale du Premier hôpital de l'Université Jilin (n° d'approbation : 2022-0045).

1. Préparation de superparticules magnétiques fluorescentes

Synthétiser des nanoparticules de Fe₃O₄ revêtues d'acide oléique.
REMARQUE : Les nanoparticules de Fe₃O₄ revêtues d'acide oléique ont été synthétisées par décomposition thermique selon une méthode décrite précédemment²⁰^,²³.
1. Ajouter 2 mmol de Fe(acac)₃, 6 mmol d'acide oléique, 6 mmol d'oléylamine et 5 mmol de 1,2-hexadécandiol dans 20 mL d'éther de benzyle dans un ballon réactionnel.
2. Agiter le mélange sous atmosphère d'azote pendant 15 min jusqu'à obtention d'une solution précurseur homogène.
3. Chauffer le mélange à 200 °C à une vitesse de 20 °C/min.
4. Maintenir la réaction à 200 °C pendant 30 min.
5. Augmenter la température à 265 °C et faire refluxer le mélange pendant 30 min.
6. Laisser refroidir naturellement le mélange réactionnel à température ambiante.
7. Recueillir les nanoparticules de Fe₃O₄ par séparation magnétique.
8. Laver les nanoparticules trois fois avec de l'éthanol.
9. Rédisperser les nanoparticules purifiées dans du toluène.
Assembler les superparticules Fe₃O₄·Cy3.5.
REMARQUE : Les superparticules Fe₃O₄·Cy3.5 ont été préparées selon une méthode décrite précédemment²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. Disperser 28 mg de nanoparticules de Fe₃O₄ revêtues d'acide oléique dans 4 mL de toluène dans un ballon à fond rond tricol de 50 mL.
2. Préparer une phase aqueuse contenant 12,5 mg de dodécylsulfate de sodium et 3 mg de Cyanine 3,5 (Cy 3,5) dans 12,5 mL d'eau.
3. Mélanger la suspension de nanoparticules de Fe₃O₄ dans le toluène (28 mg dans 4 mL ; 7 mg/mL) avec la solution aqueuse de tensioactif/colorant pour former une microémulsion huile-dans-eau.
4. Mélanger soigneusement jusqu'à obtention d'une émulsion stable.
5. Chauffer le ballon à fond rond tricol à 60 °C et agiter en continu à 300 tr/min pendant 6 h.
  REMARQUE : Aucune procédure d'évaporation sous pression réduite ou à l'aide d'un évaporateur rotatif n'est nécessaire.
6. Évaporer le toluène dans les conditions décrites ci-dessus afin d'induire l'agrégation des nanoparticules de Fe₃O₄. À l'aide d'une pipette Pasteur jetable, transférer un petit aliquot de la solution dans un tube à essai et laisser reposer. L'absence de séparation de phase indique que le toluène a été complètement éliminé.
7. Transférer la suspension de superparticules Fe₃O₄·Cy3.5 dans des tubes à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 2 370 × g pendant 5 min à température ambiante pour récupérer les superparticules, puis éliminer soigneusement le surnageant sans perturber le culot.
8. Rédisperser le culot dans de l'eau désionisée ultrapure et centrifuger à nouveau à 2 370 × g pendant 5 min à température ambiante. Éliminer le surnageant et répéter le lavage trois fois pour éliminer le colorant Cy3.5 libre résiduel et le dodécylsulfate de sodium.
Revêtir les superparticules de polydopamine (PDA).
REMARQUE : Les superparticules revêtues de polydopamine ont été préparées selon une méthode décrite précédemment²⁰^,²⁶.
1. Centrifuger la suspension de superparticules Fe₃O₄·Cy3.5 à 2 370 × g pendant 5 min à température ambiante, puis éliminer le surnageant.
2. Rédisperser le culot dans un tampon Tris 10 mM (pH 8,5).
3. Ajouter 26 mg de monomère de dopamine à la suspension.
4. Agiter le mélange à température ambiante pendant 3 h en conditions alcalines.
5. Centrifuger la suspension à 2 370 × g pendant 5 min à température ambiante.
6. Éliminer le surnageant et rédisperger le culot dans de l'eau ultrapure pour obtenir les particules Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
Fonctionnaliser éventuellement les particules avec la phalloïdine-Alexa Fluor 350.
REMARQUE : Les superparticules ont été fonctionnalisées à la surface à l'aide de phalloïdine-Alexa Fluor 350 disponible commercialement²⁰.
1. Préparer 5 mL de solution aqueuse contenant 100 unités de phalloïdine-Alexa Fluor 350.
2. Ajouter 200 µL de suspension de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA contenant 2 mg de particules à la solution.
3. Agiter doucement le mélange à température ambiante pendant 24 h.
4. Centrifuger le mélange à 2 370 × g pendant 5 min à température ambiante.
5. Éliminer le surnageant et rédisperger le culot dans de l'eau désionisée.
6. Conserver la formulation finale de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloïdine (f-SPIONs) à l'abri de la lumière jusqu'à son utilisation.

2. Caractérisation des nanoparticules

Déterminer la morphologie et la taille.
1. Préparer des échantillons de nanoparticules pour la microscopie électronique en transmission (TEM) ou la microscopie électronique en transmission à haute résolution (HRTEM), conformément aux exigences de l'instrument.
2. Acquérir des images afin de déterminer la morphologie globale des particules, la structure cœur-enveloppe et le diamètre moyen (Figure 1).
3. Préparer des suspensions aqueuses de nanoparticules pour la diffusion dynamique de la lumière (DLS).
4. Mesurer le diamètre hydrodynamique et l'indice de polydispersité (PDI).
5. Comparer les résultats de la microscopie électronique et de la DLS afin d'évaluer l'uniformité de la formulation et le comportement colloïdal.
Déterminer les propriétés magnétiques.
1. Préparer des échantillons de nanoparticules séchés ou concentrés, adaptés à l'analyse par dispositif d'interférence quantique à supraconducteur (SQUID).
2. Enregistrer les courbes d'hystérésis magnétique à 300 K.
3. Déterminer l'aimantation à saturation, la rémanence et la coercitivité.
4. Confirmer que les particules présentent un comportement superparamagnétique, avec une rémanence et une coercitivité négligeables.
Déterminer les propriétés de fluorescence.
1. Préparer une suspension de f-SPION dans de l'eau déionisée ultrapure et transférer la suspension dans une cuve en quartz.
2. Enregistrer les spectres de photoluminescence à l'aide d'un spectrophotomètre de fluorescence.
3. Confirmer que le signal fluorescent reste détectable après lavage et resuspension.
Valider la localisation associée à l'actine lors de l'utilisation de la formulation ciblée.
1. Obtenir des cellules RSC96.
  REMARQUE : Les cellules RSC96 utilisées dans cette étude, une lignée de cellules de Schwann de rat transformée spontanément obtenue par culture prolongée de cellules de Schwann primaires de rat, ont été obtenues auprès de la banque de cellules de l'Académie des sciences de Chine, Shanghai, Chine (CSTR : 19375.09.3101RATGNR6) et se sont révélées négatives pour les contaminations par les mycoplasmes et les champignons. Des cellules aux passages 3–10 ont été utilisées.
2. Cultiver les cellules dans un milieu de type Dulbecco modifié (DMEM) complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de solution de pénicilline-streptomycine (100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine).
3. Ensemencer les cellules RSC96 à une densité de 1 × 10⁵ cellules par boîte de culture cellulaire de 35 mm destinée à la microscopie et les cultiver pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂, afin de permettre l'attachement cellulaire.
4. Aspirer le milieu de culture existant, laver les cellules deux fois avec du tampon phosphate-saline (PBS), puis ajouter un milieu de culture complet contenant 15 µg/mL de f-SPIONs. Incuber les cellules avec les f-SPIONs pendant 12 h.
5. Aspirer le milieu de culture et laver les cellules deux fois avec du PBS glacé contenant 1 mM de déféroxamine afin d'éliminer complètement les particules non internalisées.
6. Acquérir des images en microscopie confocale pour évaluer la distribution intracellulaire des particules. Régler les paramètres d'imagerie sur une ouverture de 1 unité Airy (AU) et un pas en z de 0,43 µm afin d'obtenir des sections optiques à haute résolution des structures intracellulaires.
7. Examiner si les particules montrent un enrichissement dans les régions cellulaires associées à l'actine.

3. Construction et étalonnage du dispositif de stimulation électromagnétique (Figure 2)

Assembler le dispositif électromagnétique.
1. Construire un système d'aimant électromagnétique compact dimensionné pour s'adapter à la platine du microscope confocal et à la chambre pour cellules vivantes (Figure 2A,B).
2. Connecter la bobine à une alimentation réglable ou à une source de courant externe.
3. Simuler numériquement l'environnement de champ magnétique gradient à l'aide de COMSOL Multiphysics 4.3b (Figure 2C,D).
4. Vérifier que l'électroaimant génère le champ magnétique gradient (CMG) correspondant pour différents courants d'entréeFigure 2G).
Mesurer la densité de flux magnétique et étalonner le champ magnétique gradient.
1. Placer l'électroaimant à côté de la boîte de culture, avec la pointe du pôle dirigée vers le centre de la boîte et située à 1 mm de la paroi externe de celle-ci (Figure 2E,F).
2. Maintenir cette configuration géométrique relative entre l'électroaimant et la boîte de culture pendant toutes les expériences ultérieures de stimulation magnétique en temps réel sur cellules vivantes et d'acquisition d'images.
3. Utilisez un gaussmètre numérique pour mesurer la densité de flux magnétique à des positions prédéfinies au sein de la zone de stimulation, en utilisant la grille de positionnement située au fond de la boîte de culture comme référence spatiale.
4. Calculer le gradient du champ local à partir de la variation spatiale de la densité de flux magnétique.
5. Étalonner et valider le gradient de champ magnétique simulé numériquement à l'aide des valeurs de gradient de champ magnétique mesurées expérimentalement et calculées.

4. Estimation des forces magnétiques délivrées par la plateforme.

Définir le modèle d'estimation de la force.
1. Utiliser l'équation de la force pour des nanoparticules magnétiques dans un champ magnétique non uniforme²⁷^,²⁸ :
2. Sous l'hypothèse d'un alignement superparamagnétique avec le champ appliqué, simplifier l'équation en
  $Schéma de l'équation de la force magnétique pour le calcul de la dynamique des SPION, montrant $ F_{f-SPION} = m \frac{dB}{dr} $.$
  où :
  F est la force nanomagnétique
  m est le moment dipolaire magnétique
  est le gradient du champ magnétique
  dB/dr est le gradient du champ magnétique (T/m) généré par le dispositif correspondant de génération de champ magnétique.
3. Utiliser le gradient de champ mesuré à partir du dispositif étalonné dans tous les calculs.
Estimer la force agissant sur une nanoparticule unique.
1. Déterminer les dimensions moyennes des particules à partir d'images de METHR.
2. Calculer le volume du noyau magnétique en supposant une géométrie sphérique.
3. Estimer le volume magnétique spécifique de Fe₃O₄ en fonction de la fraction magnétique du noyau.
4. Calculer le moment dipolaire magnétique selon
  où :
  M_m représente la magnétisation massique des f-SPION (16 A·m²/kg) sous l'intensité de champ donnée ;
  ρ est la densité du Fe₃O₄ (5,24 g/cm³).
  V est le volume du noyau magnétique de Fe₃O₄ dans chaque f-SPION (5,89 × 10⁻¹⁷ cm³).
5. Multiplier le moment dipolaire par le gradient de champ mesuré pour estimer la force agissant sur une nanoparticule unique ( $SPION en friction statique ; formule $F_{f-SPION}$ ; concept dans l'analyse des forces des nanoparticules magnétiques.$ ).
Estimer la prise en charge des nanoparticules par cellule de Schwann.
1. Ensemencer les cellules de Schwann RSC96 à raison de 5 × 10⁵ cellules par puits dans des boîtes de culture cellulaire microscopiques de 35 mm.
2. Incuber les cellules pendant 24 h dans des conditions de culture standard.
3. Remplacer le milieu par un milieu frais contenant 15 µg/mL de f-SPION.
4. Incuber les cellules pendant 12 h supplémentaires.
5. Laver les cellules deux fois avec du tampon phosphate salin glacé contenant 1 mM de déféroxamine.
6. Récupérer et compter les cellules.
7. Mesurer la teneur intracellulaire en fer par spectroscopie d'émission atomique à plasma couplé inductivement (ICP-AES).
8. Calculer le nombre de particules internalisées par cellule en divisant la masse moyenne de fer par cellule par la masse de fer par particule .
Estimer la force délivrée à une cellule de Schwann unique.
1. Calculer la force au niveau cellulaire selon
  
  où :
  $SPION en friction statique ; formule $F_{f-SPION}$ ; concept dans l'analyse des forces des nanoparticules magnétiques.$ est la force magnétique exercée sur un f-SPION unique.
  est le nombre de f-SPION internalisés par cellule.
  F_cell est la force magnétique exercée sur une cellule unique.
2. Indiquer la valeur obtenue comme force magnétique estimée délivrée à une cellule de Schwann unique (F_cell).
3. Préciser clairement que cette valeur constitue une estimation basée sur un modèle et non une mesure directe de la force intracellulaire.

5. Combinaison de la stimulation magnétique avec l'imagerie en temps réel par microscopie confocale à balayage laser (CLSM)

Charger les cellules de Schwann avec des nanoparticules magnétiques.
1. Ensemencer les cellules de Schwann dans des boîtes de culture ibidi compatibles avec l'imagerie ou dans des chambres de culture microfluidiques.
2. Laisser les cellules adhérer et se rétablir.
3. Remplacer le milieu existant par du milieu de culture frais contenant 15 µg/mL f-SPIONs
4. Incuber les cellules pendant 12 h pour permettre la charge en f-SPION.
5. Inspecter la morphologie cellulaire avant de poursuivre.
Éliminer les particules non internalisées.
1. Retirer le milieu contenant les nanoparticules.
2. Laver les cellules deux fois avec du PBS contenant 1 mM de déféroxamine.
3. Remplacer la solution de lavage par un milieu pour cellules vivantes compatible avec l'imagerie.
4. Vérifiez un faible fond de particules extracellulaires avant l'acquisition d'images.
Intégrez le dispositif électromagnétique au système d'imagerie CSLM.
1. Assembler l'électroaimant avec la chambre de culture pour cellules vivantes, en positionnant l'électroaimant à son emplacement préétalonné.
2. Placer la chambre de culture pour cellules vivantes assemblée sur la platine du microscope confocalFigure 3). Vérifiez que la boîte de culture se trouve dans la région de stimulation effective (Figure 3A).
3. Activer l'électroaimant selon les paramètres prédéfinis et confirmer l'exposition efficace au champ magnétique gradient dans la zone de la boîte de culture (Figure 3B).
4. Vérifiez que l'objectif peut atteindre le plan focal sans interférence.
5. Vérifiez que le dispositif n'entrave pas le positionnement de l'objectif ou le déplacement de la platine.
6. Compte tenu de la chaleur dégagée pendant le fonctionnement de l'électroaimant, régler les paramètres de température des composants de la chambre pour cellules vivantes conformément aux conditions de culture optimales prédéterminées afin de garantir un environnement interne de 37 °C et 5 % CO₂ (Figure 3C).
7. Confirmez que l'ensemble du système fonctionne normalement et de manière stable.
Ca fonctionnel²⁺ imagerie dans des cellules vivantes.
1. Incuber les cellules avec une solution de Krebs–Ringer (pH 7,4) contenant 3 µM Fluo-4 AM et 0,1 % de Pluronic F-127 à 37 °C pendant 30 min.
2. Après l'incubation, laver les cultures deux fois avec du PBS et les transférer vers la plateforme d'imagerie de cellules vivantes du système de microscopie confocale à balayage laser (CLSM) pour l'acquisition d'images (Figure 4A).
3. En utilisant la grille de positionnement située au fond de la boîte de culture ibidi, acquérir des images de cinq emplacements prédéfinis.
4. Divisez chaque champ d'imagerie en 25 régions égales et sélectionnez 0 à 3 cellules dans chaque région pour la quantification de la fluorescence, selon la densité cellulaire réelle au sein de cette région.
5. Définir le contour complet d'une cellule individuelle comme région d'intérêt (ROI) et surveiller la réponse calcique induite magnétiquement en analysant les variations de l'intensité de fluorescence (ΔF) au sein de la ROI.
6. Calculer la variation de l'intensité de fluorescence selon ΔF = (F_stimulation- F₀). Envisager la variation de l'intensité de fluorescence avant et après la stimulation (ΔF/F₀) dépassant 10 %, un événement de réponse au calcium.
  REMARQUE : F_{non stimulé} représente l'intensité de fluorescence avant la stimulation par force magnétique, F₀ représente l'intensité de fluorescence de base, et F_stimulation représente l'intensité de fluorescence induite après stimulation par force magnétique.
7. Pour la correction du fond, soustraire l'intensité moyenne de fluorescence du fond, mesurée dans une région sans cellules, de la valeur d'intensité de fluorescence de chaque région d'intérêt (ROI).
8. Effectuez trois expériences indépendantes, en incluant une boîte de culture par expérience.
Effectuer un enregistrement en imagerie en laps de temps et appliquer une stimulation magnétique pendant l'acquisition des images.
1. Configurer les paramètres d'acquisition en mode timelapse comme suit : un intervalle d'acquisition de 2,1 s par image, une durée totale d'acquisition de 650 s, et une imagerie optique en coupes optiques à résolution élevée standard utilisant 1 AU.
2. Pendant l'imagerie cellulaire, acquérir continuellement des images pendant 50 s sans injection de courant afin d'enregistrer l'intensité de fluorescence calcique intracellulaire en l'absence de stimulation par force magnétique (F_{non stimulé}) (Figure 2H et Figure 4B).
3. Normaliser l'intensité de fluorescence enregistrée pendant les 50 premières secondes et la définir comme l'intensité de fluorescence de base (F₀).
4. Ensuite, appliquer un courant constant de 3,0 A à l'électroaimant, exposant ainsi les cellules de Schwann chargées de nanoparticules magnétiques à un champ magnétique gradient de 3,25 T/m et les soumettant par conséquent à une stimulation par force magnétique. Poursuivre l'acquisition d'images en laps de temps pendant 10 min afin d'enregistrer l'intensité de fluorescence calcique intracellulaire durant la stimulation par force magnétique (F_stimulation) (Figure 2H et Figure 4C).
5. Calculer quantitativement la variation de l'intensité de fluorescence selon ΔF/F₀ (Figure 4D,E).
Effectuer l'analyse statistique et analyser le Ca²données de fluorescence
1. Pour chaque cellule, calculez la valeur médiane de ΔF/F₀ sur la série temporelle analysée et utilisez cette valeur comme indicateur du Ca²⁺ au niveau cellulaire.²métrique de réponse ⁺
2. Effectuer trois expériences indépendantes pour chaque condition expérimentale, avec une boîte de culture par condition dans chaque expérience. Regrouper les cellules analysées provenant des trois expériences indépendantes pour la présentation descriptive, et indiquer n comme le nombre total de cellules analysées dans chaque groupe.
3. Évaluer la normalité des données cellulaires de ΔF/F₀ à l'aide du test de Kolmogorov-Smirnov.
4. Parce que le Ca²Les données de réponse fluorescente étant distribuées de façon non normale, présenter les données sous forme de médiane et d'intervalle interquartile (IIQ).
5. Analyser les différences entre les groupes à l'aide du test de Friedman non paramétrique, suivi de tests de Wilcoxon pour les comparaisons par paires, comme décrit précédemment.
6. Considérer P < 0,05 pour indiquer la signification statistique.

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Résultats

La microscopie électronique en transmission à haute résolution (METHR) a montré que la formulation finale de nanoparticules possédait un noyau magnétique agrégé et une couche externe après la modification de surface (Figure 1). Les f-SPIONs finaux présentaient un diamètre total moyen de 63,36 ± 16,65 nm, avec un noyau magnétique riche en Fe₃O₄ d’environ 56,60 ± 6,19 nm et une couche externe composée de polydopamine et de phalloïdine-Alexa Fluor 350, d’une épaisseur moyenne d’environ 5,79 ± 1...

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Discussion

Les nanoparticules d'oxyde de fer sont largement reconnues comme des nanomatériaux magnétiques possédant une biocompatibilité favorable. En tant qu'agents de contraste largement utilisés en imagerie par résonance magnétique, les nanoparticules superparamagnétiques de Fe₃O₄ ont été largement appliquées dans le diagnostic clinique par imagerie²⁹^,³⁰. Dans une étude récente de notre équipe²⁰, les f-SPIONs se sont révélées présenter une cytotox...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 82571677 et 82001304 attribués à Y.W.), le Programme spécial pour les talents du secteur médical et de la santé de la province du Jilin (numéro de subvention JLSRCZX2025-134 attribué à Y.W.) et le projet du programme Bethune de l'Université du Jilin (numéro de subvention 2024B19 attribué à Y.W.). Les auteurs remercient le Collège de chimie de l'Université du Jilin (Laboratoire d'excellence national de structure supramoléculaire et de matériaux) ainsi que l'Institut de chimie appliquée de Changchun, Académie des sciences de Chine, pour leur aide dans la conception, la synthèse et la caractérisation des nanomatériaux. Les auteurs remercient également l'Institut de médecine translationnelle du Premier hôpital de l'Université du Jilin pour leur assistance en imagerie par microscopie à fluorescence confocale (CLSM).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,2-hexadécanediol	Sigma-Aldrich	213748	Qualité technique, 90 % ; utilisée en synthèse par décomposition thermique
35 mm ibidi µ-plaques	ibidi	80156	Utilisé pour la culture et l'imagerie des cellules de Schwann
Éther benzylique	Sigma-Aldrich	108014	98 % ; solvant pour Fe₃O₄ synthèse de nanoparticules
Microscope confocal à balayage laser	Nikon	AXR (Ti2-E)	Utilisé pour l'imagerie de cellules vivantes et l'imagerie par fluorescence
Électroaimant personnalisé	Personnalisé	N/A	Électroaimant unipolaire compact pour la génération in vitro d'un champ magnétique gradient
Acide cyanine3.5 carboxylique	Duofluor Inc.	D10128	Colorant fluorescent utilisé pour le Fe₃O₄·Assemblage de superparticules Cy3.5 ; MM 593,20 ; conserver à -20 °C, protégé de la lumière
Sel de mésylate de déféroxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Agent chélateur du fer utilisé pour éliminer le fer non internalisé et associé à la membrane
Gaussmètre numérique	CHAMP MAGNÉTIQUE	WT103	Utilisé pour mesurer la densité de flux magnétique et étalonner le champ magnétique gradient généré par l'électroaimant sur mesure
Chlorhydrate de dopamine	Sigma-Aldrich	H8502	≥98 % (CCM) ; utilisé pour le revêtement de polydopamine
Instrument de diffusion dynamique de la lumière	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Utilisé pour la mesure du diamètre hydrodynamique et de l'indice de polydispersité (PDI)
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Indicateur de calcium utilisé pour le calcium intracellulaire vivant²⁺ imagerie
Spectrophotomètre de fluorescence	Shimadzu	RF-6000	Utilisé pour la caractérisation par photoluminescence
Microscope électronique en transmission à haute résolution	JEOL	JEM-F200	Utilisé pour l'imagerie en microscopie électronique en transmission à haute résolution de la morphologie des nanoparticules et du noyau–structure de la coquille
Spectromètre d'émission atomique à plasma induit	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Utilisé pour la quantification du fer intracellulaire
Acétylacétonate de fer(III), Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	97 % ; précurseur de Fe₃O₄ synthèse de nanoparticules
Incubateur à plateau pour cellules vivantes	TOKAI HIT	TENP&CO₂	Utilisé pour l'imagerie confocale de cellules vivantes pendant la stimulation magnétique
Acide oléique	Sigma-Aldrich	O1008	≥99 % (CG) ; ligand de surface pour le Fe₃O₄ synthèse de nanoparticules
Oléylamine	Sigma-Aldrich	O7805	Qualité technique, 70 % ; ligand pour la synthèse de nanoparticules
Phalloïdine–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Réactif de fonctionnalisation ciblant l'actine (facultatif)
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Utilisé pour faciliter le chargement de Fluo-4 AM pour la détection du Ca²⁺ dans des cellules vivantes²⁺ imagerie
Alimentation électrique continue réglable et programmable	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	Utilisé pour alimenter l'électroaimant personnalisé destiné à la génération d'un champ magnétique gradient in vitro
Cellules de Schwann RSC96	Banque de cellules de l'Académie des sciences de Chine	N/A	Ligne cellulaire de cellules de Schwann dérivée du rat
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	réactif ACS, ≥99,0 % ; tensioactif pour microémulsion huile dans eau
magnétomètre SQUID	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	Utilisé pour la mesure de l'hystérésis magnétique à 300 K
Toluène	Sigma-Aldrich	244511	Anhydre, 99,8 % ; solvant pour l'assemblage de superparticules
Microscope électronique en transmission	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Utilisé pour l'observation de l'ultrastructure des tissus cellulaires et nerveux

Références

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