Imagerie par spectrométrie de masse à cellule unique utilisant l’ionisation par électrospray par désorption couplée aux spectromètres de masse Orbitrap

Résumé

Ce protocole décrit l’imagerie par spectrométrie de masse monocellulaire des cellules OVCAR-8 utilisant une ionisation par électropulvérisation par désorption couplée à des spectromètres de masse Orbitrap pour une analyse métabolomique à haute résolution spatiale.

Résumé

L’imagerie par ionisation par électropulvérisation par désorption (DESI–MSI) permet l’imagerie moléculaire ambiante, sans matrice, avec une préparation minimale de l’échantillon. Ce protocole décrit un flux de travail pour la MSI monocellule des cellules OVCAR-8 utilisant le DESI couplé aux spectromètres de masse Orbitrap. Le système intègre un pulvérisateur DESI, une interface de spectromètre de masse modifiée, un étage XYZ motorisé et une carte d’apprentissage optique pour l’imagerie à haute résolution spatiale. Les cellules sont cultivées sur des membranes de verre grillées, lavées avec une solution de formate d’ammonium pour réduire les interférences de sel, séchées et analysées dans des conditions ambiantes. Le solvant est administré en continu à l’aide d’un système de nanochromatographie liquide, et la nébulisation du gaz azoté est régulée pour maintenir la stabilité de la pulvérisation. Le protocole décrit également l’imagerie raster, le contrôle des pixels et l’enregistrement d’images optique-spectrométrie de masse pour la localisation en cellule unique. La haute résolution de masse et la précision de masse fournies par la détection Orbitrap permettent de différencier des espèces moléculaires étroitement apparentées et soutiennent l’analyse métabolomique unicellulaire. Ce protocole offre une stratégie adaptable pour la mise en œuvre de MSI monocellule à haute résolution spatiale utilisant plusieurs plateformes de spectromètres de masse Orbitrap.

Introduction

La métabolomique cherche à caractériser de manière exhaustive les métabolites de petites molécules qui reflètent l’état fonctionnel des systèmes^biologiques 1,2,3,4,5. Parce que les métabolites sont des produits directs de l’activité enzymatique, ils fournissent une lecture dynamique du phénotype cellulaire et de la régulation biochimique. Cependant, les flux de travail métabolomiques conventionnels reposent généralement sur des méthodes d’extraction en masse qui moyennent les signaux entre des milliers et des millions de cellules, obscurcissant ainsi l’hétérogénéité^{cellulaire 6,7,8}.

La métabolomique unicellulaire répond à cette limitation en permettant le profilage moléculaire au niveau des cellules individuelles, révélant la diversité métabolique au sein de populations complexes et améliorant la compréhension mécaniste de la progression de la maladie, de la réponse aux médicaments et de la différenciation cellulaire. La spectrométrie de masse (SEP) est un outil indispensable pour l’analyse moléculaire d’échantillons biologiques. Les avancées récentes dans les techniques de la SEP, incluant la préparation des échantillons, l’instrumentation et l’analyse des données, permettent de réaliser des études métabolomiques sur la EM au niveau^{unicellulaire} 9,10,11,12.

L’imagerie MS (MSI), qui permet l’analyse moléculaire spatialement résolue d’échantillons biologiques, intègre un mouvement précis de l’échantillon, un échantillonnage minimisé, une ionisation efficace et la visualisation des données en acquérant un spectre massif complet à chaque coordonnée spatiale définie sur une surface^{d’échantillon 12, 13, 14}. Les images MS sont reconstituées en traçant l’intensité des valeurs sélectionnées du rapport masse/charge (m/z) sur les coordonnées x–y, préservant ainsi l’information spatiale chimique au sein des systèmes biologiques^complexes 12,13,15,16,17,18. Atteindre une métabolomique unicellulaire spatialement résolue nécessite des plateformes analytiques capables de préserver la localisation moléculaire tout en maintenant une sensibilité et une résolution de masse suffisantes pour détecter les espèces à faible^abondance 9,12,19,20.

L’MSI monocellulaire présente des défis supplémentaires car les cellules individuelles mesurent généralement entre 5 et 20 μm de^{diamètre 8,21}. À cette échelle spatiale, l’abondance des analytes par événement d’échantillonnage est extrêmement limitée. Par conséquent, plusieurs facteurs, dont un contrôle précis du mouvement de l’échantillon, un échantillonnage minimisé, une grande efficacité d’ionisation et une transmission d’ions efficace, sont tout aussi essentiels pour obtenir des informations moléculaires interprétables à partir de cellules^{individuelles 14,22}. La désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)–MSI, une technique basée sur le vide couramment utilisée pour les études MSI à haute résolution spatiale, nécessite un dépôt matriciel et un fonctionnement sous vide ; cependant, la cristallisation matricielle dans MALDI peut introduire la délocalisation et la variabilité des analytes à l’échelle^{de cellule unique} 23,24,25,26,27. En revanche, les approches MSI ambiantes fonctionnent dans des conditions ambiantes, et les échantillons maintiennent des états chimiques proches de la nativité car peu ou pas de préparation de l’échantillon est requise. Parmi les méthodes de MSI ambiante, DESI²⁸, nano-DESI²¹, nano-DESI²⁹ assisté pneumatiquement et Single-probe 8,30,31,32,33,34,35, ont déjà été utilisés pour des études MSI unicellulaires. Bien que les techniques basées sur l’extraction micro-liquide, incluant le nano-DESI, le nano-DESI assisté pneumatiquement et la sonde unique, offrent une grande efficacité d’échantillonnage et d’ionisation, elles reposent sur le maintien d’un pont liquide stable à la pointe de la sonde, tandis que la perturbation du pont liquide, telle que des changements de morphologie de surface ou un bouchon de la sonde, peut affecter la qualité des expériences^{MSI 5,8, 21, 30, 35}.

DESI est une technique d’ionisation ambiante dans laquelle des gouttelettes de solvant chargé impactent une surface, extraient des analytes et génèrent des gouttelettes secondaires contenant l’espèce^{ionisée 36}. DESI offre un échantillonnage sans contact et sans obstruction, compatible avec les flux de travail d’imagerie raster, ce qui le rend parfaitement adapté à la cartographie moléculaire multi-ions haute résolution de cellules uniques identifiées optiquement lorsqu’elles sont couplées à des plateformes Orbitrap à haute résolution 20,37,38,39,40. Le DESI est largement utilisé pour l’imagerie tissulaire mais a rarement été appliqué aux MSI unicellulaires, principalement en raison de défis techniques^20,28. Des études récentes réalisées avec un dispositif commercial composé d’un Waters DESI XS couplé à un spectromètre de masse IMS cyclique SELECT SERIES ont démontré que la résolution d’une seule cellule peut être atteinte pour plusieurs lignées cellulaires. Atteindre une haute résolution spatiale en DESI–MSI nécessite un contrôle coordonné de l’efficacité d’ionisation, de la transmission ionique, du taux d’acquisition et de l’alignement des pulvérisateurs^{12, 20, 28}. En particulier, les avancées dans la conception de nouvelles générations de pulvérisateurs DESI, notamment DESI XS et l’ionisation par focalisation électro-flux par désorption (DEFFI), ont considérablement réduit la zone d’échantillonnage^41,42. De plus, réduire les débits de solvant, tels que les débits de nanolitres par minute délivrés par les pompes de nanochromatographie liquide (LC), peut considérablement améliorer le confinement spatial pour obtenir une délimitation moléculaire^{unicellulaire 28}. Bien que cette approche ait atteint la résolution MSI à une seule cellule, elle repose sur l’instrumentation d’un fournisseur spécifique (Waters). Une mise en œuvre plus large du DESI–MSI à cellule unique nécessite donc des stratégies pouvant être intégrées à des spectromètres de masse haute résolution largement disponibles, tels que les systèmes Orbitrap, afin d’offrir une grande sensibilité, une précision de masse et une puissance de résolution élevée. La combinaison de DESI avec les spectromètres de masse Orbitrap offre de nouvelles opportunités dans les études MSI unicellulaires, y compris la différenciation d’espèces rapprochées et isobare dans des extraits cellulaires^complexes 20,43,44.

Ce protocole décrit une stratégie modulaire pour intégrer un pulvérisateur Waters DESI XS avec des spectromètres de masse Orbitrap pour des études MSI monocellulaires. Le workflow intègre des couvertures grillées pour l’attache des cellules et la corrélation optique, un étage XYZ motorisé pour le balayage raster contrôlé, une délivrance de solvant à l’échelle nanométrique pour une formation stable de pulvérisation, et une détection Orbitrap haute résolution. Bien qu’un spectromètre de masse Thermo Orbitrap Tribrid Lumos ait été choisi comme plateforme, de nombreux autres modèles de spectromètre de masse Orbitrap équipés de géométries source-interface compatibles pourraient potentiellement être couplés à des configurations DESI XS personnalisées similaires après une adaptation mécanique appropriée et une optimisation.

Protocole

Les cellules OVCAR-8 ont été obtenues à partir de la collection américaine de culture de type (ATCC). Toutes les procédures de culture cellulaire ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Les cellules étaient régulièrement testées pour la contamination par mycoplasma à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes conformément aux instructions du fabricant.

REMARQUE : Effectuer toutes les procédures conformément aux directives institutionnelles de biosécurité. Portez un équipement de protection individuelle approprié. Manipulez les solvants organiques dans une hotte chimique.

1. Cultiver et préparer les cellules OVCAR-8 sur des caches grillées

1. Préparez un milieu complet en complétant le milieu RPMI-1640 avec 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline–streptomycine. Réchauffez le milieu à 37°C.
2. Maintenir les cellules OVCAR-8 dans des plats de culture cellulaire de 10 cm contenant 10 mL de milieu complet. Incubez les cellules à 37°C dans un incubateur humidifié avec 5 % de_CO2.
3. Faire passer les cellules lorsque environ 80 % de la surface de culture est visuellement occupée par des cellules adhérentes, généralement tous les 2 jours dans les conditions de culture décrites.
   1. Aspirez le milieu de la cuvette de culture de 10 cm et rincez les cellules une fois avec 5 mL de solution saline tamponnée phosphate à 1×.
   2. Ajoutez 2 mL d’acide trypsine à 0,25 % d’acide ethylénedidiaminetétraacétique dans la boîte de culture. Incubez les cellules à 37°C pendant environ 3 minutes, ou jusqu’à ce que la majorité des cellules se détache visiblement de la surface de culture lors de l’examen au microscope.
   3. Ajoutez 8 mL de médium complet pré-chauffé au plat pour neutraliser la trypsine. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, faites doucement pieffer la suspension cellulaire vers le haut et vers le bas environ 15 à 20 fois pour disperser les cellules.
   4. Transférez 1 mL de la suspension dans 9 mL de milieu complet frais.
   5. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatique. Chargez 10 μL de suspension à cellules resuspendues directement dans la culasse de comptage sans dilution supplémentaire et effectuez le comptage selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Les colorants de viabilité cellulaire tels que le bleu de trypan n’ont pas été utilisés dans ce protocole. Évaluez visuellement l’état cellulaire en surveillant la morphologie et l’attache cellulaire avant la trypsinisation.
4. Ensemence les cellules sur les couvertures de couverture.
   1. Diluez les cellules à une concentration finale de ~1 × 10⁶ cellules/mL à l’aide d’un milieu complet. Calculez le volume requis de suspension cellulaire en utilisant C₁V₁ = C₂V₂, où C₁ est la concentration de cellule comptabilisée, V₁ le volume de suspension de cellules requis, C₂ la concentration cible, et V₂ le volume final désiré.
   2. Placez des bâtons de revêtement en verre grillé de 28 mm individuels avec un espacement de 50 μm dans des puits d’une plaque à 6 puits.
      REMARQUE : Autoclave les vernis en verre avant utilisation pour la culture cellulaire. Placez le côté grille orienté vers le bas pour minimiser les interférences avec la croissance cellulaire.
   3. Ajoutez 2 mL de milieu complet et 200 μL de suspension de cellules (~2 × 10^{cellules de 5} cellules/puits) à chaque puits. Balancez doucement la plaque à 6 puits en motif « X » pour répartir uniformément les cellules sur la surface du couvercle.
   4. Incubez les cellules pendant environ 15 à 20 heures pour permettre l’attachement cellulaire.
      REMARQUE : Surveillez régulièrement la morphologie cellulaire au microscope pour assurer une croissance cellulaire normale. Examinez une contamination potentielle par mycoplasmes à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes si les cellules se développent mal.

2. Lavage cellulaire avec une solution de formate d’ammonium (AF)

REMARQUE : Préparez une solution AF fraîche avant chaque utilisation.

1. Préparez un tampon de lavage isotonique AF immédiatement avant utilisation. Pèser 0,45 g de FA et dissoudre dans 50 mL d’eau de qualité LC/MS pour préparer une concentration finale de FA de 0,14 M (0,9 % v/w). Ne modifie pas le pH ^5,45.
   REMARQUE : Utilisez la solution AF fraîchement préparée le jour même de la préparation. Conservez la solution bien froide (0°C–4°C) jusqu’à utilisation.
2. Aspirez le milieu de culture de chaque puits de la plaque à 6 puits. Ajoutez immédiatement 2 mL de solution de refroidissement à froid dans chaque puits.
3. À l’aide de pinces stériles, soulevez doucement chaque couche de couverture contenant les cellules adhérentes du puits tout en maintenant la surface recouverte de cellules orientée vers le haut. Placez brièvement la gaine de couverture pendant 2 à 3 secondes dans un puits séparé pré-rempli de 2 mL de solution froide 0,9 % AF.
4. Répétez le processus de rinçage pour un total de deux rinçages avec une solution AF fraîche à chaque rinçage. Après le rinçage final, retirez la gaine de couverture de la solution AF et laissez-la sécher à température ambiante dans une hotte chimique pendant environ 20 à 30 minutes avant l’analyse DESI–MSI.
   REMARQUE : Rincez doucement les cellules pour éviter de les déranger pendant l’étape de lavage.

3. Fabrication d’une interface MS modifiée basée sur FAIMS

1. Démontez l’adaptateur de la source ionique FAIMS Pro pour accéder à la région interne de l’électrode. Confirmez que l’adaptateur est compatible avec les spectromètres de masse Thermo Orbitrap équipés de la configuration FAIMS Pro.
2. Retirez les composants de l’électrode FAIMS, y compris les fils internes, les ensembles d’électrodes, les joints toriques et les structures internes de soutien. Conserver la coque externe du boîtier, les brides de montage et la broche de détection d’interface nécessaire à la reconnaissance du spectromètre de masse de l’adaptateur.
3. Modifier l’ouverture circulaire en utilisant les procédures standard d’usinage de l’atelier mécanique. Agrandir l’ouverture jusqu’à ce qu’elle offre suffisamment de dégagement autour de l’ensemble d’entrée Orbitrap/cheminée ionique en proéminence.
4. Lisser et ébavurer le bord usiné après coupe. Confirmez que l’ouverture modifiée permet un positionnement libre de l’adaptateur de boîtier sur le spectromètre de masse.
5. Modifiez la longueur des deux branches de l’adaptateur de boîtier à l’aide d’une scie. Coupez les jambes à une longueur finale d’environ 2 1/4 pouces pour permettre la connexion avec la carte d’essai optique.
   REMARQUE : Utilisez des outils d’usinage appropriés et évitez d’endommager l’intégrité structurelle du logement restant.
6. Préparez une table optique en aluminium (10 in × 12 in × trous filonnés de 0,5 in, 1/4"-20). Placez la planche d’essai horizontalement sous l’adaptateur FAIMS modifié.
7. Utilisez deux supports de montage pour connecter l’adaptateur FAIMS modifié à la carte d’essai optique. Ajustez les supports au besoin pour réduire le poids et permettre un bon positionnement de la planche par rapport à l’entrée Orbitrap.
8. Fixez l’interface FAIMS modifiée sur la breadboard optique à l’aide d’un matériel de montage mécaniquement compatible, aligné avec le motif de trous filonnés 1/4"-20 de la breadboard. Assurez-vous d’assurer une position stable lors des expériences d’imagerie.
   REMARQUE : Assurez-vous que l’interface est rigidement fixée afin de minimiser les vibrations lors des mouvements de l’étage et de l’acquisition des données.
9. Usinez ou découpez une rainure peu profonde dans la breadboard optique directement sous la zone de contact du FAIMS qui abrite. Taille et positionnement de la rainure pour offrir un espace suffisant pour un siège, un alignement stable du boîtier modifié du FAIMS par rapport à l’entrée d’air Orbitrap.
   REMARQUE : Dimensionez la rainure pour accueillir la base de l’adaptateur de boîtier FAIMS et améliorer la reproductibilité positionnelle.
10. Alignez l’interface montée avec l’entrée du spectromètre de masse. Vérifiez que les brides de montage maintenues s’insèrent correctement sur l’instrument et que la breadboard optique reste à plat sous l’interface.
11. Vérifiez que l’ouverture circulaire modifiée offre un dégagement libre autour de l’ensemble de l’entrée Orbitrap/entonnoir ionique avant d’installer le pulvérisateur DESI.

4. Assembler le pulvérisateur DESI et l’interface Orbitrap

1. Montez le pulvérisateur DESI sur le système intégré comprenant le cadre FAIMS personnalisé, l’étage XYZ motorisé, le régulateur de gaz et la carte optique. Utilisez une scène motorisée contrôlée par un contrôleur CONEX-MFACC.
2. Définissez l’axe des x comme la direction de balayage matricielle de gauche à droite et définissez l’axe des y comme la direction du pas de ligne de haut en bas. Fixez la position de l’axe z avant l’acquisition et gardez-la fixe pendant l’imagerie.
3. Utilisez une plage de déplacement d’étage d’environ 1 mm dans la direction x et 1 mm dans la direction y. N’appliquez pas le mouvement de l’axe z lors de l’acquisition.
4. Placez le pulvérisateur DESI à un angle d’environ 70° par rapport à la surface de l’échantillon. Placez l’échantillon directement sous le pulvérisateur et placez la pointe du pulvérisateur aussi près que possible de l’entrée Orbitrap sans contact physique.
5. Connectez le métal de mise à la terre DESI à une source terrestre sous le spectromètre de masse. Contrôlez le déplacement du raster à l’aide du logiciel de contrôle de la scène (Figure 1).
   REMARQUE : Le pulvérisateur DESI utilisé dans cette étude est disponible uniquement pour les utilisateurs possédant des instruments DESI–MSI.
6. Utilisez un contrôleur de scène motorisé XYZ pour le déplacement et le positionnement de la scène. Connectez la ligne de tension, la conduite gazeuse azoteuse, la ligne de solvant et la ligne de mise à la terre avant l’utilisation.
7. Installer un tube de transfert d’ions en acier inoxydable fabriqué sur mesure (1/16 de diamètre extérieur × 0,033 de diamètre intérieur) conçu pour correspondre à l’entrée de source ionique Orbitrap. Positionnez le tube de transfert d’ions de façon à ce qu’il s’aligne directement avec l’entrée Orbitrap tout en s’étendant suffisamment vers l’extérieur pour permettre un accès libre au panache DESI.
   REMARQUE : Personnalisez le tube de transfert d’ions selon la configuration du spectromètre de masse. Fabriquez le tube de transfert d’ions selon des procédures d’usinage appropriées.
8. Utilisez un tube de transfert d’ions avec une géométrie courbée pour améliorer le positionnement du pulvérisateur DESI par rapport à la surface de l’échantillon et à l’entrée Orbitrap.
9. Alignez le pulvérisateur à un angle d’environ 70° par rapport à la surface de l’échantillon afin que le panache de pulvérisation DESI intersecte la région d’entrée Orbitrap sans toucher la surface de l’échantillon.
10. Définissez un panache de pulvérisation stable par la présence de spectres de masse stables et des valeurs de niveau normalisé (NL) cohérentes lors de l’acquisition. Ajustez la position du pulvérisateur jusqu’à ce qu’un signal ionique stable soit observé.
11. Réglez la distance entre le pulvérisateur et la surface à environ 1,0 à 1,5 mm comme condition de départ. Ajustez manuellement la position du pulvérisateur tout en surveillant les valeurs NL pour obtenir le signal ionique le plus stable possible.

Figure 1. Système intégré d’ionisation par électropulvérisation par désorption (DESI) – imagerie par spectrométrie de masse (MSI) couplé à un spectromètre de masse Orbitrap. Le pulvérisateur DESI est monté sur une plateforme intégrée composée d’un adaptateur modifié pour spectrométrie de mobilité ionique asymétrique à haut champ (FAIMS ), d’un étage XYZ motorisé, d’un régulateur de gaz et d’une carte d’essai optique. Le solvant est administré à l’aide d’un système de chromatographie nano-liquide, et l’azote gazeux est fourni à environ 12 psi pour la stabilisation par pulvérisation. La figure montre également la connexion de la tension d’ionisation, la ligne de solvant et la position du pulvérisateur par rapport à l’entrée Orbitrap. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

5. Configurer les conditions d’administration du solvant et de pulvérisation

1. Préparez un solvant en pulvérisation frais composé de méthanol/eau/acide formique (98:2:0.1, v/v/v) avant l’analyse DESI–MSI.
   REMARQUE : D’autres systèmes de solvants compatibles DESI, y compris les solvants à base d’acétonitrile et différents rapports méthanol/eau, peuvent être utilisés après optimisation. Le méthanol/eau/acide formique (98:2:0.1, v/v/v) a été utilisé comme condition de départ standard dans ce protocole car il a permis une formation stable de panaches, une réduction de la dispersion du solvant et des signaux lipidiques en mode ion positif reproductibles lors des expériences DESI–MSI à cellule unique.
   ATTENTION : Le méthanol est inflammable et toxique. L’acide formique est corrosif. Manipulez les solvants dans une hotte chimique.
2. Administrez le solvant à l’aide d’un système Ultimate 3000 nano-LC fonctionnant comme une pompe isocratique à solvant à 750 nL/min pour les expériences rapportées. Connectez la prise nano-LC au pulvérisateur DESI à l’aide de tubes PEEK (1/16 de diamètre extérieur × 0,005 de diamètre intérieur).
3. Installer une colonne C18 (par exemple, nanoEase M/Z peptide BEH ; 130 Å, 1,7 μm, 300 μm × 150 mm) en ligne pour fournir une contre-pression suffisante pour une formation stable de pulvérisation à faibles débits.
4. Réglez la méthode du spectromètre de masse en mode ion positif avec détection Orbitrap, une tension de pulvérisation de 0,85 kV, une résolution Orbitrap de 120 000 à m/z 200, et une plage m/z de 150–1200.
5. Réglez la cible normalisée AGC à 100 %, le temps d’injection maximal à 100 ms, l’objectif RF à 45 % et les microscans à 1. Désactivez l’isolation des quadrupôles et la fragmentation de la source.
6. Fournir du gaz d’azote à partir d’un générateur d’azote ou d’une source d’azote liquide à environ 12 psi pour stabiliser le panache de pulvérisation DESI. Utilisez 12 psi comme pression de fonctionnement de départ et effectuez de petits ajustements manuels uniquement si nécessaire pour améliorer les valeurs NL et maintenir un spectre de masse stable.

6. Effectuer l’imagerie raster et le contrôle des pixels

1. Identifier une région d’intérêt contenant des cellules uniques optiquement visibles en utilisant les couvertures grillées comme référence. Sélectionnez des cellules isolées avec une séparation visuelle claire des cellules voisines, une morphologie adhésive intacte, et aucun chevauchement évident avec des débris ou des groupes cellulaires.
2. Définir la région raster à l’aide du logiciel Fance Stage^{Controller 46}. Réglez la taille du pas raster à 0,01 mm, la vitesse de l’étage à 0,01 mm/s, et le temps de permanence à 20 s.
3. Utilisez un balayage raster de gauche à droite sur chaque ligne, suivi d’un déplacement vers la ligne suivante dans la direction y. Réglez la taille orthogonale des pas entre les droites matricielles à 10 μm.
4. Ajustez la vitesse de l’étage selon la vitesse d’acquisition Orbitrap pour obtenir la dimension de pixels souhaitée dans la direction de balayage (par exemple, environ 2,5–6,5 μm). Calculez la dimension du pixel de la direction de balayage en utilisant la relation suivante : dimension du pixel de la direction du balayage = vitesse de l’étape × temps d’acquisition par balayage.
5. En utilisant une vitesse d’étage de 0,01 mm/s (10 μm/s), obtenir 376 balayages sur 102 s pour produire un temps d’acquisition de 0,271 s par balayage et une dimension de pixel correspondante d’environ 2,7 μm. Synchronisez le mouvement de l’étage et l’acquisition du spectre de masse en réglant le timing d’acquisition Orbitrap légèrement plus court que les paramètres combinés de déplacement de l’étage et de temps de séjour.
   REMARQUE : La dimension orthogonale du pixel est déterminée par la taille programmée du pas et les limitations physiques et mécaniques de l’étage, tandis que la dimension de la direction de balayage est régie par la vitesse de l’étage et le taux d’acquisition spectrale.
6. Acquérir des données d’imagerie sur la plage de masse sélectionnée jusqu’à l’achèvement de la région matricielle prédéfinie. Pour une région d’imagerie de 1 mm × 1 mm acquise en utilisant un pas de ligne de 0,01 mm et une vitesse d’étage de 0,01 mm/s, le temps total d’acquisition est d’environ 4 à 5 heures.
7. Générez des fichiers de données RAW lors de l’acquisition et de l’arrêt après l’achèvement des coordonnées raster x–y spécifiées et de la durée correspondante de la méthode d’instrument. Dans les conditions de mode ion positif décrites ici, chaque ligne matricielle génère généralement un fichier RAW d’environ 50 Mo, ce qui donne environ 5 Go de données totales pour 101 lignes matricielles.

7. Enregistrement d’image optique vers MS

1. Capturez des images en champ clair des cellules dans la région de grille sélectionnée après lavage et séchage AF et avant l’acquisition du DESI à l’aide d’un microscope en champ lumineux équipé d’un objectif de 10×.
2. Convertir des fichiers RAW en fichiers mzML en utilisant msConvert depuis ProteoWizard⁴⁸. Convertir les fichiers mzML au format imzML à l’aide du convertisseur^{imzML 49}.
3. Utilisez des réglages de conversion de centroïde/profil cohérents avec le format de données acquis. Téléchargez les fichiers imzML directement sur METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ pour la visualisation d’images.
4. N’appliquez pas de normalisation, de suppression de points chauds ou de corrections supplémentaires de traitement d’image avant la visualisation. Alignez manuellement les images optiques et MS en utilisant les repères de la grille comme références de position.
5. Mettez l’image optique à l’échelle en utilisant les dimensions connues et l’espacement de la grille. Superposez manuellement l’image MS pour évaluer la correspondance entre les positions optiques des cellules et les signaux ioniques localisés.
6. Confirmer la localisation d’une seule cellule par accord visuel entre les cellules isolées dans l’image du champ clair et les distributions d’ions MS correspondantes.

Résultats

L’exécution réussie de ce protocole produit des ensembles de données DESI–MSI dans lesquels des cellules individuelles identifiées optiquement correspondent spatialement à des signaux ioniques moléculaires localisés (Figure 2). Les images de microscopie en champ clair acquises avant l’analyse DESI–MSI permettent l’identification visuelle de cellules OVCAR-8 individuelles et facilitent l’enregistrement de l’image optique vers MS en utilisant la couverture grillée comme référence positionnelle. Des images d’ions DESI–MSI représentatives démontrent des distributions d’ions localisées qui corrélément spatialement avec des cellules individuelles identifiées dans l’image de champ clair correspondante (Figure 2A–2D).

Figure 2. Comparaison de la microscopie en champ clair et de la MSI des cellules OVCAR-8. (A) Image microscopique en champ clair des cellules OVCAR-8 acquises à un grossissement de 10×. (B–D) Images MS acquises avec DESI–MSI avec une taille de pixel de 5,5 μm × 10 μm. Les distributions d’ions représentatives sont présentées pour (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562, et (D) m/z 788.616. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les cellules individuelles génèrent des spectres de masse complets contenant plusieurs ions liés aux lipides et de petites molécules. Plutôt que de s’appuyer sur un seul marqueur moléculaire, chaque cellule présente un profil moléculaire multi-ions qui agit comme une empreinte chimique. Des images ioniques représentatives à m/z 317.111, m/z 808.562 et m/z 788.616 montrent des distributions moléculaires hétérogènes entre les cellules voisines, indiquant une hétérogénéité métabolique mesurable au niveau de la cellule unique (Figure 2B–2D). Les annotations basées sur le métaspace suggéraient que les ions détectés à m/z 808.562 et m/z 788.616 étaient principalement associés aux espèces lipidiques phosphatidylcholine et phosphatidyletanolamine, tandis que m/z 317.111 correspondait à plusieurs petites molécules candidates et espèces apparentées aux dipeptides. Ces résultats démontrent que la plateforme permet la détection de caractéristiques moléculaires spatialement localisées à partir de cellules uniques identifiées optiquement dans des conditions ambiantes. Des résultats supplémentaires, incluant des espèces provisoirement annotées, des espèces identifiées comme SEP/MS, des images représentatives de la SEP et des spectres de masse, sont fournis dans des études^{précédentes 20}.

La plateforme intégrée DESI–MSI se compose d’un pulvérisateur DESI, d’un adaptateur FAIMS modifié, d’un étage XYZ motorisé et d’une table d’essai optique montée à côté de l’entrée Orbitrap (Figure 1). Cette installation permet une livraison stable du solvant, un mouvement contrôlé de l’étage et l’alignement du panache de pulvérisation DESI avec l’entrée du spectromètre de masse pour des expériences d’imagerie monocellulaire ambiante. Le tube de transfert d’ions personnalisé illustré à la Figure 3 permet la transmission d’ions entre la région source DESI et l’entrée Orbitrap. La géométrie capillaire courbée facilite le positionnement du pulvérisateur DESI par rapport à la surface de l’échantillon et à la région d’entrée tout en maintenant un transfert d’ions non obstrué.

Figure 3. Tube de transfert d’ions personnalisé pour Orbitrap MSI. Photographie du tube de transfert ionique fabriqué sur mesure utilisé pour coupler le pulvérisateur DESI au spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos. La figure montre la géométrie capillaire de transfert courbée et l’ensemble de montage utilisés pour la transmission ionique lors des expériences MSI à cellule unique ambiante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

La figure 4 montre l’adaptateur FAIMS modifié intégré à la carte optique et à l’étage XYZ motorisé. La vue du dessus (Figure 4A) illustre le positionnement de l’étage d’échantillonnage et de l’adaptateur modifié par rapport à l’entrée Orbitrap, tandis que la vue du bas (Figure 4B) montre les supports de montage et l’ensemble de l’étage utilisés pour soutenir la plateforme d’imagerie. La stabilité mécanique de l’ensemble intégré est importante pour maintenir un mouvement raster constant et minimiser la dérive de position lors de l’acquisition de l’imagerie.

Figure 4. Adaptateur modifié pour la spectrométrie de mobilité ionique asymétrique à haut champ (FAIMS) intégré à la carte d’essai optique et à l’étage XYZ motorisé. (A) Vue de dessus de l’adaptateur modifié monté à côté de l’entrée d’entrée et de l’étage d’échantillonnage Orbitrap. (B) Vue du bas montrant les supports modifiés, la breadboard optique et l’ensemble de l’étage XYZ motorisé utilisés pour soutenir et aligner la plateforme d’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

La haute résolution de masse fournie par la détection par Orbitrap permet de différencier les espèces lipidiques rapprochées et isobares, améliorant ainsi la spécificité moléculaire et le contraste de l’image par rapport aux systèmes à résolution de masse plus faible. Les petites dimensions des pixels peuvent être obtenues par synchronisation de la vitesse de l’étage et du taux d’acquisition spectrale. Par exemple, des dimensions en pixels aussi petites que 2,7 μm × 10 μm ont été obtenues à l’aide de plateformes Orbitrap à acquisition rapide et de paramètres raster^{optimisés 42}. L’imagerie à haute résolution spatiale permet de délimiter moléculairement des cellules proches tout en minimisant le chevauchement des signaux entre les régions cellulaires voisines.

Les expériences DESI–MSI réussies se caractérisent par des conditions de pulvérisation stables, une intensité ionique constante à travers les raies raster, et une localisation spatiale des signaux moléculaires correspondant à des cellules individuelles dans l’image optique. Des expériences sous-optimales peuvent produire des distributions d’ions diffuses, une faible intensité du signal, des motifs raster incohérents ou une perte de localisation cellulaire due à une formation instable des pulvérisations, un mauvais alignement des pulvérisateurs, une dispersion excessive des solvants ou un mouvement de l’échantillon lors de l’acquisition. Une optimisation soigneuse de l’alignement des pulvérisations, du débit du solvant, de la vitesse de l’étage et du positionnement de l’échantillon améliore la fidélité spatiale et la stabilité du signal ionique lors des expériences d’imagerie monocellulaire.

Discussion

Ce protocole permet le DESI–MSI à cellule unique ambiante en utilisant des spectromètres de masse Orbitrap à haute résolution de masse grâce à l’intégration d’un contrôle précis de l’étage, de la délivrance de solvants à l’échelle nanométrique, du ciblage optique et de l’analyse de masse à haute résolution spatiale. La combinaison de ces éléments répond à de multiples obstacles techniques qui ont historiquement limité l’application de DESI–MSI au niveau de la cellule unique. En particulier, le contrôle coordonné de la stabilité du pulvérisage, de la transmission des ions et du timing d’acquisition permet une détection fiable des signaux moléculaires provenant de volumes d’échantillonnage extrêmement faibles correspondant à des cellules individuelles. Un facteur central régissant la performance dans ce flux de travail est la stabilité et la confinement du panache de pulvérisation DESI. À des résolutions spatiales à l’échelle du micromètre, de petites perturbations du débit du solvant, de la pression du gaz ou du positionnement du pulvérisateur peuvent modifier significativement la surface d’échantillonnage effective. L’utilisation d’une délivrance de solvant à l’échelle nanométrique combinée à une contre-pression appropriée améliore la stabilité du pulvérisateur et réduit la propagation du solvant, améliorant ainsi la fidélité spatiale. De plus, maintenir une distance et un angle constants entre pulvérisateur et surface est essentiel pour l’efficacité de l’ionisation reproductible. Même de légères déviations géométriques peuvent entraîner une variation substantielle de l’intensité du signal, en particulier lors de l’analyse d’échantillons cellulaires hétérogènes. En pratique, l’optimisation des conditions de pulvérisation DESI a été réalisée empiriquement en surveillant le courant ionique total, la stabilité spectrale et les valeurs de NL (généralement autour de 10⁵–10⁶) lors de l’acquisition. La qualité du signal reproductible a été obtenue par un ajustement itératif de la position du pulvérisateur, de la stabilité en écoulement des solvants, de la pression du gaz et de l’alignement du panache DESI par rapport à l’entrée Orbitrap.

L’efficacité de transmission des ions représente une autre limitation clé à l’échelle d’une seule cellule, car l’abondance d’analytes est intrinsèquement faible dans les cellules individuelles. À ces échelles spatiales, la transmission efficace des ions peut devenir une limitation pratique plus grande que l’efficacité d’ionisation dans certaines implémentations, car seule une très faible fraction des ions désorbits atteint finalement l’entrée du spectromètre de masse. Un transfert efficace des ions de la région d’échantillonnage vers l’entrée du spectromètre de masse est donc essentiel. L’adaptateur de logement FAIMS modifié utilisé dans ce protocole offre une interface entre la source de pulvérisation DESI et un spectromètre de masse thermique, permettant la compatibilité avec plusieurs modèles d’instruments, y compris les plateformes Orbitrap Tribrid, Exploris et Astral. L’intégration de l’adaptateur FAIMS modifié avec une carte d’essai optique assure également une stabilité mécanique, minimisant ainsi le désalignement lors d’expériences d’imagerie prolongées. La synchronisation entre le mouvement de l’étape et l’acquisition spectrale de masse est tout aussi cruciale pour atteindre une haute résolution spatiale. Dans DESI–MSI, la dimension du pixel dans la direction du balayage est régie par la relation entre la vitesse de l’étape et le taux d’acquisition, tandis que la dimension orthogonale est définie par la taille de pas programmée. Un contrôle précis de ces paramètres permet un échantillonnage précis. Comme de nombreuses cellules de mammifères ont généralement un diamètre d’environ 5 à 20 μm, des dimensions de pixels approchant seulement quelques micromètres sont nécessaires pour minimiser le chevauchement des signaux entre cellules adjacentes et améliorer la localisation des caractéristiques moléculaires dans des régions cellulaires individuelles. Cependant, la taille nominale des pixels ne correspond pas nécessairement à l’empreinte réelle d’échantillonnage car l’interaction du panache de solvant avec la surface de l’échantillon peut introduire une dispersion latérale et un chevauchement partiel du signal entre pixels adjacents. Les dimensions rapportées des pixels doivent donc être interprétées dans le contexte de la résolution spatiale effective plutôt que dans des définitions strictement géométriques. Le tube de transfert ionique personnalisé utilisé dans cette étude a été conçu selon la géométrie du tube de transfert ionique standard afin de préserver les caractéristiques de transmission ionique tout en permettant l’intégration avec la configuration source DESI.

Un haut pouvoir de résolution de masse et une précision de masse fournis par les spectromètres de masse Orbitrap sont essentiels pour résoudre le mélange complexe de métabolites et de lipides présent dans les cellules individuelles. De nombreuses caractéristiques moléculaires détectées ont été annotées de manière provisoire à l’aide de mesures de masse précises et d’une analyse METASPACE. Parce que plusieurs assignations candidates peuvent correspondre à une seule valeur m/z mesurée, des stratégies supplémentaires de validation MS/MS et de confirmation moléculaire orthogonale pourraient renforcer davantage l’identification moléculaire dans de futures études. En mode ion positif, les spectres DESI sont souvent dominés par des espèces de phospholipides avec des valeurs m/z rapprochées ou isobares. La détection à haute résolution par Orbitrap permet de différencier ces espèces, améliorant ainsi la spécificité moléculaire et réduisant l’ambiguïté spectrale. Cette capacité est particulièrement importante pour les analyses unicellulaires, où la dépendance à un nombre limité d’ions peut entraîner une mauvaise interprétation de l’hétérogénéité cellulaire. Cette adaptabilité suggère que des stratégies similaires pourraient être applicables à d’autres plateformes de spectrométrie de masse utilisant des interfaces correspondantes avec des modifications appropriées. Malgré ces avantages, plusieurs limites doivent être prises en compte. Premièrement, la source DESI utilisée dans les travaux actuels n’est disponible que pour les utilisateurs possédant des systèmes DESI–MSI, et la construction de systèmes de pulvérisateur/Orbitrap DESI peut donc être limitée par la disponibilité des sources DESI. Cependant, des dispositifs DESI alternatifs, y compris DEFFI, peuvent également être mis en œuvre pour des études MSI à haute résolution^{spatiale 42,47}. Deuxièmement, la mise en œuvre de cette plateforme nécessite une personnalisation importante, incluant l’usinage des interfaces d’instruments et la fabrication des composants de montage. Ces exigences peuvent limiter l’accessibilité pour les laboratoires sans expérience en développement d’instruments ou fabrication mécanique. Dans la mise en œuvre actuelle, le boîtier d’interface FAIMS servait de plateforme de montage mécanique pratique pour positionner l’ensemble pulvérisateur DESI par rapport à l’entrée Orbitrap. Par conséquent, la mise en œuvre de la configuration décrite est plus pratique pour les laboratoires disposant d’un accès à des systèmes Orbitrap compatibles FAIMS et d’un support de base en usinage. Cependant, le concept plus large de couplage mécanique des sources DESI aux entrées Orbitrap peut être réalisé en utilisant des conceptions alternatives sans modifier le matériel d’interface FAIMS. Troisièmement, bien que de faibles débits de solvants améliorent le confinement spatial, ils peuvent aussi réduire le rendement global des ions, nécessitant une optimisation minutieuse pour équilibrer sensibilité et résolution spatiale.

Un autre point important à considérer est le potentiel de délocalisation de l’analyte lors de l’échantillonnage. Bien que le DESI fonctionne dans des conditions ambiantes et ne nécessite pas d’application de matrice, l’interaction des gouttelettes de solvant avec la surface de l’échantillon peut entraîner une redistribution des analytes, en particulier pour les espèces très solubles. Minimiser le volume du solvant et optimiser les conditions de pulvérisation sont donc essentiels pour préserver l’intégrité spatiale au niveau de la cellule unique. De même, la procédure de lavage utilisant du formate d’ammonium isotonique peut réduire la suppression des ions associée au sel tout en maintenant l’intégrité cellulaire et en préservant les espèces cellulaires, comme précédemment rapporté dans les flux de travail de SEP^{unicellulaire 5}.

Les développements futurs pourraient encore améliorer les performances et l’applicabilité de cette plateforme. Par exemple, l’intégration avec des systèmes d’acquisition de données plus rapides pourrait permettre des pixels effectifs plus petits et des expériences MSI à plus grand débit. La mise en œuvre de systèmes d’alignement automatisés ou de contrôle par rétroaction en temps réel peut réduire la variabilité et améliorer la reproductibilité. De plus, combiner cette approche avec des techniques complémentaires, telles que l’imagerie par fluorescence ou des stratégies de marquage ciblée, pourrait améliorer l’identification des types cellulaires et permettre des analyses multimodales.

Au-delà des considérations techniques, cette plateforme a de larges implications pour la recherche biologique et biomédicale. La capacité à caractériser les profils moléculaires au niveau des cellules individuelles dans des conditions ambiantes offre de nouvelles opportunités pour étudier l’hétérogénéité cellulaire dans des systèmes complexes. DESI–MSI a déjà été appliqué avec succès au niveau tissulaire dans des études sur les microenvironnements tumoraux, les maladies neurologiques, les interactions hôte–pathogène et les populations cellulaires résistantes^{aux médicaments} 12,15,16,35. Étendre le DESI–MSI au niveau unicellulaire pourrait encore améliorer la capacité à délimiter l’hétérogénéité chimique localisée entre cellules voisines, à identifier des sous-populations cellulaires rares et à découvrir des marqueurs moléculaires qui pourraient autrement être obscurcis dans les mesures de tissu en masse. Cependant, la présente étude a été réalisée à l’aide d’un modèle simplifié de culture cellulaire monocouche, et des études supplémentaires sont nécessaires pour démontrer la compatibilité avec d’autres systèmes biologiques complexes, incluant différents modèles cellulaires, tissus, organoïdes et cultures 3D. Le flux de travail actuel pourrait fournir une base pour étendre les mesures DESI à haute résolution spatiale vers des environnements biologiques de plus en plus hétérogènes après validation et optimisation supplémentaires. Parce que cette méthode préserve le contexte spatial tout en fournissant des informations moléculaires détaillées, elle peut servir de pont entre les approches d’imagerie et les approches basées sur l’omique. En résumé, ce protocole établit un cadre flexible et adaptable pour atteindre la résolution DESI–MSI en cellule unique sur les spectromètres de masse Orbitrap. En relevant les principaux défis liés à l’efficacité de l’ionisation, à la transmission ionique, au contrôle spatial et à la résolution de masse, cette approche permet une caractérisation moléculaire détaillée de cellules individuelles. Bien que d’autres optimisations et validations soient nécessaires, la méthodologie fournit une base pour étendre l’utilisation de l’IMS ambiant dans les études métabolomiques unicellulaires et spatiales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
−80 °C congélateur	Eppendorf New Brunswick	U700	Stockage des échantillons biologiques avant préparation.
Support vertical de 6" pour planches à pain, trous de 1/4"-20 (2 pièces)	Millipore Sigma	VB01A	Support mécanique et stabilisation de l'assemblage personnalisé de support de pulvérisateur
Acétonitrile	Fisher Chemical	240744	Solvant organique pour la préparation et l'optimisation de solvants compatibles avec DESI
Formiate d'ammonium	Thermo Fisher Scientific	401152500	Préparation du tampon de lavage en formiate d'ammonium isotonique pour le lavage cellulaire avant DESI–MSI
Microscope à champ clair	Fisher Scientific	12575252	Imagerie optique et visualisation des cellules adhérentes avant acquisition DESI–MSI
Colonne C18	Waters	186009259	Génération de contre-pression en ligne pour une formation stable de pulvérisation DESI en nano-débit
Fil de cuivre	N/A	N/A	Connexion électrique et mise à la terre lors de la fabrication du support de pulvérisateur
Pulvérisateur DESI XS	Waters	700014033	Source d'ionisation DESI ambiante pour des expériences DESI–MSI sur cellule unique
Résine époxy	Devcon	20945	Stabilisation mécanique et fixation des composants personnalisés du support de pulvérisateur
Adaptateur de boîtier de source d'ions d'électrode FAIMS Pro	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modification et fabrication de l'interface DESI compatible Orbitrap personnalisée
Acide formique	Ward’s Science	470301-120	Modificateur acide pour la préparation du solvant de pulvérisation DESI
Méthanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Solvant organique pour la préparation du solvant de pulvérisation DESI
Régulateur de gaz	Millipore Sigma	23831-U	Régulation de la pression du gaz de gaine en azote pendant le fonctionnement DESI
Lame de verre quadrillée	Ibidi	10817	Substrat de culture cellulaire et référence positionnelle pour l'enregistrement d'image optique à MS
Fil de mise à la terre	N/A	N/A	Connexion de mise à la terre électrique pour le pulvérisateur DESI et l'assemblage d'interface
Incubateur	HeraCell	51026282	Maintien des cultures de cellules mammifères dans des conditions de température et de CO2 contrôlées
Eau de qualité LC/MS	Thermo Fisher Scientific	W6500	Préparation du tampon de lavage en formiate d'ammonium et du solvant de pulvérisation DESI
Plateforme METASPACE	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Visualisation d'images MS basée sur le cloud et analyse de données de métabolomique spatiale
Interface FAIMS modifiée	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Interface personnalisée pour le couplage du pulvérisateur DESI avec les spectromètres de masse Orbitrap
Plateforme XYZ motorisée	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Mouvement contrôlé de la plateforme raster pendant l'acquisition DESI–MSI
Kit de détection de mycoplasmes MycoAlert PLUS	Lonza	LT07-703	Surveillance de routine de la contamination par les mycoplasmes dans les cellules cultivées
Système de nano-chromatographie liquide	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Système de distribution de solvant en nano-débit pour la génération de pulvérisation DESI
Planche optique	Thorlabs	MB1012	Plateforme de support mécanique pour le pulvérisateur DESI et l'assemblage d'interface modifié
Spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Spectromètre de masse Orbitrap haute résolution pour l'acquisition de données DESI–MSI
Tuyaux PEEK	IDEX	1535	Connexion de la ligne de solvant entre le système nano-LC et le pulvérisateur DESI
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140-122	Supplément d'antibiotiques pour le milieu de culture cellulaire mammifère
Tampon de phosphate (PBS)	VWR	0780-50L	Solution de lavage pour les cellules cultivées pendant le passage
Milieu RPMI-1640	Gibco	11875093	Milieu de culture cellulaire mammifère pour le maintien des cellules OVCAR-8
Logiciel de contrôle de la plateforme	Lasken Group	Version 6	Contrôle logiciel du balayage raster, du mouvement de la plateforme et des paramètres d'acquisition d'images
Tuyaux en acier inoxydable	MicroGroup	316H16H	Tuyaux de transfert d'ions fabriqués sur mesure (1/16" OD, 0,033" ID) pour l'intégration de l'interface Orbitrap
Seringue, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Chargement de solvant et distribution de solvant en nano-débit
Sérum bovin fœtal synthétique (FBS)	HyClone	SH3006603	Supplément sérique pour la préparation du milieu de culture cellulaire mammifère complet
Compteur de cellules automatisé TC20	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Comptage automatisé des cellules cultivées avant semis sur lames
Plat de culture tissulaire, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Expansion et maintenance des cultures cellulaires OVCAR-8 adhérentes
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Détachement enzymatique des cellules adhérentes pendant le passage
Résine à durcissement UV	Prime Dental	6.03	Fabrication et stabilisation des composants personnalisés du support de pulvérisateur DESI
Logiciel Xcalibur	Thermo Fisher Scientific	4.7	Contrôle de l'instrument, configuration de la méthode Orbitrap et acquisition de données spectrales de masse