Article de méthode

Mise au point d'un essai rapporteur STAT6 pour le criblage de toxiques environnementaux affectant l'inflammation allergique des voies respiratoires

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DOI :

10.3791/71694

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25 août 2026

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1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la génération et la validation d'un test rapporteur luciférase STAT6 stable dans des cellules épithéliales des voies respiratoires humaines. La méthode permet un criblage efficace des toxiques environnementaux et des composants de la pollution atmosphérique qui modulent l'activité de STAT6 dans des conditions in vitro contrôlées.

Résumé

L'inflammation des voies respiratoires allergique associée à la pollution de l'air constitue un problème croissant de santé publique. L'interleukine‑4 (IL‑4) et l'interleukine‑13 (IL‑13), qui activent la voie de signalisation du facteur de transcription et transducteur de signal 6 (STAT6), médiateur central de l'inflammation allergique des voies respiratoires, pourraient moduler la toxicité respiratoire des polluants. La présente étude décrit la mise au point et la validation d'un test rapporteur luciférase STAT6 stable dans des cellules épithéliales humaines des voies respiratoires, destiné à évaluer les agents toxiques environnementaux modulant la signalisation STAT6. Des cellules épithéliales bronchiques humaines 16HBE14o− ont été transduites à l'aide d'un rapporteur luciférase sensible au STAT6 par un vecteur lentiviral, suivi d'une optimisation de la sélection à la puromycine et de la multiplicité d'infection, puis d'une isolation monoclonale par dilution limitante. Un clone stable présentant une induction forte et reproductible au cours de passages successifs a été sélectionné. La réponse du rapporteur a été validée par stimulation avec IL-4/IL-13, et la dépendance au STAT6 a été confirmée à l'aide d'inhibiteurs spécifiques de STAT6, STAT5 et STAT3. Les performances du test ont été quantifiées par analyse du facteur Z′, indiquant une séparation reproductible du signal. En outre, le test a été appliqué à des constituants individuels de la pollution atmosphérique, et le benzo[b]fluoranthène ainsi que les particules en suspension ont significativement augmenté l'activité du rapporteur STAT6. Cette méthode offre une approche évolutible pour mesurer l'activité de STAT6 dans les cellules épithéliales des voies respiratoires et pour hiérarchiser les agents toxiques environnementaux modulant la signalisation allergique des voies respiratoires.

Introduction

La pollution de l'air représente l'un des défis mondiaux les plus urgents en matière de santé publique, avec des effets sanitaires profonds et des impacts socioéconomiques importants. Elle est actuellement classée au deuxième rang des facteurs de risque de mortalité, responsable de 8,1 millions de décès chaque année1,2,3. Parmi les polluants atmosphériques, les particules fines de diamètre inférieur à 2,5 micromètres (PM2,5) présentent le plus grand risque pour la santé en raison de leur capacité à pénétrer profondément dans les voies respiratoires4,5. Une exposition élevée aux PM2,5 a été régulièrement associée à une fonction pulmonaire altérée et à une augmentation des taux d'hospitalisation pour des maladies respiratoires6. La prévalence des maladies inflammatoires allergiques, notamment l'asthme, la rhinite allergique et la dermatite atopique, augmente dans le monde entier et est particulièrement élevée dans les mégapoles fortement polluées4.

Les maladies allergiques des voies respiratoires telles que l'asthme atopique sont principalement médiées par une réponse inflammatoire de type 2, caractérisée par des taux élevés de cytokines interleukine‑4 (IL‑4) et interleukine‑13 (IL‑13), ainsi que par l'activation de la voie de signalisation du transducteur de signal et activateur de la transcription 6 (STAT6)7. Dans les cellules épithéliales des voies respiratoires, la phosphorylation de STAT6 induite par l'IL-4 et l'IL-13 favorise l'hypersecretion de mucus et la perturbation de la barrière épithéliale, ce qui fait de STAT6 un médiateur central de la pathologie allergique des voies respiratoires et une cible thérapeutique pertinente8,9. Des preuves expérimentales provenant de modèles murins indiquent que l'exposition aux particules fines (PM2,5) et au dioxyde de soufre amplifie la signalisation de STAT6 et aggrave l'inflammation allergique des voies respiratoires10,11. Toutefois, on n'a pas encore évalué systématiquement si les différents constituants de la pollution atmosphérique modulent directement l'activité transcriptionnelle de STAT6 dans les cellules épithéliales humaines des voies respiratoires.

La pollution atmosphérique comprend un mélange chimiquement complexe de constituants, notamment des particules, des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), des métaux lourds et des sels inorganiques, dont les contributions individuelles à l'activation de STAT6 dans les voies respiratoires restent mal définies12,13. Les méthodologies actuelles pour mesurer l'activité de STAT6 dans les cellules épithéliales des voies respiratoires, telles que les dosages de phosphorylation en point final ou les systèmes rapporteurs basés sur la transfection transitoire, ne se prêtent pas au criblage chimique à grande échelle. Une plateforme rapporteur de STAT6 stable, basée sur des cellules, dans des cellules épithéliales humaines des voies respiratoires fournirait donc un outil évolutif permettant d'identifier les composés issus de la pollution qui modulent la signalisation allergique des voies respiratoires. Ce protocole décrit la mise au point et la validation d'un dosage rapporteur de STAT6 par luciférase stable dans des cellules épithéliales des voies respiratoires 16HBE14o−, permettant une évaluation quantitative de l'activation de STAT6 pour le criblage systématique d'échantillons environnementaux et de toxiques chimiques individuels.

Protocole

L'approbation éthique pour des sujets humains n'est pas applicable car cette étude a utilisé la lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine 16HBE14o− bien établie.

1. Génération de cellules 16HBE14o− exprimant de façon stable un rapporteur d'activité STAT6

REMARQUE : Figure 1 donne un aperçu du flux de travail.

  1. Culture cellulaire
    NOTA : Effectuer toutes les procédures en utilisant une technique aseptique dans une hotte de sécurité biologique de classe II. Vérifier que les cellules sont exemptes de contamination par les mycoplasmes avant utilisation.
    1. Entretenir les cellules 16HBE14o− dans un milieu minimum essentiel supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline–streptomycine. Incuber les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2, et renouveler le milieu de culture tous les deux jours.
    2. Laisser les cellules atteindre environ 80 % de confluence. Aspirer le milieu de culture et rincer la monocouche cellulaire une fois avec du tampon phosphate salin.
    3. Ajouter suffisamment de tampon phosphate salin pour recouvrir la monocouche cellulaire et incuber les cellules pendant 20 min à 37 °C. Aspirer complètement le tampon phosphate salin.
      NOTA : Utiliser une incubation de 20 min avec le tampon phosphate salin pour faciliter la disruption des jonctions intercellulaires serrées formées par cette lignée cellulaire. Cette durée représente une modification optimisée en interne.
    4. Ajouter suffisamment de solution de trypsine–acide éthylènediaminotétraacétique à 0,25 % pour recouvrir la monocouche cellulaire. Incuber les cellules pendant 10 min à 37 °C.
      NOTA : Surveiller le détachement cellulaire à l’aide d’un microscope optique inversé. Tapoter doucement le récipient de culture si nécessaire pour faciliter le détachement.
    5. Ajouter environ cinq volumes de milieu de culture complet par rapport au volume de la solution de trypsine–acide éthylènediaminotétraacétique afin de stopper l’activité enzymatique. Pipeter doucement la suspension pour obtenir une suspension monocellulaire.
    6. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger la suspension à 300 × g pendant 5 min à 25 °C.
    7. Aspirer soigneusement le surnageant et resuspendre le culot cellulaire dans du milieu de culture frais. Trisurer doucement la suspension et vérifier la présence d’une suspension monocellulaire au microscope optique inversé.
    8. Compter les cellules à l’aide d’un hématimètre et ajuster la concentration cellulaire à la densité requise pour l’expérience suivante. Utiliser un ratio de fractionnement habituel de 1:8.
      NOTA : Se référer au Tableau supplémentaire 1 et au Tableau supplémentaire 2 pour les surfaces de croissance des récipients de culture et les volumes correspondants de tampon phosphate salin et de solution de trypsine–acide éthylènediaminotétraacétique.
  2. Détermination de la cytotoxicité induite par la puromycine
    ​NOTA : Choisir l’antibiotique en fonction du gène de résistance codé par le vecteur lentiviral.
    1. Ensemencer les cellules 16HBE14o− à raison de 2 × 104 cellules par puits dans une plaque de culture 96 puits contenant 100 µL de milieu de culture complet par puits. Incuber les cellules pendant la nuit.
    2. Remplacer le milieu de culture par du milieu frais contenant de la puromycine à des concentrations finales de 0,5, 1, 2 ou 4 µg/mL. Préparer des plaques séparées pour les points temporels à 24, 48 et 72 h.
    3. Ajouter 5 µL de réactif de comptage cellulaire dans chaque puits. Incuber la plaque pendant 1 h à 37 °C.
      NOTA : Éviter d’introduire des bulles d’air dans les puits, car elles pourraient interférer avec les mesures d’absorbance.
    4. Mesurer l’absorbance à 450 nm en utilisant 650 nm comme longueur d’onde de référence. Agiter la plaque pendant 15 s immédiatement avant d’enregistrer l’absorbance en mode point final.
    5. Calculer la viabilité cellulaire14 à l’aide de l’équation 1.
      Équation de viabilité cellulaire, OD450-650 pour échantillons, contrôle, blanc ; formule pour analyse de bioessai.
      où :
      Équation d’absorbance OD450-650, méthode de soustraction, utilisée en spectrophotométrie, formule.
      Formule de densité optique (OD450-650) pour analyse d’absorption dans des expériences de spectroscopie.
      Équation de densité optique, OD450-650blanc=OD450blanc-OD650blanc, pour analyse de données spectroscopiques.
      NOTA : Définir le contrôle comme des cellules non traitées et le blanc comme un milieu sans cellules contenant le réactif d’essai. Choisir la concentration minimale de puromycine qui élimine complètement les cellules non transduites dans un délai de 48 à 72 h.
  3. Détermination de la multiplicité d’infection optimale
    ATTENTION : Manipuler les particules lentivirales en conditions de niveau de sécurité biologique 2, dans un établissement agréé de niveau 2 et conformément aux réglementations institutionnelles de sécurité biologique. Effectuer toutes les manipulations virales dans une hotte de sécurité biologique de classe II. Recouvrir les consommables contaminés par le virus et les déversements avec une solution d’eau de Javel à 10 % pendant au moins 1 h avant de les jeter comme déchets biologiques dangereux.
    ​NOTA : Optimiser la multiplicité d’infection car elle affecte directement l’efficacité de la transduction.
    1. Calculer le volume requis de stock lentiviral15 à l’aide de l’équation 2.
      Formule de calcul de MOI, rapport entre particules virales et cellules cibles, équation en biologie moléculaire.
      où :
      Formule de titre viral fonctionnel, T_virus = UT/mL, équation pour analyse de données en recherche virologique.
      Équation de volume viral, V_virus=volume viral en mL, formule, étude virologique, méthode de calcul
      Équilibre statique, équation : N_cells = nombre de cellules cibles, schéma pour usage éducatif en recherche.
      NOTA : Le titre fonctionnel du stock lentiviral rapporteur de luciférase STAT6 utilisé dans ce protocole était de 5 × 107 unités transduisantes/mL. Pour 2 × 104 cellules cibles, une MOI de 20 correspond à 8 µL de stock lentiviral par puits. Le volume viral doit être recalculé pour des préparations virales ayant des titres différents.
    2. Ensemencer les cellules 16HBE14o− à raison de 2 × 104 cellules par puits dans une plaque 96 puits blanche à fond transparent contenant 100 µL de milieu de culture complet par puits. Incuber les cellules pendant la nuit jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 80 % de confluence.
    3. Remplacer le milieu de culture par du milieu frais contenant 5 µg/mL de polybrene et le lentivirus rapporteur de luciférase STAT6 à des MOI de 1, 5, 10 et 20. Inclure un puits contrôle faux (mock) non transduit sans lentivirus.
      NOTA : Calculer le volume de lentivirus requis pour chaque MOI à partir du titre fonctionnel du stock.
    4. Incuber les cellules avec les particules lentivirales pendant 48 h. Remplacer le milieu de transduction par du milieu de culture frais et incuber les cellules pendant 24 h supplémentaires.
    5. Remplacer le milieu de culture par du milieu frais contenant de l’interleukine-4 et de l’interleukine-13 à 10 ng/mL chacune. Incuber les cellules pendant 24 h.
    6. Ajouter 25 µL de réactif d’essai de luciférase dans chaque puits16. Protéger la plaque de la lumière et l’incuber pendant 20 min à température ambiante.
    7. Agiter la plaque linéairement pendant 20 s. Mesurer la luminiscence en mode point final à l’aide d’une lecture sur toute la plaque et d’un réglage de gain de 120.
      ATTENTION : Enregistrer la luminiscence dans l’heure suivant l’ajout du réactif d’essai de luciférase afin de capter le signal maximal. Suivre les instructions du fabricant concernant la sécurité et la manipulation du réactif.
      NOTA : Utiliser le même lecteur de microplaque multimode et les mêmes paramètres d’acquisition pour toutes les mesures d’absorbance et de luminiscence.
  4. Sélection des cellules transduites
    1. Ensemencer les cellules 16HBE14o− à 2 × 105 cellules/mL dans une plaque de culture 24 puits. Incuber les cellules pendant la nuit.
    2. Remplacer le milieu de culture par du milieu frais contenant le lentivirus rapporteur de luciférase STAT6 à une MOI de 20 et 5 µg/mL de polybrene. Incuber les cellules pendant 48 h.
    3. Remplacer le milieu de transduction par du milieu de culture frais. Incuber les cellules pendant 24 h supplémentaires.
    4. Aspirer le milieu de culture et ajouter du milieu frais contenant 1 µg/mL de puromycine. Incuber les cellules pendant 5 jours, en renouvelant le milieu de sélection tous les 2 jours.
    5. Poursuivre la sélection à la puromycine jusqu’à ce que toutes les cellules du puits contrôle faux (mock) non transduit soient éliminées.
      ​NOTA : Laisser passer au moins 24 h après la transduction avant d’appliquer la sélection antibiotique, afin de permettre l’expression du gène de résistance.
  5. Isolation de clones monocellulaires par dilution limitante
    1. Détacher et compter les cellules rapporteurs STAT6 sélectionnées à la puromycine. Préparer une suspension monocellulaire à 5 cellules/mL par dilution sériée.
      ​NOTA : Éviter l’agrégation cellulaire pendant la dilution. Faire passer la suspension à travers un filtre cellulaire si nécessaire.
    2. Distribuer 200 µL de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de culture 96 puits afin d’obtenir une densité moyenne d’environ une cellule par puits.
    3. Examiner chaque puits au microscope inversé dans les 24 h et identifier les puits contenant une seule cellule. Exclure les puits contenant plus d’une cellule ou plusieurs foyers cellulaires spatialement séparés.
    4. Surveiller les puits sélectionnés durant la première semaine pour confirmer la croissance clonale. Renouveler le milieu de culture tous les 3 jours.
    5. Élargir chaque clone dans la plaque 96 puits d’origine pendant environ 20 jours ou jusqu’à ce que les cellules atteignent la confluence. Transférer chaque clone successivement dans une plaque 6 puits, puis dans un flacon de culture T-25.
      NOTA : Cultiver les cellules dans la plaque 6 puits pendant environ 6 jours avant de les transférer dans le flacon T-25, ou les transférer lorsqu’elles atteignent la confluence appropriée.
      ​POINT D’ARRÊT : Continuer l’expansion des clones ou les cryoconserver à 1 × 106 cellules par ampoule dans 1 mL de milieu de cryoconservation contenant 90 % de sérum de veau fœtal et 10 % de diméthylsulfoxyde.
    6. Ensemencer chaque clone élargi à 2 × 105 cellules/mL dans une plaque 96 puits blanche à fond transparent. Incuber les cellules pendant la nuit.
    7. Remplacer le milieu de culture par du milieu frais contenant de l’IL-4 et de l’IL-13 à 10 ng/mL chacune. Incuber les cellules pendant 24 h.
    8. Mesurer l’activité de la luciférase comme décrit aux étapes 1.3.6–1.3.7. Comparer l’activité du rapporteur induite entre les différents clones.
    9. Répéter l’essai de luciférase sur des passages cellulaires croissants. Sélectionner les clones qui maintiennent une activité du rapporteur induite par les cytokines constante au fil des passages.
      NOTA : Le clone 3 a été sélectionné pour sa faible luminiscence de base et sa capacité à maintenir un signal d’activation induit par les cytokines constant au fil des passages successifs.

2. Mise en place et validation du test rapporteur d'activité de STAT6

REMARQUE : Figure 2 donne un aperçu du flux de travail.

  1. Validation du test rapporteur d'activité de STAT6
    1. Ensemencer les cellules rapporteuses de STAT6 à raison de 2 × 105 cellules/mL dans une plaque blanche à fond transparent de 96 puits, en utilisant 100 µL de milieu de culture complet par puits. Incuber les cellules pendant la nuit.
    2. Remplacer le milieu de culture par du milieu frais contenant l'IL-4 et l'IL-13 à des concentrations finales de 10 ng/mL chacun. Ajouter simultanément les inhibiteurs spécifiques selon les modalités suivantes : 100 nM d'AS1517499 (inhibiteur de STAT6), 2,5 µM d'AC-4-130 (inhibiteur de STAT5) ou 2,5 µM de Stattic (inhibiteur de STAT3).
    3. Inclure un témoin véhicule contenant 0,1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). Incuber les cellules pendant 24 h.
    4. Déterminer la viabilité cellulaire à l’aide du test de dénombrement cellulaire décrit aux étapes 1.2.3–1.2.5.
    5. Mesurer l’activité de la luciférase comme décrit aux étapes 1.3.6–1.3.7.
    6. Normaliser le signal de luminescence de chaque puits par rapport à sa viabilité cellulaire correspondante. Exprimer les valeurs normalisées relativement au groupe témoin traité aux cytokines.
      NOTE : Une viabilité cellulaire réduite peut diminuer le signal de luciférase indépendamment de l’activité de STAT6. Interpréter l’activité rapporteur uniquement après avoir confirmé une viabilité cellulaire acceptable.
  2. Évaluation de la robustesse du test
    1. Évaluer la robustesse du test en calculant le facteur Z′ à partir de 21 puits répliqués pour les groupes témoins positif et négatif.
    2. Calculer le facteur Z′ à l’aide de l’équation 3.
      Équation d'équilibre statique, formule du facteur Z, expression mathématique pour le contrôle qualité du test.
      où :
      Équation d'équilibre statique, σₚ désigne l'écart-type du témoin, illustration de formule éducative.
      Équation de l'écart-type, σn, utilisée en analyse statistique pour la précision du témoin négatif.
      Équation μ<sub>p</sub> = signal moyen du témoin positif ; concept d'analyse de données statistiques.
      Équilibre statique, équation μn = signal moyen du témoin négatif, analyse éducative.
      NOTE : Un facteur Z′ compris entre 0,5 et 1,0 indique que le test est adapté au criblage à haut débit.

3. Application du test rapporteur STAT6 pour le criblage de toxiques environnementaux

ATTENTION : Manipulez les hydrocarbures aromatiques polycycliques et les sels de métaux lourds comme des substances toxiques et potentiellement cancérogènes. Utilisez des équipements de protection individuelle appropriés, effectuez toutes les manipulations dans une hotte de chimie certifiée et éliminez les matériaux contaminés conformément aux procédures institutionnelles de déchets dangereux.

  1. Test de dépistage des toxiques environnementaux
    1. Ensemencer les cellules rapporteuses STAT6 à une concentration de 2 × 105 cellules/mL dans une plaque blanche à 96 puits, fond transparent, en utilisant 100 µL de milieu de culture complet par puits. Incuber les cellules toute la nuit.
    2. Remplacer le milieu de culture par du milieu frais contenant chaque composé test à la concentration finale souhaitée, soit 10 µM pour ce protocole, et traiter les cellules en l'absence d'IL-4 et d'IL-13.
    3. Inclure un groupe témoin négatif contenant 0,1 % de diméthylsulfoxyde et un groupe témoin positif contenant de l'IL-4 et de l'IL-13 à 10 ng/mL chacun. Incuber les cellules pendant 24 h.
    4. Déterminer la viabilité cellulaire à l’aide du test de dénombrement cellulaire décrit aux étapes 1.2.3–1.2.5.
    5. Mesurer l’activité de la luciférase comme décrit aux étapes 1.3.6–1.3.7.
    6. Normaliser le signal de luminescence de chaque puits par rapport à la valeur correspondante de viabilité cellulaire. Exprimer le résultat normalisé par rapport au groupe témoin négatif.
    7. Exclure les composés qui réduisent la viabilité cellulaire en dessous de 80 % lors de l’interprétation de l’activité du rapporteur STAT6.
      NOTE : Considérer les signaux du rapporteur obtenus dans des conditions cytotoxiques comme non fiables, car une viabilité cellulaire réduite peut modifier la luminescence indépendamment de l’activité de la voie STAT6.

Résultats

Pour déterminer la concentration optimale de puromycine pour une sélection stable, les cellules parentales 16HBE14o− ont été traitées avec des concentrations croissantes de puromycine (0,5–4 µg/mL), et la viabilité cellulaire a été évaluée après 24, 48 et 72 h à l’aide d’un test de viabilité cellulaire. La puromycine a réduit la viabilité cellulaire de manière dépendante de la dose et du temps, toutes les concentrations abaissant la viabilité à moins de 20 % après 48–72 h (Figure 3). Une concentration de 1 µg/mL était la plus faible concentration éliminant complètement les cellules non transduites, réduisant le signal de viabilité résiduel à environ 4,5 % en 48 h (p < 0,0001). L’augmentation de la concentration de puromycine n’a entraîné aucune réduction supplémentaire de la viabilité cellulaire. Par conséquent, une concentration de 1 µg/mL de puromycine a été retenue pour la sélection ultérieure des cellules transduites.

Afin d'optimiser l'efficacité de la transduction lentivirale, les cellules 16HBE14o− ont été transduites avec le lentivirus rapporteur de STAT6 à des multiplicités d'infection (MOI) de 1, 5, 10 et 20 pendant 48 h, puis stimulées par l'IL-4 et l'IL-13 (10 ng/mL chacune) pendant 24 h afin d'activer la voie de signalisation de STAT6. Comme illustré dans la Figure 4, les unités de luminiscence relatives (RLUs) ont augmenté de manière dépendante du MOI. Un MOI de 20 a produit l'induction maximale du rapporteur, entraînant une augmentation d'environ 50 fois de la luminiscence par rapport au témoin non stimulé (p < 0,0001). Sur la base de ces résultats, un MOI de 20 a été choisi pour les expériences ultérieures.

Après la transduction et la sélection par la puromycine dans des conditions optimisées, les cellules non transduites ont subi une mort cellulaire étendue, tandis que les cellules transduites ont conservé une morphologie et une viabilité normales (Figure 5). Les cellules survivantes ont ensuite été soumises à une dilution limitante afin d'établir des lignées cellulaires rapporteuses monoclonales de STAT6.

Trois lignées cellulaires rapporteuses monoclonales dérivées de cellules individuelles ont été évaluées pour leur activité rapporteuse STAT6. Tous les clones présentaient une luminiscence basale faible (<1 000 ULR). La stimulation par l'IL-4 et l'IL-13 a induit une activité rapporteuse importante dans les clones 2 et 3, avec une luminiscence dépassant 20 000 ULR, correspondant à une induction supérieure à 20 fois (Figure 6A). Le clone 3 présentait la luminiscence basale la plus faible et a donc été sélectionné pour une caractérisation ultérieure. L'activité rapporteuse du clone 3 a été évaluée au cours de passages successifs (P9–P21) afin d'évaluer sa stabilité à long terme. Comme indiqué sur la Figure 6B, l'induction du rapporteur dépendant de STAT6 est restée stable sur l'ensemble de la gamme de passages évaluée. Un clone était considéré comme approprié pour les expériences ultérieures lorsqu'il présentait une vitesse de croissance normale, une luminiscence basale inférieure à environ 1 000 ULR et une induction supérieure à 20 fois après stimulation par des cytokines.

Étant donné que l'IL-4 et l'IL-13 peuvent activer d'autres membres de la famille STAT, notamment STAT3 et STAT5, la spécificité du test rapporteur a été davantage évaluée17,18. Les cellules rapporteuses STAT6 ont été stimulées par l'IL-4 et l'IL-13 en présence ou en absence d'inhibiteurs sélectifs ciblant STAT6, STAT5 ou STAT3 pendant 24 h19,20,21. La viabilité cellulaire est restée supérieure à 90 % dans toutes les conditions de traitement (inhibiteur de STAT6 AS1517499, 100 nM : 98,4 % ; inhibiteur de STAT5 AC-4-130, 2,5 µM : 97,4 % ; inhibiteur de STAT3 Stattic, 2,5 µM : 96,2 % ; Figure 7A). L'inhibition de STAT6 a fortement réduit l'activité de la luciférase (p < 0,0001), tandis que l'inhibition de STAT5 ou de STAT3 n'a eu aucun effet significatif sur l'activité rapporteuse (p = 0,2593 et p = 0,8857, respectivement ; Figure 7B). Ces résultats ont confirmé que l'activation du rapporteur dépendait principalement de STAT6.

La robustesse du test a été évaluée en calculant le facteur Z′ à l'aide de cellules stimulées par l'IL-4 et l'IL-13 comme témoin à signal élevé et de cellules traitées avec un inhibiteur de STAT6 comme témoin à signal faible. Le test a donné un facteur Z′ de 0,703 ± 0,097, indiquant une excellente performance du test, une fenêtre de signal étendue et une aptitude au criblage à haut débit.

Enfin, le test rapporteur STAT6 a été utilisé pour analyser des constituants environnementaux sélectionnés de la matière particulaire en fonction de leur capacité à moduler la signalisation STAT6. Après un traitement de 24 heures, le benzo[b]fluoranthène (10 µM) a augmenté de manière significative l'activité rapporteur d'environ 1,75 fois (p = 0,0006), tandis que la matière particulaire (100 µg/mL) a augmenté l'activité rapporteur d'environ 1,5 fois (p = 0,0398 ; Figure 8). En revanche, les autres hydrocarbures aromatiques polycycliques et composés de métaux lourds, notamment le CdCl2, le HgCl2 et le NiSO4 (chacun à 10 µM), n'ont pas modifié de manière significative l'activité rapporteur. Dans leur ensemble, ces résultats montrent que le test rapporteur STAT6 est stable, spécifique, robuste et adapté au criblage à haut débit de composés environnementaux modulant la signalisation STAT6.

Schéma de la transduction cellulaire ; rapporteur luciférase STAT6 ; sélection par antibiotique ; optimisation du MOI.
Figure 1 : Flux opératoire pour la génération de cellules rapporteuses STAT6 16HBE14o− . Aperçu schématique du protocole permettant de générer des cellules 16HBE14o− exprimant de façon stable un rapporteur luciférase STAT6. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Schéma du processus du test sur cellules rapporteuses STAT6 : stimulation par IL-4/13, CCK8, ajout de luciférase, résultats.
Figure 2 : Flux opératoire pour la mise en place et l'application du test rapporteur STAT6. Aperçu schématique du test rapporteur STAT6 utilisé pour la validation du test et le criblage de toxiques environnementaux. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Histogramme de viabilité cellulaire montrant les effets de la puromycine à des concentrations de 0,5-4 µg/mL sur 24-72 h ; analyse statistique.
Figure 3 : Détermination de la concentration optimale de puromycine pour la sélection stable de cellules. Les cellules parentales 16HBE14o− ont été traitées avec de la puromycine (0,5, 1, 2 ou 4 µg/mL) pendant 24, 48 ou 72 heures. Les cellules témoins ont reçu 0,1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO). La viabilité cellulaire a été déterminée à l’aide d’un test de viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire a été calculée à partir de la différence d’absorbance entre 450 et 650 nm après soustraction du blanc et normalisation par rapport au témoin véhiculaire. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de trois réplicats biologiques indépendants avec des doublons techniques (n = 3). La signification statistique a été évaluée par une ANOVA à un facteur suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett. Les valeurs p pour les comparaisons avec le témoin véhiculaire sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphiques en barres de la luminescence en fonction du MOI ; analyse des données du changement de rapport des RLU et des valeurs <em>p</em> statistiques.
Figure 4 : Optimisation de l'efficacité de transduction lentivirale. Des cellules 16HBE14o− ont été transduites avec un lentivirus rapporteur de STAT6 à des multiplicités d'infection (MOI) de 1, 5, 10 ou 20 pendant 48 h. Après une période de récupération de 24 h, les cellules ont été stimulées avec l'IL-4 et l'IL-13 (10 ng/mL chacune) pendant 24 h. (A) Unités de luminescence relative (RLU) dans les cellules transduites de manière factice et les cellules transduites avec le rapporteur aux MOI indiqués. Une analyse statistique a été réalisée par ANOVA à un facteur, suivie d'un test de comparaisons multiples de Dunnett. (B) Induction du rapport après stimulation par les cytokines par rapport au témoin non stimulé au MOI 20. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide d'un test t de Student non apparié. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type à partir de trois réplicats biologiques indépendants (n = 3). Les valeurs p sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Morphologie cellulaire sous exposition à la puromycine ; image de microscopie montrant des variations à l'échelle de 50 μm.
Figure 5 : Images représentatives de cellules après sélection par la puromycine. Les cellules 16HBE14o− ont été transduites ou non avec le lentivirus rapporteur de STAT6 (MOI = 20), puis traitées avec 1 µg/mL de puromycine pendant 5 jours. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope inversé à contraste de phase avec un grossissement de 100×, dans des conditions d’imagerie identiques. Les cellules parentales non traitées formaient une monocouche épithéliale normale (à gauche). Les cellules non transduites traitées à la puromycine présentaient une mort cellulaire étendue et un détachement (au centre), tandis que les cellules transduites sélectionnées par la puromycine restaient viables et conservaient une morphologie normale (à droite). Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Résultats du test de luminescence ; graphique à barres comparant les conditions contrôle et IL dans des clones cellulaires et des passages.
Figure 6 : Identification de clones rapporteurs STAT6 et évaluation de la stabilité du rapporteur. Après dilution limitante, trois lignées cellulaires rapporteurs STAT6 monoclonales ont été mises en culture et stimulées avec l'IL-4 et l'IL-13 (10 ng/mL chacune) pendant 24 h. (A) Activité de la luciférase dans des clones rapporteurs individuels après stimulation par les cytokines, comparée aux témoins non stimulés. (B) Stabilité de l'activité rapporteur STAT6 dans le clone 3 au cours de passages successifs (P9–P21). Les données sont exprimées comme moyenne ± ÉT à partir de duplicats techniques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphiques en barres comparant le pourcentage de viabilité cellulaire et la luminescence normalisée dans les tests cellulaires traités par médicament.
Figure 7 : Inhibition sélective de l'activité du rapporteur STAT6 sans effet sur la viabilité cellulaire. Des cellules rapporteuses STAT6 ont été stimulées par l'IL-4 et l'IL-13 (10 ng/mL chacun) pendant 24 h en présence de l'inhibiteur de STAT6 AS1517499 (100 nM), de l'inhibiteur de STAT5 AC-4-130 (2,5 µM) ou de l'inhibiteur de STAT3 Stattic (2,5 µM). Le groupe contrôle au véhicule stimulé par les cytokines a reçu 0,1 % de DMSO. (A) La viabilité cellulaire a été déterminée à l'aide d'un test de viabilité cellulaire. (B) Activité luciférase dépendante de STAT6, normalisée par rapport au témoin stimulé par les cytokines. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de trois réplicats biologiques indépendants (n = 3). Les valeurs p sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Graphique à barres des résultats normalisés du test de luminescence comparant les traitements chimiques à des échantillons témoins.
Figure 8 : Évaluation des effets modulateurs des toxiques environnementaux sur STAT6. Des cellules rapporteuses de STAT6 ont été traitées pendant 24 h avec des matières particulaires (100 µg/mL) ou avec les toxiques environnementaux indiqués, notamment des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et des métaux lourds (10 µM chacun). L'activité de la luciférase dépendante de STAT6 a été normalisée par rapport au témoin véhicule (DMSO à 0,1 %). Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de trois réplicats biologiques indépendants (n = 3). La signification statistique a été déterminée par comparaison avec le témoin véhicule, et les valeurs de p sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Spécifications des récipients de culture et paramètres de repiquage pour les 16HBE14o-− culture cellulaireVeuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Comparaison des méthodes de mesure de l'activité de STAT6.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La signalisation IL-4/IL-13–JAK–STAT6 constitue non seulement une cible thérapeutique importante, mais aussi un facteur clé dans la pathogenèse des maladies allergiques, notamment l'asthme et la rhinite allergique22. Ce protocole décrit un essai rapporteur simple, basé sur une lignée cellulaire stable, permettant d'identifier des modulateurs de l'activité de STAT6. Cet essai peut être utilisé pour évaluer les effets modulateurs de STAT6 exercés par une large gamme de composés environnementaux, et il est facilement adaptable au criblage à haut débit, comme le montre l'étude de validation du concept (Figure 8). En combinant un rapporteur luciférase avec un essai parallèle de viabilité cellulaire, cette méthode permet une évaluation quantitative de la modulation de la voie STAT6 tout en minimisant les effets perturbateurs liés à la cytotoxicité induite par les composés.

Une caractéristique distinctive de cette méthode est l'utilisation de cellules épithéliales bronchiques humaines 16HBE14o− transduites de manière stable, un type cellulaire physiologiquement pertinent dans lequel la signalisation induite par les polluants via IL-4/IL-13 contribue à l'inflammation allergique des voies respiratoires. Les approches existantes pour mesurer l'activité de STAT6 présentent d'importantes limites pratiques. La détection de la phosphorylation de STAT6 ou de protéines cibles en aval par immunoblot ou dosage immunoenzymatique (ELISA) est fastidieuse et relativement peu performante. Les tests rapporteurs de luciférase par transfection transitoire mesurent directement l'activité transcriptionnelle de STAT6, mais sont affectés par une efficacité de transfection variable, une variabilité d'un lot à l'autre et la nécessité de répéter la transfection pour chaque expérience, ce qui réduit la reproductibilité et le débit.

La lignée cellulaire rapporteuse stable décrite dans l'étude surmonte bon nombre de ces limitations. Étant donné que le construit rapporteur est intégré au génome et sélectionné de façon clonale, l'expression du rapporteur reste uniforme au sein de la population cellulaire et reproductible au fil des passages, éliminant ainsi la variabilité associée à la transfection transitoire. Le signal de luminescence est mesuré dans des cellules vivantes et peut être normalisé par rapport à une mesure parallèle de viabilité cellulaire afin d'exclure les artefacts cytotoxiques. De plus, le test est facilement compatible avec un format 96-puits pour des applications à débit moyen ou élevé. Le test a donné un facteur Z′ de 0,703, indiquant une excellente séparation entre les contrôles à signal élevé et faible et confirmant son adéquation pour le criblage à haut débit. Une comparaison des approches couramment utilisées pour mesurer l'activité de STAT6 est fournie dans le Tableau supplémentaire 2. Néanmoins, comme le test rapporte l'activation d'un promoteur sensible à STAT6 plutôt que l'expression de gènes cibles endogènes, une validation orthogonale à l'aide de gènes cibles situés en aval de STAT6, tels que MUC5AC et CCL26, reste essentielle.

Plusieurs étapes sont cruciales pour la mise en place réussie et l'application du test rapporteur STAT6. L'optimisation de la multiplicité d'infection (MOI) lentivirale est essentielle, car une quantité insuffisante de virus réduit l'efficacité de la transduction, tandis qu'une exposition excessive au virus peut induire un stress cellulaire et compromettre la viabilité cellulaire. De même, l'optimisation de la concentration de puromycine pour la sélection est nécessaire afin d'éliminer les cellules non transduites tout en préservant la viabilité des cellules rapporteuses résistantes. Étant donné que la sensibilité à la transduction lentivirale et à la sélection antibiotique varie selon les types cellulaires, ces deux paramètres doivent être optimisés empiriquement avant d'établir des lignées cellulaires rapporteuses stables. La lignée cellulaire 16HBE14o− est une lignée épithéliale bronchique humaine immortalisée largement utilisée pour étudier l'inflammation des voies respiratoires, car elle forme des jonctions serrées fonctionnelles et produit du mucus8,23. Les cellules choisies pour la génération du rapporteur doivent exprimer des récepteurs fonctionnels pour l'IL-4 et l'IL-13 et conserver une signalisation JAK–STAT en aval intacte24. Avant d'établir des lignées rapporteuses stables, la construction rapporteuse doit être validée en confirmant sa réponse à la stimulation par des cytokines, son inhibition par des inhibiteurs spécifiques de la voie de signalisation, ainsi que l'absence d'effets cytotoxiques dans les conditions choisies pour le test. Ces étapes de validation permettent de s'assurer que les variations de l'activité rapporteuse reflètent fidèlement une signalisation dépendante de STAT6, et non un stress cellulaire non spécifique.

Plusieurs limites de cette méthode doivent également être prises en compte. Les vecteurs lentiviraux s'intègrent de manière aléatoire dans le génome de l'hôte, ce qui peut entraîner des variations d'un clone à l'autre en ce qui concerne l'activité basale du rapporteur, l'inductibilité et la stabilité de l'expression à long terme. De plus, comme le test mesure l'activation d'un promoteur sensible à STAT6, il n'évalue pas directement l'activation du récepteur en amont ou les événements de signalisation endogènes en aval. Une culture prolongée de cellules rapporteuses stables peut également conduire à un silençage épigénétique ou à une diminution de l'expression du transgène. Pour minimiser ces effets, des banques maîtresses de cellules à bas passage doivent être établies, et la réponse du rapporteur doit être vérifiée périodiquement dans une plage de passages définie. En outre, ce test n'a pas encore été validé dans des cellules épithéliales humaines primaires des voies respiratoires ni sur une plateforme de criblage à haut débit entièrement automatisée. Enfin, les toxicants environnementaux évalués dans cette étude constituent un panel de preuve de concept plutôt qu'une bibliothèque chimique exhaustive.

La pollution de l'air, en particulier les particules fines (PM2,5), est constituée d'un mélange complexe de composants chimiquement et physiquement variés, notamment du carbone noir, des sels inorganiques, des hydrocarbures aromatiques polycycliques et des métaux lourds12,13. Les variations des sources d'émissions et des processus atmosphériques entraînent des différences importantes dans la composition des particules, ce qui pourrait contribuer à des effets néfastes distincts sur la santé. Par conséquent, l'identification des composants spécifiques responsables des réponses allergiques reste difficile dans les études épidémiologiques et in vivo. Le test rapporteur STAT6 décrit dans cette étude fournit une plateforme in vitro pratique pour analyser l'activité modulatrice de STAT6 exercée par des toxiques atmosphériques individuels, par des extraits de matières particulaires provenant de sources spécifiques ou par des fractions particulaires chimiquement définies. Ce protocole pourrait faciliter la priorisation de toxiques candidats pour des études mécanistiques et soutenir l'évaluation axée sur les risques des mélanges complexes de pollution atmosphérique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Conseil national de la recherche de Thaïlande (NRCT) (subvention no N42A680388), et ce projet de recherche est financé par l'Université Mahidol (Fonds de recherche stratégique : 2025) (subvention no 35). Les figures 1 et 2 ont été créées à l'aide de BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Trypsine-EDTA 0,25 %Gibco25200072Réactif de dissociation cellulaire
Tubes coniques stériles de 15 mL pour centrifugeuseCorningCLS430791Tubes en polypropylène stériles pour centrifugeuse
Ligne cellulaire épithéliale bronchique humaine 16HBE14o-Cadeau du Dr. Nawiya Huipao (Université Prince de Songkla, Thaïlande) et du Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (Université de Californie à San Francisco, États-Unis)RRID:CVCL_0112Ligne cellulaire épithéliale bronchique humaine (passages 35–40) ; confirmée sans mycoplasmes et conservant une morphologie épithéliale différenciée des voies respiratoires ainsi que des propriétés de barrière. Référence : Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994 ;10(1) :38–47.
Plaque de culture tissulaire à 24 puits, transparente, à fond plat, traitée pour la culture cellulaireCorning3527Plaque de culture cellulaire
Plaque de culture tissulaire à 6 puits, transparente, à fond plat, traitée pour la culture cellulaireCorning3516Plaque de culture cellulaire
Microplaque en polystyrène, à 96 puits, transparente, à fond plat, traitée pour la culture tissulaireCorning3599Plaque pour test de viabilité cellulaire
Microplaque en polystyrène, à 96 puits, blanche, à fond transparent, traitée pour la culture tissulaireCorning3610Plaque pour test de luminescence
AC-4-130 (inhibiteur de STAT5)MedChemExpressHY-124500Inhibiteur sélectif de STAT5
AS1517499 (inhibiteur de STAT6)MedChemExpressHY-100614Inhibiteur sélectif de STAT6
Benzo[b]fluoranthèneAccuStandardH-128NHydrocarbure aromatique polycyclique
Cabinet de sécurité biologique, Classe IINuaireNU-543-400EPour les procédures de culture cellulaire aseptiques
Chlorure de cadmium (CdCl2)Sigma202908Composé de métal lourd
Kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Test de viabilité cellulaire
Flacon de culture cellulaire, 25 cm² (T-25)Corning430639Flacon de culture tissulaire
Incubateur à CO2NuaireNU-5710EMaintenu à 37 °C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée
Diméthylsulfoxyde (DMSO)SigmaD2650Solvant (concentration finale de 0,1 %) et cryoprotecteur (10 %)
Sérum bovin fœtal (FBS)SigmaF7524Supplément du milieu (10 %) et milieu de cryoconservation (10 %)
HémocytomètreBOECOBOE14Comptage cellulaire manuel
Microscope optique inversé à contraste de phaseZEISSPrimovertObservation de la morphologie cellulaire
Système de dosage de la luciférase (ONE-Step)BPS Bioscience60690Test rapporteur de luciférase
Chlorure de mercure (HgCl2)Sigma215465Composé de métal lourd
Lecteur de microplaqueBioTekSynergy Neo2Lecteur multimode de microplaque/luminomètre contrôlé par le logiciel Gen5 (v3.08.01). Mesure de l'absorbance à 450 nm avec référence à 650 nm après 15–20 s d'agitation linéaire. Mesure de la luminescence en mode point final à l'aide d'un gain du détecteur de 120 après 20 s d'agitation linéaire.
Milieu Essentiel Minimum d’Eagle (MEM)Gibco11095-080Milieu de culture de base
Sulfate de nickel (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Composé de métal lourd
Matière particulaire (PM)Institut national des normes et de la technologie (National Institute of Standards and Technology)SRM 2975Matériau de référence normalisé pour la matière particulaire
Pénicilline-streptomycine (100×)Gibco15140122Supplément antibiotique (concentration finale de 1 %)
Solution tampon phosphate-saline (PBS)Gibco18912014Solution de rinçage
PolybreneSigmaTR-1003-GAmplificateur de transduction lentivirale
PuromycineMedChemExpressHY-B1743AAntibiotique pour la sélection stable des cellules
IL-13 humaine recombinanteThermo Fisher ScientificA42526Cytokine pour stimulation
IL-4 humaine recombinanteThermo Fisher ScientificA42602Cytokine pour stimulation
Lentivirus rapporteur luciférase STAT6BPS Bioscience78799Construction rapporteur lentivirale ; titre du stock 5 × 107 UT/mL
Stattic (inhibiteur de STAT3)MedChemExpressHY-13818Inhibiteur sélectif de STAT3

Références

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