Préparation de vésicules polymères fonctionnalisées protéine-membrane et hybrides polymère/lipide grandes et géantes unilamellaires

Résumé

Ce protocole démontre la reconstitution médiée par détergent d’une protéine membranaire, la cytochrome bo3 ubiquinol oxydase, en grandes vésicules unilamellaires composées de PDMS-g-PEO et leur conversion en vésicules géantes par fusion-électroformation. Les compartiments polymères fonctionnels ainsi obtenus conviennent aux études biochimiques et biophysiques avancées.

Résumé

Les vésicules formées à partir de copolymères amphiphiles, seules ou mélangées avec des phospholipides, offrent une stabilité mécanique et chimique supérieure à celle des vésicules lipidiques conventionnelles. Cela en fait un châssis attractif, pouvant être développé et étendu pour permettre des applications spécifiques, telles que l’administration de médicaments, la biodétection diagnostique, la construction de cellules artificielles et les micro- et nanoréacteurs bioinspirés. En particulier, la fonctionnalisation par incorporation de protéines membranaires est essentielle pour de nombreuses applications. Ici, nous présentons un protocole pour préparer des vésicules unilamelaires (LUVs) fonctionnalisées par protéine membranaire à partir du copolymère greffé PDMS-g-PEO via une reconstitution médiée par un détergent. De plus, nous décrivons comment ces grandes vésicules peuvent être converties en vésicules unilamellaires géantes (GUVs) en utilisant une approche fusion-électroformation. Le protocole couvre le marquage par fluorescence des protéines membranaires, la préparation de LUVs polymères et hybrides, la reconstitution des protéines membranaires, l’analyse de la distribution de taille via diffusion dynamique de la lumière (DLS), l’évaluation de l’activité protéique via des mesures de consommation d’oxygène, la préparation de GUV fonctionnalisés protéiquement, ainsi que l’analyse de l’insertion protéique et de l’activité de pompage de protons dans les GUV via microscopie confocale. Des résultats représentatifs démontrent la formation de protéo-LUV monodispersés avec un indice de polydispersion (PDI) inférieur à 0,2, et la génération réussie de protéo-GUV allant de 5 à 35 μm de diamètre. L’activité des protéines est confirmée par des mesures de consommation d’oxygène dans les LUV polymères (18,2 nmol/min/mL) et les LUV hybrides (26,9 nmol/min/mL). L’insertion des protéines dans les GUV est quantifiée via l’intensité de fluorescence, donnant 20,6 ± 3,7 u. pour les GUV polymères et 26,2 ± 5,0 u.a. pour les GUV hybrides. L’activité de pompage de protons dans les GUV, surveillée via un colorant encapsulé sensible au pH, est cohérente avec la fonctionnalité des protéines, le pompage de protons entrant étant prédominant. La douceur mécanique du copolymère et son épaisseur lipidique de la bicouche (~5,3 nm) favorisent une insertion efficace des protéines et la préservation de leur fonctionnalité.

Introduction

Les copolymères à blocs amphiphiles peuvent s’auto-assembler en solution aqueuse en membranes, qui se courbent spontanément et se referment sur elles-mêmes pour former des compartiments sphériques enfermés par une membrane, appelés polymésomes (vésicules polymères). Comparés aux membranes lipidiques, les compartiments polymères offrent une plus grande polyvalence chimique ainsi qu’une stabilité^{chimique 1 et mécanique 2} accrues, ce qui les rend très attractifs pour des applications telles que l’administration de médicaments, les nano- et micro-réacteurs, ainsi que la construction de cellules artificielles durables. Notre groupe et d’autres ont fonctionnalisé des membranes polymères en insérant des protéines membranaires pour créer des organites artificiels et^{des cellules} 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Les polymères contenant un noyau hydrophobe poly(diméthylsiloxane) (PDMS) sont particulièrement adaptés à l’incorporation de protéines membranaires en raison de la grande flexibilité de la chaîne et de la possibilité d’ajuster l’épaisseur hydrophobe de la membrane pour mieux correspondre au domaine^{transmembranaire 5} de la protéine. Alors que notre laboratoire s’est principalement concentré sur le copolymère greffe poly(diméthylsiloxane)-greffe-poly(oxyde d’éthylène) (PDMS-g-PEO), qui forme des membranes très dynamiques ^4,16,17 plus souples que les bicouches lipidiques conventionnelles et présentant une épaisseur d’environ 5,3^{nm 1}, d’autres groupes ont utilisé avec succès des copolymères triblocs à base de PDMS tels que PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA^5,6,7,8,9,10,11 et PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² pour la reconstitution des protéines membranaires. Même des copolymères diblocs relativement rigides comme PBD-b-PEO, en particulier dans des systèmes hybrides mélangés à lipides, ont été utilisés pour une incorporation réussie^{de protéines 13}. Ces exemples mettent en avant la polyvalence des membranes polymères en tant que plateformes de reconstitution, qui peuvent également offrir une meilleure stabilité chimique¹ et une durée de vie fonctionnelle^{prolongée 14} pour les protéines membranaires incorporées. Bien que les membranes hybrides polymère/lipidique ne correspondent pas toujours à la stabilité chimique des systèmes purs^polymères, elles offrent un compromis attrayant en combinant la robustesse mécanique des polymères avec la pertinence biologique des lipides. Cela aboutit à un environnement membranaire qui imite davantage les membranes biologiques natives tout en préservant les avantages clés des matériaux synthétiques. De telles architectures hybrides peuvent offrir des avantages supplémentaires, notamment une perméabilité réduite aux protons résultant du réarrangement à l’échelle^{nanométrique 1} et la formation de domaines au sein de la membrane¹⁵.

Plusieurs techniques existent pour reconstituer les protéines membranaires en vésicules nanométriques (LUV), notamment la reconstitution médiée par des solvants organiques (par exemple, l’évaporation en phase inverse, la réhydratation de films lipidiques), les approches mécaniques (par exemple, sonication, presse française, congélation-dégel), et la reconstitution médiée par le détergent (via retrait, dilution ou incorporation directe du détergent⁾¹⁸, ainsi que des stratégies plus récentes telles que le transfert direct à partir de nanodisques de copolymères styrène-maléique19. Alors que les porines ont été incorporées avec succès dans les LUV polymères par insertion directe, par exemple en ajoutant la protéine au film polymère lors de la^{réhydratation 8}. Cette approche aboutit généralement à une faible efficacité d’insertion pour les protéines membranaires plus grandes ou plus complexes et conduit souvent à une orientation aléatoire des protéines. Par conséquent, la reconstitution médiée par la lessive, qui consiste à ajouter un détergent contrôlé puis à l’éliminer, reste la méthode la plus utilisée. C’est également la stratégie privilégiée pour incorporer des protéines membranaires plus grandes dans les LUV à base de polymères, en particulier pour les protéines asymétriques où une orientation contrôlée est cruciale pour le fonctionnement. Dans cette approche, les membranes des vésicules sont d’abord saturées du détergent de choix (la concentration saturante du détergent est notée R_saturé), partiellement solubilisées (coexistence des vésicules et des micelles), ou entièrement solubilisées, c’est-à-dire décomposées en micelles (la concentration du détergent est notée R_sol). Ce traitement initial par membrane est suivi d’une addition de protéines, d’une incubation et d’un retrait du détergent¹⁸. Cette dernière option peut être réalisée par dialyse, chromatographie d’exclusion de taille ou adsorption sur des billes de polystyrène hydrophobes (par exemple, des bio-billes). Le choix du détergent, sa concentration et la méthode d’élimination sont optimisés pour chaque type de membrane et protéine afin de maximiser l’efficacité d’incorporation et de contrôler l’orientation^{des protéines 20}.

Bien que les LUV soient bien adaptés à la mesure de l’activité en masse, les études à vésicule unique et les analyses basées sur la microscopie optique nécessitent la reconstitution des protéines membranaires en vésicules unilamellaires géantes (GUV). Cinq approches principales sont utilisées pour l’incorporation des protéines dans les GUV : coformation en présence de protéine et solvant^{organique 21}, co-formation en présence d’un détergent²², insertion dans les GUV préformés via dilution^{de détergent 23}, insertion par fusion membranaire avec les protéo-LUV^16,24, et fusion-électroformation²⁵. Bien que ces approches aient été appliquées avec succès aux GV lipidiques, leur transfert vers des GUV polymères ou hybrides polymère/lipides est souvent difficile. En particulier, les méthodes de coformation et de dilution par détergent entraînent fréquemment de faibles efficacités d’insertion dans les membranes polymères ou sont incompatibles avec certaines compositions^{polymères 15}. Les stratégies basées sur^{la fusion} 4,16,24,26,27 qui reposent sur des agents fusogéniques supplémentaires peuvent également poser problème, car les lipides/polymères cationiques synthétiques ou les peptides fusogéniques peuvent compromettre la stabilité des protéines membranaires, modifier les propriétés membranaires ou réduire l’efficacité d’incorporation de la protéine cible. La fusion électroformation surmonte nombre de ces limitations et s’est avérée être une méthode robuste et efficace pour incorporer des protéines membranaires dans les GUV polymères et polymères/^{lipides 1,5,15}. Cette approche permet l’incorporation contrôlée des protéines tout en préservant l’intégrité des membranes et la fonctionnalité des protéines, ce qui la rend particulièrement adaptée à la génération de polymères GUV fonctionnalisés par les protéines.

Reconstituer les pompes de protons en vésicules polymères est essentiel pour construire des cellules artificielles durables, car cela permet la génération de gradients de protons transmembranaires — la monnaie énergétique fondamentale des systèmes vivants. En recréant la conversion d’énergie chimiosmotique dans un environnement à membrane minimale^{contrôlée 28}, ces vésicules peuvent stimuler la synthèse de l’ATP, le transport actif et les réactions métaboliques, établissant ainsi la base énergétique nécessaire à une fonctionnalité autonome et vivante. Une pompe à protons représentative utilisée dans de tels systèmes est la cytochrome bo₃ oxydase d’E. coli, une enzyme respiratoire terminale qui couple la réduction d’oxygène à la translocation de protons à travers la membrane. Parce que le transfert d’électrons et le pompage de protons sont étroitement couplés, leur activité dans les vésicules synthétiques peut être surveillée quantitativement soit par la consommation^{d’oxygène 1,20}, soit en suivant la formation du gradient de^{protons 1}.

Dans ce protocole, nous présentons un flux de travail détaillé pour la préparation des LUV à base de PDMS-g-PEO, incluant les membranes polymères pures et hybrides polymère/lipides, leur fonctionnalisation avec les protéines membranaires, l’échelle en GUVs, ainsi que les mesures d’activité de la pompe à protons reconstituée cytochrome bo₃ oxydase par des tests de consommation en vrac d’oxygène et des mesures de pompage de protons à vésicule simple.

Protocole

REMARQUE : Tous les déchets chimiques dangereux générés dans le cadre de ce protocole doivent être éliminés conformément aux réglementations institutionnelles et locales.

1. Préparation pour Bio-Beads SM-2

REMARQUE : Les bio-perles SM-2 sont pré-lavées avec du méthanol pour éliminer les conservateurs et les contaminants organiques avant l’adsorption du détergent.

1. Placez du papier filtre dans un entonnoir en verre placé au-dessus d’un bécher ou d’une fiole en verre propre.
2. Ajoutez au moins 600 mg de Bio-Beads SM-2 à l’entonnoir (suffisant pour 3 répétitions de reconstitution pour les LUV hybrides et polymères).
   REMARQUE : Un minimum de 90 mg de Bio-Beads SM-2 est requis par reconstitution, comme spécifié à l’étape 4.4.1. Une plus grande quantité peut être préparée si d’autres reconstitutions sont prévues.
3. Lavez les billes trois fois avec du méthanol pur, en utilisant un volume suffisant pour les immerger complètement à chaque fois.
   ATTENTION : Effectuez toutes les étapes de manipulation du méthanol dans une hotte chimique.
4. Lavez immédiatement les billes trois fois avec de l’eau Milli-Q pour éliminer les résidus de méthanol.
   REMARQUE : Ne laissez pas les billes s’assécher pendant la procédure de lavage. Lors du retrait des solutions de lavage, assurez-vous que les billes restent humides et ne deviennent pas complètement sèches.
5. Transférez les billes lavées dans un récipient de stockage approprié (par exemple, un tube centrifuge stérile en polypropylène de 50 mL ou une bouteille en verre avec un bouchon hermétiquement fermé), ajoutez de l’eau Milli-Q jusqu’à ce que les billes soient complètement immergées, et conservez à 4 °C pendant jusqu’à 3 mois.

2. Marquage par fluorescence des protéines membranaires

1. Dilution des protéines
   1. Dissoudre la cytochrome_bo3 oxydase à 2,2 mg/mL dans un tampon HEPES de 20 mM contenant 0,05 % de n-dodécyle β-D-maltoside (DDM) (p/v), pH 8,3. Ce pH garantit une fraction suffisante d’amines primaires non protonées (réactives) pour un marquage efficace.
      REMARQUE : Pour un marquage optimal avec les colorants ATTO N-hydroxysuccinimidyl (NHS), maintenez le pH tampon entre 8,3 et 8,5. Pour les autres colorants, suivez les instructions du fabricant concernant la conjugaison des protéines, y compris les conditions d’étiquetage recommandées.
2. Ajout de colorant
   1. Ajoutez un excès huit molaires d’ester N-hydroxysuccinimidyl (NHS) réactif à l’amine, dissous à 2 mg/mL dans du DMSO anhydre, à la solution protéique.
      REMARQUE : Pour les autres colorants, suivez les instructions du fabricant pour la conjugaison des protéines, y compris l’excès molaire recommandé entre colorant et protéine.
   2. Mélangez doucement en tapotant trois fois le tube de la microcentrifugeuse pour assurer une distribution homogène du colorant.
3. Incubation
   1. Incubez le mélange de réaction à température ambiante (20–25 °C) pendant 1,5 h sous une agitation douce (250 tr/min) dans un thermomélangeur, dans l’obscurité pour éviter le photoblanchiment.
4. Élimination du colorant non lié
   1. Équilibrer la colonne Superdex 200 10/300 GL (CV : 23,562 mL) avec au moins 2 volumes de colonnes (environ 48 mL) de tampon d’élution protéique membranaire (20 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,05 % DDM (p/v)) à un débit de 0,3 mL/min en utilisant un système de purification ÄKTA.
      REMARQUE : Pour l’élimination de l’excès de colorant fluorescent, des colonnes de filtration en gel plus courtes (10 à 20 cm de longueur de lit) sont généralement suffisantes, en particulier pour les colorants moins hydrophiles. Le fabricant de colorants recommande de désaler avec une matrice Sephadex G-25. Une colonne Superdex 200 10/300 GL a été utilisée dans cette étude en raison de la disponibilité de l’instrument.
   2. Chargez jusqu’à 500 μL de la protéine marquée à l’aide d’une boucle capillaire de 1 mL et éluvez avec le même tampon à 0,3 mL/min.
   3. Surveillez l’élution en mesurant l’absorption à 280 nm pour les protéines et 643 nm pour le colorant ATTO 643.
   4. Collectez des fractions de 0,5 mL sur 1,5 volume de colonne. Identifiez les fractions contenant à la fois des protéines et des colorants. Utilisez directement si la concentration est suffisante, ou concentrez en utilisant des filtres centrifuges Amicon. Pour la concentration en utilisant des filtres Amicon, utilisez un filtre centrifuge avec une limite moléculaire de 30 kDa et centrifugez à 14 000 × g pendant 30 minutes à 4 °C.
5. Détermination de la concentration en protéines et du degré de marquage (DOL)
   1. Mesurez les spectres d’absorption du conjugué purifié.
   2. Calculez la concentration en protéines et le nombre moyen de molécules de colorant par enzyme en utilisant :
      
      où A_max représente l’absorption du conjugué au maximum d’absorption du colorant (λ_abs ; ATTO 643, λ = 643 nm), A₂₈₀ est l’absorbance à 280 nm (maximum d’absorption des protéines), ε_prot est le coefficient d’extinction molaire de la cytochrome _bo3 oxydase dénaturée (184 720 M⁻¹cm⁻¹), ε_colorant est le coefficient d’extinction molaire du colorant (150 000 M⁻¹cm⁻¹), et CF₂₈₀ est le facteur de correction pour l’absorbance ATTO 643 à 280 nm (0,04).

3. Préparation de grandes vésicules unilamellaires (LUVs)

1. Préparation d’un film polymère fin ou polymère/lipide
   1. Utilisez des pipettes à déplacement positif avec des embouts résistants aux solvants ou des seringues en verre étanche au gaz pour transférer des solutions de polymères, lipides et colorants fluorescents dissous dans du chloroforme :méthanol (2:1, v/v) dans un flacon en verre propre selon les compositions listées au Tableau 1.
      ATTENTION : Effectuez toute la manipulation des solvants sous une hotte à fumée en portant des gants de protection et des lunettes de sécurité.
   2. Mélangez soigneusement la solution en faisant un vortex doux tout en tenant le flacon droit pour assurer l’homogénéité.
      ATTENTION : Ajustez soigneusement la vitesse du vortex pour éviter que le liquide ne s’éclabousse ou ne s’éclabousse de la fiole sur vos mains.
   3. Évaporez les solvants organiques sous un doux jet d’azote dans la hotte pendant environ 1 heure, jusqu’à ce qu’un film uniforme et mince se forme sur la paroi du flacon (Figure 1).
      REMARQUE : Ajustez le débit d’azote pour que le liquide se déplace doucement sans éclaboussures ; Un débit trop élevé peut provoquer une formation irrégulière du film. Après 5 à 10 minutes, le débit peut être légèrement augmenté pour assurer un séchage complet et une étalage uniforme du mélange de vésicules le long du fond du flacon.
2. Réhydratation du film
   1. Réhydratez le film séché avec 1 mL de tampon de réhydratation (1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM de saccharose) pour obtenir une concentration finale d’amphiphiles de 5 mg/mL (correspondant à 1,67 mM pour les polymésomes et 2,14 mM pour les vésicules hybrides). Si des polymésomes sont utilisés pour la reconstitution, compléter le tampon de réhydratation avec du cholate de sodium à 0,1 %.
      ATTENTION : Le cholate de sodium est un irritant léger. Évitez le contact cutané prolongé et l’inhalation de poudre. Manipulez selon la fiche de données de sécurité (SDS) du fabricant.
   2. Vortex vigoureusement jusqu’à ce que le film soit complètement détaché et suspendu, formant des vésicules multilamellaires (MLV).
3. Cycles de gel-dégel (vésicules hybrides uniquement)
   1. Soumettez les suspensions hybrides MLV à cinq cycles de congélation-dégel comme suit : congeler les échantillons dans de l’azote liquide pendant 1 minute, les décongeler dans un bain-marie à 35 °C jusqu’à ce qu’ils soient complètement fondus, puis faire un vortex à 2500–3000 tr/min pendant 30 secondes à l’aide d’un vibrateur tubulaire. Répétez cette procédure pendant un total de cinq cycles.
      REMARQUE : Sauter cette étape pour les polymésomes purs.
      ATTENTION : L’azote liquide (−196 °C) peut provoquer de graves brûlures cryogéniques. Manipulez dans un espace bien ventilé en portant des équipements de protection appropriés (gants cryogéniques, lunettes de sécurité et blouse de laboratoire). Évitez le contact avec la peau et les yeux.
4. Extrusion
   1. Transférez la suspension vésiculaire sur un mini-extrudeur équipé d’une membrane en polycarbonate de 100 nm de pores.
   2. Extrusez la suspension 21 fois pour obtenir des LUV homogènes en taille.
      REMARQUE : Assurez-vous que la dernière étape d’extrusion laisse la suspension LUV dans la seringue, en opposition à la seringue de chargement initiale. Cela minimise la contamination de l’échantillon final par des vésicules plus grandes ou du matériel résiduel qui n’a peut-être pas complètement traversé la membrane.
5. Stockage
   1. Conservez la suspension LUV à 4 °C et utilisez-la dans la semaine pour maintenir la répartition de la taille des vésicules et prévenir l’agrégation ou la croissance microbienne dans le tampon contenant du saccharose.
   2. Avant utilisation, homogénéisez doucement la suspension LUV par vortex.

4. Reconstitution de la protéine membranaire en LUV

1. Prétraitement des vésicules avec un détergent
   1. Transférez 200 μL de LUV dans un tube microcentrifuge de 2 mL (Figure 1). Si vous utilisez des LUV hybrides, ajoutez 1 μL de cholate de sodium à 20 % (p/v) pour obtenir une concentration finale de détergent de 0,1 % (p/v). Si vous utilisez des LUV polymères, aucun détergent supplémentaire n’est nécessaire car le cholate de sodium est déjà présent.
      REMARQUE : Préparez le détergent dans le même tampon utilisé pour les expériences afin d’assurer la compatibilité avec les vésicules.
   2. Mélangez doucement en tapotant légèrement le tube de la microcentrifugeuse trois fois. Évitez l’agitation vigoureuse ou le vortex, qui peut créer de la mousse et introduire des bulles d’air.
2. Introduction des protéines dans les vésicules traitées au détergent
   1. Ajouter la cytochrome bo₃ oxydase (pour les mesures d’activité) ou le cytochrome bo₃ oxydase–ATTO 643 (pour l’imagerie fluorescente) aux vésicules déstabilisées par le détergent afin d’atteindre les concentrations protéiques finales suivantes : pour les polymésomes, 0,556 μM pour les expériences LUV et 1,112 μM pour les expériences GUV ; pour les vésicules hybrides, 0,714 μM pour les expériences LUV et 1,428 μM pour les expériences GUV.
      REMARQUE : Ces concentrations correspondent à un rapport molaire protéine/polymère de 1:3 000 pour les LUV et 1:1 500 pour les GUV.
   2. Ajoutez la protéine lentement tout en mélangeant doucement, dans le but de la répartir uniformément dans la solution et d’éviter une surconcentration locale.
      REMARQUE : Le volume de protéine ajoutée peut varier entre les fractions en raison des différences de concentration dans le stock de protéines.
3. Assemblage de complexes protéine–détergent–polymère
   1. Incubez le mélange à 4 °C pendant 30 minutes avec une légère agitation (400 tr/min) dans un thermomixeur pour permettre la formation d’assemblages mixtes protéine–détergent–polymère avant l’élimination du détergent.
4. Élimination des détergents
   1. Retirez le détergent par ajout séquentiel de Bio-Perles SM-2 (Bio-Rad). Retirez 30 mg de bio-perles de la solution de stockage, en veillant à ce qu’elles restent humides (humides mais sans excès de liquide). Ajoutez les billes à l’échantillon et incubez pendant 30 minutes à 4 °C avec une légère agitation à 600 tr/min dans un thermomixeur. Répétez cette étape deux fois supplémentaires, pour un total de 90 mg de bio-billes et un temps d’incubation total de 1,5 h.
      REMARQUE : N’utilisez que des bio-perles entièrement hydratées. Ne transférez pas de billes sèches, de billes adhérant aux parois du tube d’origine Bio-Beads, ni de billes flottant à la surface. Si les billes adhèrent à la paroi du tube de réaction de reconstitution au-dessus du niveau liquide après l’addition, centrifugez brièvement le tube (par exemple, 3 à 5 s dans une minicentrifugeuse de paillard) pour recueillir les billes au fond avant l’incubation.
   2. Pelletez les bio-perles par centrifugation à 2 000 × g pendant 2 minutes à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillette. Collectez soigneusement le surnageant sans déranger la boule de billes.
      REMARQUE : En alternative à la centrifugation, laissez les billes se déposer par gravité pendant environ 5 minutes, puis retirez soigneusement le surnageant.
5. Stockage
   1. Conservez les _bo-3-LUV reconstitués à 4 °C et utilisez-les le jour même pour mesurer l’activité des protéines.

5. Taille et dispersion des LUV par diffusion dynamique de la lumière (DLS)

1. Chargement des LUV pour les mesures DLS
   1. Transférez 45 μL de suspension LUV ou protéo-LUV non dilué dans une cuvette en quartz propre. Assurez-vous que la cuvette est exempte de poussière, d’empreintes digitales ou d’autres résidus afin de minimiser les artefacts de diffusion de la lumière.
      REMARQUE : Évitez d’introduire des bulles d’air, car elles peuvent interférer avec les mesures du DLS. Pour éviter les bulles, pipettez lentement l’échantillon le long de la paroi de la cuvette et ne jetez pas la dernière goutte de force. Si de petites bulles se forment, laissez-les monter et dissiper avant la mesure.
2. Détermination de la taille et de la dispersion des LUV par DLS
   1. Mesurez le diamètre hydrodynamique et l’indice de polydispersion (PDI) à l’aide d’un instrument DLS équipé d’un laser hélium-néon de 633 nm et d’une détection de rétrodiffusion à un angle fixe de 173°.
   2. Effectuez au moins trois mesures indépendantes par échantillon pour garantir la reproductibilité.
   3. Analysez les données à l’aide du modèle généraliste (distribution normale) pour obtenir la taille moyenne et le PDI.

6. Analyse de la consommation d’oxygène des LUV

1. Configuration de la température
   1. Réglez la chambre de mesure d’un système d’électrodes à oxygène de type Clark à 22 °C et laissez le système s’équilibrer.
2. Ajout de tampon
   1. Ajouter 1 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de tampon de saccharose dans la chambre de mesure pour un volume total de 1 000 μL. Ajuster le volume tampon selon le type d’échantillon : 942,9 μL pour les polymères bo_3-LUV et 953,7 μL pour les hybrides bo_3-LUV.
      REMARQUE : Le volume restant sera occupé par les LUV et le mélange DTT/Q₁ pour atteindre le volume de mesure final.
3. Ajout des LUV
   1. Ajoutez des_bo-3-LUV dans la chambre de mesure et commencez à remuer doucement avec l’agitateur magnétique à 100 tr/min et 22 °C. Ajustez le volume des _bo-3-LUV pour obtenir une concentration théorique de bo 3-oxydase d’environ 27 nM : 48,6 μL pour les polymères bo_3-LUV et 37,8 μL pour les hybrides bo 3-LUVs.
      REMARQUE : Pour le contrôle négatif, remplacer les _BO-3-LUV par un volume équivalent de LUV sans protéines de la même composition lipidique/polymère. Toutes les étapes suivantes restent identiques.
4. Mesure de base
   1. Laissez la concentration d’oxygène se stabiliser et mesurez pendant 3 minutes sous un brassage constant à 22 °C pour obtenir une base stable.
5. Préparation du mélange réducteur/quinone
   1. Préparez fraîchement le mélange DTT/Q₁ juste avant l’utilisation en mélangeant 9,6 μL de 1 M DTT dans de l’eau Milli-Q avec 0,6 μL d’ubiquinone-1 (Q₁) à 80 mM dans le DMSO, puis montez en procédé à un vortex soigneusement pour assurer l’homogénéité.
6. Activation enzymatique
   1. Activez la _bo3 oxydase en ajoutant 8,5 μL du mélange DTT/Q₁ fraîchement préparé dans la chambre de mesure, ce qui donne des concentrations finales de 8 mM DTT et 40 μM Q₁.
7. Réplications
   1. Mesurez chaque échantillon trois fois pour garantir la reproductibilité.
8. Analyse des données
   1. Tracez la concentration d’oxygène en fonction du temps. Déterminez la pente de la portion linéaire de la courbe, qui correspond au taux de consommation d’oxygène.
9. Reportage
   1. Rapportez le taux de consommation d’oxygène en moyenne de trois mesures, avec l’écart-type.

7. Préparation de GUV fonctionnalisés par les protéines

1. Nettoyage plasma des lames en verre recouvertes d’ITO
   1. Placez des lames en verre recouvertes d’oxyde d’indium-étain (ITO) dans le nettoyant plasma avec le côté conducteur (recouvert d’ITO) orienté vers le haut. Le plasma les nettoie pendant 1 minute à un réglage de puissance élevée (« HI ») (230 V, puissance RF maximale 18 W) et à une pression d’environ 0,5 mbar.
      REMARQUE : L’allumage réussi par plasma peut être confirmé visuellement par l’apparition d’une lueur rose/violette à l’intérieur de la chambre.
2. Déshydratation partielle des protéo-LUV
   1. Mélangez 20 μL de LUV sans protéines avec 20 μL de protéo-LUVs contenant de la bo3 oxydase reconstituée-ATTO 643. Un vortex délicat pour assurer un mélange homogène.
   2. Déposez sept gouttelettes de 2 μL de la suspension résultante de 5 mg/mL LUV/protéo-LUV sur la surface conductrice (recouverte d’ITO) de chaque lame utilisée pour l’électroformation (Figure 2A). Répartir les gouttelettes uniformément sur la surface de 160,6^{mm 2} , en les gardant séparées pour favoriser une formation uniforme du film.
      REMARQUE : Pour d’autres systèmes polymères, la concentration de LUV et le volume de gouttelettes peuvent nécessiter une optimisation (plage typique : 5–100 mg/mL LUV ; 0,2–2 μL gouttelettes).
   3. Laissez les gouttelettes partiellement se déshydrater à température ambiante (∼22 °C) et à ∼20 % d’humidité pendant environ 40 minutes, ou jusqu’à ce qu’un anneau blanc se forme au périmètre des gouttelettes (Figure 2B).
      REMARQUE : La déshydratation dépend de l’humidité ambiante. Si l’humidité relative est supérieure à 40 %, prolongez le temps de déshydratation selon les besoins (jusqu’à 20 minutes). Déterminez le point final en fonction de l’apparition d’un anneau blanc au périmètre des gouttelettes plutôt que sur un temps fixe. Dans des conditions environnementales constantes (température et humidité), le temps de déshydratation requis est reproductible. Évitez le sur-séchage, qui se manifeste par des gouttelettes complètement plates et uniformément blanches, car cela peut provoquer une précipitation de protéines.
3. Assemblage de la chambre d’électroformation
   1. Assemblez la chambre d’électroformation en sandwich deux lames recouvertes d’ITO (côtés revêtus orientés vers l’intérieur) séparées par une entretoise en silicone de 1,81 mm d’épaisseur avec une découpe d’un côté, ce qui permet d’ajouter ou de retirer le tampon lors du remplissage et de la collecte.
   2. Remplir la chambre avec un tampon de réhydratation (1 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 200 mM de saccharole).
      Pour les expériences sensibles au pH, ajoutez 10 μM pyranine (8-hydroxypyrène-1,3,6-sel trisodique à l’acide trisulfonique, HPTS) au tampon.
4. Électroformation
   1. Appliquez un champ électrique alternatif sinusoïdal à l’aide du programme suivant : 50 Hz à 50, 100, 200, 300, 500, 700 et 900 mV pendant 6 minutes chacun ; 50 Hz à 1,1 V pendant 2 heures.
      REMARQUE : Pour favoriser la formation de protéo-GUV plus grands, cette étape peut être étendue à 12 h, et à 4 Hz à 2 V pendant 30 minutes pour l’étape de détachement. Lorsque le tampon contient de la pyranine de 10 μM, on augmente la fréquence à 500 Hz lors des deux premières étapes de rampe de tension.
5. Collection de GUV
   1. Ouvrez soigneusement la chambre à l’aide d’une pince à épiler et collectez les GUV à l’aide de pipettes FineTip Ultra-Micro Pastette (ou des pipettes à transfert à faible cisaillement équivalentes) pour minimiser les contraintes mécaniques.
      REMARQUE : Évitez d’utiliser des pointes de pipette standard à faible volume inférieures à 200 μL, car elles peuvent éclater des GUV plus gros. Sinon, des pointes standard peuvent être découpées à l’extrémité pour élargir l’ouverture et réduire le cisaillement lors de la collecte.
6. Stockage
   1. Conservez les protéo-GUV à 4 °C et utilisez-les dans les 48 heures pour préserver l’activité protéique.
      REMARQUE : Le taux de perte d’activité dépend du type et de la stabilité de la protéine membranaire reconstituée, ainsi que de la composition de la membrane.

8. Microscopie des GUV fonctionnalisés par les protéines

1. Installation du microscope
   1. Allume le microscope confocal. Si vous utilisez le système Leica, lancez le logiciel LAS X. Pour d’autres marques de microscopes, utilisez le logiciel d’acquisition recommandé par le fabricant.
   2. Sélectionnez un objectif d’immersion à l’huile de 63× (NA 1,40) ; Ajustez à un grossissement plus élevé ou plus bas si besoin, selon la taille du GUV.
   3. Ouvrir deux canaux d’imagerie correspondant aux fluorophores : Rhodamine Red (membrane) et ATTO 643 (protéine reconstituée).
      REMARQUE : Pour les fluorophores à spectre partiellement chevauché, sélectionnez des raies laser appropriées et des fenêtres de détection étroites afin de minimiser la diaphonie spectrale. Acquérir chaque canal séquentiellement pour éviter la traversée du signal et assurer une quantification précise de la fluorescence.
2. Sédimentation des GUV
   1. Placez un isolateur en silicone press-to-seal sur une gaine de verre propre n°1,5 (épaisseur de 0,17 mm).
      REMARQUE : Pour les microscopes droits (non inversés), des lames en verre plus épaisses peuvent être utilisées.
   2. Pipeter 60 μL de tampon (1 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 200 mM de glucose) au centre de l’espaceur.
   3. Ajoutez doucement 20 μL de suspension GUV au-dessus du tampon.
   4. Couvrez immédiatement la chambre avec une seconde coulisse en verre pour éviter l’évaporation.
   5. Laissez les GUV sédimenter ~5 minutes avant l’imagerie.
3. Acquisition d’images
   1. Concentrez-vous sur le fond de la chambre pour capturer les coupes transversales des GUV.
   2. Acquérir des images de différents GUV dans toute la chambre en scannant systématiquement du coin supérieur gauche au coin inférieur droit (motif « serpent ») pour obtenir une population représentative (~100 GUVs). Imagez toutes les vésicules rencontrées lors du scan sans présélection, quelle que soit leur taille ou leur intensité de fluorescence, afin d’éviter le biais de sélection et d’assurer leur reproductibilité.
      REMARQUE : Évitez les images répétées du même GUV pour éviter le photoblanchiment.
4. Analyse d’images
   1. Quantifiez l’intensité de fluorescence d’une protéine reconstituée marquée par ATTO 643 en traçant une polyligne le long de la membrane des GUV individuels. Lorsque vous utilisez le logiciel LAS X, sélectionnez Quantifier → profil de ligne, puis sélectionnez l’outil polyligne et tracez la membrane de chaque GUV. Pour obtenir l’intensité moyenne de fluorescence, ouvrez Statistiques et enregistrez la valeur moyenne. Analyser uniquement les GUV propres et unilamellaires ; Excluez les vésicules multivésiculaires et les vésicules agrégées de l’analyse.
      REMARQUE : Si les mesures sont prises à des jours différents, les intensités de fluorescence doivent être normalisées à la puissance du laser, mesurée sous des réglages d’imagerie identiques (longueur d’onde et puissance nominale). Pour tenir compte des variations quotidiennes de la puissance du laser, la normalisation suivante est appliquée : , où F_a.u. est l’intensité de fluorescence mesurée en unités arbitraires, la référence P est la puissance laser mesurée le jour de référence, et est la puissance laser mesurée le jour de l’acquisition. Cette correction suppose une relation linéaire entre la puissance du laser et l’intensité de fluorescence en conditions d’éclairage non saturées. Dans la présente étude, toutes les images ont été acquises le même jour, et la normalisation n’était donc pas nécessaire.
   2. Indiquez l’intensité de fluorescence en moyenne de 100 GUV avec l’écart-type correspondant.

9. Analyse du pompage de protons dans les protéo-GUV

1. Installation du microscope
   1. Allumez le microscope confocal et lancez le logiciel d’acquisition approprié (par exemple, LAS X pour les systèmes Leica).
   2. Choisissez un objectif d’immersion à l’huile de 63× (NA 1,40). Ajustez à un grossissement plus élevé ou plus bas si besoin, selon la taille du GUV.
   3. Configurez trois canaux d’imagerie correspondant aux fluorophores. Pour le Rhodamine Red (marqueur membranaire), utilisez une excitation de 561 nm et une plage d’émission de 570 à 620 nm. Pour la pyranine (colorant encapsulé sensible au pH), utilisez des excitations à 448 nm et 405 nm, et collectez les émissions entre 499 et 551 nm.
      REMARQUE : Si un laser de 458 nm est disponible, utilisez-le à la place de 448 nm pour exciter la forme déprotonée (basique) de la pyranine.
   4. Ajustez la puissance du laser et le gain du détecteur pour éviter la saturation des pixels et minimiser le photoblanchiment. Gardez les réglages d’acquisition constants tout au long de l’expérience.
2. Sédimentation des GUV
   1. Ajouter 280 μL de tampon (1 mM Tris-HCl, pH 7,5 ; 200 mM de glucose) dans un puits d’une lame à 8 puits chambrés (volume total du puits : ~874 μL).
      REMARQUE : N’utilisez pas moins de 200 μL, car les volumes inférieurs à 200 μL augmentent l’évaporation et la dérive du pH. Ne pas dépasser 400 μL pour éviter les déversements et garantir une pipetage confortable. Si vous utilisez un format de chambre différent, ajustez le volume en conséquence. Pour les microscopes inversés, utilisez des lames de chambre compatibles avec une épaisseur de couverdisse #1,5H.
   2. Ajoutez doucement 20 μL de suspension _{BO 3-GUV} au-dessus du tampon sans introduire de bulles d’air.
      REMARQUE : Pour le contrôle négatif, remplacer la suspension _{bo 3-GUV} par un volume équivalent (20 μL) de GUV sans protéines de la même composition lipidique/polymère, préparés et sédimentés dans des conditions identiques. Ce contrôle prend en compte tout effet non spécifique de la DTT et de Q₁ sur le rapport de fluorescence de la pyranine, qui sont indépendants de l’activité de la_bo3 oxydase.
   3. Laissez les GUV sédimenter environ 5 minutes avant l’imagerie.
3. Acquisition de base
   1. Concentrez-vous sur le plan inférieur de la chambre où les GUV se sont sédimentés.
   2. Ajustez le zoom pour obtenir 3 à 6 GUV dans le champ de vision.
   3. Enregistrez la fluorescence de base dans tous les canaux pendant 5 minutes avant l’activation.
4. Activation du pompage de protons
   1. Préparez un mélange DTT–Q₁ frais juste avant l’utilisation en mélangeant 4,8 μL de 1 M DTT avec 0,3 μL de 80 mM Q₁ en DMSO, puis mélangez soigneusement par vortex.
   2. Activez la cytochrome bo₃ oxydase en ajoutant doucement 2,6 μL du mélange DTT–Q₁ à la surface de la solution sans insérer la pointe de la pipette dans le tampon, ce qui donne des concentrations finales d’environ 8 mM de DTT et 40 μM de Q₁ dans la chambre.
   3. Surveiller la fluorescence de pyranine intravésiculaire pendant 30 minutes sous acquisition continue.
5. Analyse de la fluorescence de pyranine intravésiculaire
   1. Pour chaque GUV, on définit une région d’intérêt (ROI) au sein de la lumière vésiculaire. Dans le logiciel LAS X, allez dans Quantify → Stack Profile, sélectionnez Dessiner Ellipse, et dessinez un ROI circulaire à l’intérieur de chaque GUV.
   2. Pour déterminer l’intensité moyenne de fluorescence à 499–551 nm pour les deux longueurs d’onde d’excitation (448 nm et 405 nm), ouvrez Statistics dans le logiciel et enregistrez la valeur moyenne.
   3. Calculez le rapport de fluorescence comme R = I₄₄₈/I₄₀₅.
   4. Tracez le rapport dans le temps pour obtenir des traces cinétiques du changement de pH intravésiculaire.

Résultats

La cytochrome _bo3 oxydase d’E. coli a été exprimée à partir du plasmide pETcyo dans la souche E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE et purifiée comme décrit^{précédemment 29}. La bo-3oxydase purifiée a été soit utilisée directement pour la reconstitution et les mesures d’activité, soit marquée avec des colorants fluorescents, tels que l’ATTO 643 (cette étude) ou d’autres colorants ^{ATTO 1,15}. Pour les colorants très hydrophiles comme l’ATTO 643, une colonne de 30 cm a été utilisée pour assurer une séparation efficace du colorant non lié de la protéine marquée (Figure 3A). Le degré de marquage (DOL), calculé à partir des spectres d’absorbance, variait généralement de 1,1 à 1,3 molécules de colorant par enzyme, selon le colorant ATTO utilisé. Pour la bo3 oxydase marquée avec ATTO 643, le DOL était de 1,16 (Figure 3B).

Pour la reconstitution des protéines, les LUV ont d’abord été préparés par réhydratation en film mince, suivis de cycles de gel-dégel et d’extrusion pour obtenir des tailles uniformes de vésicules. Pour les polymésomes, le tampon de réhydratation était complété par un détergent. Les distributions de la taille des vésicules ont été analysées par diffusion dynamique de la lumière avant la reconstitution (Figure 4, Tableau 2). Les LUV hybrides et polymères présentaient généralement des diamètres moyens de 85 à 95 nm avec des distributions de taille étroites (PDI < 0,2). Les vésicules à base de PDMS-g-PEO devraient être légèrement plus petites que la taille nominale des pores de la membrane d’extrusion. Les polymésomes typiques présentaient des tailles très uniformes, avec des valeurs de PDI inférieures à 0,1, tandis que les vésicules hybrides formaient des populations raisonnablement uniformes avec des valeurs de PDI parfois supérieures à 0,1 mais constamment inférieures à 0,2.

La protéine membranaire_bo-3oxydase a ensuite été insérée dans les LUV en présence de détergent (cholate de sodium dans cette étude). Le détergent a ensuite été retiré à l’aide de bio-perles. Après la reconstitution, la taille du polymésome-polymésome n’a augmenté que légèrement (Figure 4A), tandis que la taille des vésicules hybrides est restée inchangée (Figure 4B). Dans les deux systèmes, une légère augmentation de la PDI a été observée (Tableau 2). De tels changements de taille mineurs sont attendus, car la solubilisation et le retrait médiés par le détergent peuvent réorganiser les chaînes polymères dans la membrane. L’activité protéique a été évaluée en mesurant la consommation d’oxygène, ce qui indique si la protéine a conservé une activité fonctionnelle (Figure 5A). L’absence de consommation d’oxygène dans le témoin LUV négatif sans protéines confirme que le signal observé provient spécifiquement de l’activité de la bo 3 oxydase. Avec une reconstitution médiée par le cholate de sodium aux concentrations utilisées ici, l’activité protéique était généralement légèrement plus élevée dans les vésicules hybrides que dans les polymésomes (Figure 5B). Une certaine variabilité de l’activité protéique a été observée entre les lots de purification et même entre les fractions au sein d’un même lot. Par conséquent, pour des études comparatives — comme la comparaison de l’activité des protéines entre différents systèmes membranaires — la même fraction de protéine purifiée doit être utilisée pour garantir la cohérence.

Pour générer des GUV fonctionnés par les protéines PDMS-g-PEO et PDMS-g-PEO/soja PC, une approche fusion-électroformation a été employée. Dans cette méthode, les protéo-LUV étaient mélangés avec des LUV sans protéines et déposés sur des lames en verre recouvertes d’ITO, suivies d’une déshydratation partielle pour favoriser la fusion vésiculaire et la formation d’un film polymère/protéine ou polymère/lipide/protéine. Une déshydratation insuffisante entraînait un faible rendement protéo-GUV, une taille de GUV plus petite et la présence de (protéo-)LUV non fusionnés.

L’intégration réussie de la protéine marquée, bo₃ oxydase–ATTO 643, dans la membrane a été confirmée par microscopie confocale après sédimentation des GUV dans un gradient de densité saccharose/glucose (Figure 6A, B). La quantification de la fluorescence associée à la membrane à l’aide d’un simple profil de raie peut être biaisée, car l’intensité mesurée dépend de l’angle auquel la ligne est tracée. Pour minimiser cet effet, l’intensité de fluorescence a été évaluée à l’aide d’une polyligne tracée le long de tout le contour de membrane de chaque GUV.

Pour évaluer les corrélations possibles entre la taille de la vésicule et l’incorporation des protéines, le diamètre du GUV a été analysé en parallèle (Figure 6C, D). Les GUV plus grands (au-dessus de 20 μm) présentaient généralement une fluorescence protéique associée à la membrane plus faible que les vésicules plus petites. Cette observation peut être attribuée au mécanisme fusion-électroformation : de petites vésicules se forment plus tôt et peuvent incorporer des protéines plus efficacement, tandis que les vésicules plus grandes apparaissent lors d’événements de fusion ultérieurs et de la croissance membranaire, pouvant conduire à une dilution avec un matériau pauvre en protéines.

L’incorporation globale des protéines est principalement déterminée au stade précoce de la reconstitution en LUVs, en particulier selon le type de détergent, la concentration et l’étape à laquelle elle est ajoutée. Pour les LUV polymères, une incorporation légèrement inférieure a été observée lors de l’ajout de détergent sur des vésicules préformées par rapport à l’ajout lors de la formation de la vésicule (étape de réhydratation), donnant des intensités de fluorescence de 18,9 ± 3,9 u. et 20,6 ± 3,7 u., respectivement (Figure 6C, D, à gauche). Pour les systèmes hybrides, où le détergent est ajouté après la formation de la vésicule, la concentration de détergent joue un rôle notable : augmenter le cholate de sodium de 0,015 % à 0,1 % a conduit à une nette augmentation de l’incorporation de protéines (22,1 ± 5,2 u.a. contre 26,2 ± 5,0 u.a., Figure 6C, D, à droite). En comparant les systèmes polymères et hybrides, une incorporation légèrement plus élevée de _bo-3oxydase par membrane a généralement été observée chez les GUV hybrides. Cela est probablement dû à la présence de défauts de remplissage aux interfaces polymère-lipide qui, en plus des défauts induits par le détergent, offrent des sites d’insertion favorables aux protéines membranaires.

En utilisant une seconde étape d’électroformation de 2 h, le diamètre moyen des GUV fonctionnalisés par_{l’oxydase bo 3} était d’environ 14 à 15 μm (13,5 ± 3,7 μm pour les GUV polymères et 15,4 ± 6,3 μm pour les GUV hybrides), bien que des vésicules notablement plus grandes étaient également présentes (Figure 6C, D). L’augmentation de la durée de la deuxième étape d’électroformation à 12 heures a entraîné une augmentation globale de la taille du GUV ^1,27.

Le protocole fusion-électroformation permet également l’encapsulation d’espèces solubles dans l’eau, telles que les colorants sensibles au pH (par exemple, la pyranine), en ajoutant le colorant au tampon de réhydratation lors de l’électroformation (Figure 7A). La taille du GUV diminue généralement lorsque des vésicules se forment en présence de colorants solubles dans l’eau. Pour compenser cet effet, la fréquence lors des premières étapes d’électroformation doit être augmentée de 50 à 500 Hz.

L’encapsulation d’un colorant sensible au pH ratiométrique, tel que la pyranine, permet la surveillance monovésicule du pompage de protons et fournit une perspective sur l’orientation des pompes à protons. Lors de l’acidification de la lumière vésiculaire, le rapport de fluorescence de la pyranine excitée à 448 nm et 405 nm diminue. Ce rapport reflète l’état de protonation de la pyranine et est donc corrélé au pH. Les mesures ratiométriques sont avantageuses, car elles sont largement insensibles aux variations d’efficacité de l’encapsulation des colorants et du photoblanchiment. Un exemple d’activité de pompage de protons est montré à la Figure 7B, où une diminution du rapport de fluorescence de la pyranine intravésiculaire (I₄₄₈/I₄₀₅) est observée dans les GUV hybrides contenant de la bo3oxydase reconstituée suite à l’ajout du DTT donneur d’électrons et du médiateur électronique Q₁. Le rapport de fluorescence commence à diminuer brusquement environ 1 minute après l’activation et continue de diminuer rapidement pendant environ 1 minute, puis ralentit au cours des ~18 minutes suivantes. Ce comportement indique que la majorité des molécules de bo₃ oxydase sont orientées de sorte que le pompage de protons se produit vers l’intérieur des GUV. Les GUV sans protéines soumis à des conditions identiques ont montré une diminution plus faible du rapport de fluorescence, servant de témoin négatif et confirmant que la plus grande diminution observée chez les GUV_bo-3-oxydase provient spécifiquement de l’activité de pompage de protons de la_bo-oxydase plutôt que des effets non spécifiques de la DTT et de Q₁ sur le rapport de fluorescence de la pyranine.

Figure 1. Représentation schématique de la préparation de grandes vésicules unilamellaires (LUV), reconstitution de la protéine membranaire cytochrome bo₃ oxydase en LUVs, et formation de vésicules géantes unilamellaires fonctionnalisées par bo₃ oxydase (GUV) via l’approche fusion-électroformation. Les LUV sont préparés par réhydratation en film mince, cycles de gel-dégel et extrusion à travers une membrane de 100 nm de la taille d’un pore. La reconstitution de la cytochrome bo₃ oxydase est effectuée en présence de détergent, qui est ensuite retiré à l’aide de bio-billes. Les _bo-3-GUV se forment en déposant des_bo-3-LUV sur des lames en verre recouvertes d’oxyde d’indium-étain (ITO), suivies d’une déshydratation partielle et d’une réhydratation en présence d’un courant électrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2. Formation d’un film de grande vésicule unilamellaire (LUV) fusionné par déshydratation. Sept gouttelettes de 2 μL de protéo-LUV et LUV mixtes ont été déposées sur des lames en verre recouvertes d’oxyde d’indium-étain (ITO) : (A) immédiatement après le dépôt et (B) après une déshydratation partielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Marquage fluorescent du cytochrome bo₃ oxydase. (A) Chromatogramme (profil élutionnel) de bo 3 oxydase-ATTO 643 purifié sur une colonne Superdex 200 10/300 GL. Les fractions mises en évidence en gris ont été collectées puis concentrées. (B) Spectres d’absorbance de la bo-3oxyase concentrée-ATTO 643, montrant des pics à 280 nm (protéine), 400 nm (bande de Soret des cofacteurs hème dans la_bo3 oxydase) et 643 nm (colorant). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4. Distributions de taille des grandes vésicules unilamellaires (LUVs) avant et après la reconstitution des protéines : (A) polypoly(diméthylsiloxane)-greffe-poly (oxyde d’éthylène) (PDMS-g-PEO) polymère et (B) vésicules hybrides PDMS-g-PEO/phosphatidylcholine de soja (PC). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5. Consommation d’oxygène par _bo3 oxydase reconstituée dans de grandes vésicules unilamellaires (LUV). (A) Trace représentative de concentration d’oxygène au fil du temps après activation de la cytochrome_bo3 oxydase reconstituée par l’ajout de dithiothréitol (DTT) et d’ubiquinone-1 (Q₁). La trace verte correspond aux LUV reconstitués par des protéines, et la trace grise au contrôle négatif (LUV sans protéines). (B) Taux de consommation d’oxygène (OCR) de _bo3 oxydase reconstituée dans des VVV poly(diméthylsiloxane)-greffe-poly (oxyde d’éthylène) (PDMS-g-PEO) et PDMS-g-PEO/phosphatidylcholine de soja (PC). Les barres représentent la moyenne ± l’écart-type (DE) de trois mesures indépendantes (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6. Insertion de bo-3oxydase marquée fluorescentement dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV). Micrographies représentatives de (A) poly(diméthylsiloxane)-greffe-poly(oxyde d’éthylène) (PDMS-g-PEO) et (B) PDMS-g-PEO/phosphatidylcholine de soja (PC) GUVs (membranes marquées avec phosphatidyléthanolamine-Rhodamine (PE-Rho), rouge) contenant du cytochrome _bo3 oxydase reconstitué (MAGENTA). Quantification de l’intensité de fluorescence de bo₃ oxydase-ATTO 643 en fonction de la taille du GUV (N = 100) pour différentes conditions de reconstitution : (C) ajout de 0,2 % de cholate de sodium (SC) aux grandes vésicules unilamellaires (LUVs) préformées du polymère et de 0,015 % de SC aux LUV hybrides préformés ; (D) des LUV polymères formés en présence de 0,1 % de SC et des LUV hybrides traités avec 0,1 % de SC après formation. Les valeurs représentent l’intensité de fluorescence des GUV individuels (N = 100 par condition). La moyenne ± les valeurs de l’écart-type (DE) sont indiquées dans le texte. Les comparaisons sont descriptives ; aucun test statistique formel n’a été effectué. U.A. (unités arbitraires). Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7. Pompage de protons par _bo-3 oxydase reconstitué dans de grandes vésicules unilamellaires (GUV). (A) Micrographie de fluorescence représentative des GUV poly(diméthylsiloxane)-greffe-poly (oxyde d’éthylène) (PDMS-g-PEO)/phosphatidylcholine de soja (PC), avec membranes marquées à 0,05 % phosphatidyléthanolamine-Rhodamine (PE-Rho, rouge), contenant de la cytochrome _bo3 oxydase reconstituée et une colorante pyranine sensible au pH encapsulée (excitation à 405 et 448 nm ; canaux bleus et verts), sédimentée dans une lame de verre à chambre. (B) Modification du rapport de fluorescence de la pyranine intravésiculaire lors de l’activation avec le dithiothréitol (DTT) et l’ubiquinone-1 (Q₁) dans les GUV de PDMS-g-PEO/soja contenant de la bo-oxydase reconstituée. La trace verte correspond aux GUV reconstitués par une protéine, et la trace grise au témoin négatif (GUV sans protéines). La trace représente la moyenne ± l’écart type (DS) (n = 3 vésicules). Barre d’échelle = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

	Composant	Stock	Montant	Composition finale de la membrane
Polymésomes	PDMS-g-PEO en chloroforme : méthanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	499,9 μL	99,95 mol %
	PE-Rhodamine en chloroforme	1 mg/mL	1,1 μL	0,05 mol %
Vésicules hybrides	PDMS-g-PEO en chloroforme : méthanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	450,1 μL	70 mol %
	Soja PC (95 %) en chloroforme	10 mg/mL	49,8 μL	29,95 mol %
	PE-Rhodamine en chloroforme	1 mg/mL	1,4 μL	0,05 mol %

Tableau 1 : Solutions et volumes de pellicule utilisés pour la préparation de films minces pour la formation de grandes vésicules unilamellaires (LUV). Les concentrations d’origine sont données en mg/mL. Les volumes sont calculés pour une concentration totale de 5 mg/mL d’amphiphiles. La composition finale de la membrane s’exprime en mol %. PDMS-g-PEO : poly(diméthylsiloxane)-greffe-poly (oxyde d’éthylène) ; PE-Rhodamine : phosphatidyléthanolamine-Rhodamine ; soja PC : phosphatidylcholine de soja ; V/V : volume/volume.

	Condition de reconstitution	Diamètre (nm)	PDI
Polymésomes	Avant la reconstitution	84,34 ± 0,22	0.084
	Après la reconstitution	100,73 ± 0,81	0.109
Hybrides	Avant la reconstitution	89,21 ± 0,77	0.129
	Après la reconstitution	85,01 ± 0,42	0.17

Tableau 2 : Taille moyenne des vésicules et indice de polydispersion (PDI) des polymésomes (poly(diméthylsiloxane)-greffe-poly (oxyde d’éthylène), PDMS-g-PEO) et des vésicules hybrides (PDMS-g-PEO/phosphatidylcholine de soja (PC)) avant et après la reconstitution. Les données représentent la moyenne de trois mesures indépendantes.

Discussion

Les polymésomes et les vésicules hybrides polymère/lipide présentent une stabilité chimique et mécanique accrue par rapport aux vésicules lipidiques conventionnelles, ce qui les rend très attrayants pour des applications allant de la délivrance de médicaments et de la biodétection aux nano- et micro-réacteurs et aux cellules artificielles. Cependant, leur architecture membranaire distincte et leurs propriétés biophysiques empêchent souvent le transfert direct de protocoles optimisés pour les vésicules lipidiques vers les systèmes^polymères 15,20,30. Le protocole présenté ici répond à ces différences et offre un flux de travail optimisé pour la reconstitution des protéines membranaires en polymères et LUV hybrides à base de PDMS-g-PEO, suivi d’une mise à l’échelle vers les GUV via électroformation par fusion.

Une étape cruciale du protocole est la préparation de LUV avec une distribution de taille étroite et reproductible. Comme pour les films lipidiques, les films PDMS-g-PEO s’auto-assemblent en vésicules lors de la réhydratation à l’aide d’un tampon aqueux. Contrairement aux systèmes lipidiques, qui produisent fréquemment un mélange de vésicules uni- et multilamellaires, le PDMS-g-PEO forme préférentiellement des structures ^{unilamellaires 1}, éliminant ainsi le besoin de cycles de gel-dégel généralement utilisés pour réduire la multilamellarité dans les préparations lipidiques. L’extrusion est réalisée pour standardiser la distribution de la taille des vésicules. En raison de la douceur accrue des membranes PDMS-g-PEO par rapport aux bicouches^{lipidiques 1}, des pressions d’extrusion plus faibles sont suffisantes. Bien que les 11 passes d’extrusion recommandées par le fabricant soient généralement suffisantes, augmenter le nombre de passes entraîne généralement une distribution de taille plus étroite et une meilleure reproductibilité. Cependant, une extrusion excessive peut produire des vésicules légèrement plus petites que la taille nominale des pores de la membrane. L’extrusion répétée peut également réduire le rendement des vésicules en raison de la perte de matériau ; nous avions précédemment déterminé qu’environ 31 % du matériau vésiculaire PDMS-g-PEO et 25 % du PDMS-g-PEO/vésicule PC soja avaient été perdus après 21 passages à travers une membrane¹ de 100 nm. Par conséquent, le nombre de passes d’extrusion doit être optimisé pour équilibrer l’uniformité de la taille avec l’intégrité et le rendement de la vésicule.

La reconstitution médiée par un détergent représente un autre facteur crucial du succès. Le type et la concentration optimaux de détergent dépendent à la fois de la protéine membranaire spécifique et de la composition^{membranaire 3,20}. Dans le cas des membranes polymères pures, lorsque les conditions de saturation sont optimales, incorporer du détergent lors de la réhydratation du film permet des efficacités d’insertion supérieures à celles des vésicules préformées saturantes. Les membranes polymères plus rigides, comme celles formées à partir de PBD-b-PEO, nécessitent des concentrations de détergent nettement plus élevées pour la solubilisation^{membranaire 30}, soulignant la nécessité d’une optimisation spécifique au polymère. La réussite de l’insertion doit être vérifiée non seulement par des mesures d’activité — comparées aux micelles de détergent ou aux vésicules lipidiques — mais aussi par une analyse structurelle, telle que la cryo-TEM, afin d’évaluer la profondeur d’insertion et l’adaptation de la membrane au désajustement^{hydrophobe 1}. L’orientation des protéines est tout aussi cruciale, en particulier pour les pompes à protons, car un gradient fonctionnel de protons exige que la plupart des pompes soient uniformément orientées. Idéalement, les pompes devraient transporter les protons vers l’intérieur afin de permettre le couplage avec des processus consommant du gradient, tels que la synthèse^{d’ATP 3,15}. L’orientation peut être évaluée à l’aide de marqueurs protéiques, par exemple en trempant sélectivement les colorants exposés à l’extérieur de la vésicule ou en déplaçant des marquants fluorescents attachés aux étiquettes^{Him 20}. Ces approches sont présentées comme des recommandations générales pour l’optimisation des protocoles et n’ont pas été réalisées dans cette étude.

La scale des protéo-LUV aux protéo-GUV utilisant l’électroformation par fusion nécessite un contrôle attentif des paramètres de dépôt et de déshydratation. La concentration de LUV et la taille des gouttelettes influencent de manière critique le rendement final et la pureté du GUV. Des concentrations excessivement élevées de VVV (≥10 mg/mL) peuvent entraîner la présence de VVV non fusionnés dans l’échantillon final, tandis que des concentrations trop faibles (<5 mg/mL) réduisent le rendement en GUV en raison d’un matériau déposé insuffisant. La déshydratation doit être partielle plutôt que complète — indiquée par l’apparition d’un anneau blanc au périmètre des gouttelettes plutôt que d’une gouttelette entièrement blanche — car une déshydratation excessive peut altuer ou abolir l’activité des protéines membranaires, en particulier pour les pompes à protons. Une humidité et une température contrôlées sont donc essentielles pour déstabiliser suffisamment les membranes en vue de la fusion tout en préservant la fonctionnalité des protéines.

Des charges protéiques élevées peuvent diminuer la taille des GUV, mais cet effet peut être atténué en diluant les LUV fonctionnalisés par les protéines par des LUV sans protéines. De cette manière, la densité protéique dans les membranes GUV peut être modulée précisément avant le dépôt. Par exemple, le mélange de BO_3-LUV fortement chargés avec des LUV vides (jusqu’à 1:10, v/v) produit des GUV de diamètre de 5 à 30 μm et une teneur en protéines ajustable tout en maintenant une distribution membranaire^{uniforme de 27}. Bien que cette stratégie aboutisse à des populations de vésicules hétérogènes en termes de densité protéique, les procédures d’étalonnage permettent une évaluation quantitative des niveaux^{d’incorporation 23,31}. Il est important de noter que l’approche de mélange permet une charge globale plus élevée en protéines sans réduction excessive de la taille de^{GUV 27}.

L’analyse fonctionnelle des protéines reconstituées peut être réalisée en encapsulant des colorants sensibles au pH tels que la pyranine dans le tampon d’électroformation afin de surveiller les variations de pH intravésiculaires. Pour une imagerie en direct fiable, les vésicules doivent sédimenter ou être immobilisées pour empêcher le mouvement, ce qui brouillerait les signaux de fluorescence et entraverait la quantification précise de la dynamique du pH intravésiculaire. L’immobilisation par couplage biotine–streptavidine à l’aide de lipides biotinylés et de surfaces recouvertes de^{streptavidine 32} assure une attache stable mais peut modifier la composition ou la tension de la membrane. La semi-immobilisation dans les pièges microfluidiques offre une alternative qui évite les composants membranaires supplémentaires et minimise la^{perturbation 1,33}. Bien que des mesures de fluorescence en vrac soient possibles après l’élimination du colorant externe par sédimentation répétée et échange tampon, le colorant résiduel associé à la membrane peut interférer avec la lecture ; par conséquent, la microscopie confocale des GUV simples est généralement préférée.

Comparée aux approches alternatives qui tentent d’insérer directement des protéines dans des GUV préformés, la stratégie fusion-électroformation permet une optimisation indépendante des conditions de reconstitution au niveau des LUV avant de passer aux GUV. Ce flux de travail modulaire améliore la reproductibilité et le rendement fonctionnel, en particulier pour les membranes polymères et hybrides moins adaptées aux protocoles conventionnels à base de lipides. La méthode est compatible avec une large gamme de protéines^{membranaires 1}, y compris les systèmes^{multi-protéiniques 15}, et permet la fonctionnisation membranaire ainsi que la co-encapsulation de composants supplémentaires. À ce titre, il offre une plateforme polyvalente pour construire des cellules artificielles durables, des micro-réacteurs et des systèmes modèles pour étudier les interactions polymère-protéine dans des conditions contrôlées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600