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Article de méthode

Fabrication d'un dispositif d'organe sur puce de complexe dentine-pulpe empilé verticalement utilisant un disque de dentine humaine

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DOI :

10.3791/71713

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14 août 2026

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1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

Dans cet article

Résumé

Décrire la fabrication et l'assemblage d'un dispositif organe-sur-puce en empilement vertical du complexe dentine-pulpe, intégrant un disque de dentine humaine et des microcanaux fabriqués par photolithographie, suivi de l'ensemencement et de la culture de cellules souches de la pulpe dentaire.

Résumé

Les modèles précliniques classiques utilisés en recherche dentaire, notamment les modèles animaux et les cultures cellulaires statiques, présentent d'importantes limites pour reproduire les conditions physiologiques de l'interface dentine-pulpe et prédire les réponses biologiques humaines aux biomatériaux dentaires. La technologie organe-sur-puce (OoC) offre une approche alternative en permettant la reconstitution de microenvironnements spécifiques aux tissus au sein de systèmes microfluidiques contrôlés. Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la fabrication et l'assemblage d'un dispositif OoC de complexe dentine-pulpe intégrant un disque de dentine humaine dans une plateforme microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS) à trois couches. Le protocole comprend la préparation du disque de dentine, la fabrication de moules microstructurés par photolithographie, la coulée et la polymérisation du PDMS, la liaison des couches assistée par plasma, l'assemblage du dispositif, le test d'étanchéité et l'ensemencement de cellules souches de la pulpe dentaire en conditions de culture statique. Les paramètres critiques de fabrication influant sur les performances du dispositif sont discutés, notamment le contrôle de l'épaisseur des couches de PDMS, le traitement de surface par plasma et l'intégration du disque de dentine dans le dispositif afin de minimiser les fuites. L'adhérence cellulaire et la viabilité dans le dispositif ont été évaluées par microscopie électronique à balayage et coloration en direct/mort en confocal. Des résultats représentatifs démontrent l'intégration réussie du disque de dentine dans l'assemblage microfluidique, le maintien de conditions étanches et l'adhérence de cellules souches de la pulpe dentaire viables à la surface de la dentine. Ce protocole fournit une méthode reproductible pour la fabrication d'une plateforme OoC de complexe dentine-pulpe qui pourrait soutenir des études futures sur les réponses cellulaires aux biomatériaux dentaires et aux stimuli microenvironnementaux.

Introduction

L'expérimentation animale a longtemps joué un rôle essentiel dans l'avancement de la compréhension des processus pathologiques et physiologiques et a occupé une place centrale dans les premières étapes du développement pharmaceutique.1Au cours du XXe siècle, l'espérance de vie humaine a augmenté sensiblement, et bien qu'il soit impossible de quantifier précisément dans quelle mesure cette amélioration est uniquement attribuable à la recherche animale, il est largement reconnu que de nombreux traitements médicaux contemporains ont été mis au point ou validés à l'aide de modèles animaux.2. Des exemples notables incluent le développement de vaccins contre la poliomyélite, la rougeole et l'hépatite B, l'évaluation de la sécurité et de l'efficacité de la pénicilline, ainsi que la production d'insuline. Dans le domaine de la recherche en odontologie et en biomatériaux, ces modèles ont été essentiels pour étudier le processus de carie, la biologie et la régénération du complexe dentine-pulpe, ainsi que la physiopathologie des tissus parodontaux.3,4.

Malgré l'utilisation extensive de ces méthodologies, le processus actuel de développement de médicaments continue d'afficher des taux d'échec élevés, de nombreux candidats-médicaments échouant lors des essais cliniques malgré une efficacité et une sécurité démontrées dans des contextes précliniques en laboratoire et sur des modèles animaux5. Cette divergence a été associée à des différences interspécifiques qui peuvent limiter la prévisibilité translationnelle des modèles animaux en raison de différences anatomiques, génétiques et physiologiques entre les espèces6. De plus, le développement de nouvelles approches thérapeutiques reste long et coûteux7. Par ailleurs, les modèles conventionnels in vitro utilisent principalement des cultures monocouches simples en deux dimensions (2D) sur des substrats plastiques non physiologiques, ce qui ne permet pas de reproduire les signaux biochimiques et physiques, les interactions entre cellules et la signalisation par la matrice extracellulaire (ECM) présents dans la cavité buccale humaine8,9. Bien que les modèles 2D offrent certains avantages expérimentaux, ils sont fondamentalement incapables de reproduire les interactions complexes qui se produisent simultanément entre plusieurs composants, tels que les biofilms, les biomatériaux, la dentine et les cellules de la pulpe10. En conséquence, l'intérêt croissant se porte sur le développement de plateformes expérimentales alternatives capables de reproduire plus fidèlement les réponses biologiques humaines. En 2022, la FDA Modernization Act 2.0 a supprimé l'exigence obligatoire de tests sur des animaux dans le processus d'approbation des médicaments et a reconnu l'utilisation potentielle de plateformes alternatives, notamment les technologies d'organes-sur-puce (OoC), dans la recherche préclinique11.

Un organe-sur-puce (OoC) est un dispositif microfluidique conçu pour reproduire la structure, la fonction et le microenvironnement d'un organe ou d'un composant tissulaire spécifique12. Ces dispositifs sont peuplés de cellules et de tissus vivants cultivés au sein de microcanaux conçus pour recréer des aspects clés du microenvironnement physiologique auquel les cellules sont naturellement exposées. Au-delà de la mimique structurelle, les microcanaux permettent un contrôle spatiotemporel de l’environnement cellulaire et soutiennent le maintien de fonctions spécifiques aux tissus, offrant ainsi des conditions expérimentales pouvant mieux refléter la physiologie in vivo que les systèmes de culture conventionnels12. Particulièrement pertinent, le flux contrôlé de milieu de culture dans les microcanaux des dispositifs OoC exerce un stress de cisaillement sur les cellules résidentes13. Ces stimuli mécaniques influencent les réponses cellulaires, notamment l’adhésion, la prolifération, la migration, l’expression génique et les interactions entre cellules14,15. En outre, le flux continu de milieu contribue au maintien du microenvironnement par l’apport de nutriments et l’élimination des déchets métaboliques16. De plus, par rapport aux cultures conventionnelles en 2D, certaines plates-formes OoC ont permis un meilleur contrôle des paramètres liés au stress oxydatif, tels que les espèces réactives de l’oxygène intracellulaires et la viabilité cellulaire, dans des modèles tridimensionnels (3D) intégrés sur puce17. Les systèmes OoC se sont donc imposés comme des plates-formes prometteuses pour l’étude de la physiologie tissulaire, des interactions biomatériaux-tissus et des processus pathologiques dans des conditions expérimentales contrôlées18. En recherche dentaire, la technologie OoC a été progressivement appliquée pour modéliser des interfaces tissulaires orales de plus en plus complexes19. Les premières plates-formes « dent-sur-puce » reproduisaient l’interface biomatériau-dentine-pulpe20, tandis que des versions plus avancées ont depuis intégré une vascularisation et une innervation trigéminale afin de reproduire plus fidèlement la complexité structurelle et fonctionnelle du complexe pulpo-dentinaire21. Au-delà de la pulpe, des modèles 3D de canaux radiculaires immatures ont permis d’évaluer les irriguants endodontiques et la formation de bourgeons angiogéniques sur des cellules souches de la papille apicale22,23. Au niveau parodontal, des plates-formes « gencive-sur-puce » ont été utilisées pour étudier les interactions hôte-microbe et évaluer le potentiel immunomodulateur des probiotiques en tant qu’agents thérapeutiques24, tandis que des dispositifs « ligament parodontal-sur-puce » ont montré comment le flux de liquide interstitiel module la formation de réseaux vasculaires et la différenciation ostéogénique des sphéroïdes de cellules souches du ligament parodontal25,26. En complément de ces modèles, des systèmes spécialisés « muqueuse orale-sur-puce » et « implant dentaire-sur-puce » ont encore élargi le champ de la recherche microfluidique dentaire en caractérisant les interactions hôte-matériau et la cytotoxicité des monomères dentaires dans des conditions physiologiquement pertinentes27,28.

Bien que les systèmes Organe-sur-puce (OoC) soient de plus en plus utilisés dans la recherche dentaire, buccale et craniofaciale, des efforts continus visant à standardiser et à assurer la reproductibilité des protocoles de fabrication restent essentiels. Plusieurs modèles de dent-sur-puce ont été décrits dans la littérature20,29,30,31, illustrant différentes configurations d'appareils et applications expérimentales. Toutefois, les variations concernant l'architecture des dispositifs, les méthodes de fabrication, l'intégration de la dentine et la description des paramètres expérimentaux peuvent limiter la reproductibilité et la comparaison directe entre études. En particulier, les différences de géométrie des microcanaux, de stratégies d'intégration de la dentine et d'approches de fabrication peuvent influencer le microenvironnement biologique et mécanique au sein du dispositif. Certains modèles rapportés intègrent de la dentine afin de reproduire certains aspects de l'interface dentine-pulpe20,29,30, tandis que d'autres utilisent des configurations alternatives31. De plus, les méthodes de fabrication telles que la photolithographie, la découpe laser, la microfraisage et l'impression 3D présentent chacune des avantages et des limites spécifiques selon la conception et l'application visées du dispositif. Par ailleurs, un facteur déterminant pour l'utilité biologique est l'orientation architecturale du dispositif, notamment le fait que les canaux et la tranche de dentine soient disposés selon une configuration horizontale ou verticale19,32. Dans les configurations empilées horizontalement, les compartiments disposés côte à côte facilitent la compartimentation latérale et la visualisation en temps réel des cellules, ce qui les rend particulièrement adaptées à la modélisation de tissus présentant une organisation spatiale latérale intrinsèque, comme le complexe parodontal24,32. Toutefois, cette conception présente une limitation inhérente quant à sa capacité à recréer des interfaces biologiques perpendiculaires, telles que le complexe biomatériau-dentine-pulpe, car l'agencement latéral des compartiments ne reproduit pas fidèlement l'orientation in vivo de la barrière dentinaire entre la cavité et la pulpe20,32. Les configurations empilées verticalement permettent de surmonter ces limitations en superposant deux compartiments selon l'axe y, séparés par une tranche de dentine native, ce qui permet de quantifier simultanément le transport moléculaire à travers la dentine intacte et de surveiller en temps réel les réponses des cellules de la pulpe mesurées dans le milieu de sortie30. Cependant, une limite reconnue de cette orientation concerne l'imagerie en coupe de l'interface dentine-cellules, car l'acquisition d'images en coupe de cette interface dans un même plan focal reste techniquement plus difficile que dans les configurations empilées horizontalement, où les cellules et les matrices extracellulaires sont disposées latéralement. Bien que plusieurs modèles de complexe dentine-pulpe-sur-puce aient été rapportés dans la littérature, la majorité adoptent une configuration empilée horizontalement, dans laquelle les compartiments sont disposés côte à côte dans un même plan10,20,21,29, tandis que peu nombreux sont ceux qui ont intégré une tranche de dentine native dans une configuration empilée verticalement30. Néanmoins, les variations des approches de fabrication et des paramètres rapportés entre ces modèles continuent de limiter la reproductibilité et les comparaisons inter-études33. Le présent manuscrit vise à améliorer la reproductibilité méthodologique en fournissant un protocole détaillé de fabrication d'un dispositif dent-sur-puce à configuration verticalement empilée, facilitant ainsi une adoption plus large de cette plateforme au sein de la communauté de recherche dentaire.

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape de fabrication et d'assemblage d'un dispositif Organe-sur-puce (OoC) du complexe dentine-pulpe, empilé verticalement, intégrant un disque de dentine humaine au sein d'une plateforme microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS) à trois couches, fabriquée à l'aide d'un moule obtenu par photolithographie. Le protocole décrit également l'ensemencement et la culture de cellules souches de la pulpe dentaire dans le dispositif dans des conditions statiques.

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Protocole

L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki et approuvée par le Comité d'éthique de l'Universidad de La Frontera pour les études impliquant des échantillons humains.

1. Obtention du disque de dentine

REMARQUE : Préparez la conception du dispositif avant de commencer le protocole (Figure 1A–1C).

  1. Prélèvement et stockage des dents
    1. Prélevez des molaires ou prémolaires humaines saines après avoir obtenu le consentement éclairé du patient.
    2. Conservez tous les échantillons dans une solution de chloramine à 0,5 % à 4 °C afin d'éviter la déshydratation de la dentine et la dénaturation des protéines.
    3. Renouvelez la solution de chloramine une fois par semaine pendant le stockage.
  2. Préparation des disques de dentine
    1. Sectionnez chaque dent horizontalement au tiers moyen de la couronne à l’aide d’une contre-angle à haute vitesse fonctionnant à 350 000 tr/min, équipée d’une fraise cylindrique en diamant (diamètre de 1 mm ; granulométrie de 100 à 150 µm).
    2. Effectuez la section sous irrigation continue d’eau à environ 50 mL/min.
    3. Positionnez la section au tiers moyen de la couronne afin d’éviter la chambre pulpaire et l’émail présent au niveau des sillons et fissures occlusaux, obtenant ainsi un disque composé principalement de tissu dentinaire.
      ATTENTION : Effectuez la section des dents sous irrigation continue et portez des équipements de protection individuelle appropriés, y compris des gants, un masque et une protection oculaire.
  3. Finition des disques de dentine
    1. Polissez le disque de dentine à l’aide de disques de finition de granulométrie décroissante.
    2. Poursuivez le polissage jusqu’à obtenir une épaisseur finale de dentine d’environ 0,8 mm (±± 0,3 mm) et des dimensions latérales d’environ 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Figure 1D).
  4. Stockage des disques de dentine
    1. Conservez les disques de dentine préparés dans une solution de chloramine à 0,5 % à 4 °C jusqu’au montage du dispositif OoC.

Schéma d'assemblage du dispositif microfluidique ; étapes de fabrication avec pincettes, outil de perforation, canaux liquides.
Figure 1 : Conception et flux de fabrication du dispositif organe-sur-puce (OoC) du complexe dentine-pulpe. (A) Conception tridimensionnelle du dispositif montrant l'architecture à trois couches. (B) Vue de dessus du dispositif avec les dimensions principales. (C) Vue latérale de la configuration du dispositif à trois couches. (D) Disque représentatif de dentine préparé avec une épaisseur approximative de 0,8 mm et des dimensions latérales d’environ 5 mm × 5 mm. (E) Moule-maître en silicium fabriqué par photolithographie et utilisé pour le moulage des couches supérieure et inférieure en polydiméthylsiloxane (PDMS). (F) Démoulage d'une couche de PDMS polymérisée à partir du moule en silicium après polymérisation thermique. (G) Traitement plasma de la surface du PDMS avant l'assemblage des couches. (H) Dispositif OoC final à trois couches du complexe dentine-pulpe assemblé par liaison plasma et intégrant l'interface de dentine. (I) Dispositif assemblé relié à des tubulures pour un test d'étanchéité et préparé pour des expériences microfluidiques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

2. Fabrication du dispositif Organe-sur-puce du complexe dentine-pulpe

  1. Préparation de l'espace de travail et des matériaux
    1. Préparer les matériaux et l'équipement
      1. Préparer tous les matériaux et équipements répertoriés dans le Tableau des matériaux avant de commencer la fabrication du dispositif.
      2. Préparer les poinçons biopsiques avant l'assemblage du dispositif.
      3. Effectuer toutes les procédures de fabrication dans un environnement propre et exempt de poussière.
      4. Porter des gants, des lunettes de protection et des équipements de protection individuelle appropriés tout au long de la fabrication et de l'assemblage du dispositif.
        NOTE : Préparer le moule fabriqué par photolithographie avant de commencer le protocole (Figure 1E).
  2. Fabrication du moule microstructuré
    1. Préparation de la plaquette de silicium
      1. Fabriquer le moule sur une plaquette de silicium polie sur une seule face de 4 pouces (type N, dopée à l'arsenic, méthode de croissance CZ, orientation <100>, épaisseur de 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, résistivité de 0,001 à 0,005 Ω·cm).
      2. Nettoyer la plaquette successivement dans de l'acétone, de l'isopropanol et de l'eau ultrapure pendant 10 min chacun sous ultrasons.
      3. Sécher la plaquette à l'air comprimé.
      4. Faire cuire la plaquette à 200°C pendant 10 min sur une plaque chauffante afin d'éliminer l'humidité résiduelle.
      5. Laisser refroidir la plaquette à température ambiante (TA ; 20°C–25°C).
    2. Activation de surface et dépôt de la résine photosensible
      1. Activer la surface de la plaquette de silicium à l'aide d'un nettoyeur à plasma sous vide, en utilisant un plasma d'air à niveau 7 pendant 120 s.
      2. Appliquer la résine photosensible négative à base d'époxy GM 1060 par centrifugation à 300 tr/min pendant 10 s.
      3. Poursuivre la centrifugation à 565 tr/min pendant 100 s et à 965 tr/min pendant 1 s, avec une accélération de 200 tr/min/s.
      4. Laisser reposer la plaquette recouverte pendant 10 min.
      5. Effectuer un pré-recuit à 65°C pendant 10 min.
      6. Poursuivre le pré-recuit à 95°C pendant 1 h.
      7. Laisser refroidir la plaquette à TA.
    3. Exposition et développement
      1. Exposer la résine photosensible à l'aide d'un système de lithographie laser directe à une dose de 1 950 mJ/cm2.
      2. Effectuer un post-recuit à 65°C pendant 10 min.
      3. Poursuivre le post-recuit à 95°C pendant 30 min.
      4. Laisser refroidir la plaquette à TA.
      5. Laisser reposer la plaquette pendant 10 min.
      6. Développer le motif dans du PGMEA pendant 4 min.
      7. Étendre le développement par intervalles de 30 s si de la résine photosensible résiduelle persiste.
      8. Arrêter le développement en rinçant avec de l'isopropanol.
      9. Sécher la plaquette à l'air comprimé.
    4. Recuit dur
      1. Effectuer un recuit dur à 135°C pendant 2 h.
      2. Obtenir un moule maître microstructuré contenant des microcanaux mesurant 1 mm de largeur et 50 µm de hauteur.
  3. Préparation et dégazage du mélange PDMS
    1. Préparation du mélange PDMS
      1. Mélanger la base PDMS et l'agent de réticulation dans un rapport massique de 10:1.
      2. Agiter manuellement le mélange avec une tige en verre dans un bécher en plastique pendant environ 5 min.
      3. Conserver des mouvements circulaires lents et continus pendant le mélange.
        NOTE : Éviter d'introduire des bulles d'air pendant le mélange.
    2. Dégazage
      1. Placer le mélange PDMS dans un dessiccateur sous vide relié à une pompe à vide.
      2. Dégazer le mélange à environ 700 mmHg pendant 5 min.
      3. Relâcher brièvement le vide pour permettre l'éclatement des bulles en surface.
      4. Réappliquer le vide.
      5. Répéter le cycle jusqu'à ce qu'aucune bulle visible ne subsiste.
        NOTE : La durée totale de dégazage est généralement d'environ 30 min.
  4. Écoulement du PDMS sur le moule
    1. Préparation du moule
      1. Placer le moule sur une surface plane.
      2. Nettoyer le moule à l'air comprimé.
      3. Éviter tout contact direct avec la surface structurée.
      4. Vérifier que le moule est exempt de poussière et de contaminants.
    2. Distribution du PDMS
      1. Distribuer environ 8 g de PDMS autour du disque de dentine pour fabriquer la couche d'encapsulation de la dentine.
      2. Régler la hauteur du PDMS pour qu'elle corresponde à l'épaisseur du disque de dentine (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Éviter que le PDMS ne recouvre la surface de la dentine.
      4. Distribuer environ 0,26 g de PDMS par unité de moule pour fabriquer chaque couche de microcanaux.
      5. Taper doucement sur le moule ou appliquer une vibration pour faciliter le remplissage des microstructures.
      6. Laisser le PDMS s'installer dans les plus petits détails.
      7. Couvrir le moule avec un couvercle ou une plaque plane sans toucher la surface du PDMS.
        NOTE : La couche d'encapsulation de la dentine a une épaisseur d'environ 0,8 mm, et chaque couche de microcanaux a une épaisseur d'environ 0,4 mm, ce qui donne une épaisseur totale du dispositif d'environ 1,6 mm.
        NOTE : Ajuster l'épaisseur des couches en fonction de la distance de travail de l'objectif confocal lorsque l'imagerie confocale est prévue.
  5. Recuit
    1. Placer les moules dans un four à 50°C.
    2. Recuire le PDMS pendant 4 h.
  6. Retrait des couches de PDMS
    1. Retrait du PDMS durci
      1. Détacher soigneusement les couches de PDMS durcies du moule (Figure 1F).
      2. Manipuler les couches de PDMS avec précaution pour éviter d'endommager les microstructures.
  7. Assemblage des couches de PDMS et fabrication des orifices d'entrée et de sortie
    1. Fabrication des orifices d'entrée et de sortie
      1. Réaliser des perforations aux emplacements désignés d'entrée et de sortie à l'aide d'un poinçon biopsique de 1 mm.
      2. Positionner la face microcanaux vers le haut pendant la perforation.
        NOTE : Placer la couche de PDMS sur un tapis de découpe pour éviter tout dommage structurel.
      3. Réaliser deux perforations dans la couche supérieure correspondant au microcanal supérieur.
    2. Nettoyage des couches de PDMS
      1. Nettoyer les couches de PDMS à l'aide d'alcool isopropylique ou d'éthanol.
      2. Éliminer les particules de poussière résiduelles à l'aide d'un ruban adhésif stérile.
      3. Vérifier que toutes les surfaces d'assemblage sont exemptes de contaminants avant l'assemblage.
    3. Activation plasma des surfaces de PDMS
      1. Positionner les couches de PDMS supérieure et intermédiaire pour le traitement au plasma (Figure 1G).
      2. Activer les surfaces à l'aide d'un appareil de traitement au corona portable fonctionnant à environ 25 W, avec de l'air ambiant comme gaz de travail.
      3. Conserver une distance de travail d'environ 1 mm entre la source de plasma et la surface de PDMS.
        CAUTION : Effectuer le traitement au plasma sous une ventilation adéquate et éviter toute exposition directe à l'ozone généré par le plasma.
      4. Activer l'appareil de traitement au plasma et laisser stabiliser pendant 5 s.
      5. Vérifier la génération d'un faisceau de plasma uniforme avant le traitement.
      6. Traiter la couche supérieure de PDMS pendant 10 s en effectuant un mouvement continu d'avant en arrière à environ 5 mm/s.
      7. Traiter la couche intermédiaire de PDMS pendant 10 s en utilisant le même mouvement et la même distance.
      8. Appliquer un traitement plasma supplémentaire de 1 s sur la couche supérieure immédiatement avant l'assemblage.
    4. Assemblage des couches supérieure et intermédiaire
      1. Aligner le microcanal supérieur avec le disque de dentine immédiatement après le traitement au plasma.
      2. Assembler les couches supérieure et intermédiaire.
      3. Placer l'assemblage collé dans un four à 75°C pendant 5 min.
      4. Consolider la liaison pendant l'incubation.
        NOTE : Le disque de dentine et le microcanal sont visibles à l'œil nu et peuvent être alignés sans outils d'alignement supplémentaires.
    5. Fabrication des orifices du microcanal inférieur
      1. Perforer deux orifices correspondant au microcanal inférieur à travers les couches supérieure et intermédiaire assemblées.
      2. Effectuer la perforation à travers les deux couches simultanément pour assurer l'alignement.
        NOTE : Cette procédure crée quatre perforations dans la couche supérieure et deux perforations dans la couche intermédiaire.
      3. Placer l'assemblage collé sur un tapis de découpe rigide avant la perforation.
      4. Appliquer une pression descendante constante en un seul mouvement.
        NOTE : Éviter les forces rotatives ou latérales afin de minimiser le risque de délaminage.
      5. Éliminer les débris des sites de perforation à l'aide d'une gaze stérile sans peluches humidifiée avec de l'alcool isopropylique.
      6. Inspecter les perforations et les zones assemblées environnantes sous un éclairage adéquat.
      7. Vérifier l'absence de délaminage, de déchirures ou de perforations incomplètes avant de poursuivre.
    6. Assemblage de la couche inférieure
      1. Effectuer le traitement plasma de la couche inférieure comme décrit à l'étape 2.7.4.
      2. Aligner les orifices d'entrée et de sortie du microcanal inférieur avec les perforations des couches supérieure et intermédiaire.
      3. Assembler la couche inférieure pour terminer l'assemblage du dispositif.
        NOTE : Marquer les emplacements d'entrée et de sortie sur la surface externe de la couche inférieure avant l'assemblage afin de faciliter l'alignement.
        NOTE : Les chambres à plasma peuvent offrir une liaison plus forte que les stylos à plasma, comme indiqué dans la littérature36.
        NOTE : Le dispositif terminé consiste en une plateforme microfluidique à trois couches intégrant une interface de dentine (Figure 1H). La surface inférieure de la dentine représente le côté pulpaire du modèle, tandis que la surface supérieure de la dentine représente le côté coronal exposé aux biomatériaux dentaires ou aux préparations bactériennes.
  8. Test d'étanchéité du dispositif microfluidique
    1. Inspection du dispositif assemblé
      1. Inspecter le dispositif assemblé pour détecter tout désalignement.
      2. Inspecter l'assemblage pour détecter un collage incomplet ou des fuites visibles.
    2. Test d'étanchéité
      1. Connecter des aiguilles Luer-lock 19G aux orifices d'entrée (Figure 1E).
      2. Connecter les aiguilles aux tubulures de la pompe microfluidique.
      3. Enfoncer doucement les embouts des aiguilles dans les orifices percés pour obtenir un joint étanche.
      4. Injecter du PBS stérile ou du milieu de culture à un débit de 10 µL/min.
      5. Maintenir l'écoulement du fluide pendant au moins 5 min.
      6. Inspecter toutes les interfaces collées, les bords des canaux et les limites du disque de dentine pendant l'écoulement.
      7. Observer le dispositif sous un éclairage adéquat pendant et après l'injection.
      8. Confirmer l'absence d'accumulation de liquide, d'humidité ou de formation de gouttelettes.
      9. Classer le dispositif comme étanche s'il n'y a aucune fuite détectée.
      10. Jeter les dispositifs présentant des fuites.
        NOTE : Effectuer le test d'étanchéité sur chaque dispositif fabriqué avant l'ensemencement cellulaire ou l'utilisation expérimentale.
  9. Stérilisation et stockage du dispositif microfluidique
    1. Stérilisation
      1. Exposer la surface supérieure du dispositif assemblé à la lumière UV (254 nm) pendant 30 min à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire.
      2. Exposer la surface inférieure à la lumière UV pendant 30 min supplémentaires.
      3. Rincer les microcanaux avec de l'éthanol à 70 % pendant 20 min.
      4. Laver les microcanaux trois fois avec du PBS stérile pour éliminer l'éthanol résiduel.
    2. Stockage
      1. Utiliser immédiatement le dispositif stérilisé pour des expériences de culture cellulaire.
      2. Alternativement, stocker le dispositif immergé dans du PBS stérile à 4°C à l'intérieur d'un récipient stérile jusqu'à son utilisation.
        ​CAUTION : Ne pas utiliser de chloramine ni d'autres solutions désinfectantes après l'assemblage du dispositif, car le PDMS peut absorber ces composés et compromettre la viabilité cellulaire.

3. Évaluation de l'adhérence et de la viabilité des cellules souches de la pulpe dentaire

  1. Préconditionnement de la surface dentinaire
    1. Injecter 10 % d'EDTA dans l'appareil.
    2. Maintenir le contact entre la solution d'EDTA et la surface de la dentine pendant 15 min.
    3. Injecter 0,5 mL d'EDTA toutes les 3 minutes pour maintenir le débit du fluide dans le microcanal.
    4. Laver le disque de dentine trois fois avec de l'eau ultrapure.
    5. Maintenir chaque lavage pendant 5 min.
      REMARQUE : Le traitement par l'EDTA élimine la couche de smear et expose les protéines de la matrice dentinaire.
      ATTENTION : Manipulez les solutions de EDTA avec des gants et des équipements de protection oculaire afin d'éviter toute irritation cutanée et oculaire.
  2. Mise en culture de cellules souches de la pulpe dentaire
    1. Expansion de cellules souches de la pulpe dentaire
      1. Séminer des cellules souches de la pulpe dentaire dans un flacon T75 à une densité de 1 × 106 cellules par flacon
      2. Incuber les cellules à 37°C et 5 % de CO₂2 jusqu'à ce qu'une confluence d'environ 80 % soit atteinte.
      3. Détacher les cellules à l'aide de la trypsine.
      4. Neutraliser la trypsine à l'aide du milieu de culture complet.
      5. Centrifuger la suspension cellulaire pour obtenir un culot cellulaire.
      6. Évaluer la viabilité cellulaire à l'aide du bleu de trypan.
      7. Utilisez des suspensions cellulaires présentant une viabilité ≥90 %.
    2. Préparation de la suspension cellulaire
      1. Préparer une suspension cellulaire préchauffée à 37°C.
      2. Ajuster la concentration cellulaire à 100 000 cellules/mL dans le milieu de culture complet.
      3. Préparer un volume final de suspension de 1 à 2 mL.
        REMARQUE : Les cellules au 5e passage ont été utilisées dans la présente étude.
    3. Semis cellulaire
      1. Injectez la suspension cellulaire dans le port d'entrée du microcanal inférieur.
      2. Inverser le dispositif après la semence cellulaire
        REMARQUE : L'inversion du dispositif favorise la sédimentation des cellules vers la surface de la dentine et améliore l'adhérence cellulaire.
    4. Incubation
      1. Placer l'appareil retourné à l'intérieur d'une boîte de Pétri.
      2. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans la boîte de Pétri pour minimiser l'évaporation.
      3. Incuber l'appareil à 37°C et 5 % de CO₂2 pendant 24 h.
      4. Maintenir des conditions de culture statiques pendant toute la période d'incubation.
        REMARQUE : La validation en flux dynamique n'a pas été effectuée dans la présente étude.
        REMARQUE : Le présent protocole décrit des conditions de culture statique pour la validation initiale du dispositif et l'évaluation de l'adhérence cellulaire.
    5. Validation initiale du dispositif
      1. Évaluer l'adhésion cellulaire par microscopie électronique à balayage.
      2. Récupérez le disque de dentine par démontage de l'appareil avant l'analyse.
  3. Préparation des échantillons pour la microscopie électronique à balayage
    1. Prélèvement et lavage des échantillons
      1. Démonter l'appareil après 24 heures d'incubation.
      2. Récupérez le disque de dentine et transférez-le dans une plaque de culture ou une boîte de Pétri.
      3. Positionner la surface de dentine ensemencée de cellules face vers le haut.
      4. Laver le disque de dentine deux fois à l'aide de 1 mL de PBS.
    2. Fixation
      1. Ajouter 2 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon phosphate de Sorensen 0,1 M.
      2. Incuber l'échantillon pendant 30 min à température ambiante.
        ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique et peut provoquer une irritation de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Réaliser les procédures de fixation à l'intérieur d'une hotte de chimie en portant des équipements de protection individuelle adaptés.
    3. Lavage après fixation
      1. Retirer la solution de glutaraldéhyde.
      2. Laver le disque de dentine trois fois avec de l'eau distillée ultrapure à température ambiante.
    4. Analyse par MEB
      1. Analyser les échantillons à l'aide d'un microscope électronique à balayage environnemental.
      2. Faire fonctionner le microscope en conditions de vide faible (25 Pa).
      3. Utilisez une tension d'accélération de 10,0 kV et une distance de travail de 7,0 mm.
      4. Acquérir des images en utilisant le mode de détection 3D des électrons rétrodiffusés (BSE-3D).
      5. Capturer des images à un grossissement de ×200 (Figure 2A).
  4. Évaluation de la viabilité cellulaire par microscopie confocale
    1. Préparation de l'échantillon
      1. Semez et cultivez les cellules comme décrit à l'étape 3.2.
      2. Incuber l'appareil pendant 24 h à 37°C et 5 % de CO₂2.
      3. Désassembler l'appareil et exposer la surface de la dentine.
      4. Transférer le disque de dentine dans une plaque de culture contenant du HBSS préchauffé+/+ supplémenté avec Ca2+ et Mg2+.
    2. Lavage de l'échantillon
      1. Laver le disque de dentine deux fois avec du HBSS+/+.
      2. Éliminer le sérum résiduel et le rouge de phénol avant la coloration.
        REMARQUE : Le sérum résiduel et le rouge de phénol peuvent augmenter l'autofluorescence de fond.
    3. Marquage de cellules vivantes
      1. Préparer une solution travail fraîche de Calcein AM à 2 µM dans HBSS+/+.
      2. Ajouter suffisamment de solution de coloration pour recouvrir entièrement la surface de la dentine.
      3. Incuber l'échantillon pendant 20 min à 37°C à l'abri de la lumière
      4. Retirer la solution de coloration après l'incubation.
    4. Marquage des cellules mortes
      1. Ajouter la solution de travail de l'iodure de propidium (1–2 µg/mL dans HBSS+/+).
      2. Incuber l'échantillon pendant 5 à 8 min à 37°C à l'abri de la lumière
      3. Ne pas dépasser 10 minutes d'incubation.
      4. Laver l'échantillon deux fois avec du HBSS+/+.
      5. Gardez l'échantillon immergé dans le tampon jusqu'à l'acquisition des images.
    5. Acquisition par microscopie confocale
      1. Acquérir des images en microscopie confocale dans les 30 minutes suivant la coloration.
      2. Acquérir les images séquentiellement dans les canaux vert et rouge.
      3. Utiliser λex 490 nm et λem 515 nm pour l'imagerie de cellules vivantes.
      4. Utiliser λex 535 nm et λem 617 nm pour l'imagerie des cellules mortes.
        REMARQUE : Protéger les solutions de marquage fluorescent et les échantillons marqués de l'exposition à la lumière pendant les étapes d'incubation et d'acquisition d'images (Figure 2B).

Comparaison entre microscopie électronique et microscopie de fluorescence, analyse de la structure cellulaire.
Figure 2 : Évaluation représentative de l'adhésion et de la viabilité des cellules souches de la pulpe dentaire dans le dispositif OoC complexe dentine-pulpe. (A) Image de microscopie électronique à balayage montrant des cellules souches de la pulpe dentaire adhérentes (astérisque blanc) à la surface de la dentine après 24 heures de culture statique dans le dispositif OoC. Après 24 heures de culture, les cellules adhérentes recouvraient 54,35 ± 0,92 % de la surface de la dentine exposée au microcanal. Aucune cellule n'est observée dans la région de la dentine recouverte par le PDMS (astérisque noir), indiquant un scellement efficace entre les couches du dispositif. Échelle = 200 µm. (B) Image de microscopie confocale montrant des cellules souches de la pulpe dentaire viables colorées en vert et adhérentes à la surface de la dentine (flèches blanches) après 24 heures de culture statique. Des cellules non viables colorées en rouge sont également observées (flèches bleues). Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

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Résultats

La fabrication réussie du dispositif dent-sur-puce a suivi le flux de travail illustré dans la Figure 1A–1I, comprenant la préparation du disque de dentine (Figure 1D), la fabrication du moule obtenu par photolithographie (Figure 1E), le retrait des couches de PDMS polymérisées (Figure 1F), l'activation au plasma avant collage (Figure 1G), l'assemblage du d...

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Discussion

Cette étude décrit un protocole étape par étape pour la fabrication d'un dispositif de type « dent-sur-puce » en empilement vertical intégrant de la dentine et des cellules souches de la pulpe dentaire, et illustre l'adhérence cellulaire et la viabilité représentatives au sein du dispositif dans des conditions de culture statique. Ce protocole a été conçu pour offrir un flux de travail reproductible permettant la fabrication et l'assemblage d'une plateforme OoC (organe-sur-puce) du complexe dentine-pulpe, adaptée à des é...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir d'intérêts financiers concurrents et n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet DIM24-0004 et le projet PP24-0031, Direction de la recherche, Université de La Frontera ; FONDECYT régulier n° 1260116 ; et FONDECYT d'initiation n° 11230701, Agence nationale du développement de la recherche (ANID), Chili.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériaux biologiques et chimiques
AcétoneExpertQSOLV 8Nettoyage de plaquette de silicium
Milieu de culture Alpha MEMCytivaSH30265.02Milieu de culture pour cellules souches de la pulpe dentaire
Chloramine (0,5 %)Merck7080-50-4Solution de stockage pour disques de dentine
Cellules souches de la pulpe dentaireNon applicableNon applicableCulture primaire de cellules. Voir les étapes 3.2.1 et 3.2.2
EDTA (10 %)WinklerN2222158EÉlimination de la couche de débris
Résine photosensible négative à base d'époxyGersteltecGM1060Fabrication d'un moule par photolithographie
Glutaraldéhyde (2,5 %) dans Sorensen 0,1 M’tampon phosphate sSigma-Aldrich210908-06Fixation pour MEB
Dents humaines saines (molaires ou prémolaires)Non applicableNon applicableÉchantillon humain
IsopropanolExpertQSOLV 16Nettoyage du wafer, arrêt du développement et nettoyage du PDMS
Kit de viabilité LIVE/DEADSigma-Aldrich451Coloration de viabilité par fluorescence. 
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)Corning46-013-CMLavage et test de fuite
Base de PDMS et agent de réticulation (polydiméthylsiloxane)DowSylgard 184Fabrication du dispositif
PGMEASigma Aldrich484431Développement du photo-résist
Bleu de trypanSigma Aldrich T8154-100mlÉvaluation de la viabilité cellulaire
TrypsineCorning25-053-CIDétachement cellulaire
Eau ultrapureCytivaSH30529.01Solution de lavage
Consommables et matériel de laboratoire
aiguilles de seringue 19GVmaticVCB19050Connexion du dispositif à une micropompe ou à une seringue
Punch-biopsie (diamètre : 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Fabrication des ports d'entrée et de sortie
Tapis de découpeNicecoolNon applicableProtection de la surface lors du poinçonnage
Disques de finition dentaire (par exemple, Sof-Lex)3MSof-LexPolissage de la dentine
Adaptateurs femelles Luer à emboîtementRunze FluidicsRH-M016Connexion du tuyau
Bâtonnet de mélange en verre ou en plastiqueDuranNon applicableMélange du PDMS
Seringues hypodermiquesCranberrypc-12246Semis cellulaire et test d'étanchéité
Compresse stérile sans peluchesLindersonNon applicableÉlimination des débris de perforation
Adaptateurs mâles LuerRunze FluidicsRH-G016Connexion du tube
Récipient de mélangeDuranNon applicablePréparation du PDMS
boîte de Pétri (140 mm) × 20 mm)Deltalab2000219Culture cellulaire/incubation
Base en polytétrafluoroéthylèneCCTValNon applicableFabrication d'une couche intermédiaire de dentine
Plaque de siliciumJiaozuo Commercial FineWinNon applicableFabrication du moule
Tube en siliconeRunze Fluidics96421Connexion fluidique
flacon T75Corning 353136Expansion de cellules souches de la pulpe dentaire
Plaque de cultureSPL Life Sciences30006Préparation de la coloration et de l'imagerie en microscopie confocale
Équipements et instruments
Sécheur d'airMETALPLANTITAN-040Séchage de l'air comprimé
Source d'air compriméSCHULZCSD-18.1Nettoyage des moisissures et des surfaces
Microscope confocalOlympusNon applicableModèle : FV1000
Système de lithographie laser directeHeidelberguPG 101Exposition du photo-résist
Microscope électronique à balayage environnementalHitachiNon applicableModèle : Quanta 400 
Turbine à vitesse élevéeNakanishiNon applicableModèle : Pana-max2
Plaque chauffanteLabTechEH20A PlusCuisson du wafer et cuisson de la résine photosensible
Panneau de flux laminaireBioBaseBBS8V1708313DStérilisation du dispositif
Pompe microfluidiqueNouvelle èreNon applicableModèle : 1002X-ES. Essai d'étanchéité à 10 µL/min
Moule microstructuré (fabriqué par photolithographie)CCTValNon applicableVoir l'étape 2.2 pour les spécifications de fabrication du moule
Étuve ou incubateurMemmertUN110Durcissement du PDMS à 50 °C°C et consolidation des liaisons à 75°C
Chambre de nettoyage par plasma sous videFari PlasmaGD-5Activation plasma de plaquettes
Plasma Corona portable Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACActivation au plasma du PDMS
UltrasonicateurElma SonicS 10 (H)Nettoyage du wafer
Chambre à vide ou dessiccateur (250 mm)WinglassNon applicableDégazage du PDMS
Pompe à videROCKER300Dégazage du PDMS

Références

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