Fabrication d'un dispositif d'organe sur puce de complexe dentine-pulpe empilé verticalement utilisant un disque de dentine humaine

Résumé

Décrire la fabrication et l'assemblage d'un dispositif organe-sur-puce en empilement vertical du complexe dentine-pulpe, intégrant un disque de dentine humaine et des microcanaux fabriqués par photolithographie, suivi de l'ensemencement et de la culture de cellules souches de la pulpe dentaire.

Résumé

Les modèles précliniques classiques utilisés en recherche dentaire, notamment les modèles animaux et les cultures cellulaires statiques, présentent d'importantes limites pour reproduire les conditions physiologiques de l'interface dentine-pulpe et prédire les réponses biologiques humaines aux biomatériaux dentaires. La technologie organe-sur-puce (OoC) offre une approche alternative en permettant la reconstitution de microenvironnements spécifiques aux tissus au sein de systèmes microfluidiques contrôlés. Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la fabrication et l'assemblage d'un dispositif OoC de complexe dentine-pulpe intégrant un disque de dentine humaine dans une plateforme microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS) à trois couches. Le protocole comprend la préparation du disque de dentine, la fabrication de moules microstructurés par photolithographie, la coulée et la polymérisation du PDMS, la liaison des couches assistée par plasma, l'assemblage du dispositif, le test d'étanchéité et l'ensemencement de cellules souches de la pulpe dentaire en conditions de culture statique. Les paramètres critiques de fabrication influant sur les performances du dispositif sont discutés, notamment le contrôle de l'épaisseur des couches de PDMS, le traitement de surface par plasma et l'intégration du disque de dentine dans le dispositif afin de minimiser les fuites. L'adhérence cellulaire et la viabilité dans le dispositif ont été évaluées par microscopie électronique à balayage et coloration en direct/mort en confocal. Des résultats représentatifs démontrent l'intégration réussie du disque de dentine dans l'assemblage microfluidique, le maintien de conditions étanches et l'adhérence de cellules souches de la pulpe dentaire viables à la surface de la dentine. Ce protocole fournit une méthode reproductible pour la fabrication d'une plateforme OoC de complexe dentine-pulpe qui pourrait soutenir des études futures sur les réponses cellulaires aux biomatériaux dentaires et aux stimuli microenvironnementaux.

Introduction

L'expérimentation animale a longtemps joué un rôle essentiel dans l'avancement de la compréhension des processus pathologiques et physiologiques et a occupé une place centrale dans les premières étapes du développement pharmaceutique.¹Au cours du XXe siècle, l'espérance de vie humaine a augmenté sensiblement, et bien qu'il soit impossible de quantifier précisément dans quelle mesure cette amélioration est uniquement attribuable à la recherche animale, il est largement reconnu que de nombreux traitements médicaux contemporains ont été mis au point ou validés à l'aide de modèles animaux.². Des exemples notables incluent le développement de vaccins contre la poliomyélite, la rougeole et l'hépatite B, l'évaluation de la sécurité et de l'efficacité de la pénicilline, ainsi que la production d'insuline. Dans le domaine de la recherche en odontologie et en biomatériaux, ces modèles ont été essentiels pour étudier le processus de carie, la biologie et la régénération du complexe dentine-pulpe, ainsi que la physiopathologie des tissus parodontaux.^3,4.

Malgré l'utilisation extensive de ces méthodologies, le processus actuel de développement de médicaments continue d'afficher des taux d'échec élevés, de nombreux candidats-médicaments échouant lors des essais cliniques malgré une efficacité et une sécurité démontrées dans des contextes précliniques en laboratoire et sur des modèles animaux⁵. Cette divergence a été associée à des différences interspécifiques qui peuvent limiter la prévisibilité translationnelle des modèles animaux en raison de différences anatomiques, génétiques et physiologiques entre les espèces⁶. De plus, le développement de nouvelles approches thérapeutiques reste long et coûteux⁷. Par ailleurs, les modèles conventionnels in vitro utilisent principalement des cultures monocouches simples en deux dimensions (2D) sur des substrats plastiques non physiologiques, ce qui ne permet pas de reproduire les signaux biochimiques et physiques, les interactions entre cellules et la signalisation par la matrice extracellulaire (ECM) présents dans la cavité buccale humaine^8,9. Bien que les modèles 2D offrent certains avantages expérimentaux, ils sont fondamentalement incapables de reproduire les interactions complexes qui se produisent simultanément entre plusieurs composants, tels que les biofilms, les biomatériaux, la dentine et les cellules de la pulpe¹⁰. En conséquence, l'intérêt croissant se porte sur le développement de plateformes expérimentales alternatives capables de reproduire plus fidèlement les réponses biologiques humaines. En 2022, la FDA Modernization Act 2.0 a supprimé l'exigence obligatoire de tests sur des animaux dans le processus d'approbation des médicaments et a reconnu l'utilisation potentielle de plateformes alternatives, notamment les technologies d'organes-sur-puce (OoC), dans la recherche préclinique¹¹.

Un organe-sur-puce (OoC) est un dispositif microfluidique conçu pour reproduire la structure, la fonction et le microenvironnement d'un organe ou d'un composant tissulaire spécifique¹². Ces dispositifs sont peuplés de cellules et de tissus vivants cultivés au sein de microcanaux conçus pour recréer des aspects clés du microenvironnement physiologique auquel les cellules sont naturellement exposées. Au-delà de la mimique structurelle, les microcanaux permettent un contrôle spatiotemporel de l’environnement cellulaire et soutiennent le maintien de fonctions spécifiques aux tissus, offrant ainsi des conditions expérimentales pouvant mieux refléter la physiologie in vivo que les systèmes de culture conventionnels¹². Particulièrement pertinent, le flux contrôlé de milieu de culture dans les microcanaux des dispositifs OoC exerce un stress de cisaillement sur les cellules résidentes¹³. Ces stimuli mécaniques influencent les réponses cellulaires, notamment l’adhésion, la prolifération, la migration, l’expression génique et les interactions entre cellules^14,15. En outre, le flux continu de milieu contribue au maintien du microenvironnement par l’apport de nutriments et l’élimination des déchets métaboliques¹⁶. De plus, par rapport aux cultures conventionnelles en 2D, certaines plates-formes OoC ont permis un meilleur contrôle des paramètres liés au stress oxydatif, tels que les espèces réactives de l’oxygène intracellulaires et la viabilité cellulaire, dans des modèles tridimensionnels (3D) intégrés sur puce¹⁷. Les systèmes OoC se sont donc imposés comme des plates-formes prometteuses pour l’étude de la physiologie tissulaire, des interactions biomatériaux-tissus et des processus pathologiques dans des conditions expérimentales contrôlées¹⁸. En recherche dentaire, la technologie OoC a été progressivement appliquée pour modéliser des interfaces tissulaires orales de plus en plus complexes¹⁹. Les premières plates-formes « dent-sur-puce » reproduisaient l’interface biomatériau-dentine-pulpe²⁰, tandis que des versions plus avancées ont depuis intégré une vascularisation et une innervation trigéminale afin de reproduire plus fidèlement la complexité structurelle et fonctionnelle du complexe pulpo-dentinaire²¹. Au-delà de la pulpe, des modèles 3D de canaux radiculaires immatures ont permis d’évaluer les irriguants endodontiques et la formation de bourgeons angiogéniques sur des cellules souches de la papille apicale^22,23. Au niveau parodontal, des plates-formes « gencive-sur-puce » ont été utilisées pour étudier les interactions hôte-microbe et évaluer le potentiel immunomodulateur des probiotiques en tant qu’agents thérapeutiques²⁴, tandis que des dispositifs « ligament parodontal-sur-puce » ont montré comment le flux de liquide interstitiel module la formation de réseaux vasculaires et la différenciation ostéogénique des sphéroïdes de cellules souches du ligament parodontal^25,26. En complément de ces modèles, des systèmes spécialisés « muqueuse orale-sur-puce » et « implant dentaire-sur-puce » ont encore élargi le champ de la recherche microfluidique dentaire en caractérisant les interactions hôte-matériau et la cytotoxicité des monomères dentaires dans des conditions physiologiquement pertinentes^27,28.

Bien que les systèmes Organe-sur-puce (OoC) soient de plus en plus utilisés dans la recherche dentaire, buccale et craniofaciale, des efforts continus visant à standardiser et à assurer la reproductibilité des protocoles de fabrication restent essentiels. Plusieurs modèles de dent-sur-puce ont été décrits dans la littérature^20,29,30,31, illustrant différentes configurations d'appareils et applications expérimentales. Toutefois, les variations concernant l'architecture des dispositifs, les méthodes de fabrication, l'intégration de la dentine et la description des paramètres expérimentaux peuvent limiter la reproductibilité et la comparaison directe entre études. En particulier, les différences de géométrie des microcanaux, de stratégies d'intégration de la dentine et d'approches de fabrication peuvent influencer le microenvironnement biologique et mécanique au sein du dispositif. Certains modèles rapportés intègrent de la dentine afin de reproduire certains aspects de l'interface dentine-pulpe^20,29,30, tandis que d'autres utilisent des configurations alternatives³¹. De plus, les méthodes de fabrication telles que la photolithographie, la découpe laser, la microfraisage et l'impression 3D présentent chacune des avantages et des limites spécifiques selon la conception et l'application visées du dispositif. Par ailleurs, un facteur déterminant pour l'utilité biologique est l'orientation architecturale du dispositif, notamment le fait que les canaux et la tranche de dentine soient disposés selon une configuration horizontale ou verticale^19,32. Dans les configurations empilées horizontalement, les compartiments disposés côte à côte facilitent la compartimentation latérale et la visualisation en temps réel des cellules, ce qui les rend particulièrement adaptées à la modélisation de tissus présentant une organisation spatiale latérale intrinsèque, comme le complexe parodontal^24,32. Toutefois, cette conception présente une limitation inhérente quant à sa capacité à recréer des interfaces biologiques perpendiculaires, telles que le complexe biomatériau-dentine-pulpe, car l'agencement latéral des compartiments ne reproduit pas fidèlement l'orientation in vivo de la barrière dentinaire entre la cavité et la pulpe^20,32. Les configurations empilées verticalement permettent de surmonter ces limitations en superposant deux compartiments selon l'axe y, séparés par une tranche de dentine native, ce qui permet de quantifier simultanément le transport moléculaire à travers la dentine intacte et de surveiller en temps réel les réponses des cellules de la pulpe mesurées dans le milieu de sortie³⁰. Cependant, une limite reconnue de cette orientation concerne l'imagerie en coupe de l'interface dentine-cellules, car l'acquisition d'images en coupe de cette interface dans un même plan focal reste techniquement plus difficile que dans les configurations empilées horizontalement, où les cellules et les matrices extracellulaires sont disposées latéralement. Bien que plusieurs modèles de complexe dentine-pulpe-sur-puce aient été rapportés dans la littérature, la majorité adoptent une configuration empilée horizontalement, dans laquelle les compartiments sont disposés côte à côte dans un même plan^10,20,21,29, tandis que peu nombreux sont ceux qui ont intégré une tranche de dentine native dans une configuration empilée verticalement³⁰. Néanmoins, les variations des approches de fabrication et des paramètres rapportés entre ces modèles continuent de limiter la reproductibilité et les comparaisons inter-études³³. Le présent manuscrit vise à améliorer la reproductibilité méthodologique en fournissant un protocole détaillé de fabrication d'un dispositif dent-sur-puce à configuration verticalement empilée, facilitant ainsi une adoption plus large de cette plateforme au sein de la communauté de recherche dentaire.

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape de fabrication et d'assemblage d'un dispositif Organe-sur-puce (OoC) du complexe dentine-pulpe, empilé verticalement, intégrant un disque de dentine humaine au sein d'une plateforme microfluidique en polydiméthylsiloxane (PDMS) à trois couches, fabriquée à l'aide d'un moule obtenu par photolithographie. Le protocole décrit également l'ensemencement et la culture de cellules souches de la pulpe dentaire dans le dispositif dans des conditions statiques.

Protocole

L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki et approuvée par le Comité d'éthique de l'Universidad de La Frontera pour les études impliquant des échantillons humains.

1. Obtention du disque de dentine

REMARQUE : Préparez la conception du dispositif avant de commencer le protocole (Figure 1A–1C).

1. Prélèvement et stockage des dents
   1. Prélevez des molaires ou prémolaires humaines saines après avoir obtenu le consentement éclairé du patient.
   2. Conservez tous les échantillons dans une solution de chloramine à 0,5 % à 4 °C afin d'éviter la déshydratation de la dentine et la dénaturation des protéines.
   3. Renouvelez la solution de chloramine une fois par semaine pendant le stockage.
2. Préparation des disques de dentine
   1. Sectionnez horizontalement chaque dent au tiers moyen de la couronne à l’aide d’une contre-angle à haute vitesse fonctionnant à 350 000 tr/min, équipée d’une fraise cylindrique en diamant (diamètre de 1 mm ; granulométrie de 100 à 150 µm).
   2. Effectuez la section sous irrigation continue d’eau à environ 50 mL/min.
   3. Positionnez la section au tiers moyen de la couronne afin d’éviter la chambre pulpaire et l’émail présent dans les sillons et fissures occlusaux, obtenant ainsi un disque composé principalement de tissu dentinaire.
      ATTENTION : Effectuez la section des dents sous irrigation continue et portez des équipements de protection individuelle appropriés, notamment des gants, un masque et une protection oculaire.
3. Finition des disques de dentine
   1. Polissez le disque de dentine à l’aide de disques abrasifs de granulométrie décroissante.
   2. Poursuivez le polissage jusqu’à l’obtention d’une épaisseur finale de dentine d’environ 0,8 mm (±± 0,3 mm) et de dimensions latérales d’environ 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Figure 1D).
4. Stockage des disques de dentine
   1. Conservez les disques de dentine préparés dans une solution de chloramine à 0,5 % à 4 °C jusqu’à l’assemblage du dispositif OoC.

Figure 1 : Schéma et procédé de fabrication du dispositif organe-sur-puce (OoC) du complexe dentine-pulpe. (A) Conception tridimensionnelle du dispositif illustrant l'architecture à trois couches. (B) Vue de dessus du dispositif avec les dimensions principales. (C) Vue latérale de la configuration à trois couches du dispositif. (D) Disque représentatif de dentine préparé avec une épaisseur approximative de 0,8 mm et des dimensions latérales d’environ 5 mm × 5 mm. (E) Moule-maître en silicium fabriqué par photolithographie et utilisé pour le moulage des couches supérieure et inférieure en polydiméthylsiloxane (PDMS). (F) Démoulage d'une couche de PDMS polymérisée à partir du moule en silicium après polymérisation thermique. (G) Traitement plasma de la surface du PDMS avant l'assemblage des couches. (H) Dispositif final OoC du complexe dentine-pulpe à trois couches assemblé par liaison plasma et intégrant l'interface de dentine. (I) Dispositif assemblé relié à des tubulures pour un test d'étanchéité et la préparation d'expériences microfluidiques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

2. Fabrication du dispositif Organe-sur-puce du complexe dentine-pulpe

1. Préparation de l'espace de travail et des matériaux
   1. Préparer les matériaux et l'équipement
      1. Préparer tous les matériaux et équipements listés dans le Tableau des matériaux avant de commencer la fabrication du dispositif.
      2. Préparer les poinçons biopsiques avant l'assemblage du dispositif.
      3. Effectuer toutes les procédures de fabrication dans un environnement propre et sans poussière.
      4. Porter des gants, des lunettes de protection et des équipements de protection individuelle appropriés tout au long de la fabrication et de l'assemblage du dispositif.
         NOTE : Préparer le moule produit par photolithographie avant de commencer le protocole (Figure 1E).
2. Fabrication du moule microstructuré
   1. Préparation de la tranche de silicium
      1. Fabriquer le moule sur une tranche de silicium polie sur une seule face de 4 pouces (type N, dopé à l'arsenic, méthode de croissance CZ, orientation <100>, épaisseur de 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, résistivité de 0,001 à 0,005 Ω·cm).
      2. Nettoyer la tranche successivement dans de l'acétone, de l'isopropanol et de l'eau ultra-pure pendant 10 min chacun sous ultrasonication.
      3. Sécher la tranche à l'air comprimé.
      4. Faire cuire la tranche à 200°C pendant 10 min sur une plaque chauffante afin d'éliminer l'humidité résiduelle.
      5. Laisser refroidir la tranche à température ambiante (TA ; 20°C–25°C).
   2. Activation de surface et application du photoresist
      1. Activer la surface de la tranche de silicium à l'aide d'un nettoyeur plasma sous vide fonctionnant avec un plasma d'air au niveau 7 pendant 120 s.
      2. Appliquer le photoresist négatif à base d'époxy GM 1060 par centrifugation à 300 tr/min pendant 10 s.
      3. Poursuivre la centrifugation à 565 tr/min pendant 100 s et à 965 tr/min pendant 1 s, avec une accélération de 200 tr/min/s.
      4. Laisser reposer la tranche recouverte pendant 10 min.
      5. Effectuer un pré-cuisson à 65°C pendant 10 min.
      6. Poursuivre le pré-cuisson à 95°C pendant 1 h.
      7. Laisser refroidir la tranche à température ambiante.
   3. Exposition et développement
      1. Exposer le photoresist à l'aide d'un système de lithographie laser directe à une dose de 1 950 mJ/cm².
      2. Effectuer un post-cuisson à 65°C pendant 10 min.
      3. Poursuivre le post-cuisson à 95°C pendant 30 min.
      4. Laisser refroidir la tranche à température ambiante.
      5. Laisser reposer la tranche pendant 10 min.
      6. Développer le motif dans du PGMEA pendant 4 min.
      7. Prolonger le développement par intervalles de 30 s si du photoresist résiduel persiste.
      8. Arrêter le développement en rinçant avec de l'isopropanol.
      9. Sécher la tranche à l'air comprimé.
   4. Cuisson finale
      1. Effectuer une cuisson finale à 135°C pendant 2 h.
      2. Obtenir un moule maître microstructuré contenant des microcanaux mesurant 1 mm de largeur et 50 µm de hauteur.
3. Préparation et dégazage du mélange PDMS
   1. Préparation du mélange PDMS
      1. Mélanger la base PDMS et l'agent de réticulation dans un rapport pondéral de 10:1.
      2. Agiter le mélange manuellement à l'aide d'une tige en verre dans un bécher en plastique pendant environ 5 min.
      3. Maintenir des mouvements circulaires lents et continus pendant le mélange.
         NOTE : Éviter d'introduire des bulles d'air pendant le mélange.
   2. Dégazage
      1. Placer le mélange PDMS dans un dessiccateur sous vide relié à une pompe à vide.
      2. Dégazer le mélange à environ 700 mmHg pendant 5 min.
      3. Relâcher brièvement le vide pour permettre l'éclatement des bulles en surface.
      4. Reprendre le vide.
      5. Répéter le cycle jusqu'à disparition complète des bulles visibles.
         NOTE : La durée totale de dégazage est généralement d'environ 30 min.
4. Écoulement du PDMS sur le moule
   1. Préparation du moule
      1. Placer le moule sur une surface plane.
      2. Nettoyer le moule à l'aide d'air comprimé.
      3. Éviter tout contact direct avec la surface structurée.
      4. Vérifier que le moule est exempt de poussière et de contaminants.
   2. Distribution du PDMS
      1. Distribuer environ 8 g de PDMS autour du disque de dentine pour fabriquer la couche d'encapsulation de la dentine.
      2. Régler la hauteur du PDMS pour qu'elle corresponde à l'épaisseur du disque de dentine (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Éviter que le PDMS recouvre la surface de la dentine.
      4. Distribuer environ 0,26 g de PDMS par unité de moule pour fabriquer chaque couche de microcanaux.
      5. Taper doucement sur le moule ou appliquer une vibration pour faciliter le remplissage des microstructures.
      6. Laisser le PDMS s'installer dans les plus petits détails.
      7. Couvrir le moule avec un couvercle ou une plaque plane sans toucher la surface du PDMS.
         NOTE : La couche d'encapsulation de la dentine a une épaisseur d'environ 0,8 mm, et chaque couche de microcanaux a une épaisseur d'environ 0,4 mm, ce qui donne une épaisseur totale du dispositif d'environ 1,6 mm.
         NOTE : Ajuster l'épaisseur des couches en fonction de la distance de travail de l'objectif confocal lorsque des acquisitions en imagerie confocale sont prévues.
5. Cuisson
   1. Placer les moules dans un four à 50°C.
   2. Cuire le PDMS pendant 4 h.
6. Retrait des couches de PDMS
   1. Retrait du PDMS durci
      1. Détacher soigneusement les couches de PDMS durci du moule (Figure 1F).
      2. Manipuler les couches de PDMS avec précaution pour éviter d'endommager les microstructures.
7. Assemblage des couches de PDMS et fabrication des orifices d'entrée et de sortie
   1. Fabrication des orifices d'entrée et de sortie
      1. Créer des perforations aux emplacements désignés pour les entrées et sorties à l'aide d'un poinçon biopsique de 1 mm.
      2. Placer la face des microcanaux vers le haut pendant la perforation.
         NOTE : Placer la couche de PDMS sur un tapis de découpe pour éviter tout dommage structurel.
      3. Créer deux perforations dans la couche supérieure correspondant au microcanal supérieur.
   2. Nettoyage des couches de PDMS
      1. Nettoyer les couches de PDMS à l'aide d'alcool isopropylique ou d'éthanol.
      2. Éliminer les particules de poussière résiduelles à l'aide d'un ruban adhésif stérile.
      3. Vérifier que toutes les surfaces d'assemblage sont exemptes de contaminants avant l'assemblage.
   3. Activation plasma des surfaces de PDMS
      1. Placer les couches supérieure et intermédiaire de PDMS pour le traitement plasma (Figure 1G).
      2. Activer les surfaces à l'aide d'un appareil de traitement plasma corona portable fonctionnant à environ 25 W, avec de l'air ambiant comme gaz de travail.
      3. Maintenir une distance de travail d'environ 1 mm entre la source plasma et la surface de PDMS.
         ATTENTION : Effectuer le traitement plasma sous une ventilation adéquate et éviter toute exposition directe à l'ozone généré par le plasma.
      4. Activer l'appareil de traitement plasma et laisser stabiliser pendant 5 s.
      5. Vérifier la génération d'un faisceau plasma uniforme avant le traitement.
      6. Traiter la couche supérieure de PDMS pendant 10 s en effectuant un mouvement continu d'avant en arrière à environ 5 mm/s.
      7. Traiter la couche intermédiaire de PDMS pendant 10 s en utilisant le même mouvement et la même distance.
      8. Appliquer un traitement plasma supplémentaire de 1 s sur la couche supérieure immédiatement avant l'assemblage.
   4. Assemblage des couches supérieure et intermédiaire
      1. Aligner le microcanal supérieur avec le disque de dentine immédiatement après le traitement plasma.
      2. Assembler les couches supérieure et intermédiaire.
      3. Placer l'ensemble assemblé dans un four à 75°C pendant 5 min.
      4. Consolider l'assemblage pendant l'incubation.
         NOTE : Le disque de dentine et le microcanal sont visibles à l'œil nu et peuvent être alignés sans outils d'alignement supplémentaires.
   5. Fabrication des orifices du microcanal inférieur
      1. Perforer deux orifices correspondant au microcanal inférieur à travers les couches assemblées supérieure et intermédiaire.
      2. Effectuer la perforation simultanément à travers les deux couches pour assurer un bon alignement.
         NOTE : Cette procédure crée quatre perforations dans la couche supérieure et deux perforations dans la couche intermédiaire.
      3. Placer l'ensemble assemblé sur un tapis de découpe rigide avant la perforation.
      4. Appliquer une pression descendante constante en un seul mouvement.
         NOTE : Éviter les forces rotatives ou latérales afin de minimiser le risque de délaminage.
      5. Éliminer les débris des sites de perforation à l'aide d'un coton stérile sans peluches humidifié avec de l'alcool isopropylique.
      6. Inspecter les perforations et les zones assemblées environnantes sous un éclairage adéquat.
      7. Vérifier l'absence de délaminage, de déchirures ou de perforations incomplètes avant de poursuivre.
   6. Assemblage de la couche inférieure
      1. Effectuer un traitement plasma sur la couche inférieure comme décrit à l'étape 2.7.4.
      2. Aligner les orifices d'entrée et de sortie du microcanal inférieur avec les perforations des couches supérieure et intermédiaire.
      3. Assembler la couche inférieure pour terminer l'assemblage du dispositif.
         NOTE : Marquer les emplacements des orifices d'entrée et de sortie sur la surface externe de la couche inférieure avant l'assemblage afin de faciliter l'alignement.
         NOTE : Les chambres plasma peuvent offrir un assemblage plus solide que les stylos plasma, comme indiqué dans la littérature³⁶.
         NOTE : Le dispositif terminé consiste en une plateforme microfluidique à trois couches intégrant une interface de dentine (Figure 1H). La surface inférieure de la dentine représente le côté pulpe du modèle, tandis que la surface supérieure de la dentine représente le côté coronal exposé aux biomatériaux dentaires ou aux préparations bactériennes.
8. Test d'étanchéité du dispositif microfluidique
   1. Inspection du dispositif assemblé
      1. Inspecter le dispositif assemblé pour détecter tout désalignement.
      2. Inspecter l'assemblage pour détecter un assemblage incomplet ou des fuites visibles.
   2. Test d'étanchéité
      1. Connecter des aiguilles Luer-lock de 19G aux orifices d'entrée (Figure 1E).
      2. Relier les aiguilles aux tubulures de la pompe microfluidique.
      3. Enfoncer doucement les embouts des aiguilles dans les orifices percés pour obtenir un joint étanche.
      4. Injecter du PBS stérile ou du milieu de culture à un débit de 10 µL/min.
      5. Maintenir l'écoulement du fluide pendant au moins 5 min.
      6. Inspecter tous les interfaces assemblés, les bords des canaux et les limites du disque de dentine pendant l'écoulement.
      7. Observer le dispositif sous un éclairage adéquat pendant et après l'injection.
      8. Confirmer l'absence d'accumulation de fluide, d'humidité ou de formation de gouttelettes.
      9. Classer le dispositif comme étanche si aucune fuite n'est détectée.
      10. Éliminer les dispositifs présentant des fuites.
          NOTE : Effectuer le test d'étanchéité sur chaque dispositif fabriqué avant l'ensemencement cellulaire ou toute utilisation expérimentale.
9. Stérilisation et stockage du dispositif microfluidique
   1. Stérilisation
      1. Exposer la surface supérieure du dispositif assemblé à la lumière UV (254 nm) pendant 30 min à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire.
      2. Exposer la surface inférieure à la lumière UV pendant 30 min supplémentaires.
      3. Passer du PBS stérile à 70 % dans les microcanaux pendant 20 min.
      4. Rincer les microcanaux trois fois avec du PBS stérile pour éliminer l'éthanol résiduel.
   2. Stockage
      1. Utiliser immédiatement le dispositif stérilisé pour les expériences de culture cellulaire.
      2. Alternativement, stocker le dispositif immergé dans du PBS stérile à 4°C à l'intérieur d'un récipient stérile jusqu'à son utilisation.
         ​ATTENTION : Ne pas utiliser de chloramine ni d'autres solutions désinfectantes après l'assemblage du dispositif, car le PDMS peut absorber ces composés et compromettre la viabilité cellulaire.

3. Évaluation de l'adhérence et de la viabilité des cellules souches de la pulpe dentaire

1. Prétraitement de la surface de la dentine
   1. Injecter de l'EDTA à 10 % dans le dispositif.
   2. Maintenir le contact entre la solution d'EDTA et la surface de la dentine pendant 15 min.
   3. Injecter 0,5 mL d'EDTA toutes les 3 min afin de maintenir le mouvement du fluide dans le microcanal.
   4. Laver le disque de dentine trois fois avec de l'eau ultrapure.
   5. Maintenir chaque lavage pendant 5 min.
      NOTA : Le traitement par l'EDTA élimine la couche de débris et expose les protéines de la matrice de la dentine.
      ATTENTION : Manipuler les solutions d'EDTA avec des gants et une protection oculaire afin d'éviter toute irritation cutanée ou oculaire.
2. Ensemencement de cellules souches de la pulpe dentaire
   1. Expansion des cellules souches de la pulpe dentaire
      1. Ensemencer les cellules souches de la pulpe dentaire dans un flacon T75 à une densité de 1 × 10⁶ cellules par flacon.
      2. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % CO₂ jusqu'à ce qu'une confluence d'environ 80 % soit atteinte.
      3. Détacher les cellules à l'aide de trypsine.
      4. Neutraliser la trypsine à l'aide du milieu de culture complet.
      5. Centrifuger la suspension cellulaire pour obtenir un culot cellulaire.
      6. Évaluer la viabilité cellulaire à l'aide de bleu de trypan.
      7. Utiliser des suspensions cellulaires présentant une viabilité ≥ 90 %.
   2. Préparation de la suspension cellulaire
      1. Préparer une suspension cellulaire préchauffée à 37 °C.
      2. Ajuster la concentration cellulaire à 100 000 cellules/mL dans le milieu de culture complet.
      3. Préparer un volume final de suspension de 1 à 2 mL.
         NOTA : Les cellules au passage 5 ont été utilisées dans la présente étude.
   3. Ensemencement cellulaire
      1. Injecter la suspension cellulaire dans l'orifice d'entrée du microcanal inférieur.
      2. Inverser le dispositif après l'ensemencement
         NOTA : L'inversion du dispositif favorise la sédimentation des cellules vers la surface de la dentine et améliore l'adhésion cellulaire.
   4. Incubation
      1. Placer le dispositif inversé dans une boîte de Pétri.
      2. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans la boîte de Pétri afin de minimiser l'évaporation.
      3. Incuber le dispositif à 37 °C et 5 % CO₂ pendant 24 h.
      4. Maintenir des conditions de culture statique tout au long de la période d'incubation.
         NOTA : Une validation en flux dynamique n'a pas été réalisée dans la présente étude.
         NOTA : Le présent protocole décrit des conditions de culture statique pour la validation initiale du dispositif et l'évaluation de l'adhésion cellulaire.
   5. Validation initiale du dispositif
      1. Évaluer l'adhésion cellulaire par microscopie électronique à balayage.
      2. Récupérer le disque de dentine par démontage du dispositif avant analyse.
3. Préparation des échantillons pour la microscopie électronique à balayage
   1. Récupération et lavage des échantillons
      1. Démonter le dispositif après 24 h d'incubation.
      2. Récupérer le disque de dentine et le transférer dans une plaque de culture ou une boîte de Pétri.
      3. Positionner la surface de dentine ensemencée face vers le haut.
      4. Laver le disque de dentine deux fois avec 1 mL de PBS.
   2. Fixation
      1. Ajouter 2 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon phosphate de Sorensen 0,1 M.
      2. Incuber l'échantillon pendant 30 min à température ambiante (TA).
         ATTENTION : Le glutaraldéhyde est toxique et peut provoquer des irritations de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Réaliser les opérations de fixation dans une hotte chimique en portant des équipements de protection individuelle adaptés.
   3. Lavage après fixation
      1. Éliminer la solution de glutaraldéhyde.
      2. Laver le disque de dentine trois fois avec de l'eau distillée ultrapure à température ambiante (TA).
   4. Analyse MEB
      1. Analyser les échantillons à l'aide d'un microscope électronique à balayage environnemental.
      2. Fonctionner avec le microscope en conditions de faible vide (25 Pa).
      3. Utiliser une tension d'accélération de 10,0 kV et une distance de travail de 7,0 mm.
      4. Acquérir les images en mode détection 3D d'électrons rétrodiffusés (BSE-3D).
      5. Capturer les images à un grossissement ×200 (Figure 2A).
4. Évaluation de la viabilité cellulaire par microscopie confocale
   1. Préparation des échantillons
      1. Ensemencer et cultiver les cellules comme décrit à l'étape 3.2.
      2. Incuber le dispositif pendant 24 h à 37 °C et 5 % CO₂.
      3. Démonter le dispositif et exposer la surface de la dentine.
      4. Transférer le disque de dentine dans une plaque à puits contenant du HBSS⁺/+ préchauffé, supplémenté en Ca²⁺ et Mg²⁺.
   2. Lavage des échantillons
      1. Laver le disque de dentine deux fois avec du HBSS⁺/⁺.
      2. Éliminer le sérum résiduel et le rouge de phénol avant la coloration.
         NOTA : Le sérum résiduel et le rouge de phénol peuvent augmenter l'autofluorescence de fond.
   3. Coloration des cellules vivantes
      1. Préparer une solution travail fraîche de Calcein AM à 2 µM dans du HBSS⁺/⁺.
      2. Ajouter suffisamment de solution de coloration pour recouvrir complètement la surface de la dentine.
      3. Incuber l'échantillon pendant 20 min à 37 °C à l'abri de la lumière.
      4. Éliminer la solution de coloration après incubation.
   4. Coloration des cellules mortes
      1. Ajouter la solution travail d'iodure de propidium (1–2 µg/mL dans du HBSS⁺/⁺).
      2. Incuber l'échantillon pendant 5 à 8 min à 37 °C à l'abri de la lumière.
      3. Ne pas dépasser 10 min d'incubation.
      4. Laver l'échantillon deux fois avec du HBSS⁺/⁺.
      5. Maintenir l'échantillon immergé dans le tampon jusqu'à l'acquisition d'images.
   5. Acquisition par microscopie confocale
      1. Acquérir les images confocales dans les 30 min suivant la coloration.
      2. Acquérir les images séquentiellement dans les canaux vert et rouge.
      3. Utiliser λ_ex 490 nm et λ_em 515 nm pour l'imagerie des cellules vivantes.
      4. Utiliser λ_ex 535 nm et λ_em 617 nm pour l'imagerie des cellules mortes.
         ​NOTA : Protéger les solutions de coloration fluorescentes et les échantillons colorés de l'exposition à la lumière pendant les étapes d'incubation et d'acquisition d'images (Figure 2B).

Figure 2 : Évaluation représentative de l'adhérence et de la viabilité des cellules souches de la pulpe dentaire dans le dispositif OoC complexe dentine-pulpe. (A) Image de microscopie électronique à balayage montrant des cellules souches de la pulpe dentaire adhérentes (astérisque blanc) à la surface de la dentine après 24 heures de culture statique dans le dispositif OoC. Après 24 heures de culture, les cellules adhérentes recouvraient 54,35 ± 0,92 % de la surface de dentine exposée au microcanal. Aucune cellule n'est observée dans la région de la dentine recouverte par le PDMS (astérisque noir), indiquant un scellement efficace entre les couches du dispositif. Échelle = 200 µm. (B) Image de microscopie confocale montrant des cellules souches de la pulpe dentaire viables colorées en vert et adhérentes à la surface de la dentine (flèches blanches) après 24 heures de culture statique. Des cellules non viables colorées en rouge sont également observées (flèches bleues). Échelle = 50 µm. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Résultats

La fabrication réussie du dispositif dent-sur-puce a suivi le flux de travail illustré dans la Figure 1A–1I, comprenant la préparation du disque de dentine (Figure 1D), la fabrication du moule obtenu par photolithographie (Figure 1E), le retrait des couches de PDMS polymérisées (Figure 1F), l'activation au plasma avant collage (Figure 1G), l'assemblage du dispositif final (Figure 1H) et la connexion du dispositif au système microfluidique (Figure 1I). Le dispositif obtenu était constitué d'un assemblage en trois couches de PDMS dans lequel le disque de dentine était entièrement intégré dans la couche intermédiaire, les microcanaux supérieur et inférieur étant positionnés de part et d'autre de la surface de la dentine (Figure 1H).

Un résultat positif à ce stade était caractérisé par l'absence de bulles d'air visibles ou de délaminage, ainsi que par un passage fluide sans fuite après injection de PBS ou de milieu de culture à travers les ports d'entrée (Figure 1I). Un mauvais alignement des ports des microcanaux, une liaison au plasma incomplète ou des fuites à l'interface dentine–PDMS indiquaient un assemblage ayant échoué et nécessitaient la répétition de la procédure de fabrication.

Un total de 30 dispositifs ont été fabriqués, parmi lesquels environ 20 % ont échoué durant la fabrication ou les tests. L'échec était principalement associé à une fuite de fluide au-delà des limites du microcanal en raison d'une liaison au plasma incomplète, tandis qu'une proportion moindre d'échecs résultait d'un délamination dans d'autres régions du dispositif. Aucun échec n'a été attribué à une fuite à l'interface dentine–PDMS ou à un mauvais alignement des orifices d'entrée et de sortie du microcanal.

Après 24 heures de culture statique, la réussite du semis cellulaire a été confirmée par la présence de cellules souches de la pulpe dentaire adhérentes présentant une morphologie fibroblastique sur la surface de la dentine. La microscopie électronique à balayage a permis d'évaluer à la fois l'adhésion cellulaire et l'intégrité du dispositif (Figure 2A). Selon le protocole actuel, les cellules adhérentes recouvraient 54,35 ± 0,92 % de la surface de la dentine exposée au microcanal après 24 heures de culture. Un résultat positif était attesté par la présence de cellules adhérentes exclusivement dans la zone du microcanal, tandis que la surface de la dentine recouverte de PDMS restait exempte d'attachement cellulaire (Figure 2A). Cette distribution spatiale indiquait un scellement réussi entre les couches du dispositif et un assemblage correct du dispositif. En revanche, la présence de cellules au-delà des limites du microcanal indiquait une fuite et devait être considérée comme un résultat négatif.

La microscopie confocale utilisant une coloration vivant/mort a permis d'évaluer de façon non destructive la viabilité cellulaire à l'intérieur du dispositif. Un résultat concluant se caractérisait par une prédominance de cellules viables présentant une fluorescence verte et une morphologie fibroblastique, avec seulement quelques cellules non viables colorées en rouge (Figure 2B). En revanche, une forte proportion de cellules non viables indiquerait un prétraitement de la dentine sous-optimal, un lavage insuffisant ou des conditions de culture inadéquates.

Lors de l'optimisation du protocole, une stratégie initiale de fabrication a été évaluée, dans laquelle un moule fixe intégrant une empreinte prédéfinie était utilisé pour positionner le disque de dentine au sein de la couche intermédiaire de PDMS (Figure 3A). Bien que cette approche visait à standardiser le positionnement du disque et à réduire les fuites au niveau de l'interface disque–PDMS, elle s'est révélée inefficace en pratique. Comme la région correspondant à l'empreinte du disque de dentine devait être découpée manuellement dans la couche de PDMS polymérisée, une adaptation précise entre les bords du disque et les bords découpés du PDMS ne pouvait pas être obtenue de manière fiable, ce qui entraînait des espaces interfaciaux responsables de fuites dans environ 50 % des dispositifs fabriqués (Figure 3A).

Figure 3 : Images représentatives illustrant des approches de fabrication infructueuses identifiées lors de l'optimisation du dispositif OoC du complexe dentine-pulpe. (A) Moule en silicium contenant des logements fixes conçus pour positionner de manière standardisée les disques de dentine (flèches blanches). En raison de la variabilité intrinsèque des dimensions des disques de dentine résultant de la préparation manuelle des échantillons, une adaptation fiable à la géométrie fixe du moule n'a pas pu être obtenue, entraînant des espaces interfaciaux et des fuites dans environ 50 % des dispositifs fabriqués. (B) Image de microscopie électronique à balayage de la surface de la dentine après application d'un matériau d'étanchéité à l'interface disque-PDMS. La dentine exposée (astérisque noir) et les dépôts de matériau d'étanchéité (astérisque blanc) sont indiqués. La propagation involontaire du matériau d'étanchéité sur la surface de la dentine a compromis l'adhésion cellulaire et réduit la surface disponible pour la colonisation cellulaire. Échelle = 100 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Pour remédier à cette limitation, un matériau d'étanchéité a été appliqué à l'interface disque–PDMS. Toutefois, cette approche a introduit un inconvénient supplémentaire, car le matériau d'étanchéité s'est étendu sur la surface de la dentine et a empêché l'adhérence cellulaire dans les régions recouvertes, comme le montre la microscopie électronique à balayage (Figure 3B). Ces résultats sous-optimaux ont mis en évidence deux limitations critiques de la stratégie initiale de fabrication : une adaptation insuffisante entre la cavité PDMS découpée manuellement et le disque de dentine, et une adhérence cellulaire réduite associée au matériau d'étanchéité.

Discussion

Cette étude décrit un protocole étape par étape pour la fabrication d'un dispositif de type « dent-sur-puce » en empilement vertical intégrant de la dentine et des cellules souches de la pulpe dentaire, et illustre l'adhérence cellulaire et la viabilité représentatives au sein du dispositif dans des conditions de culture statique. Ce protocole a été conçu pour offrir un flux de travail reproductible permettant la fabrication et l'assemblage d'une plateforme OoC (organe-sur-puce) du complexe dentine-pulpe, adaptée à des études in vitro de l'interface dentinaire. La mise en place d'un tel protocole revêt une importance particulière, car notre récente revue systématique a mis en évidence que le domaine des modèles microfluidiques du complexe dentine-pulpe en est encore à un stade émergent, marqué par une forte hétérogénéité méthodologique en ce qui concerne l'architecture et les matériaux des dispositifs, ce qui compromet gravement la reproductibilité et la standardisation des modèles actuels de « dent-sur-puce »³⁴. En fournissant un protocole détaillé et reproductible, cette étude pallie ces limites et contribue au développement de modèles biologiques mieux définis. Dans le contexte plus large du développement des OoC appliqué à la biologie orale, França et al.¹⁵ ont été les pionniers du domaine avec un modèle microfluidique de « dent-sur-puce » intégrant des disques de dentine et des cellules de type odontoblaste, démontrant ainsi la faisabilité de la reconstitution de l'interface dentine-pulpe dans un environnement microfluidique dynamique, ainsi que l'évaluation de la réponse cytotoxique aux matériaux dentaires. Depuis cette contribution fondatrice, un nombre croissant de plateformes OoC orales a été rapporté dans la littérature³⁴, abordant divers aspects de la biologie des tissus dentaires, des interactions avec les biomatériaux et de la microbiologie orale, établissant ainsi cette approche comme un domaine de recherche actif et en expansion rapide. Le présent protocole s'inscrit dans ce paysage en proposant un flux de travail détaillé et reproductible pour la fabrication d'une plateforme « dent-sur-puce » en empilement vertical, accessible aux équipes de recherche disposant de compétences microfluidiques standard.

Plusieurs étapes du protocole sont cruciales pour la fabrication réussie et le bon fonctionnement du dispositif. En particulier, la coulée du PDMS sur le moule nécessite un contrôle rigoureux afin d'obtenir une épaisseur uniforme de la couche et une formation adéquate des microcanaux. L'épaisseur des couches de PDMS doit être choisie en fonction de l'application en aval prévue. Par exemple, la microscopie confocale exige des couches de PDMS suffisamment minces pour permettre la visualisation optique des cellules adhérées à la surface de la dentine. Toutefois, des couches plus minces peuvent être plus difficiles à manipuler durant les procédures de fabrication et d'assemblage. Par conséquent, l'optimisation de l'épaisseur du PDMS représente un compromis important entre l'accès à l'imagerie et la facilité de manipulation lors de la fabrication du dispositif. De plus, dans la présente étude, la microscopie confocale sur des dispositifs intacts n'était pas réalisable, car la couche de PDMS recouvrant les cellules avait une épaisseur de 0,4 mm, dépassant ainsi la profondeur de pénétration du microscope confocal disponible (0,2 mm). En conséquence, l'imagerie confocale a été effectuée après désassemblage du dispositif et exposition directe de la surface de la dentine. En outre, la microscopie en fluorescence n'était pas applicable dans ce dispositif, car l'opacité intrinsèque de la dentine empêchait la visualisation optique directe des cellules adhérées à sa surface.

Cette limitation est particulièrement pertinente pour les configurations de puces sur organe (OoC) empilées verticalement, dans lesquelles le microcanal contenant les cellules est positionné sous le disque de dentine, ce qui entrave l'accès optique en raison à la fois de la couche de PDMS superposée et de l'opacité de la dentine elle-même. Cette limitation n'est pas rencontrée dans les conceptions de puces empilées horizontalement, où les microcanaux s'étendent latéralement le long de la dentine plutôt que de se situer en dessous, permettant ainsi un accès optique direct à la surface ensemencée de cellules sans interférence de l'opacité de la dentine ou de l'épaisseur du PDMS. Le choix entre les configurations empilées verticalement et horizontalement doit donc prendre en compte non seulement les exigences fluidiques et biologiques, mais aussi les modalités d'imagerie disponibles dans le laboratoire. Dans un système OoC, la conception du dispositif joue un rôle important, et le microenvironnement doit être maintenu aussi proche que possible des conditions in vivo. Comme la plupart des tissus, la dent est soumise à des stimuli mécaniques et présente un comportement anisotrope³⁵, ce qui signifie que ses propriétés varient selon la direction du stimulus appliqué. De plus, des différences histologiques existent entre la portion coronaire du complexe dentine-pulpe, où la dentine et les odontoblastes sont disposés verticalement, et la portion latérale, où les odontoblastes sont adjacents à la dentine, avec des différences notables en nombre de cellules, en organisation et en orientation des tubules dentinaires. Une conception de puce empilée verticalement offre donc une représentation anatomique plus fidèle des lésions carieuses et des matériaux restaurateurs affectant la partie coronaire du complexe dentine-pulpe.

Un traitement précis de surface par plasma est essentiel pour une assemblage réussi des dispositifs et demeure l'un des principaux défis dans la fabrication de puces³⁶. Dans cette étude, un décollement a été observé dans 20 % des dispositifs fabriqués. Ce résultat n'est pas surprenant, car la liaison PDMS–PDMS obtenue à l'aide d'un stylo à plasma manuel, comme celui utilisé dans la présente étude, génère une concentration plus faible d'espèces réactives de l'oxygène comparée aux systèmes de chambre à plasma sous vide, qui permettent des concentrations d'oxygène supérieures aux niveaux atmosphériques et produisent par conséquent un plus grand nombre de groupes de surface covalents disponibles pour la liaison³⁶. Par conséquent, la résistance de la liaison obtenue avec un stylo à plasma est intrinsèquement inférieure et moins reproductible que celle obtenue avec une chambre à plasma dédiée, ce qui a probablement contribué au taux de décollement observé. L'optimisation de la stratégie d'intégration de la dentine a également nécessité plusieurs itérations de fabrication afin d'assurer un contact étroit entre le disque de dentine et la couche intermédiaire de PDMS tout en minimisant les fuites. Une approche initiale consistait à fabriquer une cavité prédéfinie dans la couche intermédiaire pour y insérer la dentine ; toutefois, la découpe manuelle de cette cavité empêchait une adaptation constante entre le disque de dentine et les bords du PDMS, entraînant des fuites lors de l'injection du milieu de culture et donnant un taux de réussite global de fabrication d'environ 50 %.

Un adhésif pour prothèses dentaires a ensuite été évalué afin d'améliorer l'étanchéité à l'interface dentine–PDMS, mais la microscopie électronique à balayage a révélé une interférence avec l'adhésion cellulaire et une visualisation réduite des cellules sur la surface de la dentine. Le protocole final a donc été optimisé en plaçant directement le disque de dentine dans le moule avant de couler soigneusement le PDMS autour de l'échantillon, améliorant ainsi l'intégration du disque de dentine dans le dispositif et réduisant la nécessité d'utiliser des matériaux d'étanchéité supplémentaires. Cette approche a efficacement éliminé les fuites à l'interface dentine–PDMS en assurant un contact étroit et conforme entre les bords du disque de dentine et le PDMS environnant, sans recourir à des agents d'étanchéité secondaires susceptibles d'interférer avec l'adhésion cellulaire à la surface de la dentine. Plusieurs limites de la méthode actuelle doivent également être prises en compte. La fabrication des dispositifs microfluidiques reste partiellement dépendante de procédures de manipulation manuelle, ce qui peut introduire des variations entre les dispositifs et les opérateurs. Bien que la photolithographie offre une grande précision et une reproductibilité élevée pour la fabrication des géométries des microcanaux, ce procédé peut nécessiter des équipements spécialisés et une expertise technique. Des approches alternatives de fabrication, notamment les techniques d'impression tridimensionnelle, pourraient faciliter la conception de prototypes et l'accessibilité du dispositif pour certains laboratoires ; toutefois, des facteurs tels que la résolution d'impression, les monomères résiduels et la biocompatibilité des matériaux exigent une optimisation rigoureuse³⁷.

L'apport continu de milieu fournit aux cellules un environnement stable et les protège contre l'accumulation de déchets ou un déséquilibre calcium/phosphate¹⁶. Plusieurs études ont montré que le stress de cisaillement induit par un flux constant peut simuler des processus de mécanotransduction similaires aux signaux in vivo, qui sont des déterminants clés du comportement cellulaire^38,39, contribuant à la différenciation et à la maturation cellulaires ainsi qu'à des modifications importantes de la morphologie, de l'expression génique et de la fonction cellulaire³⁹. La présente étude décrit la fabrication et la validation initiale du dispositif, démontrant l'adhésion cellulaire et la viabilité après 24 h en conditions de culture statique ; par conséquent, les effets d'un flux dynamique n'ont pas été évalués. La mise en œuvre de conditions de flux dynamique représente une piste importante pour les recherches futures et sera abordée dans des études ultérieures. Le protocole actuel fournit un flux de travail reproductible pour la fabrication d'un dispositif OoC du complexe dentine-pulpe organisé en empilement vertical, intégrant la dentine dans une plateforme microfluidique en PDMS à trois couches. Les applications potentielles de ce modèle incluent l'étude des interactions entre la dentine et les biomatériaux, les réponses cellulaires aux matériaux dentaires, ainsi que l'évaluation in vitro de l'interface dentine-pulpe dans des conditions expérimentales contrôlées.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux biologiques et chimiques
Acétone	ExpertQ	SOLV 8	Nettoyage de plaquette de silicium
Milieu de culture Alpha MEM	Cytiva	SH30265.02	Milieu de culture pour cellules souches de la pulpe dentaire
Chloramine (0,5 %)	Merck	7080-50-4	Solution de stockage pour disques de dentine
Cellules souches de la pulpe dentaire	Non applicable	Non applicable	Culture primaire de cellules. Voir les étapes 3.2.1 et 3.2.2
EDTA (10 %)	Winkler	N2222158E	Élimination de la couche de débris
Résine photosensible négative à base d'époxy	Gersteltec	GM1060	Fabrication d'un moule par photolithographie
Glutaraldéhyde (2,5 %) dans Sorensen 0,1 M’tampon phosphate s	Sigma-Aldrich	210908-06	Fixation pour MEB
Dents humaines saines (molaires ou prémolaires)	Non applicable	Non applicable	Échantillon humain
Isopropanol	ExpertQ	SOLV 16	Nettoyage du wafer, arrêt du développement et nettoyage du PDMS
Kit de viabilité LIVE/DEAD	Sigma-Aldrich	451	Coloration de viabilité par fluorescence.
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Corning	46-013-CM	Lavage et test de fuite
Base de PDMS et agent de réticulation (polydiméthylsiloxane)	Dow	Sylgard 184	Fabrication du dispositif
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	Développement du photo-résist
Bleu de trypan	Sigma Aldrich	T8154-100ml	Évaluation de la viabilité cellulaire
Trypsine	Corning	25-053-CI	Détachement cellulaire
Eau ultrapure	Cytiva	SH30529.01	Solution de lavage
Consommables et matériel de laboratoire
aiguilles de seringue 19G	Vmatic	VCB19050	Connexion du dispositif à une micropompe ou à une seringue
Punch-biopsie (diamètre : 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	Fabrication des ports d'entrée et de sortie
Tapis de découpe	Nicecool	Non applicable	Protection de la surface lors du poinçonnage
Disques de finition dentaire (par exemple, Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	Polissage de la dentine
Adaptateurs femelles Luer à emboîtement	Runze Fluidics	RH-M016	Connexion du tuyau
Bâtonnet de mélange en verre ou en plastique	Duran	Non applicable	Mélange du PDMS
Seringues hypodermiques	Cranberry	pc-12246	Semis cellulaire et test d'étanchéité
Compresse stérile sans peluches	Linderson	Non applicable	Élimination des débris de perforation
Adaptateurs mâles Luer	Runze Fluidics	RH-G016	Connexion du tube
Récipient de mélange	Duran	Non applicable	Préparation du PDMS
boîte de Pétri (140 mm) × 20 mm)	Deltalab	2000219	Culture cellulaire/incubation
Base en polytétrafluoroéthylène	CCTVal	Non applicable	Fabrication d'une couche intermédiaire de dentine
Plaque de silicium	Jiaozuo Commercial FineWin	Non applicable	Fabrication du moule
Tube en silicone	Runze Fluidics	96421	Connexion fluidique
flacon T75	Corning	353136	Expansion de cellules souches de la pulpe dentaire
Plaque de culture	SPL Life Sciences	30006	Préparation de la coloration et de l'imagerie en microscopie confocale
Équipements et instruments
Sécheur d'air	METALPLAN	TITAN-040	Séchage de l'air comprimé
Source d'air comprimé	SCHULZ	CSD-18.1	Nettoyage des moisissures et des surfaces
Microscope confocal	Olympus	Non applicable	Modèle : FV1000
Système de lithographie laser directe	Heidelberg	uPG 101	Exposition du photo-résist
Microscope électronique à balayage environnemental	Hitachi	Non applicable	Modèle : Quanta 400
Turbine à vitesse élevée	Nakanishi	Non applicable	Modèle : Pana-max2
Plaque chauffante	LabTech	EH20A Plus	Cuisson du wafer et cuisson de la résine photosensible
Panneau de flux laminaire	BioBase	BBS8V1708313D	Stérilisation du dispositif
Pompe microfluidique	Nouvelle ère	Non applicable	Modèle : 1002X-ES. Essai d'étanchéité à 10 µL/min
Moule microstructuré (fabriqué par photolithographie)	CCTVal	Non applicable	Voir l'étape 2.2 pour les spécifications de fabrication du moule
Étuve ou incubateur	Memmert	UN110	Durcissement du PDMS à 50 °C°C et consolidation des liaisons à 75°C
Chambre de nettoyage par plasma sous vide	Fari Plasma	GD-5	Activation plasma de plaquettes
Plasma Corona portable	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	Activation au plasma du PDMS
Ultrasonicateur	Elma Sonic	S 10 (H)	Nettoyage du wafer
Chambre à vide ou dessiccateur (250 mm)	Winglass	Non applicable	Dégazage du PDMS
Pompe à vide	ROCKER	300	Dégazage du PDMS