SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology) : une plateforme informatique intégrée pour rationaliser le flux de travail de la cryo-microscopie électronique

Résumé

Ce protocole démontre un flux de travail de cryomicroscopie électronique étape par étape utilisant une plateforme logicielle intégrée (SMART) qui relie l’acquisition de données, la reconstruction tridimensionnelle et la construction de modèles atomiques dans une interface unique basée sur navigateur. À titre d’exemple représentatif, la structure TRPML1 humaine est déterminée à une résolution de 2,38 Å.

Résumé

La cryomicroscopie électronique (cryo-EM) est devenue un outil central en biologie structurale, pourtant les flux de travail actuels nécessitent généralement plusieurs logiciels spécialisés pour l’acquisition de données, la reconstruction tridimensionnelle (3D) et la construction de modèles atomiques, ce qui conduit à des pipelines fragmentés et à des interventions manuelles fréquentes. Ici, nous présentons SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), une plateforme logicielle intégrée qui combine trois modules — DataSmart pour la collecte automatisée de données, CryoSmart pour le traitement d’images et la reconstruction 3D, et ModelSmart pour la construction de modèles atomiques basés sur l’apprentissage profond — au sein d’une interface unifiée accessible via navigateur. Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour faire fonctionner les trois modules. Le flux de travail comprend la navigation automatisée des échantillons et l’acquisition de données, la correction de mouvement, l’estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF), le picking de particules, la classification bidimensionnelle (2D), le raffinement 3D, l’amélioration cartographique et la génération de modèles atomiques. À titre d’exemple représentatif, nous avons appliqué l’ensemble du flux de travail pour déterminer la structure de TRPML1 humain, un canal cationique lysosomal perméable à Ca²⁺, atteignant une résolution globale de 2,38 Å grâce à la corrélation de coquille de Fourier (FSC) de référence au critère 0,143. Les trois modules (DataSmart, CryoSmart et ModelSmart) ont été appliqués séquentiellement au même ensemble de données TRPML1 dans cette étude. Le protocole est conçu pour être accessible à des utilisateurs ayant divers niveaux d’expérience en cryo-EM.

Introduction

Cryo-microscopie électronique : évolution technologique et impact biologique. La détermination de la structure protéique tridimensionnelle reste un défi central en biologie moléculaire, car la fonction biologique est étroitement liée à l’agencement spatial des résidus d’acides aminés. L’élucidation de ces configurations structurales est impérative pour déchiffrer les mécanismes enzymatiques, les interactions avec les ligands et les voies de signalisation cellulaire à résolution atomique. Cet impératif a conduit à des développements transformateurs en cryo-EM, qui est devenu une technique de biologie structurelle largement^{adoptée 1,2}.

L’analyse cryo-EM à particule unique (SPA) constitue une approche puissante pour obtenir des connaissances biologiques à travers divers types d’échantillons en résolvant des structures à haute résolution de complexes^{isolés 3}. Cela inclut des virus, des protéines membranaires, des assemblages hélicoïdaux et d’autres complexes macromoléculaires dynamiques et hétérogènes, couvrant une large gamme de tailles moléculaires — d’environ 50 kDa à des dizaines de mégadaltons.

La SPA cryo-EM est devenue une technique fondamentale pour résoudre les architectures tridimensionnelles (3D) des macromolécules biologiques, englobant trois étapes computationnelles interdépendantes : l’acquisition de données, la reconstruction 3D et la construction de modèles atomiques (Figure 1).

Lors de l’acquisition des données, des échantillons vitrifiés sont imagés dans des conditions de faible dose pour générer des films de micrographie, capturant des milliers de projections de particules dans des états proches de la région d’origine. Ces ensembles de données bruts sont ensuite traités à l’aide d’algorithmes d’alignement et de classification itératifs pour reconstruire les cartes de densité volumétrique. Enfin, des modèles atomiques sont construits et affinés pour s’adapter à la densité, élucidant les interactions moléculaires à une résolution proche de l’atomique.

L’analyse ci-dessus démontre que la sortie du cryo-EM ne représente que le point de départ du pipeline structurel. Transformer ces données brutes en modèles atomiques interprétables nécessite une cascade d’outils logiciels informatiques spécialisés. Ainsi, le logiciel sert de pont critique transformant les données brutes en modèles atomiques.

Écosystème logiciel cryo-EM fragmenté : outils actuels et limitations. Les flux de travail cryo-EM modernes reposent sur un patchwork d’outils logiciels spécialisés, chacun adressant des étapes distinctes :

Acquisition de données. Bien que de nombreux logiciels d’acquisition de données cryo-EM soient disponibles publiquement — y compris Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ et Auto-EMation¹¹ — ces outils produisent principalement des données vidéo brutes avec des capacités de traitement post-acquisition limitées. Les étapes critiques du flux de travail, telles que la définition des paramètres et la personnalisation des modèles, exigent encore des opérations manuelles laborieuses, nécessitant souvent trop de paramètres par ensemble de données. Cette dépendance à l’intervention d’experts introduit des défis de reproductibilité et des inefficacités de flux de travail, en particulier dans les scénarios à haut débit.

Reconstruction 3D. Cryo-EM a connu des avancées significatives dans les logiciels de reconstruction 3D, permettant une résolution quasi atomique des macromolécules biologiques. Parmi les outils les plus utilisés figurent RELION, cryoSPARC et EMAN2, chacun offrant des avantages et des limites distincts. RELION utilise une approche bayésienne pour l’affinement itératif, excellant dans la gestion de jeux de données hétérogènes et la réalisation de reconstructions à haute^{résolution 12}. Cependant, son intensité computationnelle et sa courbe d’apprentissage abrupte nécessitent souvent une intervention d’experts. cryoSPARC, grâce à l’accélération GPU et à l’apprentissage profond, réduit significativement le temps de traitement et est convivial¹³. EMAN2 propose une suite complète pour le picking de particules et la reconstruction 3D, mais nécessite un réglage manuel approfondi et ne dispose pas de capacités de retour en temps^{réel 14}. Bien que ces outils excellent dans certains aspects de la reconstruction 3D, ils restent limités à des fonctionnalités uniques, manquant d’intégration avec l’acquisition de données en amont ou la modélisation atomique en aval. Par exemple, RELION et cryoSPARC nécessitent un transfert manuel de données depuis un logiciel de contrôle de microscope, introduisant des inefficacités et des erreurs potentielles. De plus, aucun de ces outils ne permet d’évaluer la qualité en temps réel lors de la collecte des données ou de transition fluide vers la construction de modèles atomiques, ce qui entraîne des flux de travail fragmentés qui freinent le débit et la reproductibilité.

La dernière étape de calcul dans la détermination structurelle basée sur la cryo-EM est la construction de modèles atomiques, où les coordonnées moléculaires sont itérativement intégrées dans des cartes de densité reconstruites pour élucider les interactions au niveau atomique.

Bien que les approches conventionnelles de construction de modèles utilisent des algorithmes de minimisation d’énergie basés sur la physique — incorporant potentiels électrostatiques, interactions de van der Waals et contraintes de géométrie de liaison covalente — elles restent fortement dépendantes d’une intervention manuelle pour le placement initial du modèle, l’interprétation de densité et la validation^{stéréochimique} 15,16,17,18 . Cette dépendance à la curation d’experts limite non seulement le débit, mais introduit aussi des biais subjectifs, en particulier dans les régimes de basse résolution (< 4 Å) où les caractéristiques de densité sont ambiguës.

Pour surmonter ces contraintes, les méthodologies basées sur l’apprentissage profond (DL) sont apparues comme des solutions transformatrices, exploitant les réseaux de neurones pour automatiser l’extraction de caractéristiques, l’initialisation et le raffinement des modèles. Ces approches démontrent une amélioration des performances dans la gestion de cartes de densité bruyantes ou incomplètes tout en réduisant significativement l’intervention manuelle, comme en témoignent les récents benchmarks montrant une réduction de 40 à 60 % des étapes dépendantes de l’utilisateur par rapport aux pipelines^{conventionnels 19, 20, 21, 22.}

Cependant, ces méthodes nécessitent invariablement d’exporter des cartes de densité à partir d’un logiciel de reconstruction 3D et de les importer dans des systèmes de construction de modèles. Avant l’importation, des étapes de prétraitement supplémentaires — souvent impliquant des outils tiers — peuvent être nécessaires pour optimiser les cartes de densité. Ce flux de travail fragmenté nécessite des transferts de données répétitifs et des conversions de formats, créant des inefficacités. De plus, si les résultats initiaux de la construction du modèle sont insatisfaisants, les chercheurs doivent revenir à l’étape de reconstruction pour le recalcul, suivie d’un nouveau cycle de construction et de validation du modèle. De tels cycles itératifs entravent considérablement le débit et l’efficacité opérationnelle des pipelines de détermination structurelle cryo-EM.

1.3 SMART : Une solution intégrée pour la cryo-EM de bout en bout

Malgré des avancées significatives dans la cryo-EM SPA, l’absence de solutions computationnelles entièrement intégrées continue de freiner son potentiel pour la biologie structurale à haut débit. Les logiciels existants, bien qu’excellents dans l’automatisation de composants isolés de flux de travail — tels que l’acquisition de données ou la reconstruction 3D — ne comblent pas les lacunes critiques entre la collecte de micrographes brutes, l’affinement des cartes de densité et la construction de modèles atomiques. Cette fragmentation nécessite un transfert manuel de données, des conversions de formats et un réglage redondant des paramètres, ce qui entraîne des inefficacités qui s’aggravent avec l’échelle du jeu de données.

Pour remédier à ces limitations, nous présentons la plateforme intégrée de flux de travail cryo-EM, une plateforme informatique intégrée unifiant l’ensemble du pipeline cryo-EM SPA en un flux de travail cohérent piloté par l’IA. La plateforme intégrée intègre trois modules principaux : DataSmart (acquisition automatisée de données), CryoSmart (reconstruction 3D hybride compatible avec réseau de neurones) et ModelSmart (modélisation atomique basée sur l’apprentissage profond).

Les trois modules de calcul de la plateforme sont interconnectés via un flux de données standardisé, permettant un flux de données rationalisé où la sortie d’un module peut permettre d’ajuster les paramètres lors des étapes de traitement suivantes. Cette intégration vise à réduire le nombre d’étapes manuelles et de transferts de données requis dans les flux de travail cryo-EM conventionnels, améliorant potentiellement l’accessibilité et l’efficacité des laboratoires de biologie structurale.

Protocole

La lignée cellulaire Expi293F utilisée pour l’expression des protéines de la protéine TRPML1 humaine a été achetée auprès de Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (Numéro de catalogue : SC0236058). L’identité de la lignée cellulaire a été correctement authentifiée via un profilage Short Tandem Repeat (STR) (Fichier Supplémentaire 1).

Déclaration d’éthique
Cette étude n’a pas impliqué de participants humains, d’animaux, ni d’échantillons prélevés directement sur des humains ou des animaux. La protéine TRPML1 humaine a été produite par expression recombinante et purifiée in vitro. La lignée cellulaire Expi293F utilisée pour l’expression de protéines recombinantes est une lignée cellulaire immortalisée et établie disponible sur le marché. Par conséquent, l’approbation éthique institutionnelle ni le consentement éclairé écrit n’étaient pas requis.

REMARQUE : La plateforme intégrée de flux de travail cryo-EM est structurée en trois modules principaux : un module d’acquisition automatisée de données, un module de reconstruction 3D compatible avec un réseau de neurones hybride, et un module de modélisation atomique basé sur l’apprentissage profond, les données servant d’interface de communication entre ces composants logiciels, comme illustré à la Figure 2. Le système intégré de plateforme de workflow cryo-EM adopte une architecture Navigateur-Serveur (B/S), permettant aux utilisateurs d’effectuer toutes les opérations via une interface web, garantissant ainsi l’utilisabilité et l’accessibilité opérationnelle.

1. Acquisition automatisée de données

REMARQUE : La plateforme intégrée de flux de travail cryo-EM se compose de trois modules principaux : un module automatisé d’acquisition de données, un module de reconstruction 3D compatible avec un réseau de neurones hybride, et un module de modélisation atomique basé sur l’apprentissage profond. Les données servent d’interface de communication entre ces composants logiciels (Figure 2). Le système utilise une architecture Navigateur-Serveur (B/S) qui permet toutes les opérations via une interface web.

1. Initialisation du projet
   1. Créer un nouveau projet dans une plateforme logicielle automatisée de modules d’acquisition de données.
   2. Sélectionnez l’option pour hériter des paramètres de configuration d’un projet récent, si vous le souhaitez. Réutilisez les paramètres hérités pour la configuration du microscope électronique au lieu de créer une nouvelle configuration.
2. Inspection du déplacement de la poutre
   REMARQUE : Effectuer un réglage du décalage du faisceau dans le logiciel de contrôle du microscope électronique à transmission (TEM).
   1. Contrôle de faible grossissement (Atlas et GridSquare)
      1. Ouvre le module de Filtrage . Acquérez des images aux grossissements Atlas et GridSquare.
      2. Vérifiez que les images sont correctement éclairées et exemptes de décalage de faisceau. Assurez-vous que le centre de l’image n’est pas positionné au-dessus des barres de la grille.
   2. Contrôle de grossissement par acquisition de données
      1. Acquérir des images à la grossissement d’acquisition des données (par exemple, 60K ou 100K). Évaluez l’alignement de la poutre.
      2. Corrigez le décalage du faisceau avant de procéder si l’acquisition d’image échoue ou si un décalage important du faisceau est observé.
   3. Contrôle de grossissement eucentrique des trous
      1. Prenez des images au trou/grossissement eucentrique (généralement 8K). Ajustez le décalage du faisceau jusqu’à ce que le point d’éclairage soit centré si le faisceau ne l’est pas.
      2. Ne modifiez pas la position de l’ouverture. Vérifiez que la taille de l’ouverture correspond à celle utilisée lors de l’acquisition des données.
3. Ajustement de la hauteur en Z
   1. Auto-eucentrique Ajustement
      1. Accédez à la page Filtrage . Déplacez la scène vers une zone propre de film de carbone au niveau du trou/grossissement à hauteur eucentrique. Ouvrez le module Auto-Eucentrique sur la page AutoFonction .
      2. Cliquez sur Démarrer. Surveillez le panneau de journal pour détecter des retours. Déplacer un autre endroit et répéter la procédure si l’opération échoue.
   2. Réglage automatique de la mise au point
      1. Ouvrez le module AutoFocus sur la page AutoFonction . Cliquez sur Démarrer.
      2. Consultez les messages du journal. Ajustez les paramètres comme indiqué ou répétez la section 1.3.1 si l’autofocus échoue.
4. Vérification de l’alignement du grossissement
   1. Inspection de l’alignement
      1. Localisez une caractéristique distinctive au niveau du grossissement des données et prenez une image. Acquiers une image au niveau du trou/EucentricHeight.
      2. Comparez les régions centrales des deux images. Procéder à l’étalonnage si un désalignement est observé entre les grossissements de données et de trou.
      3. Inspectez l’alignement entre les grossissements de trou et de quadrillage si les grossissements de données et de trou sont alignés. Procéder sans calibration si tous les niveaux de grossissement sont alignés.
   2. Calibration par décalage de grossissement
      1. Accédez à la page Calibration . Ouvre le module de décalage de grossissement . Commencez par le grossissement de données ou le plus faible grossissement mal aligné.
      2. Obtenez une image à fort grossissement contenant une caractéristique particulière. Acquérez une image à faible grossissement correspondante. Évaluez le déplacement entre les deux images.
      3. Faites un clic droit sur l’emplacement correspondant au centre des caractéristiques dans l’image à faible grossissement. Sélectionnez déplacer ici. Reprenez l’image à haute grossissement et vérifiez l’alignement.
      4. Répétez l’ajustement si nécessaire. Cliquez sur Suivant pour passer à la paire de grossissement suivante une fois l’alignement effectué. Répétez la procédure de calibration pour toutes les paires de grossissement restantes mal alignées.
5. Préparation à la collecte de données
   1. Effectuer l’acquisition d’atlas, la sélection de carrés, l’imagerie carrée et la sélection de trous
      1. Ouvre le module Atlas . Laissez le champ de tuiles vide pour obtenir les 81 tuiles, ou entrez le nombre de tuiles souhaité à obtenir.
      2. Naviguez jusqu’à l’interface de sélection de cases . Faites un clic droit pour sélectionner les carrés appropriés.
      3. Accédez à la page de sélection des trous . Cliquez sur Préparer tout. Surveillez la fenêtre de journal jusqu’à la fin de l’acquisition de l’image.
      4. Sélectionnez une image carrée capturée dans la liste d’images. Utilisez la fonction Trouver des trous pour effectuer la sélection automatique lorsque les trous sont clairement visibles.
         ATTENTION : La détection automatique de trous peut échouer sur des grilles avec une épaisse glace ou une contamination de surface. Vérifiez visuellement les trous détectés avant l’acquisition et utilisez la méthode semi-automatisée de sélection des trous lorsque la détection automatique n’est pas fiable.
      5. Utilisez la fonction de sélection basée sur les graines lorsque la glace épaisse ou la contamination empêche une sélection automatique fiable (Figure 3).
         1. Choisissez un trou central. Sélectionnez deux trous adjacents formant un angle droit.
         2. Sélectionnez deux trous éloignés selon les directions définies par le deuxième et le troisième trou.
         3. Cliquez sur Envoyer. Activez Déplacer Tout lors du traitement d’une autre case. Faites glisser l’un des cinq trous de semence jusqu’à un trou dégagé. Cliquez sur Envoyer.
   2. Définition du modèle
      1. Accédez à la page de définition du modèle . Cliquez sur Acquérir pour obtenir une image. Vérifiez que l’image contient un trou complet.
      2. Faites un clic droit sur la zone cible et sélectionnez MoveStageTo si un trou complet n’est pas visible. Réacception de l’image modèle. Spécifiez la position de l’imagerie et l’emplacement de l’autofocus en faisant glisser les marqueurs correspondants.
      3. Entrez le nombre de frames par trou. Entrez la valeur de défocalisation souhaitée (par exemple, −1,5 μm). Vérifiez tous les paramètres d’acquisition (Figure 4).
6. Vérification du décalage de faisceau
   1. Répétez la section 1.2 après avoir terminé toutes les procédures de préparation.
7. Correction de l’astigmatisme et du coma
   1. Correction de l’astigmatisme
      1. Déplacez la scène vers une zone propre de film carbone. Ajustez la hauteur avec AutoFocus à la valeur de défocalisation souhaitée (par exemple, −1,5 μm). Ouvrez le module Autostigmate sur la page AutoFonction .
      2. Cliquez sur Démarrer. Surveillez la sortie Ctffind dans le panneau de log. Examinez les valeurs d’astigmatisme et d’adéquation à la résolution. Répétez la procédure dans une autre zone si l’astigmatisme reste élevé.
   2. Coma Correction
      1. Ouvrez le module Autocoma si les résultats de l’Autostigmate restent sous-optimaux après plusieurs tentatives. Cliquez sur Démarrer.
8. Collecte automatisée de données
   1. Naviguez vers la page AutoCollect . Cliquez sur Démarrer. Permettre au système d’effectuer automatiquement les calibrations AutoEmission et AutoZLP .
   2. Acquérir les données en utilisant les paramètres définis dans les paramètres de Filtrage, Acquisition de Données et Préparation. Surveillez le processus automatisé de collecte (Figure 5).
      POINT DE PAUSE : Une fois la collecte des données terminée, les piles de films acquises peuvent être stockées et le protocole repris à l’étape du traitement de l’image ultérieurement sans affecter les résultats en aval.
9. Surveillance instantanée à distance
   1. Surveillez l’avancement de la collecte via le module de surveillance à distance. Examinez les résultats de correction de mouvement en temps réel générés avec MotionCor2²³. Examinez en temps réel les mesures de l’astigmatisme et du défocalisation.
   2. Partagez l’URL de surveillance avec les utilisateurs autorisés. Accédez aux informations sur l’état de la collecte et la qualité des données depuis un ordinateur ou un appareil mobile. Examinez un exemple de fonctionnalité de surveillance à distance dans la Figure 6.

2. Reconstruction tridimensionnelle

REMARQUE : Utilisez un module de reconstruction 3D pour effectuer une reconstruction tridimensionnelle à partir de jeux de données d’images acquis précédemment. Le flux de travail comprend la création de projets, l’importation de micrographes, l’estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF), le picking de particules, l’extraction de particules, la classification 2D, la génération initiale de modèles et l’affinement 3D (Figure 7).

1. Création du projet
   1. Accédez à la page d’accueil du module de reconstruction 3D. Cliquez sur Projets pour ouvrir la page de gestion de projet. Cliquez sur NOUVEAU PROJET.
   2. Saisissez le nom du projet et spécifiez l’emplacement de stockage. Cliquez sur CRÉER PROJET. Cliquez sur Ouvrir à côté du projet nouvellement créé. Cliquez sur NOUVELLE expérience pour créer une nouvelle expérience.
      REMARQUE : Un projet représente une session globale de traitement des données, tandis qu’une expérience représente un flux de travail individuel de traitement au sein d’un projet. Plusieurs expériences peuvent être créées au sein d’un même projet.
2. Fichiers d’importation
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez Importer et cliquez sur Créer. Sélectionnez le type de fichier approprié. Importez les fichiers .mrc générés lors de l’acquisition des données. Voici la taille des pixels, la tension d’accélération et le nombre de processeurs. Cliquez sur la file d’attente pour le travail.
      REMARQUE : Pour terminer une tâche en cours, cliquez sur Éliminer, puis sur Effacer pour revenir la tâche à l’état du bâtiment. Pour les tâches terminées ou en file d’attente, cliquez sur Effacer pour réinitialiser le statut de la tâche.
3. CTF Estimation
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez Estimation CTF et cliquez sur Créer.
      REMARQUE : Le module de reconstruction 3D prend en charge plusieurs algorithmes d’estimation CTF. Ce protocole utilise CTFFIND4.
   2. Cliquez sur le bouton Connecter pour les Expositions. Sélectionnez les micrographies importées. Régler le contraste d’amplitude à 0,1, la résolution d’ajustement minimale à 30 Å, la résolution d’ajustement maximale à 4 Å, la valeur minimale de recherche de défocalisation à 5 000 Å, la valeur maximale de recherche de défocalisation à 50 000 Å et la taille de l’étape de recherche de défocalisation à 500 Å.
   3. Cliquez sur la file d’attente pour le travail.
4. Picking manuel des particules
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez Sélection de particules puis sélectionnez Sélecteur de blobs. Cliquez sur Créer. Cliquez sur le bouton Connecter pour les micrographies (expositions).
   2. Sélectionnez les micrographies importées. Entrez les paramètres requis. Cliquez sur la file d’attente pour le travail. Inspectez 3 à 4 micrographies représentatives. Sélectionnez les particules avec le bouton gauche de la souris.
   3. Désélectionnez les particules avec le bouton droit de la souris. Déterminez la plage de diamètres des particules à partir des particules sélectionnées. Cliquez sur la fin du choix ! Extraire les particules.
      REMARQUE : Mesurez les particules à partir d’au moins trois micrographies.
5. Sélecteur de blobs
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez Sélection de particules puis sélectionnez Sélecteur de blobs. Cliquez sur Créer. Relie les micrographies (expositions) entrées.
   2. Sélectionnez les micrographies importées. Entrez les paramètres requis. Cliquez sur la file d’attente pour le travail.
6. Inspecter les pics de particules
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez Inspecter les choix de particules. Cliquez sur Créer. Relie les micrographies (expositions) entrées. Connecte les entrées des Particules.
   2. Sélectionnez les fichiers correspondants. Entrez les paramètres requis. Cliquez sur la file d’attente pour le travail. Inspectez 3 à 4 images représentatives après la fin du travail.
   3. Vérifiez la bonne sélection des particules. Cliquez sur la fin du choix ! Emplacements de sortie.
7. Extraire les particules des micrographies
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez extrait à partir des micrographies. Cliquez sur Créer. Relie les micrographies (expositions) entrées. Connecte les entrées des Particules. Sélectionnez les fichiers correspondants.
   2. Réglez la taille de la boîte d’extraction à 2 à 3 fois le diamètre de la particule. Utilisez une boîte d’extraction de 400 pixels pour TRPML1. Fixez la taille de la culture de Fourier à un quart à la moitié de la taille de la boîte d’extraction.
   3. Utilisez une taille de recadrage de Fourier de 100 pixels pour TRPML1. Cliquez sur la file d’attente pour le travail.
      REMARQUE : Réduire la taille de la culture de Fourier diminue la demande de calcul GPU.
8. Classification bidimensionnelle
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez la classification 2D. Cliquez sur Créer. Connecte les entrées des Particules.
   2. Importez la pile de particules. Entrez les paramètres requis. Cliquez sur la file d’attente pour le travail.
      REMARQUE : Sélectionnez 50 à 200 classes. Utilisez moins de classes pour les jeux de données plus petits et plus de classes pour les ensembles de données plus grands.
9. Classes bidimensionnelles sélectionnées
   1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez les classes 2D sélectionnées. Cliquez sur Créer. Connecte les entrées des Particules. Connectez l’entrée des Templates.
   2. Importez les fichiers nécessaires. Cliquez sur la file d’attente pour le travail. Attends que le poste entre en état d’attente. Cliquez sur Attendre.
   3. Sélectionnez des classes 2D claires et bien définies. Cliquez sur terminé.
10. Génération initiale de modèles
    1. Clique sur Nouveau travail. Sélectionnez Abinit Reconstruction. Connecte les entrées des Particules. Importez les particules sélectionnées.
    2. Entrez le nombre de cours initiaux. Entrez le paramètre de symétrie. Cliquez sur la file d’attente pour le travail.
11. Raffinement hétérogène
    REMARQUE : Utilisez un raffinement hétérogène pour des échantillons hétérogènes et un raffinage homogène pour des échantillons homogènes.
    1. Clique sur Nouveau travail. Créez un travail de raffinement hétérogène. Connecte les entrées des Particules. Connecte l’entrée Volume.
    2. Sélectionnez les fichiers correspondants. Voici les paramètres de raffinement. Spécifiez la symétrie appropriée (par exemple, C1). Cliquez sur la file d’attente pour le travail.
12. Raffinement homogène
    1. Clique sur Nouveau travail. Créez un travail de raffinement homogène. Connecte les entrées des Particules. Connecte l’entrée Volume.
    2. Connecte éventuellement l’entrée Masque. Importez la pile de particules et la classe de volume la mieux performante de l’étape de raffinement précédente. Entrez les paramètres requis.
    3. Spécifiez la symétrie appropriée (par exemple, O ou C1). Cliquez sur la file d’attente pour le travail. Cliquez sur Sortie après la fin du travail. Inspectez la carte de densité reconstruite dans l’interface du navigateur (Figure 8).
13. Amélioration de la carte
    REMARQUE : Map Enhancer utilise DeepEMhancer²⁴. Utilisez des demi-cartes autant que possible. Les modifications post-traductionnelles et les molécules de ligand n’ont pas été incluses dans l’ensemble d’entraînement DeepEMhancer et peuvent ne pas être améliorées avec précision. Map Enhancer effectue l’affûtage local, le masquage automatisé et la réduction du bruit.
    1. Clique sur Nouveau travail. Créez un job d’Améliorateur de Carte. Importez le volume généré lors du raffinage homogène.
    2. Importez le masque correspondant. Importez les fichiers cartographiques via l’option Map Data Path si nécessaire. Exécutez le travail.

3. Une modélisation atomique basée sur l’apprentissage profond

REMARQUE : Un module de modélisation atomique basé sur l’apprentissage profond est basé sur le framework^{SMARTFold 25} précédemment développé et supporte la construction de modèles atomiques pour les protéines et les acides nucléiques (ARN/ADN) à partir de cartes de densité cryo-EM.

1. Lancez un module de modélisation atomique basé sur l’apprentissage profond
   1. Connectez-vous à un système de modules de modélisation atomique basé sur l’apprentissage profond. Ouvrez l’interface de soumission de tâches. Téléchargez la carte de densité cryo-EM dans le panneau de gauche.
   2. Entrez les paramètres d’entrée requis. Soumettez la tâche de modélisation.
2. Téléchargez la carte de densité cryo-EM
   1. Téléchargez la carte de densité au format .mrc, .ccp4 ou .map. Vérifiez que la taille du fichier est inférieure à 100 Mo.
      REMARQUE : Si la carte de densité dépasse 100 Mo, réduisez la taille du fichier avant de téléverser.
      1. Recadrez la carte de densité à la région d’intérêt à l’aide de UCSF ChimeraX²⁶ avec la commande : zone de volume. Rééchantillonner la carte à une taille de pixel plus grande.
      2. Appliquez un masque souple pour enlever les zones de solvant.
         REMARQUE : Inspectez la carte de densité avant de la télécharger afin d’assurer des performances optimales du modèle et de réduire le risque d’erreurs de traitement.
3. Inspecter et préparer la carte de densité
   1. Effectuez le recadrage de la carte de densité. Pour cette culture, la carte de densité permet de supprimer les régions inutiles. Vérifiez que la carte recadrée ne contient que la région requise pour la construction de modèles.
      REMARQUE : Le recadrage réduit la taille du fichier et aide à prévenir le débordement de mémoire lors de la génération du modèle.
   2. Ensuite, vérifie l’inversion du miroir. Inspectez la carte de densité pour détecter une possible inversion miroir. Examinez les régions hélicoïdales α sur la carte. Vérifiez que les hélices α présentent une configuration droitière et spiralent vers le haut dans le sens antihoraire. Inversez la carte de densité si une structure miroir est détectée.
4. Téléverser le fichier de séquence
   1. Téléchargez le fichier de séquence correspondant. Sinon, il faut entrer la séquence manuellement. Fournir toutes les séquences protéiques ou d’acides nucléiques incluses dans la reconstruction.
   2. Spécifier les informations de séquence hétéromérique ou homomérique lorsque cela est pertinent. Entrez le nom de la protéine, si désiré (étape optionnelle).
5. Spécifiez la résolution de la carte. Voici la résolution rapportée de la carte de densité cryo-EM. Sélectionnez la partition de calcul. Sélectionnez le nœud de calcul GPU à utiliser pour la génération de modèles.
6. Pour spécifier les ressources CPU, saisissez le nombre de processeurs à allouer. Ne dépassez pas huit processeurs. Examinez tous les fichiers et paramètres téléchargés. Cliquez sur SOUMETTRE pour lancer la génération du modèle.
7. Inspecter le modèle atomique prédit
   1. Ouvrez la fenêtre de visualisation interactive après la fin du travail. Faites pivoter le modèle pour inspecter les caractéristiques structurelles. Zoomez et dézoomez pour examiner les détails structurels locaux et globaux.
   2. Inspectez le modèle sous plusieurs orientations. Évaluer la qualité du modèle, la conformation spatiale et les caractéristiques au niveau atomique. Utilisez le modèle généré pour l’analyse et la validation en aval.
   3. Voir la figure 9 pour un exemple de l’interface de visualisation.

Résultats

TRPML1, également connu sous le nom de mucolipine-1 (MCOLN1), est un canal cationique lysosomal essentiel au maintien de l’homéostasie ionique, à la régulation du trafic vésiculaire et au soutien de l’autophagie chez les cellules de^{mammifères 27,28}. Le dysfonctionnement de TRPML1 dû à des mutations génétiques a été directement lié à la mucolipidose de type IV, un trouble neurodégénératif sévère de la réserve lysosomale caractérisé par un neurodéveloppement anorma...

Discussion

La détermination structurale des macromolécules biologiques par cryomicroscopie électronique (cryo-EM) implique intrinsèquement un flux de travail long et en plusieurs étapes, nécessitant une intégration étroite des outils informatiques et une confiance à l’intervention d’experts. La plateforme intégrée répond à ce défi en unifiant l’acquisition de données, la reconstruction 3D et la modélisation atomique dans un cadre unique et verticalement intégré — une étape vers des flux de travail ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Module de reconstruction 3D de la plateforme SMART; réseau neuronal hybride activé
Cryo-electron microscope	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Utilisé pour l'acquisition de données; équipé d'un filtre d'énergie
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Module d'acquisition de données automatisé de la plateforme SMART
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Post-traitement du volume cryo-EM basé sur l'apprentissage profond; intégré dans CryoSmart Map Enhancer
Direct electron detector	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Caméra utilisée pour l'enregistrement de films
Grid	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Grille de spécimen cryo-EM
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Module de modélisation atomique basé sur l'apprentissage profond de la plateforme SMART; étend le cadre SMARTFold
SMART Platform	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Plateforme cryo-EM intégrée; architecture Browser-Server (B/S); comprend les modules DataSmart, CryoSmart et ModelSmart
TEM control software	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Logiciel de contrôle de microscope électronique pour l'ajustement du déplacement du faisceau
Topaz	Open source	V 2.5	Outil de sélection de particules basé sur l'apprentissage profond; intégré en tant que module d'extension dans CryoSmart
TRPML1 protein sample	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	TRPML1 humain (mucolipine-1); préparé en interne par le département Protéines et Cristallographie
Vitrification device	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Pour la préparation d'échantillons cryo-EM
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Logiciel polyvalent pour l'affichage, l'analyse et plus encore
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Plateforme de flux de travail cryo-EM intégrée
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Cadre d'apprentissage en profondeur sous-jacent à ModelSmart
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Logiciel automatisé d'acquisition de données cryo-EM
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	Logiciel automatisé d'acquisition TEM/cryo-EM
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Logiciel automatisé de collecte de données cryo-EM
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Acquisition cryo-EM automatisée multi-grille
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Logiciel d'acquisition en microscopie électronique
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Système d'acquisition cryo-EM automatisé
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	Logiciel d'acquisition cryo-EM automatisé
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Logiciel de reconstruction cryo-EM bayésien
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Traitement d'image et reconstruction cryo-EM
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Suite de traitement d'image cryo-EM
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	Logiciel d'estimation CTF
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	Estimation CTF accélérée par GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Logiciel de correction de mouvement
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Amélioration de carte cryo-EM basée sur l'apprentissage en profondeur
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	Sélection de particules par apprentissage en profondeur
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	Logiciel de visualisation moléculaire
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	Ajustement CTF utilisé dans le flux de travail CryoSmart
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	Carte de référence TRPML1 humaine
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	Jeu de données de référence β-galactosidase
Transmission Electron Microscope (TEM)	Not specified	N/A	Utilisé pour l'acquisition de données cryo-EM
FEI Tecnai Electron Microscope	FEI (now Thermo Fisher Scientific)	Not specified	Mentionné dans le flux de travail cité
Energy Filter	Not specified	N/A	Utilisé pendant la collecte automatisée
GPU Computing Node	Not specified	N/A	Utilisé pour les calculs ModelSmart