Une méthode chIRP à base d’UV pour l’identification vérifiable des protéines qui interagissent directement avec lncRNA : des cellules cultivées au testicule de souris

Résumé

Une méthode ChIRP à base d’UV pour identifier les interactions directes entre lncRNA et protéine.

Résumé

Les ARN longs non codants (ARNnc) sont devenus des régulateurs importants de divers processus biologiques. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents aux fonctions de la plupart des ARNnc restent mal compris. L’identification des protéines interagissantes, en particulier les protéines liant l’ARN (RBP), est une stratégie clé pour élucider la fonction des ARNnc. Parmi les approches disponibles, l’identification complète des protéines de liaison à l’ARN (ChIRP) couplée à la spectrométrie de masse est largement utilisée en raison de sa conception simple de la sonde et de son flux de travail simple. Le ChIRP conventionnel repose sur la réticulation par paraformaldéhyde (PFA), qui capture à la fois les contacts directs ARN-protéine et les interactions indirectes médiées par des facteurs de pont. En revanche, la réticulation UV combinée à des conditions de lavage strictes préserve préférentiellement les interactions directes ARN-protéine. En utilisant l’ARNn Tug1 comme modèle, la réticulation UV et la réticulation PFA ont été comparées dans le cadre ChIRP dans des cellules cultivées, démontrant que le ChIRP à base d’UV enrichit les interactions directes entre lncRNA et protéine. Ce flux de travail basé sur les UV a ensuite été étendu aux testicules de souris, où les tissus étaient dissociés en suspensions unicellulaires avant la réticulation UV, permettant l’identification des protéines de liaison Tug1 dans un contexte tissulaire natif. La comparaison avec des interactomes dérivés de lignées cellulaires a révélé à la fois des interacteurs partagés et spécifiques aux tissus. Deux interactions directes partagées ont été validées indépendamment par une immunoprécipitation réticulée améliorée (eCLIP). Cette approche ChIRP à base d’UV est appelée cPDiRT (capture de protéines interagissant directement avec une cible ARN). Ensemble, cPDiRT permet d’identifier des protéines liant l’ARNnc tant dans les cellules cultivées que dans les tissus natifs. La combinaison de la dissociation tissulaire et de la réticulation UV offre une stratégie largement applicable pour étudier les interactions directes entre lncRNA et protéine à travers divers systèmes d’organes.

Introduction

Des études transcriptomiques récentes à haut débit ont mis au jour des milliers d’ARN longs non codants (ARNnc) qui participent à divers processus biologiques, allant de l’organisation de la chromatine à la signalisation^{cellulaire 1,2}. Malgré leur expression généralisée et leur importance fonctionnelle, les mécanismes moléculaires de la plupart des lncRNA restent peu définis. Un obstacle majeur est l’identification de leurs partenaires protéiques physiques, en particulier les protéines liant l’ARN (^RBPs)3,4,5.

Les méthodes actuelles centrées sur l’ARN reposent principalement sur la réticulation chimique, qui capture à la fois les interactions directes et indirectes ARN-protéine. En conséquence, ces approches sont plus adaptées à la cartographie globale par interactomes qu’à l’identification de contacts directs^{véritables 6}. L’identification complète des protéines de liaison à l’ARN suivie de spectrométrie de masse (ChIRP-MS) est une technique largement utilisée pour cartographier les interactions lncRNA-RBP grâce à sa conception simple de la sonde et son flux de travail^{efficace 7,8}. Le ChIRP-MS conventionnel utilise le métaculation par paraformoldéhyde (PFA), qui capture à la fois les contacts directs ARN-protéine et les associations indirectes médiées par des facteurs de^{pontage 9,10}.

En revanche, la réticulation UV à 254 nm offre un avantage crucial. Il lie covalentement l’ARN et les protéines uniquement lorsqu’ils sont en contact proche de zéro distance (généralement <1 Å)¹¹. Ce procédé convertit les liaisons hydrogène en liaisons covalentes stables et permet des conditions strictes de lavage à haute teneur en sel qui éliminent les interacteurs indirects non liés de façon covalente. Par conséquent, les approches basées sur les UV offrent une plus grande spécificité pour les interactions directes ARN-protéine que les méthodes de réticulation^{chimique 12,13}. Néanmoins, les approches basées sur les UV restent sous-utilisées dans les études d’interactomes d’ARNlcRNA issus des tissus, principalement en raison de préoccupations concernant l’efficacité de la réticulation et la pénétration limitée des UV.

Pour étudier les interactions directes ARNN-protéine dans un contexte physiologiquement pertinent, l’ARNlnc Tug1 a été sélectionné comme système modèle. Tug1 représente une référence idéale pour valider un flux de travail d’interaction directe compatible avec les tissus, en raison de son phénotype de knockout sévère et de son enrichissement élevé du testicule. L’ablation génétique de Tug1 entraîne une stérilité masculine complète, une spermatogenèse altérée et une morphologie anormale^{des spermatozoïdes 14}. De plus, Tug1 soutient la fonction des cellules de Sertoli et l’intégrité de la barrière sanguin-testiculaire chez les souris riche en^{graisses 15}. Malgré ces phénotypes bien établis, les partenaires protéiques directs qui médient la fonction Tug1 dans le testicule — un organe exprimant un grand nombre de RBP récemment profilés^{expérimentalement 16} — restent inconnus. Cette lacune de connaissances reflète en grande partie le fait que la plupart des méthodes de cartographie des interactions ARNN-protéine ont été développées pour les systèmes cellulaires en culture.

Pour répondre à cette limitation, le cadre ChIRP a été modifié en remplaçant la réticulation PFA par la réticulation UV afin de capturer les protéines qui interagissent directement avec Tug1. Les interactions candidates ont été validées indépendamment par une immunoprécipitation par réticulation renforcée, suivie d’un séquençage profond (eCLIP-seq⁾¹⁷. Le flux de travail a été étendu aux applications tissulaires en dissociant des testicules de souris frais en cellules uniques avant la réticulation UV. Cette approche optimisée a été désignée cPDiRT (capture de protéines interagissant directement avec une cible ARN).

L’application de cPDiRT à Tug1 dans le testicule de la souris a permis la cartographie d’interaction directe dans un contexte tissulaire natif. Des expériences parallèles dans des cellules cultivées ont permis de comparer côte à côte les profils d’interaction basés sur le PFA et les UV. Combinée à une validation indépendante d’eCLIP, cette approche a généré un ensemble de partenaires moléculaires à haute confiance qui pourraient contribuer à la fonction de Tug1 lors de la spermatogenèse. Le protocole présenté ici permet de capturer des protéines qui interagissent directement avec un ARNnc cible, tant dans les cellules cultivées que dans les tissus natifs. En définissant l’interactome direct de Tug1 dans le testicule, cette méthode fait progresser les études mécanistes d’un ARNlnc essentiel à la fertilité et fournit une plateforme généralisable pour étudier les interactions ARNN-protéine dans les tissus reproducteurs et autres tissus complexes.

Protocole

Toutes les solutions ont été préparées à l’aide d’eau ultrapure sans nucléase et protéase, ainsi que des réactifs. Tous les réactifs et équipements sont listés dans le tableau des matériaux.

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale de Nankin (Approbation n° : IACUC-1812003-4) et ont été menées conformément au Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (Conseil national de la recherche, 8e édition). Maintenir les mâles C57BL/6 souris (4 semaines) dans un cycle de 12 h clair/12 h sombre avec un accès improvisé à la nourriture et à l’eau. Minimisez la souffrance animale en utilisant le moins d’animaux nécessaire pour atteindre une signification statistique. Euthanasiez les souris par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale selon les protocoles institutionnels approuvés.

1. Préparer les tampons

1. Préparer le tampon de lyse cellulaire
   1. Préparez un tampon de lyse cellulaire contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM d’EDTA et 1 % de SDS.
   2. Juste avant l’utilisation, ajoutez 1 mM de PMSF, un cocktail inhibiteur de protéase et un inhibiteur spécialisé de RNase.
      ATTENTION : Le SDS est un irritant pour la peau et les yeux. Évitez d’inhaler de la poussière ou des aérosols. Le PMSF est hautement toxique, agit comme un inhibiteur de la cholinestérase et est instable en solution aqueuse. Préparez le PMSF immédiatement avant utilisation. Portez des gants et des lunettes de sécurité lorsque vous manipulez ces réactifs. Manipulez le PMSF dans une hotte chimique.
2. Préparer le tampon d’hybridation
   1. Préparez un tampon d’hybridation contenant 750 mM de NaCl, 1 % de SDS, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM d’EDTA et 15 % de formamide.
   2. Juste avant l’utilisation, ajoutez 1 mM de PMSF, un cocktail inhibiteur de protéase et un inhibiteur spécialisé de RNase.
      REMARQUE : Conservez la formamide à 4 °C, protégée de la lumière.
      ATTENTION : Le formamide est un tératogène et un risque reproductif. Manipulez la formamide dans une hotte chimique en portant des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Évitez l’inhalation et le contact cutané.
3. Préparez le tampon de lavage
   1. Préparez un tampon de lavage contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM d’EDTA, 1 % NP-40, 0,1 % de SDS et 0,5 % de désoxycholate de sodium.
   2. Protégez le tampon de lavage de la lumière pendant le stockage.
4. Préparez le tampon de protéinase K (PK)
   1. Préparez un tampon PK contenant 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM d’EDTA et 0,5 % de SDS.
   2. Ajoutez la protéinase K à une concentration finale de 5 % juste avant l’utilisation.

2. Concevoir et préparer les sondes

1. Conception de sondes antisens
   1. Concevez des sondes oligonucléotides antisens en utilisant le concepteur de sondes en ligne disponible à^{partir du 18} singlemoleculefish.com.
2. Obtenir des sondes biotinylées
   1. Commandez des sondes d’ADN antisens contenant une modification 3'-BiotinTEG.
3. Préparez la piscine de sondes
   1. Diluez chaque sonde individuellement à 100 μM.
   2. Mélangez des volumes égaux de toutes les sondes pour générer un pool de sondes. Maintenir une concentration finale combinée d’oligonucléotides de 100 μM.
   3. Stockez la piscine de sondes à -20 °C.
      REMARQUE : Les paramètres recommandés de conception de la sonde sont les suivants : (i) une sonde pour 100 pb d’ARN cible, (ii) une teneur en GC cible de 45 %, (iii) une longueur de sonde de 20 nt, et (iv) un espacement de 60 à 80 nt entre les sondes.
      REMARQUE : Si l’ARN dépasse la limite de taille acceptée par le concepteur de la sonde, divisez la séquence en segments plus petits avant la conception. Excluez les régions répétitives et celles avec une homologie de séquence étendue.

3. Effectuer la prélèvement cellulaire, la dissociation tissulaire et la réticulation UV

1. Préparez des contrôles sans UV
   1. Préparez les échantillons témoins en parallèle avec les échantillons expérimentaux.
   2. Omettez l’étape de la réticulation UV dans les échantillons témoins.
   3. Effectuer toutes les procédures suivantes, y compris la sonication, le tirage vers le bas de l’ARN-protéine, l’extraction d’ARN et l’extraction des protéines, de manière identique pour les deux groupes.
      REMARQUE : Utilisez le contrôle sans UV pour distinguer les interactions ARN-protéine dépendantes des UV de la liaison de fond non spécifique.
2. Prélever des cellules et effectuer la réticulation UV
   1. Cellules cultivées à lavage
      1. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pour retirer le milieu de culture résiduel.
   2. Cellules de réticulation
      1. Répartir 3 mL de PBS uniformément sur un bol de culture de 15 cm.
      2. Irradier les cellules dans un réticulateur UV de 254 nm à une dose de 4000 mJ/^cm2.
   3. Collecter les cellules réticulées
      1. Collectez les cellules dans PBS après la réticulation.
      2. Centrifugez la suspension et jetez le surnageant.
      3. Peser le granule et confirmer une masse minimale de 500 mg par échantillon.
3. Dissociez le tissu testiculaire et effectuez la réticulation UV
   1. Préparez les testicules
      1. Décapsulez les testicules.
      2. Lavez le mouchoir deux fois avec du DMEM.
   2. Effectuer la digestion de la collagénase
      1. Incubez le tissu dans un DMEM contenant 1 mg/mL de collagénase IV à 37 °C pendant 5 à 15 minutes.
      2. Poursuivre la digestion jusqu’à ce que les tubules séminifères soient libérés.
         REMARQUE : Ne pas dépasser 15 minutes de digestion.
   3. Laver les tubules séminifères
      1. Centrifugez la suspension à 1000 × g pendant 1 minute à 4 °C.
      2. Retirez le surnageant.
      3. Lavez le granule avec 5 à 10 mL de DMEM.
      4. Centrifugeuse à nouveau dans les mêmes conditions.
   4. Effectuer la digestion de la trypsine
      1. Resuspendez le pellet dans 0,25 % de trypsine contenant 1 mg/mL de DNase I.
      2. Incubez à 37 °C pendant 5 à 15 minutes.
         REMARQUE : Ne pas dépasser 15 minutes de digestion.
   5. Arrêter la digestion enzymatique
      1. Ajoutez un volume équivalent de DMEM complété par 10 % de FBS.
   6. Générer une suspension à cellule unique
      1. Filtrez la suspension à travers un filtre à cellules de 70 μm.
   7. Cellules de lavage
      1. Centrifugez les cellules à 2000 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
      2. Jetez le surnageant.
      3. Lavez le pellet avec 5 à 10 mL de PBS.
      4. Centrifugeuse à nouveau dans les mêmes conditions.
   8. Cellules testiculaires réticulées
      1. Resuspendez la suspension à cellule unique dans PBS.
      2. Répartissez la suspension uniformément sur un plat de culture de 15 cm.
      3. Irradier les cellules dans un réticulateur UV de 254 nm à une dose de 4000 mJ/^cm2.
   9. Collecter les cellules réticulées
      1. Pour les contrôles sans UV, omettez l’irradiation.
      2. Collectez les cellules dans le PBS.
      3. Centrifugez la suspension et jetez le surnageant.
      4. Peser le granule et confirmer une masse minimale de 500 mg par échantillon.
         REMARQUE : Le nombre de souris nécessaires pour obtenir environ 500 mg de granule cellulaire dépend de l’âge et du rendement tissulaire. Environ 10 à 12 souris âgées de quatre semaines ont été utilisées dans cette étude.

4. Effectuer la sonication

1. Préparer les lysats
   1. Resuspendez les granulés cellulaires dans le tampon de lyse cellulaire à un ratio de 100 mg de granule pour 1 mL de tampon.
   2. Mélangez soigneusement pour obtenir une suspension homogène.
2. Échantillons sonores
   1. Sonicez les lysates à l’aide d’un sonicateur à bain-marie ou d’un ultrasonicateur focalisé.
   2. Continuez la sonication jusqu’à ce que le lysat devienne visuellement clair.
      REMARQUE : Vérifier la fragmentation de l’ADN par électrophorèse sur gel d’agarose. Continuez la sonication jusqu’à ce que la plupart des fragments d’ADN soient entre 1 et 2 ko.

5. Effectuer un pull-down ARN-protéine

1. Collecter des échantillons d’entrée
   1. Retirez les aliquotes de lysat pour les contrôles d’entrée.
   2. Réservez environ 10 μL pour l’analyse de l’ARN et 10 μL pour l’analyse des protéines.
   3. Maintenir les échantillons d’entrée à 37 °C pendant les procédures d’hybridation et de lavage.
2. Lysats préclairs
   1. Ajoutez 30 μL de billes magnétiques pré-lavées à chaque échantillon.
   2. Incubez les échantillons à 37 °C pendant 30 minutes en les mélangeant doucement dans un four d’hybridation.
      REMARQUE : Lavez les billes magnétiques avant utilisation. Placez les aliquotes de billes sur un support magnétique pendant 1 minute ou jusqu’à ce que la solution soit claire. Retirez complètement la solution de stockage. Lavez les billes deux fois avec 500 μL de tampon de lyse cellulaire.
3. Retirez les billes de préclairage
   1. Placez les échantillons sur un support magnétique.
   2. Transférez le surnageant dans un tube frais.
   3. Répétez le transfert une fois pour garantir l’élimination complète des perles résiduelles.
4. Sondes hybrides
   1. Ajoutez deux volumes de tampon d’hybridation à chaque échantillon.
   2. Ajouter des sondes à un rapport de 1 μL de stock de sonde de 100 μM pour 1 mL de lysat (Tableau supplémentaire 1).
5. Réactions d’hybridation par incubation
   1. Incuber des échantillons à 37 °C avec une rotation de bout en bas pendant 12 à 16 heures dans un four d’hybridation.
6. Préparer les billes de capture
   1. Laver 100 μL de billes magnétiques trois fois avec un tampon de lyse cellulaire immédiatement avant la fin de l’hybridation.
   2. Retirez tout tampon résiduel après le lavage final.
7. Capture des complexes liés à la sonde
   1. Quelques réactions d’hybridation par centrifugeuse.
   2. Résuspendez les billes lavées dans 1 mL d’échantillon hybridé.
8. Lier les complexes aux perles
   1. Remis la suspension à billes dans le tube d’origine.
   2. Incubez à 37 °C en mélangeant pendant 30 à 40 minutes.
9. Récupérer les perles
   1. Quelques échantillons par centrifugeuse brièvement.
   2. Placez les tubes sur un support magnétique pendant 1 à 2 minutes ou jusqu’à ce que la solution soit claire.
   3. Jetez le surnageant.
   4. Retirez le liquide résiduel à l’aide d’une pointe de pipette.
      REMARQUE : Évitez de déranger la pellete magnétique lors de l’élimination du liquide.
10. Complexes capturés par le lavage
    1. Ajoutez 1 mL de tampon de lavage.
    2. Lavez les billes à 37 °C avec un mélange continu pendant 5 minutes.
    3. Répétez la procédure de lavage cinq fois.
       REMARQUE : Le tampon de lavage contient 1 M NaCl, qui perturbe les interactions protéine-protéine et protéine-ARN non covalentes tout en préservant les réticulations covalentes induites par les UV. Ces conditions strictes éliminent les interacteurs indirects et le fond non spécifique, enrichissant ainsi les partenaires protéiques^{directs 19}.
11. Matériel de réserve pour l’analyse de l’ARN
    1. Transférez 1 % à 10 % des billes lavées dans un tube frais pour une analyse d’ARN.
    2. Utilisez immédiatement les billes restantes pour l’extraction des protéines ou conservez-les à -80 °C.
       REMARQUE : Mettez le protocole en pause ici si nécessaire. Conservez les échantillons de billes à -80 °C jusqu’à l’extraction des protéines.
12. Protéines élutes
    1. Ajoutez un tampon d’échantillon SDS aux billes.
    2. Faites bouillir les échantillons à 95 °C pendant 30 minutes pour éluer les protéines et inverser les réticulations.
    3. Passez à l’analyse par spectrométrie de masse.

6. Extraction de l’ARN

1. Protéines digestes
   1. Resuspendez des échantillons d’ARN lié à la perle dans 100 μL de tampon PK.
   2. Ajustez les échantillons d’ARN à un volume final de 100 μL à l’aide d’un tampon PK.
2. Incuber avec la protéinase K
   1. Incubez les échantillons à 50 °C pendant 45 minutes avec un mélange continu.
3. Inactivation de la protéinase K
   1. Chauffez à 95 °C pendant 10 minutes.
4. Ajouter un réactif TRIzol
   1. Ajoutez 500 μL de réactif TRIzol à chaque échantillon.
   2. Vortex complètement.
   3. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
      ATTENTION : Le réactif Trizol contient du phénol et du thiocyanate de guanidine. Manipulez le réactif dans une hotte chimique en portant des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Évitez l’inhalation et le contact cutané. En cas de contact cutané, lavez-vous immédiatement avec du savon et de l’eau.
5. Effectuer la séparation de phase
   1. Ajoutez 100 μL de chloroforme à chaque échantillon.
   2. Vortex complètement.
   3. Incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
6. Récupérer la phase aqueuse
   1. Centrifugez les échantillons à 4 °C pendant 15 minutes.
   2. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais.
7. Liez l’ARN aux colonnes de purification
   1. Ajoutez un volume égal de 100 % d’éthanol à la phase aqueuse.
   2. Mélangez soigneusement.
   3. Chargez les échantillons sur les colonnes de purification de l’ARN.
8. Purifier l’ARN
   1. Effectuez le nettoyage de l’ARN selon les instructions du fabricant.
   2. Élute de l’ARN dans 30 μL d’eau sans nucléase.
9. Vérifier l’enrichissement de l’ARN par qRT-PCR
   1. Utilisez 1 μL d’ARN élué par réaction pour la PCR quantitative par transcription inverse (qRT-PCR).
   2. Évaluer l’enrichissement de l’ARN cible par rapport aux témoins.

7. Effectuer une analyse LC-MS/MS

1. Séparer les protéines par SDS-PAGE
   1. Mélangez les protéines obtenues à l’étape 5.12 avec 4× tampon d’échantillon LDS.
   2. Séparer les protéines sur un gel Bis-Tris à 4 % à 12 %.
   3. Teignez le gel à l’aide d’un kit de coloration argenté.
   4. Supprimez toute la voie protéique en une seule bande.
2. Pièces de gel d’accise
   1. Retirez l’anneau protéique avec un scalpel propre.
   2. Minimisez la quantité excessive de gel.
   3. Coupez le gel en environ 1^{mm 3} morceaux.
   4. Transférez les morceaux de gel dans un tube de 0,5 mL.
3. Pièces de gel de détention
   1. Ajoutez 100 μL de solution anticolorante.
   2. Vortex pendant 10 minutes.
   3. Centrifugeuse à 14 000 × g pendant 1 minute.
   4. Retirez le surnageant.
   5. Répétez la procédure de décoloration jusqu’à ce que les morceaux de gel deviennent transparents.
4. Réduire les protéines
   1. Ajoutez 100 μL de solution de réduction.
   2. Incubez à 56 °C pendant 30 minutes.
   3. Des échantillons refroidis à température ambiante.
   4. Centrifugez brièvement et retirez le surnageant.
5. Protéines alkylates
   1. Ajoutez 100 μL de solution d’alkylation.
   2. Incubez à température ambiante pendant 20 minutes dans le noir.
   3. Retirez le surnageant.
   4. Lavez les morceaux de gel avec 100 μL de tampon digestif pendant 5 minutes.
6. Protéines digestes
   1. Ajoutez suffisamment de solution de trypsine pour recouvrir complètement les morceaux de gel.
   2. Incuber à 37 °C pendant 16 à 18 heures.
7. Peptides extraits
   1. Ajoutez 30 μL de solution d’extraction.
   2. Sonicate pendant 15 minutes ou vortex pendant 30 min.
   3. Centrifugeuse à 14 000 × g pendant 1 minute.
   4. Transférez le surnageant dans un tube frais.
   5. Répétez la procédure d’extraction deux fois.
   6. Regroupez tous les extraits.
   7. Extraits secs en pool dans un concentrateur sous vide pendant environ 1 heure.
8. Nettoyez les peptides à l’aide d’un StageTip
   1. Resuspendez les peptides séchés dans 20 μL d’acide formique (FA) à 0,1 %.
   2. Chargez les échantillons sur un StageTip C18.
   3. Centrifugez à 1 000 × g pendant 2 minutes.
   4. Lavez le StageTip avec 20 μL de 0,1 % de FA.
   5. Des peptides élués avec 20 μL d’acétonitrile/0,1 % d’ACA dans un flacon de LC-MS.
   6. Séche l’éluat.
   7. Resuspendre les peptides dans 10 μL de 0,1 % d’AF.
      REMARQUE : Mettez le protocole en pause ici si nécessaire. Conserver les peptides purifiés à -80 °C avant l’analyse LC-MS/MS.
9. Acquisition des données LC-MS/MS
   1. Reconstituez les peptides dans 0,1 % d’acide formique.
   2. Séparer les peptides sur une colonne analytique de 75 μm × 250 mm C18 à un débit de 300 nL/min.
   3. Appliquez le gradient B du solvant suivant (acide formique à 0,1 % dans l’acétonitrule) :
      2 %–25 % B sur 0–40 min
      25 % à 40 % B sur 40 à 48 min
      40 % à 99 % B sur 50 à 57 min
      Maintenez à 99 % de B pendant 3 minutes
   4. Faire fonctionner le spectromètre de masse en mode acquisition dépendante des données.
   5. Acquérir des spectres MS à balayage complet sur une plage m/z de 350–1200 à une résolution de 70 000.
   6. Acquérir quinze scan séquentiels de dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) MS/MS à une résolution de 17 500.
   7. Enregistrer un microscan par scan.
   8. Réglez l’exclusion dynamique à 30 s.
10. Données de spectrométrie de masse de procédé
    1. Traiter les données brutes à l’aide de MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. Rechercher les spectres à partir des séquences protéiques de souris téléchargées depuis UniProt.
    3. Spécifiez la trypsine comme enzyme digestive.
    4. Prévoyez un maximum de deux clivages manqués.
    5. Spécifiez l’oxydation de la méthionine comme une modification variable.
    6. Spécifiez la carbamidométhylation de la cystéine comme une modification fixe.
    7. Fixez les tolérances de masse des précurseurs et fragments à 15 ppm et 20 ppm, respectivement.
    8. Contrôler le taux de fausses découvertes à 1 % à la fois au niveau du peptide et de la protéine.
    9. Estimer l’abondance des protéines en utilisant la quantification sans marqueur basée sur iBAQ.

8. Effectuer une analyse d’enrichissement par ontologie génique

1. Analyse de l’enrichissement fonctionnel
   1. Effectuer une analyse d’enrichissement par ontologie génétique (GO) à l’aide du package clusterProfiler R (v4.6.0).
   2. Utilisez la base de données GO (v2024-09-20) comme source de référence pour les annotations.
   3. Appliquez la correction de Benjamini-Hochberg pour plusieurs tests.
   4. Définissez la signification statistique comme une valeur P ajustée (FDR) < 0,05.

9. Effectuer la validation eCLIP-seq

1. Préparer des échantillons eCLIP
   1. Effectuer une immunoprécipitation par réticulation améliorée (eCLIP) comme décrit^{précédemment 17}.
   2. Préparer des échantillons cellulaires reticulés UV pour l’immunoprécipitation de PABPC1 et CCT3.
   3. Analyse des échantillons en utilisant le tampon de lyse eCLIP.
2. Complexes ARN-protéine immunoprécipités
   1. Ajoutez 10 μg d’anticorps à chaque échantillon.
   2. Capturez des complexes ARN-protéine sur des billes magnétiques.
   3. Prélever des échantillons d’entrée avant l’immunoprécipitation.
3. Préparer des bibliothèques d’ARN
   1. Déphosphorylate les ARN liés aux protéines.
   2. Ligature d’un adaptateur ARN 3' vers l’ARN récupéré.
   3. Laver les échantillons immunoprécipités et les échantillons en admission dans des conditions strictes.
   4. Élute complexe en faisant bouillir les billes.
   5. Résolvez les échantillons sur un gel de gradient Bis-Tris à 4 % à 12 %.
   6. Transférer les complexes séparés vers une membrane de nitrocellulose.
4. Récupérer l’ARN
   1. Retirer une région membranaire correspondante à la taille.
   2. Digérer les protéines à l’aide de l’urée et de la protéinase K.
   3. Récupérer de l’ARN de la membrane.
5. Générer des bibliothèques de séquençage
   1. La transcription inverse a récupéré l’ARN en ADNc.
   2. Purifiez l’ADNc à l’aide d’un mélange d’exonucléase I et de phosphatase alcaline de crevettes.
   3. Liguez un adaptateur ADN à l’extrémité 3' de l’ADN cD en utilisant la ligase d’ARN T4.
   4. Amplifier les bibliothèques à l’aide d’une ADN polymérase haute fidélité.
   5. Séparez les bibliothèques amplifiées sur un gel d’agarose à faible point de fusion à 3 %.
   6. Purifiez les bibliothèques de taille sélectionnée à l’aide d’un kit d’extraction en gel.
   7. Bibliothèques de séquences sur une plateforme Illumina.
6. Analyser les données eCLIP-seq
   1. Analysez les données de séquençage à l’aide du pipeline ENCODE^{eCLIP 20}.
   2. Adaptateurs de trim et dimers adaptateurs 3' utilisant Cutadapt (v1.14).
   3. Aligner les lectures vers les éléments répétés UCSC en utilisant STAR (v2.7.6a).
   4. Supprimez la correspondance des lectures vers des éléments répétitifs.
   5. Alignez les lectures restantes au génome de référence mm10 (GENCODE vM23).
   6. Supprimez les doublons PCR.
   7. Identifier les sites de liaison enrichis à l’aide de CLIPPER.
   8. Définissez les pics significatifs comme ceux avec enrichissement de pli ≥ 8 et un P ajusté ≤ 0,001.
   9. Identifier les pics reproductibles en utilisant un seuil de taux de découverte irreproductible (IDR) de 0,01.

Résultats

Pour identifier les protéines de liaison Tug1, la réticulation UV a été intégrée au flux de travail du ChIRP, établissant une méthode désignée cPDiRT (Figure 1). Le ChIRP conventionnel a été réalisé pour la première fois dans des cellules GC2 pour enrichir les protéines interagissant avec le Tug1 (Figure 2A, B). L’analyse par spectrométrie de masse a identifié plus de 190 protéines enrichies pa...

Discussion

cPDiRT a été développé comme un protocole modifié basé sur le ChIRP qui remplace la réticulation par paraformaldéhyde (PFA) par la réticulation UV afin de capturer sélectivement les interactions directes entre lncRNA et protéine. En combinant la dissociation enzymatique de tissu testiculaire frais en cellules uniques avec réticulation UV, la cartographie d’interaction directe a été étendue des lignées cellulaires cultivées aux tissus natifs. Des expériences parallèles dans des cellules c...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	pour la dissociation des tissus et la préparation de suspensions de cellules uniques
100% Éthanol	Sigma-Aldrich	459844	pour le nettoyage de l'ARN
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	pour la synthèse de l'ADNc eCLIP
Anticorps Anti-CCT3	Abcam	Ab225878	anticorps pour eCLIP
Anticorps Anti-PABPC1	Abcam	Ab312314	anticorps pour eCLIP
Chloroforme	Sigma-Aldrich	C2432	pour l'extraction de l'ARN
Collagénase de Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	pour la dissociation enzymatique des tissus testiculaires
Réactifs de déphosphorylation (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	pour la déphosphorylation de l'ARN eCLIP
Milieu DMEM à haute teneur en glucose	Gibco	11965092	pour la culture cellulaire et le tampon de dissociation des tissus
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Perles magnétiques	Thermo Fisher Scientific	65001	pour la capture des complexes sonde-ARN-protéine biotinylés
Magnet DynaMag-15	Thermo Fisher Scientific	12301D	pour la séparation des perles magnétiques
Magnet DynaMag-2	Thermo Fisher Scientific	12321D	pour la séparation des perles magnétiques
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	pour la chélation des cations divalents dans les tampons de lyse et de lavage
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S	pour la purification de l'ADNc eCLIP
Sérum bovin foetal (FBS)	Gibco	10099141C	pour arrêter la digestion trypsique
Formamide	Thermo Fisher Scientific	AM9342	pour la préparation du tampon d'hybridation
Four d'hybridation	TUOHE	LF-I	pour l'hybridation des sondes et le lavage des billes
Agarose à basse température de fusion	Sigma-Aldrich	A9414	pour la sélection de la taille de la bibliothèque eCLIP
Kit d'extraction de gel MinElute	Qiagen	28604	pour la sélection de la taille de la bibliothèque eCLIP
Kit miRNeasy Mini	Qiagen	217004	pour la purification de l'ARN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	pour la préparation du tampon de lavage à haute concentration en sel
Membrane de nitrocellulose	GE Healthcare / Amersham	10600002	pour le transfert de western blot eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	pour le détergent du tampon de lavage
Eau libre de nucléase et de protéase	Thermo Fisher Scientific	10977035	pour la préparation des solutions exemptes de nucléase
Gel Bis-Tris NuPAGE 4-12%	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	pour la sélection de la taille eCLIP
Gels pré-moulés NuPAGE Bis-Tris	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	pour la séparation des protéines par SDS-PAGE
PBS (pH 7,4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	pour le lavage et la remise en suspension des cellules
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	inhibiteur de protéase à sérine pour le tampon de lyse cellulaire ; ajouté frais avant utilisation
Cocktail d'inhibiteurs de protéase	Roche	4693132001	inhibiteur de protéase à large spectre pour le tampon de lyse cellulaire ; ajouté frais avant utilisation
Protéinase K	Sigma-Aldrich	P4850	pour la digestion des protéines dans l'extraction de l'ARN
Mélange Master qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	11704044	pour la RT-PCR quantitative pour confirmer l'enrichissement de l'ARN
Solution de DNase I sans RNase/protéase	Thermo Fisher Scientific	EN0521	pour la dissociation des tissus
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74104	pour la purification de l'ARN
Tampon de chargement d'échantillon SDS-PAGE	Beyotime	P0286	pour la préparation des échantillons de protéines
Phosphatase alcaline de crevette	New England Biolabs	M0371S	pour la purification de l'ADNc eCLIP
Kit de coloration argentique	Beyotime	P00175	pour la visualisation des protéines dans les gels SDS-PAGE
Déoxycholate de sodium	Sigma-Aldrich	D6750	pour le détergent du tampon de lavage
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	pour la lyse cellulaire et la dénaturation des protéines
Superase-in Inhibiteur de RNase	Thermo Fisher Scientific	AM2694	inhibiteur spécialisé de la RNase ; ajouté frais avant utilisation
T4 RNA Ligase	New England Biolabs	M0204	pour la liaison de l'adaptateur eCLIP
Tris–HCl (pH 7,0)	Sigma-Aldrich	T5941	pour la préparation des tampons de lyse, d'hybridation et de lavage
Réactif TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	pour l'extraction de l'ARN
Écraseur cellulaire à ultrasons	ATPIO	ATPIO-650D	pour la lyse cellulaire et la fragmentation de l'ADN
Appareil de réticulation ultraviolet	Analytik Jena	UVP CL-1000	pour la réticulation UV des interactions ARN-protéine
urée	Sigma-Aldrich	U5128	pour la dégradation des protéines eCLIP sur membrane