Article de méthode

Laminectomie lombaire L5 chez des souris C57BL/6J âgées pour modéliser le dysfonctionnement cognitif postopératoire

4 vues

⸱

DOI :

10.3791/71733

⸱

22 septembre 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une laminectomie lombaire L5 standardisée chez des souris C57BL/6J âgées afin de créer un modèle de troubles cognitifs postopératoires tout en minimisant les troubles moteurs, soutenant ainsi des études comportementales, histologiques et mécanistiques des troubles neurocognitifs périopératoires.

Résumé

Le trouble cognitif postopératoire (POCD) est une complication neurologique fréquente après une chirurgie et une anesthésie, en particulier chez les personnes âgées, et est associé à un rétablissement retardé, une hospitalisation prolongée et une qualité de vie réduite. Les interventions orthopédiques et rachidiennes sont liées à un risque relativement élevé de POCD ; toutefois, les modèles précliniques reflétant fidèlement les caractéristiques périopératoires de la chirurgie de la colonne vertébrale restent limités. Les modèles couramment utilisés, tels que la laparotomie et la fracture du tibia, peuvent entraîner une altération persistante de la locomotion et une inflammation périphérique prolongée, ce qui peut fausser l'interprétation des résultats comportementaux cognitifs. Ici, ce protocole décrit une méthode normalisée et peu coûteuse pour modéliser le POCD par laminectomie lombaire au niveau L5 sous anesthésie à la sévoflurane chez des souris mâles C57BL/6J âgées de 18 mois. L'intervention est réalisée à l'aide d'instruments chirurgicaux courants et provoque une lésion chirurgicale contrôlée tout en minimisant les déficits moteurs persistants. La fonction cognitive est évaluée à l'aide du test de reconnaissance d'objet nouveau, du labyrinthe en Y à bras nouveau et du labyrinthe de Barnes, tandis que les lésions neuronales hippocampiques et les modifications neuroinflammatoires sont évaluées respectivement par la coloration de Nissl et l'immunofluorescence anti-Iba1. Des résultats représentatifs montrent une activité locomotrice préservée, une performance cognitive altérée, une intégrité neuronale hippocampique réduite et une neuroinflammation hippocampique accrue après l'intervention chirurgicale. Ce modèle normalisé et accessible fournit une plateforme cliniquement pertinente pour étudier les mécanismes sous-jacents aux troubles cognitifs associés à la chirurgie de la colonne vertébrale et pour évaluer des interventions neuroprotectrices périopératoires candidates.

Introduction

Le trouble cognitif postopératoire (POCD) est défini comme un déclin des apprentissages et de la mémoire, de l'attention, de la vitesse de traitement de l'information et des fonctions exécutives après une anesthésie et une chirurgie1, affectant principalement les patients âgés, et son incidence rapportée semble varier selon le contexte chirurgical et la population de patients2,3. Le POCD a été fréquemment rapporté chez les personnes âgées subissant une chirurgie orthopédique élective4. Cliniquement, le POCD peut persister pendant des semaines à des mois après l'intervention chirurgicale et a été associé à une hospitalisation prolongée ainsi qu'à une mortalité accrue5,6,7. Avec le vieillissement continu de la population et l'augmentation mondiale du volume de chirurgies, le POCD est devenu un enjeu important de santé publique et de prise en charge périopératoire.

Sur le plan pathophysiologique, le DPEC est considéré comme un syndrome multifactoriel déclenché par un traumatisme chirurgical et une exposition aux anesthésiques, l'inflammation neurologique, le stress oxydatif, une régulation altérée de l'autophagie et un dysfonctionnement synaptique étant parmi les mécanismes proposés à l'origine du dysfonctionnement neuronal dans des régions pertinentes pour les fonctions cognitives, telles que l'hippocampe8. Pour analyser ces mécanismes et évaluer des interventions candidates, plusieurs modèles précliniques de DPEC ont été mis au point. Ces modèles précliniques comprennent des modèles utilisant uniquement l'anesthésie, des modèles basés sur une chirurgie abdominale et des modèles de lésions orthopédiques tels que la fracture du tibia9. Bien que ces modèles aient fait progresser le domaine, ils ne reproduisent peut-être pas intégralement les caractéristiques périopératoires pertinentes pour la chirurgie de la colonne vertébrale, et certains pourraient introduire des facteurs de confusion, tels que des déficits moteurs prolongés et une inflammation tissulaire durable, ce qui complique l'interprétation des résultats cognitifs et des mécanismes sous-jacents.

Parmi les stratégies chirurgicales disponibles, nous avons sélectionné un modèle de laminectomie lombaire L5 afin d'étudier les troubles cognitifs précoces après l'opération dans un contexte chirurgical standardisé et pertinent pour la colonne vertébrale. Cette procédure provoque une atteinte chirurgicale localisée et contrôlée sous anesthésie inhalatoire, permettant d'analyser les réponses neuroinflammatoires postopératoires et les dysfonctionnements cognitifs, sans entraîner d'atteinte motrice évidente. Grâce à l'optimisation d'étapes opératoires clés, ce protocole offre une méthode standardisée, pratique et rentable pour étudier les troubles cognitifs associés à la chirurgie de la colonne vertébrale et évaluer des stratégies neuroprotectrices périopératoires.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le Comité de soins aux animaux et d'utilisation de l'Université de Zhejiang (numéro d'approbation éthique : ZJU20260153).

1. Préparation préopératoire

  1. Animaux expérimentaux, répartition en groupes, analgésie et aveugle
    1. Utiliser des souris mâles C57BL/6J âgées de 18 mois et pesant entre 30 et 34 g. Élever les souris dans un cycle lumineux de 12 h lumière/12 h obscurité avec un accès libre à la nourriture et à l’eau.
    2. Laisser les souris s’acclimater aux conditions d’hébergement pendant au moins 7 jours avant la chirurgie. Répartir aléatoirement les souris dans le groupe laminectomie L5 ou dans le groupe témoin après l’acclimatation.
    3. Attribuer à chaque souris un numéro d’identification codé avant les procédures expérimentales. Conserver le code de répartition en groupes afin que les évaluations comportementales puissent être réalisées en aveugle par rapport au traitement.
    4. Soumettre les souris du groupe laminectomie L5 à une anesthésie au sévoflurane suivie d’une laminectomie lombaire L5. Ne pas exposer les souris du groupe témoin à l’anesthésie au sévoflurane, à la préparation du site chirurgical ni à une intervention chirurgicale.
    5. Administrer du méloxicam par voie sous-cutanée à une dose de 2 mg/kg aux souris des deux groupes. Administrer la première dose après l’induction de l’anesthésie dans le groupe laminectomie L5 et au moment correspondant à la fin de la chirurgie dans le groupe témoin.
    6. Administrer des doses ultérieures de méloxicam par voie sous-cutanée à 2 mg/kg toutes les 24 h pendant 48 h aux souris des deux groupes. Élever, manipuler et surveiller les deux groupes dans les mêmes conditions tout au long de la période expérimentale.
    7. Réaliser toutes les évaluations comportementales selon le même calendrier expérimental pour les deux groupes. S’assurer que l’investigateur effectuant les évaluations comportementales reste en aveugle par rapport à la répartition en groupes.
  2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux et désinfecter l’espace de travail chirurgical. Préchauffer un tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle pendant l’anesthésie. Préparer le méloxicam pour une administration périopératoire.
  3. Allumer l’appareil d’anesthésie gazeuse et placer la souris dans une chambre d’induction. Induire une anesthésie générale avec 3–5 % de sévoflurane pendant 3–5 min tout en maintenant un débit d’oxygène de 1 L/min.
  4. Transférer la souris anesthésiée sur la plateforme chirurgicale. Maintenir l’anesthésie avec 1,5–3 % de sévoflurane délivré par un masque d’anesthésie à un débit d’oxygène de 0,5–0,8 L/min. Administrer du méloxicam par voie sous-cutanée à 2 mg/kg. La durée totale d’anesthésie, mesurée à partir du début de l’induction au sévoflurane, est d’environ 4 h. Ajuster la concentration de sévoflurane selon les besoins afin de maintenir un plan chirurgical d’anesthésie stable.
  5. Positionner la souris en décubitus ventral avec la colonne lombaire orientée vers le haut. Fixer doucement les membres antérieurs avec du ruban adhésif afin de stabiliser l’animal et d’assurer un accès dégagé au champ opératoire L5.
  6. Confirmer une profondeur d’anesthésie adéquate en vérifiant l’absence du réflexe de retrait podal. Appliquer une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement cornéen.
  7. Épiler la région lombaire médiane (environ L3–S1) à l’aide d’un tondeur pour petits animaux. Désinfecter la peau exposée avec de l’éthanol à 75 %, puis avec de la povidone-iodée, en répétant la procédure 2 à 3 fois pour assurer des conditions aseptiques.

2. Intervention chirurgicale de laminectomie lombaire L5

REMARQUE : Dans le présent protocole, toutes les étapes chirurgicales ont été réalisées sous visualisation directe, sans microscope stéréoscopique ni loupes grossissantes.

  1. Placer la souris anesthésiée en position prona sur une plateforme chirurgicale préchauffée. Fixer les membres antérieurs avec du ruban adhésif afin de stabiliser le corps et exposer complètement la région lombaire (Figure 1).
  2. Identifier le niveau vertébral L5 à l’aide de repères cutanés. Palper les crêtes iliaques bilatérales et tracer une ligne transversale imaginaire reliant leurs points les plus élevés.
  3. Utiliser cette ligne transversale comme repère approximatif de l’espace intervertébral L5–L6. Centrer l’incision cutanée prévue légèrement au-dessus de cette ligne afin de cibler la lame L5.
  4. Assainir le site chirurgical. Réaliser une incision cutanée longitudinale médiane d’environ 1,5 à 2,0 cm de long au-dessus du niveau L5 prédéterminé, afin d’exposer la région L4–L6.
  5. Écarter les bords de la peau à l’aide de pinces stériles. Exposer la fascia dorsale et identifier le raphé fascial médian.
  6. Confirmer le niveau vertébral après exposition de la colonne vertébrale. Identifier la jonction lombosacrée et la vertèbre lombaire la plus caudale.
  7. Identifier la vertèbre L5 comme celle située immédiatement au-dessus de L6, car les souris C57BL/6 possèdent généralement six vertèbres lombaires. Confirmer ce niveau en comptant deux vertèbres vers le haut à partir de la jonction lombosacrée.
  8. Créer une petite ouverture le long du raphé fascial médian. Écarter bilatéralement les muscles paravertébraux sous vision directe.
  9. Séparer les muscles adjacents à l’apophyse épineuse L5 afin d’exposer la lame sous-jacente. Étendre l’exposition vers le haut jusqu’à l’apophyse épineuse L4 et vers le bas jusqu’à l’apophyse épineuse L6, jusqu’à ce que les trois apophyses épineuses soient clairement visibles.
  10. Effectuer principalement une dissection émoussée adjacente à l’os à l’aide de cotons-tiges ou de pinces fines. N’utiliser la dissection tranchante que si nécessaire pour libérer les adhérences fasciales et minimiser les saignements.
  11. Maintenir une rétraction latérale à l’aide de cotons-tiges afin d’exposer complètement la lame L5 et l’espace interlamineux L5–L6. Reconfirmer le niveau vertébral avant de poursuivre.
  12. Saisir délicatement l’apophyse épineuse L5 avec une pince et soulever l’apophyse épineuse ainsi que la colonne lombaire adjacente jusqu’à un angle d’environ 30° par rapport à la plateforme chirurgicale, afin d’élargir l’espace interlamineux L5–L6.
  13. Insérer les pointes fermées des ciseaux ophtalmiques dans l’espace interlamineux L5–L6 sous vision directe. Avancer les ciseaux selon un plan peu profond immédiatement sous le bord caudal de la lame L5.
  14. Ouvrir légèrement les ciseaux pour créer l’ouverture osseuse initiale. Élargir la fenêtre de laminectomie en retirant successivement de petits fragments osseux le long des bords de la lame. Limiter le retrait osseux à la lame dorsale L5 et éviter d’étendre la fenêtre osseuse latéralement vers les articulations interapophysaires bilatérales.
  15. Éviter une profondeur d’insertion excessive et une force de coupe excessive afin de prévenir une lésion de la dure-mère.
  16. Continuer à retirer la lame de manière progressive jusqu’à ce que la dure-mère soit clairement visible à travers la fenêtre osseuse.
  17. Examiner attentivement le champ opératoire. Confirmer l’absence de saignement actif et vérifier que la dure-mère reste intacte.
  18. Irriquer le site chirurgical avec du sérum physiologique stérile tiède. Obtenir l’hémostase par une compression douce.
  19. Fermer la plaie par couches. Fermer la peau avec des sutures en nylon 6-0 et désinfecter le site d’incision.
  20. Après la fermeture de la plaie, poursuivre l’anesthésie au sévoflurane jusqu’à ce que la durée totale d’anesthésie atteigne environ 4 h. Ensuite, arrêter l’administration de sévoflurane et passer aux soins postopératoires.

3. Soins postopératoires

  1. Au moment correspondant à la fin de la chirurgie dans le groupe laminectomie, administrer du méloxicam par voie sous-cutanée à raison de 2 mg/kg aux souris du groupe témoin. Placer chaque souris du groupe laminectomie sur un tapis chauffant à température contrôlée et maintenir la température corporelle jusqu’à ce que la souris reprenne conscience et présente une respiration spontanée et une activité motrice stables.
  2. Replacer chaque souris du groupe laminectomie dans sa cage d’origine après un réveil complet de l’anesthésie. Surveiller ensuite l’animal jusqu’à l’observation d’une marche normale. Administrer des doses ultérieures de méloxicam par voie sous-cutanée à raison de 2 mg/kg toutes les 24 heures pendant 48 heures aux souris des deux groupes.
  3. Inspecter quotidiennement l’incision chirurgicale et l’intégrité des points de suture jusqu’au troisième jour postopératoire. Réanesthésier la souris et remplacer les points de suture desserrés ou rompus si nécessaire.
  4. Examiner quotidiennement l’incision à la recherche d’un gonflement, d’un saignement, d’un écoulement ou de signes d’inflammation locale.
  5. Surveiller le poids corporel, le comportement de toilette, l’activité spontanée ainsi que la consommation de nourriture et d’eau tout au long de la période postopératoire.
  6. Pratiquer l’euthanasie de manière humanitaire sur toute souris avant la fin expérimentale prévue si l’un des critères prédéfinis de fin humanitaire suivants est atteint : une perte de ≥20 % du poids corporel préopératoire ; une anorexie complète pendant 24 heures ou une ingestion alimentaire inférieure à 50 % de la quantité normale pendant 3 jours consécutifs ; une incapacité ou une réticence marquée à se tenir debout ou à accéder à la nourriture ou à l’eau persistant pendant 24 heures après le réveil de l’anesthésie ; ou un état moribond caractérisé par une dépression marquée accompagnée d’une température corporelle inférieure à 37 °C.

4. Évaluation comportementale du DCPO

  1. Test du champ ouvert (contrôle de la locomotion ; jour postopératoire 3)
    1. Réaliser le test du champ ouvert dans une arène de 45 cm × 45 cm dotée de parois hautes de 40 cm, sous un éclairement de 20 lux. Placer la caméra vidéo directement au-dessus du centre de l’arène afin que toute la zone de test soit visible dans le champ de la caméra.
    2. Placer la souris au centre de l’arène et démarrer immédiatement le suivi vidéo après son placement. Laisser la souris explorer librement pendant 5 min. Analyser l’ensemble de la session de 5 min et calculer la distance totale parcourue ainsi que la vitesse moyenne de déplacement à l’aide du système de suivi vidéo.
  2. Analyse de la démarche
    1. Réaliser l’analyse de la démarche le jour postopératoire 3 à l’aide d’un système automatisé d’analyse de la démarche.
    2. Placer chaque souris à une extrémité du parcours et lui permettre de le traverser librement. Enregistrer les empreintes des pattes pendant la locomotion à l’aide de la caméra haute vitesse intégrée au système d’analyse de la démarche.
    3. Enregistrer plusieurs essais de démarche pour chaque souris et recueillir trois passages valides comportant un déplacement continu vers l’avant sur tout le parcours, destinés à une analyse ultérieure.
    4. Analyser les données des empreintes enregistrées à l’aide du logiciel d’analyse de la démarche. Vérifier les empreintes de pattes identifiées automatiquement et corriger manuellement la classification de la patte antérieure droite, de la patte antérieure gauche, de la patte postérieure droite et de la patte postérieure gauche si nécessaire, avant d’extraire les paramètres de la démarche.
    5. Quantifier la longueur de la foulée, la durée d’appui, la vitesse de balancement et la surface des empreintes, puis calculer la valeur moyenne à partir des trois passages valides pour chaque souris en vue de l’analyse statistique.
  3. Labyrinthe de Barnes (apprentissage et mémoire spatiale ; jours postopératoires 4–6)
    ​REMARQUE : Réaliser les tests du labyrinthe de Barnes une fois par jour pendant trois jours consécutifs, à partir du jour postopératoire 4. Effectuer les tests dans la même fenêtre horaire quotidienne afin de minimiser les variations circadiennes.
    1. Placer la boîte de sortie sous le trou cible désigné. Conserver la même position cible tout au long de l’expérience.
    2. Placer la souris au centre du labyrinthe pour commencer chaque essai. Lui permettre de rechercher la boîte de sortie pendant un maximum de 3 min. Mettre fin à l’essai lorsque la souris pénètre dans la boîte de sortie.
    3. Guider doucement la souris vers le trou cible si elle ne parvient pas à localiser la boîte de sortie dans les 3 min. Laisser la souris rester brièvement dans la boîte de sortie afin de renforcer l’apprentissage de la tâche.
    4. Enregistrer la latence d’évasion et la distance parcourue à l’aide du système de suivi vidéo. Pour les essais où la souris ne pénètre pas dans la boîte de sortie dans les 3 min, attribuer une latence d’évasion de 180 s. N’inclure dans l’analyse statistique que la latence d’évasion et la distance parcourue enregistrées lors de la dernière session du jour 3.
  4. Reconnaissance d’un objet nouveau (mémoire de reconnaissance ; jours postopératoires 3–4)
    ​REMARQUE : Utiliser la même arène et le même système de suivi vidéo que décrit pour le test du champ ouvert. Utiliser la session du champ ouvert du jour postopératoire 3 pour habituer les souris à l’arène de test avant l’entraînement à la reconnaissance d’un objet nouveau.
    1. Placer deux objets cylindriques identiques à des positions symétriques dans l’arène pendant la session d’entraînement. Laisser la souris explorer librement pendant 5 min.
    2. Après un intervalle de rétention de 1 h, remplacer l’un des objets cylindriques familiers par un nouvel objet de forme cubique. Contrebalancer la position de l’objet nouveau entre les souris afin de minimiser d’éventuelles préférences latérales. Laisser la souris explorer pendant 5 min.
    3. Enregistrer le temps d’exploration des objets familier et nouveau à l’aide du système de suivi vidéo. N’inclure dans l’analyse que les souris dont le temps total d’exploration des objets est d’au moins 3 s.
    4. Calculer l’indice de préférence (PI) selon la formule suivante :
      figure-protocol-1
      Définir Tnovel et Tfamiliar comme les durées passées à explorer respectivement l’objet nouveau et l’objet familier pendant la session de test.
  5. Labyrinthe en Y à bras nouveau (mémoire de reconnaissance spatiale ; jour postopératoire 5)
    1. Réaliser le test dans un labyrinthe en forme de Y composé de trois bras identiques séparés par des angles de 120°. Bloquer aléatoirement l’un des bras à l’aide d’une porte opaque et désigner ce bras comme bras nouveau.
    2. Sélectionner aléatoirement l’un des deux bras ouverts comme bras de départ. Désigner l’autre bras ouvert comme bras familier. Placer la souris à l’extrémité du bras de départ et lui permettre d’explorer librement les deux bras accessibles pendant 5 min.
    3. Après un intervalle inter-essais de 1 h, retirer la porte opaque et replacer la souris à l’extrémité du même bras de départ.
    4. Lui permettre d’explorer librement les trois bras pendant 5 min.
    5. Définir une entrée dans un bras comme le passage du centre du corps suivi dans une zone prédéfinie du bras à partir de la zone centrale. Enregistrer le nombre d’entrées et le temps passé dans chaque bras à l’aide du système de suivi vidéo.
    6. Calculer l’indice de préférence pour le bras nouveau basé sur le temps selon la formule suivante :
      figure-protocol-2
      Définir Tnovel, Tstart et Tfamiliar comme les durées passées respectivement dans les bras nouveau, de départ et familier.
    7. Calculer l’indice de préférence basé sur le nombre d’entrées selon la formule suivante :
      figure-protocol-3
      Définir Enovel comme le nombre d’entrées dans le bras nouveau, et Etotal comme le nombre total d’entrées dans les trois bras pendant l’essai de test.

5. Traitement des tissus, coloration de Nissl et coloration immunofluorescente

  1. Transformation du tissu
    1. Au point final expérimental désigné, anesthésier profondément la souris avec du sévoflurane à 3 % administré à un débit d'oxygène de 2 L/min.
    2. Confirmer une profondeur d'anesthésie adéquate par l'absence du réflexe de retrait podal. En maintenant une anesthésie profonde et avant l'arrêt cardiaque, réaliser une perfusion transcardiaque avec 20 mL de solution tamponnée au phosphate (PBS) afin d'éliminer le sang intravasculaire.
    3. Perfuser immédiatement la souris avec 20 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA).
    4. Dissecter l'ensemble du cerveau avec précaution. Plonger le cerveau dans du PFA à 4 % pendant 24 h à 4 °C pour une postfixation.
    5. Transférer le cerveau dans une solution de 30 % de saccharose jusqu'à ce que le tissu coule complètement.
    6. Inclure le cerveau dans un milieu de congélation optimal (OCT).
    7. Congeler rapidement le tissu inclus et le conserver à −80 °C jusqu'à la cryodisséction.
  2. Coloration de Nissl
    1. Porter des coupes cryogéniques de 16 µm à température ambiante. Laisser sécher les lames à l'air pendant 20 min.
    2. Rincer les lames dans du PBS pendant 2 min.
      NOTE : S'assurer que les sections tissulaires restent fermement attachées aux lames avant la coloration.
    3. Couvrir complètement les sections avec une solution de coloration au bleu de toluidine. Incuber pendant 30 min à 55 °C.
      NOTE : Optimiser empiriquement le temps de coloration pour les sections de 16 µm afin d'éviter une surcoloration.
    4. Rincer brièvement les lames dans de l'eau distillée pendant 10 à 30 s.
    5. Différencier les sections successivement dans de l'éthanol à 95 %, 85 % et 75 % pendant 2 min chacun.
      NOTE : Ajuster le temps de différenciation si nécessaire pour optimiser l'intensité de la coloration.
    6. Clarifier les lames deux fois dans du xylène frais pendant 5 min chacun.
      NOTE : Réaliser toutes les étapes impliquant du xylène sous une hotte chimique.
    7. Monter les sections avec du baume neutre. Poser délicatement une lame couvre-objet sur chaque section.
    8. Imager les sections colorées à l'aide d'un microscope optique muni d'un objectif 20×. Identifier la région CA1 en fonction de sa couche compacte caractéristique de cellules pyramidales dans la section coronale de l'hippocampe. Pour chaque souris, analyser une section coronaire et acquérir deux champs non superposés de la région CA1 de chaque hémisphère hippocampique.
    9. Compter manuellement les neurones positifs à la Nissl et les corps de Nissl morphologiquement intacts à l'aide du module de comptage cellulaire dans un logiciel d'analyse d'images. Identifier les neurones intacts par un soma intact, un noyau rond avec un nucléole visible et une abondante substance de Nissl cytoplasmique ; identifier les corps de Nissl comme des structures granuleuses ou agrégées intensément basophiles dans le cytoplasme neuronal.
    10. Moyenner les valeurs obtenues à partir de tous les champs analysés afin d'obtenir une valeur unique par animal. S'assurer que l'observateur effectuant les comptages reste aveugle à l'affectation des groupes.
  3. Coloration immunofluorescente Iba1
    1. Laisser les sections cérébrales s'équilibrer à température ambiante avant la coloration.
    2. Plonger les lames dans une solution de récupération d'antigène au citrate de sodium et effectuer la récupération d'antigène dans un bain-marie à 80 °C pendant 25 min. Après la récupération d'antigène, laisser refroidir naturellement les lames et la solution à température ambiante.
    3. Laver les sections trois fois avec du PBS pendant 3 min chacune.
    4. Perméabiliser les sections avec du Triton X-100 à 0,2 % dans du PBS pendant 30 min à température ambiante, puis effectuer trois lavages avec du PBS pendant 3 min chacun.
    5. Bloquer les liaisons non spécifiques en incubant les sections avec de l'albumine sérique bovine (BSA) à 3 % dans du PBS pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humide.
    6. Laver les sections trois fois avec du PBS pendant 3 min chacune.
    7. Diluer l'anticorps primaire dirigé contre la molécule d'adaptation liant le calcium ionisé 1 (Iba1 ; 1:100) dans la solution de blocage (BSA à 3 % dans du PBS) et incuber les sections avec l'anticorps primaire dilué toute la nuit à 4 °C dans une chambre humide.
    8. Laver les sections trois fois avec du PBS pendant 3 min chacune.
    9. Incuber les sections avec une IgG de chèvre anti-lapin conjuguée à la fluorochrome 488 (H+L) (1:1000) pendant 90 min à température ambiante à l'abri de la lumière.
    10. Laver les sections trois fois avec du PBS pendant 3 min chacune à l'abri de la lumière.
    11. Contrecoller les noyaux avec du DAPI (1:8000) pendant 5 min à l'abri de la lumière.
    12. Laver les sections trois fois avec du PBS pendant 3 min chacune à l'abri de la lumière.
    13. Monter les sections avec un milieu de montage antifade, poser des lames couvre-objets et protéger les sections de la lumière jusqu'à l'acquisition des images.
    14. Acquérir des images de fluorescence de la région CA1 hippocampique à l'aide d'un microscope à fluorescence confocale muni d'un objectif 20×. Utiliser des paramètres d'acquisition identiques pour toutes les sections incluses dans les comparaisons quantitatives. Pour chaque souris, analyser une section coronaire et acquérir deux champs non superposés de la région CA1 de chaque hémisphère hippocampique.
    15. Quantifier l'intensité moyenne de fluorescence Iba1 dans la région CA1 hippocampique avec des seuils identiques pour toutes les images. Moyenner les valeurs provenant de tous les champs pour obtenir une valeur unique par animal.

6. Analyse statistique

  1. Effectuer toutes les analyses statistiques à l'aide d'un logiciel d'analyse statistique. Présenter les données sous la forme de la moyenne ± l'écart type (ET).
  2. Évaluer la normalité des données à l'aide du test de Shapiro–Wilk. Évaluer l'égalité des variances à l'aide du test F.
  3. Comparer les groupes témoin et laminectomie L5 à l'aide d'un test t de Student non apparié bilatéral lorsque l'hypothèse d'homoscédasticité est respectée. Utiliser le test t de Welch lorsque cette hypothèse n'est pas respectée.
  4. Définir n comme le nombre d'animaux inclus dans chaque analyse. Considérer une valeur de P < 0,05 comme statistiquement significative.

Résultats

Tous les souris ont survécu jusqu'au point final prévu de l'expérience, aucune n'a atteint les critères prédéfinis de fin anticipée pour des raisons éthiques, et toutes ont été incluses dans les analyses finales. La fonction motrice a été évaluée au troisième jour postopératoire à l'aide d'analyses en champ ouvert et de la démarche. Ni la distance totale parcourue ni la vitesse moyenne lors du test en champ ouvert ne différaient entre les groupes, indiquant une activité locomotrice spontanée comparable (Figure 2A). L'analyse de la démarche n'a montré aucune différence significative entre les groupes concernant la longueur de la foulée, la durée d'appui, la vitesse de balancement ou la surface d'empreinte (Figure 2B). Ensemble, ces résultats indiquent que la laminectomie L5 n'a pas provoqué de déficit moteur manifeste suffisant pour expliquer les différences ultérieures observées dans la performance cognitivo-comportementale.

Les performances cognitives ont été évaluées à l'aide du test de reconnaissance d'objet nouveau (NOR), du labyrinthe en Y à bras nouveau et du labyrinthe de Barnes. Dans le test NOR, le groupe laminectomie L5 a présenté un indice de préférence pour l'objet nouveau (IP) significativement plus faible que le groupe témoin (Figure 3A). Dans le labyrinthe en Y à bras nouveau, le groupe laminectomie L5 a montré des IP significativement plus bas tant pour le temps passé dans le bras nouveau que pour les entrées dans ce bras (Figure 3B). Dans le labyrinthe de Barnes, le groupe laminectomie L5 a présenté une latence d'échappement plus longue et une distance parcourue plus grande au jour 3 du test au labyrinthe de Barnes (Figure 3C). Ensemble, ces résultats comportementaux indiquent une altération des performances cognitives postopératoires après laminectomie L5.

Dans la région CA1 de l'hippocampe, le groupe soumis à la laminectomie L5 présentait significativement moins de neurones positifs à la Nissl et significativement moins de corps de Nissl que le groupe témoin, indiquant un dommage structural neuronal (Figure 4A, B). De plus, l'intensité moyenne de fluorescence d'Iba1 était significativement augmentée dans le groupe soumis à la laminectomie L5, ce qui est compatible avec une activation accrue des microglies (Figure 4C, D).

figure-results-1
Figure 1 : La procédure de laminectomie lombaire L5 pour la modélisation du trouble cognitif postopératoire (POCD) chez la souris. (A) Illustration de la cible chirurgicale au niveau de la lame L5 et de l'étendue d'exposition s'étendant des niveaux vertébraux adjacents (L4–L6). (B) Images peropératoires illustrant les étapes clés de la procédure de laminectomie lombaire L5. (a) Région lombaire après épilation, avec identification de la ligne médiane spinale ; les flèches indiquent le sens de l'incision cutanée prévue. (b) Incision cutanée médiane au niveau de la colonne lombaire. (c) Incision de la fascia avec une séparation progressive des muscles paravertébraux afin d'exposer les apophyses épineuses et de dégager davantage les tissus autour de l'apophyse épineuse et de la lame L5 pour une exposition complète de la lame L5. (d) Laminectomie L5 après ablation de la lame L5. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Évaluation de l'activité locomotrice et de la démarche après une laminectomie lombaire L5. (A) Test du champ ouvert montrant la distance totale parcourue et la vitesse moyenne (n = 10). (B) Analyse de la démarche montrant la longueur du pas, la durée d'appui, la vitesse de balancement et la surface d'empreinte (n = 6). Les données représentent la moyenne ± écart-type. La significativité statistique est indiquée par ns, non significative. Abréviations : Control = groupe témoin ; Laminectomy = groupe laminectomie L5. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Évaluations comportementales cognitives après laminectomie lombaire L5. (A) Test de reconnaissance d'un objet nouveau (n = 10). (B) Test du labyrinthe en Y avec bras nouveau (n = 10). (C) Test du labyrinthe de Barnes (n = 10). Les données représentent la moyenne ± ÉT. La signification statistique est indiquée par *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001. Abréviations : Control = groupe témoin ; Laminectomy = groupe laminectomie L5. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Évaluation histologique de la région CA1 de l'hippocampe après une laminectomie lombaire L5. (A) Images représentatives de la coloration de Nissl dans la région CA1 de l'hippocampe. (B) Quantification des neurones positifs pour Nissl (à gauche) et des corps de Nissl (à droite) (n = 5). (C) Images représentatives de l'immunofluorescence d'Iba1 dans la région CA1 de l'hippocampe. Échelle = 100 µm. (D) Quantification de l'intensité moyenne de fluorescence d'Iba1 (n = 6). Les données représentent la moyenne ± ÉT. La significativité statistique est indiquée par **P < 0,01 et ***P < 0,001. Abréviations : Control = groupe témoin ; Laminectomy = groupe laminectomie L5. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les troubles cognitifs postopératoires ont été rapportés chez les adultes âgés subissant une chirurgie rachidienne10. Des preuves expérimentales indiquent en outre que le vieillissement augmente la susceptibilité aux troubles cognitifs associés à la chirurgie ainsi qu'aux réponses neuroinflammatoires11,12. Le présent protocole combine environ 4 h d'anesthésie au sévoflurane avec une laminectomie L5 chez des souris âgées afin de modéliser un trouble cognitif précoce après l'intervention chirurgicale. Sa valeur méthodologique principale réside dans la mise à disposition d'une procédure pratique et accessible pour étudier les modifications comportementales et histologiques de l'hippocampe après une chirurgie rachidienne.

Les modèles précliniques de troubles cognitifs postopératoires (POCD) incluent l'exposition uniquement à l'anesthésie, la chirurgie abdominale et les paradigmes de lésions orthopédiques13. Les paradigmes d'anesthésie seule permettent d'évaluer les effets des anesthésiques en l'absence de traumatisme chirurgical14, mais ne reproduisent pas l'exposition combinée à l'anesthésie et à la lésion tissulaire. Les modèles de chirurgie abdominale et de fracture tibiale intègrent une lésion chirurgicale et ont été utilisés pour étudier l'altération cognitive associée à la chirurgie15,16. Toutefois, leurs sites opératoires et leurs profils de lésion tissulaire diffèrent de ceux des interventions rachidiennes. Étant donné que le type et l'intensité du traumatisme chirurgical peuvent influencer les résultats cognitifs postopératoires ainsi que les réponses inflammatoires centrales9, le contexte chirurgical doit être pris en compte lors du choix d'un modèle préclinique. Le protocole de laminectomie L5 présenté ici fournit donc un paradigme expérimental lié à la chirurgie de la colonne vertébrale permettant d'étudier les troubles cognitifs précoces après une intervention chirurgicale chez des souris âgées.

Le défi technique principal de ce protocole consiste à retirer suffisamment d'os de la lame L5 pour exposer clairement la dure-mère tout en évitant toute lésion de celle-ci. Lors d'une laminectomie réalisée sous visualisation directe, une maîtrise précise de la profondeur de l'instrument, de la force de coupe et de l'angle d'insertion des ciseaux ophtalmiques est nécessaire. L'os doit être retiré progressivement, par petites incisions contrôlées le long des marges de la lame. Saisir le processus épineux de L5 avec une pince et surélever le segment lombaire opératoire d'un angle d'environ 30° par rapport à la plateforme chirurgicale permet d'élargir l'espace interlaminaire L5–L6. Cette manœuvre autorise une insertion peu profonde des pointes des ciseaux sous le bord osseux et réduit le risque de contact avec la dure-mère. Un retrait incomplet de l'os peut limiter l'exposition chirurgicale, tandis qu'une coupe trop agressive ou une profondeur d'insertion excessive peut entraîner une lésion de la dure-mère. Un saignement incontrôlé peut obscurcir le champ opératoire, nuire à la récupération postopératoire et augmenter la variabilité des résultats comportementaux. Lorsque l'espace interlaminaire est insuffisant pour permettre une insertion sécuritaire des pointes des ciseaux, il convient de réajuster la position et l'angle d'élévation du segment lombaire opératoire plutôt que d'augmenter la profondeur d'insertion. Si un saignement obscurcit le champ opératoire, le retrait de l'os doit être interrompu jusqu'à ce qu'une visualisation adéquate soit rétablie, après quoi tout os restant doit être retiré de façon progressive.

La séparation des muscles paravertébraux et la laminectomie L5 peuvent contribuer à une douleur postopératoire transitoire, et une hypersensibilité mécanique a été observée après laminectomie expérimentale chez la souris17. Le méloxicam a été administré selon un protocole analgésique prédéfini. Des expressions faciales liées à la douleur postopératoire chez la souris ont été signalées comme persistant environ 36 à 48 heures18. Le protocole analgésique de 48 heures visait à couvrir cette période postopératoire précoce, et les tests comportementaux cognitifs ont été initiés au troisième jour postopératoire, après l'achèvement du traitement analgésique, afin de réduire l'influence potentielle de la douleur immédiate postopératoire. Le test du champ ouvert a été utilisé dans des études expérimentales de DOPC pour évaluer l'activité locomotrice spontanée et déterminer si une diminution de la locomotion pourrait fausser les performances comportementales cognitives19,20. En conséquence, les tests en champ ouvert et l'analyse de la démarche ont été réalisés au troisième jour postopératoire, avant l'évaluation cognitive. Aucune différence significative entre les groupes n'a été observée concernant l'activité locomotrice en champ ouvert ou les paramètres de la démarche, suggérant que les différences comportementales cognitives ultérieures ne pouvaient probablement pas être attribuées principalement à un déficit moteur évident. Toutefois, comme la douleur spontanée postopératoire et l'inconfort de la plaie n'ont pas été évalués directement, leurs effets résiduels sur la performance comportementale ne peuvent être entièrement exclus. De futures études pourraient intégrer des évaluations directes de la douleur spontanée postopératoire.

Dans l'ensemble, ce protocole fournit une approche expérimentale pratique pour étudier l'altération cognitive postopératoire précoce chez des souris âgées après une laminectomie L5. Il peut être utilisé pour examiner les conséquences comportementales et les mécanismes sous-jacents de l'altération cognitive associée à une chirurgie de la colonne vertébrale, ainsi que pour évaluer des interventions visant à prévenir ou réduire l'altération cognitive postopératoire. Une validation sur des cohortes plus importantes et dans des laboratoires indépendants permettrait de confirmer davantage la stabilité et la reproductibilité du modèle.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Nous remercions Sanhua Fang de la plateforme des installations centrales de l'École de médecine de l'Université de Zhejiang, Yanhong Chen et Xuliang Zhang du centre animalier de l'Université de Zhejiang pour leur soutien technique. Cette étude a été financée par les fonds suivants : Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82575196, 82074535 et U23A20508).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
C57BL/6J male miceSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-0005Modèle animal
Logiciel de suivi vidéo ANY-mazeStoelting Co., USA6000Suivi et analyse comportementaux par vidéo
Pommade ophtalmique d'érythromycineBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H11021270Prévenir le dessèchement oculaire
Pinces finesNANAPincer la peau
Plaque chauffanteNANAContrôle de température
Anticorps monoclonal de lapin Iba1/AIF-1 (E4O4W)Cell Signaling Technology17198Coloration immunofluorescente pour Iba1
Équipement d'anesthésie inhalatoireRWD Life Science Co., Ltd.R581SAnesthésie
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY2025112704Analyse de la démarche
Ciseaux ophtalmiques microchirurgicauxNANASuppression de l'os
Solution de coloration de NisslHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Coloration de Nissl
CiseauxShang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY00030Incision cutanée
SévofluraneShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.25062331Anesthésie
Champ opératoire chirurgical à usage uniqueJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.20212140221Plateforme pour intervention chirurgicale
Tondeuse pour petit animalYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-03310Épilation
Aiguilles à suture chirurgicales avec filShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Suture de la peau
Crème dépilatoire VeetRECKITT BENCKISER (India) LtdNAÉpilation

Références

  1. Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
  2. Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
  3. Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
  4. Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
  5. Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
  6. Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
  7. Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
  8. Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
  9. Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
  10. Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
  11. Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
  12. Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
  13. Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
  14. Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
  15. Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
  16. Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
  17. Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
  18. Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
  19. Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
  20. Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Modèle de chirurgie rachidienneanesthésie au sévofluranetest de la fonction cognitivelésion neuronale hippocampiquemodifications neuro-inflammatoirescoloration de Nisslimmunofluorescence Iba1

Cet article a été publié

Vidéo bientôt disponible

Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.