Ce protocole décrit la mise en place d'un modèle murin d'asthme allergique induit par l'ovalbumine (OVA) afin d'évaluer les mécanismes thérapeutiques de la thérapie par application médicamenteuse sur le point d'acupuncture Kechuanting (KAST) dans l'inflammation bronchique de type 2, en modulant les cellules lymphoïdes innées de groupe 2 (ILC2) pulmonaires via la voie du peptide apparenté au gène de la calcitonine (CGRP)/protéine modifiant l'activité du récepteur 1 (RAMP1).
Article de recherche
La thérapie par application de patchs sur le point d'acupuncture Kechuanting atténue l'inflammation des voies respiratoires de type 2 chez des souris atteintes d'asthme allergique en modulant le nombre d'ILC2
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
On a montré que la thérapie par application médicamenteuse sur l'acupuncture Kechuanting (KAST) améliore efficacement l'inflammation des voies respiratoires chez les patients souffrant d'asthme allergique (AA) ; toutefois, ses mécanismes sous-jacents restent mal compris. Cette étude visait à explorer les mécanismes thérapeutiques de la KAST dans un modèle murin d'AA selon une perspective neuro-immunitaire. Un modèle murin d'asthme allergique induit par l'ovalbumine (OVA) a été établi, et les souris ont été traitées par KAST. Les effets de la KAST sur les cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2) pulmonaires et sur l'inflammation de type 2 des voies respiratoires ont été évalués par cytométrie en flux, coloration à l'hématoxyline-éosine (HE) et immunohistochimie. Le niveau protéique du peptide apparenté au gène de la calcitonine (CGRP) dans les tissus pulmonaires a été mesuré par immunobuvardage (WB) et ELISA. Une administration intranasale de CGRP ou de l'inhibiteur du récepteur du CGRP, BIBN-4096, a été réalisée chez des souris asthmatiques afin d'étudier le rôle régulateur de la voie CGRP/protéine modifiant l'activité du récepteur 1 (RAMP1) sur les ILC2 et l'inflammation de type 2 des voies respiratoires. La KAST a réduit le nombre d'ILC2 et atténué l'inflammation de type 2 des voies respiratoires, accompagné d'une diminution de l'expression du CGRP dans les tissus pulmonaires. L'administration intranasale de CGRP a augmenté les ILC2 exprimant RAMP1+ ainsi que le nombre total d'ILC2 dans les poumons, et a aggravé l'inflammation de type 2 des voies respiratoires. En revanche, l'administration intranasale de BIBN-4096 a diminué les ILC2 pulmonaires et atténué l'inflammation de type 2 des voies respiratoires. La KAST réduit l'inflammation des voies respiratoires dans l'asthme allergique, ce qui est étroitement associé à la régulation à la baisse de la voie CGRP/RAMP1 et à la suppression subséquente des ILC2 pulmonaires, comme le confirme l'inhibition pharmacologique.
Introduction
L'asthme allergique (AA) est le phénotype d'asthme le plus courant, représentant 60 à 80 % de tous les cas d'asthme en Chine1. Il se caractérise par une prévalence élevée et un contrôle insuffisant de la maladie, ce qui altère gravement la qualité de vie des patients et entraîne un fardeau économique important2,3,4,5. Bien que les corticostéroïdes inhalés (ICS) restent le pilier du traitement clinique6, certains patients présentent une réponse limitée, et l'utilisation à long terme est souvent associée à des effets indésirables ainsi qu'à l'incapacité d'arrêter la progression de la maladie7. Par conséquent, le développement de stratégies thérapeutiques nouvelles, sûres et efficaces demeure une priorité tant sur le plan clinique que de la recherche. La thérapie par application cutanée au point d'acupuncture Kechuanting (KAST), une application externe de médecine traditionnelle chinoise, délivre des composés actifs par voie transdermique, ce qui permet potentiellement d'éviter l'effet de premier passage hépatique et de minimiser les réactions indésirables systémiques8,9. Des études cliniques ont démontré que la KAST peut soulager les symptômes de l'asthme, restaurer partiellement la fonction pulmonaire et améliorer la qualité de vie des patients10,11,12. Parallèlement, des études en métabolomique sérique, en pharmacologie en réseau et sur des modèles animaux d'asthme suggèrent que la KAST atténue l'inflammation des voies respiratoires en réduisant les niveaux sériques et dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) de médiateurs inflammatoires, notamment en diminuant l'expression de l'IgE, de l'IL-4 et de l'IL-139,13,14. Dans leur ensemble, ces résultats fournissent des preuves appuyant l'efficacité thérapeutique de la KAST dans l'asthme. Toutefois, ses mécanismes d'action précis restent encore mal compris.
L'un des mécanismes pathologiques fondamentaux à l'origine de la récidive de l'AA est l'inflammation des voies respiratoires de type 2, dans laquelle les cellules lymphoïdes innées de groupe 2 (ILC2) jouent un rôle clé15. Suite à une stimulation par un allergène, les ILC2 sécrètent des cytokines telles que l'IL-5 et l'IL-13, induisant ainsi l'inflammation des voies respiratoires16,17. Des études ont montré que l'élimination des ILC2 atténue considérablement l'inflammation des voies respiratoires chez des souris asthmatiques, soulignant leur rôle central dans la progression de la maladie18. Notamment, l'activation et la fonction des ILC2 sont strictement régulées par plusieurs mécanismes, les interactions neuro-immunitaires suscitant un intérêt croissant ces dernières années. Des preuves récentes indiquent que le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP) peut se lier à la protéine 1 modifiant l'activité du récepteur (RAMP1) à la surface des ILC2, provoquant leur activation et la libération subséquente de cytokines de type 2, ce qui aggrave l'inflammation des voies respiratoires dans l'AA19,20,21. Dans la présente étude, notre criblage par séquençage de l'ARN à haut débit (RNA-seq) a identifié le CGRP comme un neuropeptide essentiellement réactif, fortement modulé par l'intervention KAST. Ainsi, en ciblant la voie CGRP/RAMP1, nous avons utilisé KAST comme intervention chez des souris atteintes d'AA afin d'explorer ses mécanismes potentiels dans la modulation de l'activité des ILC2 et l'atténuation de l'inflammation des voies respiratoires de type 2.
Protocole
Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire publié par les Académies nationales des sciences. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique sur les animaux de l'Hôpital affilié de l'Université de médecine chinoise de Nanjing (numéro d'approbation : 2023DW-059-01). Une liste exhaustive de tous les matériaux, réactifs, outils et logiciels utilisés dans cette étude est détaillée dans le Tableau des matériaux.
Animaux de laboratoire et regroupement
Des souris femelles BALB/c saines (de grade SPF, âgées de 8 à 10 semaines) ont été obtenues auprès du centre d'animaux expérimentaux de l'Université de médecine chinoise de Nanjing (licence n° SYXK (Su) 2018-0049). Les animaux ont été élevés dans des conditions standard avec un cycle lumineux de 12 heures d'obscurité et 12 heures de lumière à une température de 24–26 °C. De la nourriture et de l'eau stériles ont été fournies ad libitum, la litière a été remplacée régulièrement et les cages nettoyées de façon routinière. Après 7 jours d'acclimatation, les souris ont été réparties aléatoirement en six groupes (n = 7 par groupe) : groupe témoin, groupe modèle, groupe CGRP, groupe BIBN-4096, groupe KAST et groupe KAST + CGRP. L'attribution aléatoire des animaux aux groupes a été réalisée à l'aide d'une table de nombres aléatoires générée par ordinateur. L'affectation aux groupes a été masquée aux investigateurs jusqu'à l'attribution des interventions. Afin d'optimiser l'utilisation des tissus, les échantillons pulmonaires du groupe randomisé (n = 7 par groupe) ont été attribués systématiquement à différentes voies de traitement, les tailles exactes des échantillons analysés (n = 5, 4 ou 3) pour des tests histologiques et moléculaires spécifiques étant indiquées explicitement dans les légendes des figures correspondantes. Aucune donnée n'a été exclue de l'analyse.
Préparation de la formulation KAST
La formulation a été préparée par le service de pharmacie de l'hôpital affilié à l'Université de médecine chinoise de Nanjing22. Neuf herbes médicinales chinoises traditionnelles ont été utilisées : Semen Brassicae (2 parts), Rhizoma Corydalis (2 parts), Radix Kansui traitée au vinaigre (1 part), Asarum (1 part), Ephedra (1 part), Semen Lepidii (1 part), Clou de girofle (1 part), Écorce de cannelle (1 part) et Gleditsia sinensis (1 part). Chaque plante a été broyée en une poudre fine et tamisée à travers un tamis de 80 mailles. Pour chaque 100 g de poudre mélangée, 70 mL de jus de gingembre frais et 30 mL de paraffine liquide ont été ajoutés, soigneusement mélangés, puis transformés en patchs de 0,3 g ± 5 % et de 0,5 cm de diamètre. Plus précisément, tous les ingrédients à base de plantes et le gingembre frais ont été authentifiés par le pharmacien en chef Lin-gang Zhao et conservés à 4 °C dans un environnement sombre et sec avant utilisation9. Afin de garantir la reproductibilité de l'intervention et la stabilité d'un lot à l'autre, une norme rigoureuse de contrôle qualité a été mise en œuvre, fondée sur les méthodes UPLC-Q-TOF-MS et HPLC établies par notre équipe, confirmant la présence constante de marqueurs actifs majeurs tels que la thiocyanate de sinapine23. En pratique, les patchs de 0,5 cm ont été fixés à l'aide d'un ruban adhésif médical hypoallergénique respirant de 2,5 cm × 5,5 cm afin d'assurer une délivrance transdermique optimale.
Mise en place du modèle murin de polyarthrite
Le modèle d'AA a été induit selon un protocole établi dans la littérature, utilisant une sensibilisation à l'OVA et une provocation intranasale24. Sauf pour le groupe Normal, toutes les souris ont été sensibilisées par injection intrapéritonéale de 200 µL de solution saline contenant 100 µg d'OVA et 2 mg d'hydroxyde d'aluminium aux jours 0 et 12. Du jour 18 au jour 23, les souris ont été provoquées une fois par jour par voie intranasale avec 50 µg d'OVA dans 50 µL de solution saline. Du jour 24 au jour 53, l'OVA a été administré par voie intranasale tous les deux jours. Le jour 54, après pesée des souris, l'euthanasie a été réalisée par dislocation cervicale, puis les tissus ont été prélevés. Par la suite, le coefficient pulmonaire a été déterminé en divisant le poids total des poumons par le poids corporel.
Interventions
Du jour 40 au jour 53, les souris du groupe KAST et du groupe KAST + CGRP ont été épilées sur une zone dorsale de 3 cm × 6 cm. Des patchs ont été appliqués sur les points d’acupuncture bilatéraux Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) et Shenshu (BL23), fixés avec du ruban adhésif pendant 1,5 heure une fois par jour pendant 14 jours consécutifs. Les souris des groupes CGRP et KAST + CGRP ont reçu une administration intranasale de 10 µL de solution de Calcitonine/CALCA (1 pg/µL) tous les deux jours, du jour 40 au jour 53. Les souris du groupe BIBN-4096 ont reçu une administration intranasale de 10 µL de solution de BIBN-4096 (0,3 mg/mL, antagoniste du récepteur CGRP) tous les deux jours. Les groupes normal et modèle ont reçu une alimentation standard sans intervention. Le KAST a été administré du jour 40 au jour 53, après l’induction de l’inflammation des voies respiratoires allergique (démarrée au jour 40, soit 22 jours après le premier défi à l’OVA au jour 18). Ainsi, dans cette étude, le KAST a constitué une intervention thérapeutique plutôt que prophylactique.
Pour la préparation de la peau, l'épilation de la région dorsale désignée a été réalisée à l'aide d'un tondeuse électrique. La localisation des points d'acupuncture a strictement suivi la nomenclature et la localisation normalisées des points d'acupuncture pour les animaux de laboratoire – Partie 3 : Souris (T/CAAM 0002-2020), publiée par la Société chinoise d'acupuncture-moxibustion. Les quatre paires de sites dorsaux bilatéraux ont été précisément marqués et définis comme suit : Feishu (V13 : entre les côtes, au-dessous de l'apophyse épineuse de la 3e vertèbre thoracique, à 3 mm de la ligne médiane postérieure), Geshu (V17 : au-dessous de l'apophyse épineuse de la 7e vertèbre thoracique, à 3 mm de la ligne médiane), Pishu (V20 : au-dessous de l'apophyse épineuse de la 12e vertèbre thoracique, à 3 mm de la ligne médiane) et Shenshu (V23 : au-dessous de l'apophyse épineuse de la 2e vertèbre lombaire, à 3 mm de la ligne médiane). Le ruban adhésif 3M a été solidement enroulé afin d'assurer une adhérence stable, empêchant tout déplacement du pansement ou toute érosion cutanée secondaire pendant la période de maintien de 1,5 heure.
Les doses de CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL par souris) et de BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL par souris) ont été choisies sur la base d'études publiées25. Plus précisément, pour l'intervention par CGRP, une solution de BSA à 0,1 % a été préparée en dissolvant 1 mg de BSA dans 1 mL d'eau ddH2O, puis en vortexant pour obtenir une concentration finale de 1 mg/mL. Avant la reconstitution, la poudre lyophilisée de protéine Calcitonin/CALCA a été centrifugée à 12 000 × g pendant 30 secondes à 4 °C. Ensuite, 20 µL de la solution de BSA à 0,1 % préparée ont été ajoutés pour obtenir une solution mère à 1 µg/µL. Le flacon a été doucement retourné plusieurs fois (sans vortexer), centrifugé brièvement, puis laissé à température ambiante pendant plusieurs minutes afin de garantir une reconstitution complète de la protéine. Pour préparer la solution de travail à 1 pg/µL sans générer un volume trop élevé en une seule étape, une dilution sérielle standard en deux étapes a été effectuée : 1 µL de la solution mère à 1 µg/µL a d'abord été dilué dans 999 µL de sérum physiologique stérile pour obtenir une solution intermédiaire à 1 ng/µL, puis 1 µL de cette solution intermédiaire a été à nouveau mélangé avec 999 µL de sérum physiologique stérile pour obtenir la solution de travail finale à 1 pg/µL. La solution de travail a été conservée à 4 °C, tandis que les aliquots restants ont été stockés à -20 °C pendant 2 à 3 mois maximum. Pour le groupe BIBN-4096, 1 mg de poudre de BIBN-4096 a été dissous dans 333 µL d'eau ddH2O pour obtenir une solution mère à 3 mg/mL, qui a été divisée en aliquots de 50 µL par flacon et stockée à -80 °C. Pour préparer la solution de travail à 0,3 mg/mL, chaque aliquot de 50 µL de solution mère a été soigneusement mélangé avec 450 µL de sérum physiologique stérile. Du jour 40 au jour 53, un volume de 10 µL de la solution de CGRP à 1 pg/µL ou de la solution de BIBN-4096 à 0,3 mg/mL a été administré par voie intranasale à chaque souris tous les deux jours, sous contention douce et sans anesthésie.
Mesures des résultats et méthodes de détection
Tests comportementaux
Le jour 53, après le dernier défi intranasal, les fréquences de frottements du nez et d'épisodes d'éternuements ont été surveillées et enregistrées à l'aide d'un système vidéo numérique pendant une durée de 10 min. Les fréquences comportementales présentes dans les vidéos ont été comptabilisées indépendamment par deux chercheurs de manière double-aveugle. En cas de divergence importante entre leurs comptages, un troisième chercheur a réévalué la vidéo, et les données présentant la plus grande cohérence ont été retenues pour l'analyse statistique.
Test de provocation bronchique
Moins de 24 heures après le dernier défi, la réactivité des voies respiratoires a été évaluée à l’aide d’acétylcholine (ACh) nébulisée à des concentrations de 0, 5, 10, 20 et 40 mg/mL (300 µL par concentration, nébulisés pendant 1 min). Les valeurs de pause augmentée (Penh), un indice sans dimension utilisé empiriquement pour indiquer le rétrécissement des voies respiratoires et évaluer l’hyperactivité bronchique (AHR), ont été enregistrées pendant 5 min après chaque nébulisation au moyen d’une pléthysmographie corporelle entière non invasive. Les souris ont été habituées à la chambre pendant 10 min avant l’enregistrement. Le Penh a été calculé automatiquement à l’aide du logiciel intégré du système de stockage/transmission en continu, selon une formule empirique tenant compte du rapport entre le temps expiratoire et inspiratoire ainsi que des débits maximaux.
Histopathologie (coloration HE)
Les tissus pulmonaires fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % ont été déshydratés à l'aide d'une série alcoolique progressive, dégraissés au xylène, puis inclus dans des blocs de paraffine à l'aide d'un appareil automatique. Les blocs ont été coupés à une épaisseur de 4 µm, mis à flotter dans un bain-marie à 42 °C, puis déposés sur des lames de verre. Les lames ont été incubées à 80 °C pendant 2 h, puis séchées toute la nuit avant d'être ramenées à température ambiante. Pour la coloration, les coupes ont été déparaffinées dans le xylène (I et II, 20 min chacun), réhydratées à l'aide d'une série éthanolique progressive (100 % I/II et 75 %, 5 min chacun), puis rincées à l'eau du robinet. Les lames ont été colorées à l'hématoxyline pendant 3 à 5 min, différenciées à l'alcool acide à 1 %, puis bleuies dans une solution de bleuissement. Après lavage, les coupes ont été déshydratées à l'éthanol à 85 % et 95 % (5 min chacun) et contre-colorées à l'éosine pendant 5 min. Enfin, les lames ont été déshydratées dans de l'éthanol absolu (I, II et III, 5 min chacun), dégraissées au xylène (I et II, 5 min chacun), montées au baume de Canada neutre, puis séchées à l'air libre. Des images ont été capturées dans des champs aléatoires à un grossissement de 200× à l'aide d'un microscope optique et du système CaseViewer. L'inflammation pulmonaire et l'épaississement épithélial ont été notés à l'aveugle selon une échelle de 0 à 4 : 0, absence d'inflammation ; 1, présence occasionnelle de cellules inflammatoires ; 2, quelques foyers inflammatoires (<3) ; 3, plusieurs foyers inflammatoires (≥3) ; 4, infiltration diffuse dans tout le poumon. L'épaississement épithélial a été noté comme suit : 0, normal ; 1, épaississement visible ; 2, épaississement partiel des voies respiratoires ; 3, obstruction quasi-complète ; 4, absence de structure normale. Pour chaque groupe expérimental, un total de 20 champs microscopiques aléatoires ont été photographiés et évalués afin d'obtenir les scores histopathologiques bruts. Les données de chaque groupe de quatre champs ont été moyennées pour produire un point de données indépendant unique, ce qui a donné une taille finale d'échantillon de n = 5 réplicats par groupe pour l'analyse statistique. L'évaluation a été réalisée de manière aveugle.
ARN-séq
L'ARN total a été extrait de tissus pulmonaires murins à l'aide du réactif TRIzol selon le protocole du fabricant. La pureté, la concentration et l'intégrité de l'ARN ont été évaluées à l'aide d'un spectrophotomètre et d'une plateforme basée sur la microfluidique. Des bibliothèques de transcriptome ont été construites à l'aide d'un kit commercial de préparation de bibliothèques et séquencées sur une plateforme de séquençage à haut débit afin de produire des lectures appariées de 150 pb. Les données brutes ont été contrôlées en qualité à l'aide d'un logiciel de filtrage approprié pour obtenir des lectures nettoyées, qui ont été alignées sur le génome de référence à l'aide d'un outil d'alignement sensible aux épissages. Les niveaux d'expression des gènes ont été calculés sous forme de FPKM, et les décomptes de lectures ont été compilés à l'aide d'un utilitaire de comptage des lectures. Une analyse d'expression différentielle a été réalisée à l'aide d'un package statistique spécialisé, avec des seuils fixés à |log2 Rapport d'expression| ≥ 1 et une valeur p ajustée < 0,05.
ELISA
Des tissus pulmonaires frais de souris ont été précisément pesés et homogénéisés dans un tampon PBS selon un rapport strict de 20 mg de tissu pour 200 µL de tampon. Les homogénats ont été centrifugés environ 10 min à 13 400 × g à 4 °C afin de récupérer les surnageants protéiques. Pour la normalisation, la teneur brute en protéines des surnageants a été déterminée par la méthode BCA. La procédure ELISA a été réalisée en triplets techniques à l’aide de kits commerciaux, conformément au protocole du fabricant. Brièvement, 50 µL de dilutions étalons ou 50 µL d’échantillons pré-dilués (10 µL d’échantillon protéique mélangés à 40 µL de diluant, ce qui correspond à une dilution finale de 5 fois) ont été ajoutés dans des plaques 96 puits revêtues d’anticorps. Les plaques ont été scellées et incubées à 37 °C pendant 30 min. Après cinq lavages avec un tampon de lavage dilué au 1/30, 50 µL de réactif conjugué marqué par une enzyme ont été ajoutés dans chaque puits (sauf les puits témoins), puis le mélange a été incubé à 37 °C pendant 30 min. Après cinq nouveaux lavages, 50 µL de solution chromogène A et 50 µL de solution chromogène B ont été ajoutés dans chaque puits, et la plaque a été incubée à l’abri de la lumière à 37 °C pendant 10 min. La réaction a été arrêtée par l’ajout de 50 µL de solution d’arrêt, provoquant un changement de couleur du bleu au jaune. L’absorbance (valeur d’OD) de chaque puits a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques dans les 15 min suivant l’ajout de la solution d’arrêt. Des courbes standards ont été tracées à l’aide d’un modèle de régression logistique à quatre paramètres ou d’un modèle linéaire (avec un coefficient de détermination R2 > 0,99), permettant de calculer les concentrations des protéines cibles dans les homogénats de tissu pulmonaire.
Cytométrie en flux
Les tissus pulmonaires ont été prélevés, hachés et digérés dans 5 mL de RPMI-1640 contenant 10 % de FBS, 50 µL de Liberase TM et 5 µL de DNase I à 37 °C pendant 45 min sous agitation à 80 tr/min. La suspension digérée a été filtrée à travers un tamis cellulaire de 400 mailles, puis centrifugée à 300 × g pendant 10 min à 4 °C. Le culot a été resuspendu dans 2 mL de tampon de lyse des érythrocytes pendant 10 min à température ambiante à l’abri de la lumière. Après un lavage, les cellules ont été resuspendues et marquées avec le colorant Ghost Dye Red 780 (1,25 µL par échantillon) pendant 20 min à 4 °C à l’abri de la lumière, afin d’exclure les cellules mortes. Après un nouveau lavage, les cellules ont été bloquées avec 10 µL de réactif de blocage FcR pendant 10 min à 4 °C. Les cellules ont ensuite été marquées en surface avec les anticorps conjugués à des fluorochromes suivants pendant 30 min à 4 °C : FITC anti-souris CD45 (0,5 µL), PE anti-souris/humain KLRG1 (1,25 µL), BB700 rat anti-souris CD90,2 (0,5 µL), et un mélange d’anticorps de lignée biotinylés contenant anti-souris CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (0,5 µL chacun) et anti-souris CD19 (2 µL). Après lavage, les cellules ont été incubées avec la streptavidine Brilliant Violet 605 (2 µL) pendant 30 min à 4 °C. Les données ont été acquises sur une plateforme de cytométrie en flux BD et analysées à l’aide du logiciel FlowJo. Les matrices de compensation du recouvrement de fluorescence ont été automatiquement surveillées et ajustées par le logiciel d’acquisition calibré de l’appareil. La stratégie de sélection hiérarchique pour l’identification des ILC2 pulmonaires a été appliquée séquentiellement comme suit : les lymphocytes totaux ont d’abord été isolés selon leur morphologie en fonction de la diffusion directe et latérale (FSC-A/SSC-A), puis les doublets ont été éliminés par la sélection des cellules uniques (FSC-H/FSC-A). Les cellules viables ont ensuite été identifiées par exclusion des cellules mortes (Ghost Dye-), puis des fenêtres de sélection standard ont été progressivement appliquées pour isoler les populations CD45+ et Lineage-. Dans la fenêtre de sélection viable CD45+ Lineage-, les ILC2 pulmonaires ont été clairement définis et quantifiés en fonction des cascades positives successives suivantes : agrégats CD90,2+ puis KLRG1+.
Immunofluorescence (IF)
Des sections congelées de poumon ont été décongelées à température ambiante pendant 15 à 30 minutes et lavées trois fois avec du PBST (PBS contenant 0,05 % de Tween-20), chaque lavage durant 6 minutes, afin d'éliminer le composé OCT. Après élimination du liquide excédentaire par absorption, une barrière hydrophobe a été tracée autour du tissu à l’aide d’un stylo pour immunohistochimie. Les sections ont été incubées dans un tampon de blocage et de perméabilisation contenant 0,3 % de Triton X-100 et 5 % de sérum de chèvre à 37 °C pendant 100 minutes, puis incubées toute la nuit (16 à 20 heures) à 4 °C avec l’anticorps primaire. Le jour suivant, les sections ont été rééquilibrées à température ambiante pendant 30 minutes, lavées trois fois avec du PBST, puis incubées avec un anticorps secondaire marqué par un fluorophore, compatible avec l’espèce, à 37 °C à l’abri de la lumière pendant 60 à 90 minutes. Après trois nouveaux lavages supplémentaires avec du PBST, les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI (dilué 1:1 ou 2:1 dans du PBS) pendant 8 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Après un dernier cycle de lavages avec du PBST (3 × 6 minutes), les sections ont été montées avec un milieu de montage anti-décoloration, scellées pour éviter la formation de bulles, puis stockées à l’abri de la lumière. Les images ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal avec un grossissement de 400×. Le nombre de cellules positives par champ a été décompté manuellement à l’aide du logiciel Leica LAS X. Pour chaque groupe expérimental, un total de 15 champs microscopiques choisis au hasard ont été analysés afin d’obtenir les décomptes bruts de cellules. Les données provenant de chaque groupe de trois champs ont été moyennées pour produire un point de données indépendant unique, ce qui a conduit à une taille finale d’échantillon de n = 5 réplicats par groupe pour l’analyse statistique. Le décompte a été effectué de manière aveugle.
Immunohistochimie (IHC)
Les coupes en paraffine ont été déparaffinisées dans trois bains de xylène (15 min chacun), réhydratées à l’aide d’une série d’éthanol à concentrations décroissantes (100 % deux fois, 85 %, et 75 % ; 5 min chacun), puis rincées à l’eau distillée. La récupération des antigènes a été réalisée dans un tampon citrate (pH 6,0) à l’aide d’un autocuiseur (3 min à haute pression après ébullition), suivie d’un refroidissement et de trois lavages de 5 min dans le PBS (pH 7,4). La peroxydase endogène a été bloquée avec du H2O2 à 3 % pendant 15 min à température ambiante à l’abri de la lumière. Après lavage, les coupes ont été entourées à l’aide d’un stylo hydrophobe et bloquées avec 3 % de sérum de chèvre pendant 30 min. Les coupes ont ensuite été incubées toute la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires dilués dans le PBS : anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) ou anti-IL-13 (1:150). Le jour suivant, les coupes ont été lavées puis incubées avec des anticorps secondaires marqués à la peroxydase (anti-souris pour IL-4 ; anti-lapin pour IL-5 et IL-13) pendant 50 min à température ambiante. Les signaux ont été visualisés à l’aide d’une solution fraîchement préparée de DAB sous contrôle microscopique, puis l’incubation a été arrêtée à l’eau du robinet. Enfin, les coupes ont été contre-colorées à l’hématoxyline, différenciées, bleuies, déshydratées à l’aide d’alcools et de xylène à concentrations croissantes, puis montées au baume neutre pour examen microscopique. La densité optique moyenne (IOD/Surface) a été quantifiée à l’aide d’une plateforme logicielle d’analyse d’image à un grossissement de 200×. Pour chaque groupe expérimental, un total de 15 champs microscopiques choisis au hasard ont été photographiés afin d’obtenir les valeurs brutes. Les données de chaque groupe de trois champs ont été moyennées pour produire un point de données indépendant unique, ce qui a donné une taille finale d’échantillon de n = 5 réplicats par groupe pour l’analyse statistique. Le comptage a été effectué par deux observateurs en insu.
Immunotransfert (WB)
Pour la préparation des échantillons, des tissus pulmonaires de souris (environ 30 mg) ont été finement hachés et homogénéisés dans 300 µL de tampon de lyse RIPA prérefroidi, supplémenté avec 1 % de cocktail d'inhibiteurs de protéases/phosphatases. L'homogénéisation a été réalisée à l'aide d'un homogénéisateur de tissus à 60 Hz pendant quatre cycles (60 s par cycle). Les lysats ont ensuite été centrifugés à environ 13 400 × g pendant 15 min à 4 °C afin de récupérer le surnageant. Les concentrations totales en protéines ont été déterminées à l'aide d'un kit standard d'essai protéique BCA. Les échantillons ont ensuite été normalisés, mélangés avec un tampon de charge 5x selon un rapport volumétrique de 4:1, puis dénaturés à 95 °C pendant 7 min. Pour l'électrophorèse SDS-PAGE, des échantillons protéiques (20 µg par puits) ont été chargés en parallèle d'un marqueur de poids moléculaire protéique pré-teinté, puis séparés à une tension constante de 80 V pendant 20 min, suivie d'un ajustement à 120 V pendant 70 min. Les protéines ont ensuite été transférées par transfert humide sur des membranes PVDF de 0,22 µm sous un courant constant de 300 mA pendant 120 min dans un bain de glace. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de BSA dans du TBST pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit (jusqu'à 18 h) à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre CGRP (1:500) et GAPDH (1:2000). Après trois lavages avec du TBST (10 min chacun), les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (1:10000) pendant 1 à 2 h à température ambiante. Suite à trois nouveaux lavages, les bandes protéiques ont été visualisées à l'aide d'un substrat chimiluminescent amélioré (ECL) dans un système d'imagerie VILBER Fusion FX. Les intensités des bandes ont été quantifiées à l'aide d'ImageJ 1.8, et l'expression des protéines cibles a été normalisée par rapport au témoin interne GAPDH.
Analyse statistique
Toutes les données expérimentales sont exprimées comme la moyenne ± écart type (ET). L'analyse des données et la réalisation des graphiques statistiques ont été effectuées à l'aide d'une plateforme logicielle spécialisée en statistique. Avant les comparaisons entre groupes, les jeux de données ont systématiquement fait l'objet de tests de normalité. Pour les données normalement distribuées et présentant des variances homogènes, une analyse de la variance (ANOVA) unidirectionnelle ou bidirectionnelle ordinaire a été utilisée, suivie de tests a posteriori de Tukey, de Šídák, de Holm-Šídák ou du test LSD de Fisher pour les comparaisons multiples deux à deux. Lors de la comparaison de plusieurs groupes par rapport à un seul groupe témoin, le test de Dunnett a été appliqué. Pour les jeux de données présentant des variances hétérogènes, l'ANOVA de Brown-Forsythe a été utilisée, suivie du test a posteriori T3 de Dunnett. Pour les jeux de données ne suivant pas une distribution normale, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis a été employé, suivi du test a posteriori de Dunn pour les comparaisons multiples. Une valeur P < Une valeur de 0,05 a été considérée comme indiquant des différences statistiquement significatives. Les différents niveaux de significativité sont notés dynamiquement par *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 et ****p < 0,0001. Toutes les évaluations des résultats expérimentaux, y compris le score histologique, l'analyse par cytométrie en flux et la quantification d'images, ont été réalisées de manière strictement aveugle.
Résultats
KAST réduit les ILC2 pulmonaires et atténue l'inflammation des voies respiratoires de type 2
Afin d'étudier les effets thérapeutiques du KAST, un modèle murin d'AA induite par l'OVA a été établi et traité à l'aide de patchs appliqués sur les points d'acupuncture Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) et Shenshu (BL23) (Figure 1A). Après la constitution du modèle, les souris atteintes d'AA présentaient une diminution du poids corporel, tandis que les souris traitées au KAST montraient une augmentation significative du poids corporel par rapport au groupe modèle (Figure 1B). Le coefficient pulmonaire, un indicateur de l'inflammation pulmonaire, était élevé chez les souris AA mais nettement réduit après traitement par le KAST (Figure 1C). Les évaluations comportementales ont révélé une augmentation des grattages nasaux et des éternuements chez les souris AA, symptômes qui ont été significativement atténués par le KAST (Figure 1D–E). La pléthysmographie en corps entier a montré que les valeurs de Penh, indicatives d'une hyperactivité bronchique, étaient élevées chez les souris AA mais diminuaient après le traitement, suggérant une amélioration de la fonction pulmonaire (Figure 1F). L'analyse histopathologique par coloration à l'HE a révélé une infiltration de cellules inflammatoires péribronchiques et périalvéolaires dans le groupe modèle par rapport aux témoins normaux. En revanche, l'infiltration inflammatoire était réduite dans le groupe KAST (Figure 2A–B). L'immunohistochimie a montré que l'IL-4, l'IL-5 et l'IL-13 étaient principalement localisées dans le cytoplasme des cellules inflammatoires infiltrantes et de certaines cellules épithéliales, avec une accumulation potentielle dans les espaces interstitiels. Par rapport aux témoins normaux, le groupe modèle présentait des signaux positifs et des valeurs de densité optique moyenne nettement augmentés, lesquels étaient significativement réduits dans le groupe KAST (Figure 2C–H). La cytométrie en flux a en outre démontré que le nombre d'ILC2 était significativement accru dans les poumons des souris AA par rapport aux témoins normaux, alors que le KAST réduisait fortement les effectifs d'ILC2 (Figure 2I–J).
KAST atténue l'inflammation des voies respiratoires de type 2 en supprimant l'axe CGRP/RAMP1
L'hyperactivation des LCI2 est régulée par de multiples facteurs. Une analyse par séquençage de l'ARN a révélé que l'expression de la CGRP était significativement augmentée chez les souris AA, et que le KAST réduisait de manière marquée les niveaux pulmonaires de CGRP (Figure 3A). Le western blot et l'ELISA ont confirmé une élévation des niveaux protéiques de la CGRP dans le groupe modèle par rapport aux témoins, élévation qui était atténuée par le KAST (Figure 3B–D). Ces résultats suggèrent que le KAST atténue l'expression de la CGRP dans les poumons des souris AA, modulant ainsi les réponses immunitaires des LCI2. L'ensemble de ces variations observées lors du séquençage à haut débit et du criblage protéique suggère une forte association entre l'intervention thérapeutique par le KAST et la diminution des niveaux pulmonaires de CGRP chez les souris AA.
Afin d'approfondir le rôle du CGRP, des souris AA ont été traitées avec du CGRP exogène, l'antagoniste du récepteur du CGRP BIBN-4096, ou du KAST combiné au CGRP. Les résultats de l'ELISA ont montré des niveaux protéiques de CGRP significativement réduits dans les groupes KAST et BIBN-4096, des niveaux élevés dans le groupe CGRP, et des niveaux plus élevés dans le groupe KAST + CGRP par rapport au KAST seul (Figure 4A). La cytométrie en flux a révélé que le nombre d'ILC2 était réduit dans les groupes KAST et BIBN-4096, mais augmenté dans les groupes CGRP et KAST + CGRP par rapport au groupe modèle (Figure 4B–C). La coloration à l'hématoxyline-éosine a montré une infiltration réduite de cellules inflammatoires autour des voies respiratoires et des alvéoles dans les groupes KAST et BIBN-4096, tandis que l'infiltration était aggravée dans les groupes CGRP et KAST + CGRP (Figure 4D–E). L'ELISA a en outre confirmé une diminution des niveaux d'IL-4, d'IL-5 et d'IL-13 dans les groupes KAST et BIBN-4096, mais une augmentation dans les groupes CGRP et KAST + CGRP (Figure 4F–H).
Le nombre de cellules ILC2 exprimant RAMP1+ dans les poumons a été évalué par coloration immunofluorescente multicolore chez les différents groupes. Les résultats ont montré que, par rapport au groupe témoin normal, le nombre total d'ILC2 RAMP1+ dans les tissus pulmonaires du groupe modèle était significativement augmenté. Par rapport au groupe modèle, le nombre d'ILC2 pulmonaires RAMP1+ a encore augmenté de manière significative dans le groupe CGRP, tandis qu'il était nettement réduit dans les groupes BIBN-4096 et KAST. Notamment, par rapport au groupe KAST, le groupe KAST + CGRP a présenté une augmentation significative du nombre d'ILC2 pulmonaires RAMP1+, indiquant que la supplémentation exogène en CGRP a inversé avec succès les effets inhibiteurs du KAST sur la population totale d'ILC2 RAMP1+ (Figure 5A–B).
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les ensembles complets de données brutes générés et analysés au cours de la présente étude ont été déposés dans un référentiel accessible au public. Plus précisément, ces documents complets comprennent tous les scans membranaires complets et originaux des dosages par immunotransfert (WB), toutes les images microscopiques complètes, brutes et haute résolution destinées aux dosages d'histologie (HE et IHC) et d'immunofluorescence (IF), ainsi que les jeux de données individuels des répétitions expérimentales et les feuilles de quantification au format Excel. Toutes les données brutes sont librement accessibles via le DOI persistant suivant : https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. L'ordre de sélection des populations cellulaires en cytométrie en flux est indiqué dans la figure supplémentaire 1. Deux images complètes de transferts sont fournies sous forme de figures supplémentaires 2–3, et les données quantitatives sont fournies dans le tableau supplémentaire 1.
Figure 1 : Effets de KAST sur les symptômes et la fonction pulmonaire chez les souris AA. (A) Protocole d'induction de l'asthme allergique à l'aide d'OVA. (B) Statistiques du poids corporel des souris dans chaque groupe, n = 5. (C) Coefficient pulmonaire des souris dans chaque groupe, n = 5. (D) Nombre de frottements nasaux au cours des 10 minutes suivant le dernier défi, n = 5. (E) Fréquence des éternuements au cours des 10 minutes suivant le dernier défi, n = 5. (F) Valeurs de Penh des souris dans chaque groupe après stimulation avec différentes concentrations d'acétylcholine, n = 5. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur ou d'une ANOVA à deux facteurs, suivie d'un test de comparaisons multiples post hoc lorsque cela était applicable. n = réplicats biologiques. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Régulation par KAST du nombre d'ILC2 et de l'inflammation bronchique de type 2 chez les souris AA. (A) Modifications morphologiques des poumons examinées par coloration à l'HE. Échelle = 50 µm. Grossissement : 200×. Le score d'inflammation a été évalué de manière aveugle. (B) Analyse statistique des scores d'inflammation entre les différents groupes, n = 5. (C–H) Images représentatives d'immunohistochimie et valeurs moyennes de densité optique de l'expression protéique d'IL-4 (C, D), d'IL-5 (E, F) et d'IL-13 (G, H) dans les tissus pulmonaires des différents groupes, n = 5. Échelle = 50 µm. Grossissement : 200×. (I) Profils représentatifs de cytométrie en flux montrant le gating final des ILC2 pulmonaires dans les groupes Normal, Modèle et KAST. Les cellules uniques et viables ont été sélectionnées successivement comme CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), puis CD90.2+, et les ILC2 pulmonaires ont été finalement identifiées par l'expression positive de KLRG1+. Les données ont été acquises sur une plateforme de cytométrie en flux haute performance et analysées à l'aide d'un logiciel spécialisé d'analyse de cytométrie en flux. (J) Analyse des ILC2 exprimée en pourcentage de cellules CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ parmi les cellules vivantes, n = 5. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les comparaisons statistiques ont été réalisées par une ANOVA à un facteur suivie de tests post hoc appropriés de comparaisons multiples. n = réplicats biologiques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le KAST inhibe l'expression de la CGRP dans les tissus pulmonaires de souris AA. (A) Carte thermique de l'expression génique parmi différents groupes, n = 4. (B) Images représentatives de western blot de l'expression de la CGRP (10 kDa) et de la GAPDH (37 kDa) dans les tissus pulmonaires de chaque groupe. (C) Analyse par western blot de l'expression protéique de la CGRP dans les tissus pulmonaires, exprimée comme expression relative de la CGRP (rapport CGRP/GAPDH), n = 3. (D) Analyse par ELISA de l'expression protéique de la CGRP dans les tissus pulmonaires, n = 4. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie d'un test de comparaisons multiples post hoc. n = réplicats biologiques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Effets de KAST sur le nombre d'ILC2 et l'inflammation bronchique de type 2 via le CGRP chez les souris AA. (A) Analyse par ELISA de l'expression protéique du CGRP dans les tissus pulmonaires provenant de différents groupes, n = 4. (B) Profils représentatifs de cytométrie en flux des ILC2 (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) dans chaque groupe. (C) Analyse des ILC2 indiquée par le pourcentage de cellules CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ parmi les cellules vivantes, n = 5. (D) Modifications morphologiques des poumons examinées par coloration à l'hématoxyline-éosine. Échelle = 50 µm. Grossissement : 200×. (E) Analyse statistique des scores d'inflammation parmi les différents groupes, n = 5. (F–H) Analyse par ELISA de l'expression protéique de l'IL-4 (F), de l'IL-5 (G) et de l'IL-13 (H) dans les tissus pulmonaires provenant de différents groupes, n = 4. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les comparaisons statistiques ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie de tests post hoc appropriés pour comparaisons multiples. n = réplicats biologiques. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Effets de la KAST sur les nombres de cellules ILC2 dans les tissus pulmonaires via la voie CGRP/RAMP1. (AComptage cellulaire de RAMP1⁺ ILC2 (définis comme KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ cellules triplement positives par 400× champ dans les tissus pulmonaires, n = 5. (BColoration fluorescente représentative de tissus pulmonaires. Les noyaux ont été colorés avec le DAPI (bleu) et une immunomarquage a été réalisée pour KLRG1 (violet), GATA3 (rouge) et RAMP1 (vert). Échelle = 50 µm. Quantification : comptage manuel de RAMP1⁺ ILC2 (KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ cellules) de manière aveugle à l'aide d'une plateforme spécialisée d'analyse d'images. Les données sont présentées comme moyenne ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0,0001. Les comparaisons statistiques ont été effectuées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie d'un test de comparaisons multiples a posteriori. n = réplicats biologiques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Graphiques représentatifs de cytométrie en flux illustrant la stratégie de sélection séquentielle pour l'isolement des ILC2 pulmonaires. Premièrement, les événements totaux ont été sélectionnés à l’aide de la diffusion directe (FSC-A) et de la diffusion latérale (SSC-A). Les doublets ont été exclus par comparaison FSC-A vs. FSC-H afin d’obtenir des cellules simples. Les cellules vivantes ont été identifiées comme étant négatives pour le colorant Ghost Dye Red 780⁻ afin d’éliminer les populations de cellules mortes. Les leucocytes ont ensuite été sélectionnés selon l’expression de CD45⁺, suivis par la sélection de cellules négatives pour les marqueurs de lignée (Lin⁻). Au sein de la sous-population CD45⁺ Lin⁻, les cellules ont été davantage sélectionnées selon l’expression de CD90.2⁺, et les ILC2 pulmonaires ont finalement été définis par l’expression positive de KLRG1 (KLRG1⁺).Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Image représentative de l'immunotransfert du témoin interne GAPDH (37 kDa) à partir d'échantillons de tissu pulmonaire de souris. La densité optique intégrée des bandes a été quantifiée à l'aide du logiciel ImageJ pour une normalisation ultérieure.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 3 : Image représentative de l'immunotransfert Western du protéine ciblée CGRP (10 kDa) à partir d'échantillons de tissu pulmonaire de souris. L'expression relative de CGRP a été calculée en divisant la densité optique intégrée des bandes CGRP par les valeurs correspondantes de densité optique intégrée de GAPDH.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Valeurs brutes des données. Valeurs brutes des données utilisées pour tracer les graphiques.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Le traitement de l'AA fait face à plusieurs limites, notamment des effets secondaires liés à une utilisation prolongée de médicaments, un contrôle incomplet des symptômes et des rechutes fréquentes. Bien que la pharmacothérapie conventionnelle soit efficace, elle s'accompagne souvent d'effets indésirables tels que la dépendance aux stéroïdes26,27. En revanche, la KAST offre une alternative sûre, économique et pratique pour la prise en charge de l'AA. Des preuves cliniques ont montré que la KAST peut atténuer efficacement les symptômes de l'asthme en modulant la fonction immunitaire pulmonaire28. Dans cette étude, nous avons en outre démontré que la KAST atténue l'inflammation des voies respiratoires de type 2 chez des souris atteintes d'AA en supprimant la voie CGRP/RAMP1 et en réduisant le nombre de cellules ILC2.
L'immunité innée, en particulier les ILC2, joue un rôle indispensable dans l'initiation, l'amplification et le maintien de l'inflammation bronchique de type 2 dans l'AA29. Après une exposition aux allergènes, les ILC2 réagissent rapidement aux alarmines d'origine épithéliale, sécrétant de grandes quantités d'IL-5 et d'IL-13 en quelques heures, déclenchant ainsi des réponses inflammatoires de type 230,31. De plus, les ILC2 favorisent la différenciation des lymphocytes Th2 et la synthèse d'IgE, amplifiant davantage les réponses immunitaires adaptatives et aggravant l'inflammation bronchique32. Des études ont montré que l'ablation génétique des ILC2 réduit significativement la durée de l'inflammation bronchique dans les modèles d'AA, soulignant leur rôle central dans le maintien de l'inflammation de type 218. Les ILC2 sont régulés par des cytokines (par exemple, IL-25, IL-33, TSLP), des médiateurs inflammatoires (par exemple, les leucotriènes) et des neuropeptides (par exemple, CGRP, VIP, NMU)33. Parmi ceux-ci, les neuropeptides jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'immunité innée. La neuromédine U (NMU) renforce directement l'activité des ILC2, induisant rapidement la libération d'IL-5 et d'IL-1334. Le peptide intestinal vasoactif (VIP) contribue à l'absorption des nutriments et à la régulation circadienne, favorise la production d'IL-5 par les ILC2 et maintient l'homéostasie des éosinophiles33. Le CGRP augmente fortement la libération d'IL-5 par les ILC2, favorisant ainsi l'inflammation bronchique dans l'AA. Notamment, RAMP1, la sous-unité réceptrice du CGRP, est exprimée à des niveaux beaucoup plus élevés sur les ILC2 que les récepteurs des autres neuropeptides, suggérant que le CGRP est le ligand le plus puissant pour l'activation des ILC235. Dans cette étude, une analyse transcriptomique a identifié le CGRP comme l'un des neuropeptides les plus différentiellement exprimés chez les souris atteintes d'AA, et des dosages protéiques ont confirmé sa surexpression dans les tissus pulmonaires. L'administration exogène de CGRP a encore augmenté le nombre d'ILC2 et la libération de cytokines de type 2, aggravant l'inflammation bronchique.
D'un point de vue mécanistique, le CGRP se lie à RAMP1 sur les ILC2 pour réguler leurs réponses immunitaires en aval. Alors que certaines études existantes décrivent le CGRP comme un régulateur négatif limitant l'expansion des ILC2 afin de protéger contre l'hyperinflammation20,21, des preuves contraires indiquent que le CGRP peut coopérer avec les alarmines pour provoquer de manière marquée une immunité innée de type 2 dans des microenvironnements pathologiques spécifiques. Nos critères d'évaluation expérimentaux s'alignent précisément sur cette dernière cascade, démontrant une augmentation, induite par le CGRP, de l'infiltration pulmonaire par les ILC2 dans le microenvironnement allergique induit par l'OVA. En revanche, le blocage de la voie du CGRP à l'aide de l'antagoniste récepteur BIBN-4096 atténue significativement l'inflammation des voies respiratoires médiée par les ILC2. Plutôt que de fournir une preuve directe par abolition génétique, nos résultats s'appuient sur des variations transcriptomiques associatives et sur des expériences parallèles d'intervention pharmacologique (utilisant du CGRP exogène et l'antagoniste BIBN-4096) pour démontrer que la protection thérapeutique offerte par le KAST est étroitement corrélée à la suppression des groupes de signalisation CGRP/RAMP1 sur les ILC2.
Malgré ces résultats prometteurs, plusieurs limites inhérentes doivent être reconnues. Premièrement, bien que le modèle murin induit par l’OVA fournisse des informations mécanistiques précieuses, il pourrait ne pas reproduire fidèlement le paysage pathophysiologique et immunologique complexe de l’asthme allergique humain en raison de différences interspécifiques. Deuxièmement, la taille relativement restreinte de l’échantillon dans certains dosages exploratoires implique que des cohortes plus importantes sont nécessaires afin d’obtenir une généralisation statistique plus large. Troisièmement, cette étude a principalement privilégié l’axe de signalisation CGRP/RAMP1/ILC2, ce qui signifie que d’autres voies de communication neuro-immunitaire potentiellement pertinentes ainsi que les réseaux de cytokines chevauchants méritent une exploration plus approfondie à l’avenir. De manière particulièrement notable, une limitation technique majeure réside dans l’absence d’un groupe contrôle utilisant un point sham, avec des patchs non médicamenteux ou appliqués en dehors des points d’acupuncture. Par conséquent, des facteurs de confusion non spécifiques potentiels—tels que le stress mécanique dû au rasage, la manipulation expérimentale et la stimulation adhésive du patch lui-même—ne peuvent pas être entièrement dissociés des propriétés thérapeutiques spécifiques du KAST. Pour lever ces réserves, nos futures lignes de recherche intégreront strictement des groupes contrôle sham rigoureusement conçus ainsi que des validations multi-voies afin de consolider davantage la spécificité et la reproductibilité de ces résultats. En ce qui concerne la réduction observée des niveaux protéiques de CGRP après l’intervention par BIBN-4096, il est essentiel de préciser que, bien que le BIBN-4096 fonctionne principalement comme un antagoniste compétitif ciblant le complexe récepteur RAMP1/CRLR plutôt qu’un inhibiteur direct de la synthèse du CGRP, son administration in vivo peut entraîner une diminution de l’accumulation tissulaire locale du ligand. Ce phénomène secondaire est probablement médié par l’interruption de la boucle de rétroaction positive neuro-immunitaire. En bloquant le RAMP1 sur des cellules immunitaires cibles telles que les ILC2, le BIBN-4096 supprime la libération en aval de cytokines effectrices, ce qui, en retour, diminue l’activation rétrograde des terminaisons nerveuses sensorielles et des cellules pulmonaires neuroendocrines (PNEC) par l’inflammation, atténuant ainsi indirectement la synthèse et la rétention tissulaire du CGRP en aval.
En résumé, nos résultats empiriques démontrent que KAST remodèle efficacement le microenvironnement immunitaire inné pulmonaire en ciblant l'axe neuronal CGRP/RAMP1. Bien que nous reconnaissions qu'une extrapolation clinique directe nécessite une optimisation prudente en raison des différences biologiques entre les rongeurs et les humains, ces résultats fournissent une base mécanistique essentielle, jusqu'ici manquante, qui étaye la théorie traditionnelle « Fei Wai He Pi Mao » (le poumon associé à la peau et aux poils). En offrant une perspective neuro-immunitaire affinée, ce protocole établit une référence scientifique fiable pour orienter et soutenir les futures traductions cliniques prospectives et multicentriques des thérapies traditionnelles de cataplasme médicamenteux sur points d'acupuncture dans la prise en charge de l'asthme allergique.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82274632), le projet de formation des talents leaders de la province du Jiangsu en médecine traditionnelle chinoise (n° SLJ0309), la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (n° BK20231381), le projet du plan de développement scientifique et technologique en médecine traditionnelle chinoise de la province du Jiangsu (n° ZT202205), et le laboratoire clé de recherche sur l'acupuncture et la médecine du ministère de l'Éducation de l'Université de médecine chinoise de Nanjing (n° AML202304).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 3M Medical Breathable Tape | 3M, USA | 1530C | Fixation du patch |
| Chlorure d'acétylcholine | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | Provocation bronchique |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, USA | G2939BA | Évaluation de la qualité et de l'intégrité de l'ARN |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG de chèvre anti-lapin (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | (commande personnalisée) | Immunofluorescence (secondaire) |
| Hydroxyde d'aluminium | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | Adjuvant |
| Anticorps anti-CGRP (lapin) | Abcam, UK | ab81887 | Western blot / IF |
| Souris BALB/c (femelle, SPF, 8–10 semaines, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | Modèle animal |
| BB700 anti-CD90.2 de rat anti-souris (clone 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | Cytométrie en flux |
| Cytomètre en flux BD FACSCanto II | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | Cytométrie en flux |
| BIBN-4096 (chlorhydrate d'Olcegepant) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | Antagoniste du récepteur CGRP |
| Cocktail biotiné de lignage | BD Biosciences, USA | (Personnalisé, clones comme décrits) | Cytométrie en flux |
| Streptavidine Brilliant Violet 605 | BD Biosciences, USA | 563260 | Cytométrie en flux |
| BSA Albumine Fraction V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Allemagne | 4240GR100 | Blocage |
| Protéine Calcitonine/CALCA | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | Intervention CGRP |
| Anticorps CD11c/ITGAX (lapin) | Abmart, Shanghai, Chine | MU115408S | Immunofluorescence |
| Solution de récupération d'antigène au citrate | Boster, Chine | AR0024 | Immunohistochimie |
| Solution de coloration DAPI | Beyotime, Shanghai, Chine | C1006 | Coloration nucléaire |
| ddH2O (eau doublement distillée) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | Reconstitution protéique et dissolution de poudre |
| DESeq2 | Bioconductor (paquet R) | Version 1.42.0 | Logiciel d'analyse d'expression différentielle |
| DNase I | Roche Diagnostics, Allemagne | 10104159001 | Digestion du tissu pulmonaire |
| Anti-IgG de chèvre anti-souris H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, UK | ab150106 | Immunofluorescence (secondaire) |
| Substrat ECL (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, Chine | – | Chimioluminescence en Western blot |
| Kit amélioré d'essai de protéines BCA | Beyotime, Shanghai, Chine | P0010 | Quantification des protéines |
| Solution de coloration Eosine Y | Sigma-Aldrich, USA | HT110216 | Histologie (coloration HE) |
| Éthanol (absolu, qualité analytique) | Sinopharm Chemical Reagent, Chine | 10009218 | Déshydratation tissulaire et histologie |
| Anticorps F4/80 (souris, clone C-7) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | Immunofluorescence |
| fastp | Open Source (GitHub) | Version 0.23.4 | Logiciel de contrôle qualité des données brutes de séquençage ARN |
| FITC anti-CD45 de souris (clone 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | Cytométrie en flux |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | Analyse de cytométrie en flux |
| Anticorps monoclonal anti-GAPDH (souris) | Proteintech, Wuhan, Chine | 60004-1-Ig | Western blot |
| Anticorps GATA3 (souris, clone L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | Immunofluorescence |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | Exclusion des cellules mortes |
| Anticorps secondaire anti-IgG de chèvre anti-lapin (H+L) adsorbé croisé | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | Immunofluorescence (secondaire) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | Analyse statistique |
| Solution d'hématoxyline (Harris) | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | Histologie (coloration HE) |
| HISAT2 | Johns Hopkins University (Open Source) | Version 2.2.1 | Logiciel d'alignement du génome de référence pour le séquençage ARN |
| Anticorps secondaire anti-IgG de chèvre anti-souris conjugué à la HRP (H+L) | Proteintech, Wuhan, Chine | SA00001-1 | Western blot (secondaire) |
| Anticorps secondaire anti-IgG de chèvre anti-lapin conjugué à la HRP (H+L) | Proteintech, Wuhan, Chine | SA00001-2 | Western blot (secondaire) |
| HTSeq-count | EMBL (utilitaire Python) | Version 2.0.3 | Utilitaire de comptage des lectures par caractéristique génomique en séquençage ARN |
| Peroxyde d'hydrogène (H2O2, solution à 3 %) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Blocage de la peroxydase endogène |
| Anticorps de chèvre anti-lapin IgG conjugué à iFluor™ 488 | Huabio, Chine | HA1121 | Immunofluorescence (secondaire) |
| Anticorps monoclonal IL-4 | Proteintech, Wuhan, Chine | 66142-1-Ig | Western blot |
| Anticorps IL13 | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Western blot |
| Anticorps IL5 | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, USA | – | Séquençage ARN |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Quantification en Western blot |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Version 6.0 | Quantification de la densité optique des images |
| Formulation à base de plantes KAST | Service de pharmacie, Hôpital affilié de l'Université de médecine chinoise de Nanjing | – | Intervention |
| Anticorps monoclonal KLRG1 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | Immunofluorescence |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Allemagne | 4.5 | Quantification de l'immunofluorescence |
| Microscope confocal Leica STELLARIS 8 DIVE | Leica Microsystems, Allemagne | STELLARIS 8 | Imagerie par immunofluorescence |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Allemagne | 5401119001 | Digestion du tissu pulmonaire |
| Marcueur (échelle de protéines pré-étalonnée) | NCM Biotech, Suzhou, Chine | P9001 | Western blot |
| Kit ELISA souris CGRP | Aifang Biotechnology, Hunan, Chine | AF2491-A | ELISA |
| Kit ELISA souris IL-13 | Aifang Biotechnology, Hunan, Chine | AF-02456M1 | ELISA |
| Kit ELISA souris IL-4 | Aifang Biotechnology, Hunan, Chine | AF-02448M1 | ELISA |
| Kit ELISA souris IL-5 | Aifang Biotechnology, Hunan, Chine | AF-11729M1 | ELISA |
| Milieu de montage au baume neutre | Sinopharm Chemical Reagent, Chine | 10014061 | Montage des lames histologiques |
| Sérum de chèvre normal (pour blocage) | Abcam, UK | ab7481 | Blocage en immunohistochimie/IF |
| Composé d'inclusion OCT | Sakura, USA | 4583 | Inclusion pour cryosections |
| Kit de préparation rapide One-Step PAGE Gel | Vazyme, Nanjing, Chine | E303-01 | Préparation du gel SDS-PAGE |
| Ovalbumine (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | Sensibilisation/défi |
| Paraformaldéhyde (4 % en PBS) | Biosharp, Chine | BL539A | Fixation tissulaire |
| PE anti-KLRG1 de souris/humain (clone 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | Cytométrie en flux |
| Cocktail d'inhibiteurs de phosphatase (50×) | Beyotime, Shanghai, Chine | P1092 | Extraction protéique |
| Solution de poly-L-lysine | Boster, Chine | AR0003 | Revêtement des lames histologiques |
| Inhibiteur de protéinase et de phosphatase | NCM Biotech, Suzhou, Chine | P002 | Extraction protéique |
| Membre PVDF (0,22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Western blot |
| Anticorps polyclonal RAMP1 (lapin) | Proteintech, Wuhan, Chine | 10327-1-AP | Immunofluorescence |
| Solution de lyse des globules rouges (RBC) | Beyotime, Shanghai, Chine | C3702 | Préparation des échantillons pour cytométrie en flux |
| Solution de lyse RIPA (forte) | Beyotime, Shanghai, Chine | P0013B | Extraction protéique |
| Milieu RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11875093 | Solution de base pour digestion cellulaire tissulaire |
| Milieu de montage antifade SuperKine™ amélioré | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | Montage en immunofluorescence |
| Triton X-100 (détachant) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | Perméabilisation en immunofluorescence |
| Réactif TRIzol | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | Extraction d'ARN |
| Kit de préparation de bibliothèque VAHTS Universal V10 pour séquençage ARN | Vazyme, Nanjing, Chine | NR605-01 | Construction de bibliothèque pour séquençage ARN |
| Système de pléthysmographie corporelle entière | Guangyuanda, Pékin, Chine | WBP-4 | Fonction pulmonaire (Penh) |
| Xylène (qualité analytique) | Sinopharm Chemical Reagent, Chine | 10023418 | Déparaffinage et clarification |
Références
- Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
- Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
- Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
- Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
- Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
- Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
- Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
- Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
- Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
- Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
- Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
- Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
- Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
- Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
- Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
- Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
- Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
- Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
- Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
- Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
- Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
- Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
- Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
- Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
- Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
- Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
- Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
- Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
- van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
- Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
- Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
- Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
- Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
- Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
- Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.