Protocole standardisé de cytométrie à flux multicolore pour l’évaluation mesurable des maladies résiduelles dans la leucémie aiguë

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail standardisé de cytométrie à flux multicolore pour l’évaluation mesurable des maladies résiduelles dans la leucémie aiguë, intégrant le traitement contrôlé des échantillons, des paramètres d’acquisition harmonisés, des stratégies de verrouillage séquentiel et une interprétation ajustée au dénominateur afin d’améliorer la reproductibilité analytique dans les laboratoires cliniques de routine.

Résumé

La maladie résiduelle mesurable (MRD) est un indicateur pronostique important dans la prise en charge de la leucémie aiguë. Cependant, l’évaluation systématique du flux multicolore (MFC) de routine reste vulnérable à la variabilité pré-analytique et analytique, notamment l’hémodilution, la profondeur d’acquisition incohérente et l’interprétation subjective. Cet article présente un flux de travail opérationnel standardisé pour l’évaluation de routine des MRD dans la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL) et la leucémie myéloïde aiguë (LMA). Le protocole intègre des critères stricts d’acceptation des échantillons, avec une évaluation intégrée de l’hémodilution, et utilise une méthode de lyse massive des globules rouges pour la moelle osseuse et les échantillons de sang périphérique. La standardisation analytique est réalisée grâce à des panels d’anticorps à deux tubes et huit couleurs spécifiques à la maladie, des objectifs d’acquisition harmonisés nécessitant au moins 500 000 événements positifs au CD45, et des stratégies de verrouillage séquentiel fixes. De plus, le flux de travail applique des limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ajustées au dénominateur pour soutenir un système de reporting objectif à trois niveaux. La validation de 197 échantillons cliniques a démontré une forte répétabilité, une linéarité dilutionnelle robuste et une forte concordance avec des tests moléculaires orthogonaux appariés. Collectivement, ce protocole fournit un cadre pratique pour la surveillance standardisée des MRD. pour la surveillance standardisée des MRD dans les laboratoires cliniques de routine en intégrant une manipulation pré-analytique contrôlée et des paramètres analytiques harmonisés.

Introduction

Même après avoir atteint la rémission morphologique, les patients atteints de leucémie aiguë nécessitent une surveillance continue pour détecter la maladie résiduelle mesurable (MRD) afin d’évaluer avec précision le risque de rechute. Les examens morphologiques et cytopathologiques conventionnels manquent de la sensibilité nécessaire pour détecter des populations leucémiques résiduelles de faible niveau. Par conséquent, l’évaluation des MRD est devenue un élément essentiel du suivi de la maladie tant dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA) que dans la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL). Les recommandations récentes de l’European LeukemiaNet soulignent que l’évaluation fiable des MRD dans la LMA dépend de la normalisation technique et de la reproductibilité interobservateur, plutôt que de la simple disponibilité des tests ^1,2. Dans B-ALL, la cytométrie à flux multicolore (MFC) reste particulièrement importante pour les patients sans cibles moléculaires stables. Des études antérieures ont démontré que des approches cytométriques à flux multicolore standardisées utilisant des panneaux d’anticorps structurés peuvent permettre une détection résiduelle reproductible^{et sensible de la maladie 3}. La cytométrie en flux est largement utilisée en raison de sa large applicabilité, de son temps de réponse rapide et de son rapport qualité-prix. La performance des tests reste fortement dépendante de la préparation standardisée de l’échantillon, des paramètres d’acquisition et de l’interprétation des^{données 4}.

L’un des principaux défis techniques dans l’évaluation des MRD cytométriques en flux est la détection d’événements rares, fortement influencée par la profondeur d’acquisition et le nombre total d’événements. Des panneaux d’anticorps identiques peuvent produire des sensibilités analytiques différentes si des échantillons sont acquis avec des tailles de dénominateur^{incohérentes 5}. La standardisation va donc au-delà de la sélection des anticorps et nécessite un traitement harmonisé des échantillons, une lyse des globules rouges en masse, la compensation des instruments, des cibles d’acquisition et des stratégies de verrouillage. Dans les échantillons de moelle osseuse, l’hémodilution représente également une variable pré-analytique significative car la contamination sanguine périphérique peut réduire artificiellement la charge leucémique résiduelle^{apparente 6,7}. De plus, l’interprétation des événements de basse fréquence nécessite des seuils de signalement clairement définis basés sur la profondeur d’acquisition spécifique à chaque échantillon. Des études récentes ont souligné l’importance des limites de détection (LOD) et de quantification (LOD) ajustées par dénominateur (LOQ) pour améliorer la cohérence de l’interprétation MRD cytométrique^{en flux 8}.

L’objectif global de ce protocole est de fournir un flux de travail standardisé pour l’évaluation de routine des MRD basée sur la MFC dans B-ALL et AML. Le protocole intègre les critères d’acceptation des échantillons, l’évaluation de l’hémodilution, la conception de panels d’anticorps spécifiques à la maladie, la préparation d’échantillons par lyse en masse, des cibles d’acquisition harmonisées, des stratégies de verrouillage séquentiel fixes et des critères de déclaration ajustés au dénominateur dans un seul cadre opérationnel ^9,10. En combinant des procédures pré-analytiques et analytiques standardisées, cette méthode offre une approche pratique et reproductible pour la mise en œuvre clinique de routine en laboratoire du suivi des MRD. La figure 1 illustre le flux de travail standardisé pré-analytique et analytique mis en œuvre dans cette étude. Le tableau 1 résume les caractéristiques de cohorte et de spécimen des patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (LLA) et de leucémie myéloïde aiguë (LMA) inscrits durant la période de validation sur des fenêtres de suivi prédéfinies (fin d’induction, consolidation et pré-HSCT).

Figure 1 : Flux de travail standardisé pour l’évaluation cytométrique systématique à flux multicolore de MRD. (A) Flux de travail pré-analytique montrant le criblage des échantillons et l’évaluation de la qualité sur des intervalles de suivi prédéfinis. (B) Flux de travail analytique, de la lyse globale des globules rouges et la coloration des anticorps jusqu’à la surveillance séquentielle, l’interprétation ajustée au dénominateur et le rapport final des MRD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Démographie des patients consolidée, caractéristiques cliniques des échantillons et métriques d’acquisition de routine. Ce tableau unique révisé résume les caractéristiques cliniques de base de la cohorte engagée comprenant les cas de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL) et de leucémie myéloïde aiguë (LMA), et combine les données démographiques au niveau du patient avec les caractéristiques au niveau de l’échantillon, les intervalles de suivi du traitement, la viabilité, les scores d’hémodilution, les profondeurs d’acquisition et les classifications mesurables mesurables de la maladie résiduelle ajustée au dénominateur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des spécimens humains ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le Comité d’éthique du Second Hôpital Populaire de Neijiang (Approbation n° PXTS887192). L’étude a utilisé des échantillons cliniques résiduels dé-identifiés obtenus après des tests diagnostiques de routine. Le consentement éclairé a été renoncé car l’étude n’affectait pas les soins aux patients, l’allocation des traitements ou les procédures de collecte des échantillons. Les produits chimiques, réactifs et équipements utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Collecte de spécimens et évaluation pré-analytique

1. Collectez des aspirates de moelle osseuse comme type d’échantillon préféré pour l’évaluation de la maladie résiduelle mesurable (MRD). Utilisez des échantillons de sang périphérique uniquement lorsque l’aspiration de moelle osseuse est cliniquement contre-indiquée ou lors de vidéosurveillance et d’analyses comparatives sélectionnées.
2. Prélever l’échantillon de moelle osseuse lors du premier prélèvement aspiré dès que possible. Éviter les extractions aspirées ultérieures afin de minimiser la contamination du sang périphérique et la sous-estimation des résiduels de faibles résidus.
3. Transférer les échantillons dans des tubes d’acide éthylénédiaminetétraacétique dipotassique (K2-EDTA) ou d’anticoagulants sodium-héparine immédiatement après la collecte. Stockez et transportez les spécimens à température ambiante (18–25 °C) et protégez-les du soleil direct.
   ATTENTION : Ne réfrigérez pas les spécimens.
4. Traiter tous les spécimens dans les 24 heures suivant la collecte. Pour les études de stabilité, conserver les aliquotes pour une analyse répétée à 24 h et 48 h tout en conservant des conditions de stockage à température ambiante.
5. Vérifiez l’identifiant du patient, le type d’anticoagulant, l’intégrité de l’échantillon et le délai de prélèvement lors de la réception. Rejeter des spécimens présentant une coagulation importante, une hémolyse sévère ou une dégénérescence cellulaire marquée
6. Évaluer les échantillons de moelle osseuse pour l’hémodilution avant l’interprétation finale. Calculez un score semi-quantitatif d’hémodilution allant de 0,00 à 1,00 pour estimer la contamination du sang périphérique.
7. Déterminez cette valeur en divisant la proportion de lymphocytes matures par la somme des progéniteurs CD34-positifs, des granulocytes immatures et des lymphocytes matures, où un quotient plus élevé indique un effet dilutionnel plus important.
   REMARQUE : Calculez le score en utilisant la formule suivante :
    
   où un score plus élevé indique une contamination sanguine périphérique plus importante.
8. Classez les scores d’hémodilution comme suit : <0,20, acceptable ; 0,20–0,39, légèrement hémodiluté ; et ≥0,40, substantiellement hémodilutée.
   REMARQUE : N’attribuez pas d’interprétations définitives négatives à la MRD à des spécimens fortement hémodilutés à moins que la taille adéquate du dénominateur et l’architecture précurseur de la moelle préservée ne soient confirmées.

2. Préparation du bilan anticorps spécifique à la maladie

1. Préparez des panels d’anticorps standardisés à deux tubes et huit couleurs spécifiques à la maladie pour l’analyse B-ALL et AML. Atteindre la standardisation des panels en respectant strictement les marqueurs fixes de la colonne vertébrale sur tous les tubes pour un contrôle stable de population.
2. Utilisez des conjugués fluorochromes cohérents pour les antigènes de lignée correspondants et suivez strictement les volumes de titration recommandés par le fabricant afin de minimiser la variabilité de fluorescence d’un lot à l’autre.
3. Consultez le Tableau Supplémentaire 1 pour les combinaisons de marqueurs, les affectations des fluorochromes, les clones d’anticorps, les volumes de coloration et les paramètres d’acquisition.
4. Pour l’évaluation de B-ALL, utilisez CD19, CD45, CD34, CD10 et CD20 comme marqueurs de colonne vertébrale dans les deux tubes afin de définir les populations de précurseurs et les schémas de maturation. Ajoutez CD38, CD58 et CD81 dans le tube 1.
5. Ajouter CD66c, CD123, et soit CD73 soit CD304 dans le tube 2 selon l’immunophénotype associé diagnostique à la leucémie établi lors de l’évaluation initiale.
6. Pour l’évaluation de la LMA, utilisez CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 et HLA-DR comme marqueurs de la colonne vertébrale dans les deux tubes afin de définir les populations de blasts et de myéloïdes immatures.
7. Ajoutez CD7 et CD56 au tube 1 pour évaluer l’expression d’antigènes croisés. Ajouter CD11b et CD15 dans le tube 2 pour évaluer les anomalies de maturation des myéloïdes.

3. Préparation et coloration de la lyse en vrac

1. Transférez 2,0 mL de moelle osseuse bien mélangée ou d’échantillons de sang périphérique dans un tube de polypropylène de 15 mL. Si le volume d’échantillon est limité, utilisez un volume d’entrée minimum de 1,0 mL.
2. Ajoutez 10 mL de tampon de lyse au chlorure d’ammonium préchauffé à l’échantillon. Incubez la suspension pendant 10 minutes à température ambiante pour lyser les globules rouges.
3. Centrifugez l’échantillon à 500 × g pendant 5 minutes. Jetez le surnageant soigneusement sans déranger la pellete de cellules nucléées.
4. Résuspendez le pellet dans 2 mL de solution saline tamponnée phosphate (PBS) contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA). Répétez l’étape de lavage une fois si une contamination résiduelle par hémoglobine reste visible.
5. Déterminer la concentration des cellules nucléées à l’aide d’un analyseur hématologique automatisé ou du comptage manuel d’hémocytomètres avec exclusion du bleu de trypan. Considérons une concentration minimale de cellules nucléées de 5 × 10⁶ cellules/mL comme optimale pour l’acquisition standard.
   REMARQUE : Si le rendement cellulaire descend en dessous de ce seuil, concentrez l’échantillon par centrifugation supplémentaire à 500 × g pendant 5 minutes, puis réduisez soigneusement le volume du tampon de resuspension pour maximiser la densité cellulaire.
6. Aliquote 5 × 10⁶ cellules nucléées par tube pour la coloration de routine. Augmenter l’entrée à un maximum de 1 × 10⁷ cellules par tube pour une analyse à haute sensibilité lorsque la récupération de l’échantillon le permet ^6,7.
7. Ajoutez le cocktail d’anticorps titré individuellement et le colorant de viabilité réparable spécifié dans le tableau des matériaux à chaque tube selon la configuration validée du panneau de coloration. Le bilan validé de routine utilise 5 μL par anticorps conjugué au fluorochrome, sauf si la titrage recommandée par le fabricant indique un volume spécifique à l’anticorps différent.
8. Assurez-vous que le volume final de la réaction de coloration soit strictement maintenu à 100 μL par test afin de préserver une stœchiométrie optimale anticorps-antigène. Incubez les spécimens pendant 15 minutes à température ambiante dans le noir.
9. Lavez les cellules colorées une fois à l’aide d’un tampon de lavage et resuspendez la dernière pellete dans 500 μL de tampon d’acquisition.
10. Préparez des contrôles de compensation à une seule teinture à l’aide de billes de compensation le jour même de l’acquisition de l’échantillon.

4. Installation des instruments et acquisition des données

1. Effectuez un contrôle qualité quotidien au démarrage du cytomètre de débit avant de prétendre les échantillons du patient. Vérifiez la fluidique, l’alignement laser, les performances du détecteur et les valeurs cibles de fluorescence à l’aide de billes d’étalonnage, en suivant les instructions du fabricant.
2. Préparez des contrôles de compensation à coloration unique en utilisant les mêmes fluorochromes inclus dans les panneaux d’anticorps. Ajustez la matrice de compensation avant l’acquisition du patient et confirmez que les marqueurs de la colonne vertébrale restent dans les plages de fluorescence cibles prédéfinies.
3. Utilisez le même modèle d’acquisition, les mêmes réglages du détecteur, la même stratégie de compensation et la hiérarchie de gating pour tous les échantillons analysés pendant la période de validation.
   REMARQUE : Assurez une harmonisation adéquate entre les instruments en établissant des valeurs standardisées d’intensité médiane de fluorescence cible pour tous les détecteurs à l’aide de billes d’étalonnage spécialisées, et confirmez que des échantillons identiques produisent des profils de fluorescence comparables sur différentes plateformes avant l’acquisition des données cliniques.
4. Acquérir des données à un débit faible à modéré afin de réduire les événements coïncidents et de préserver la précision de la détection des événements rares. Surveillez continuellement le taux d’événements pendant l’acquisition.
5. Acquérir au moins 500 000 événements nucléés positifs au CD45 pour chaque résultat de MRD à déclarer. Lorsque la qualité des spécimens et la stabilité des événements le permettent, il faut étendre l’acquisition à 1,0 à 1,5 million d’événements au total, surtout lorsque des maladies résiduelles de faible niveau sont suspectées.
6. Pause ou arrêt de l’acquisition si une instabilité fluidique, des bouchons d’échantillons, des changements brusques de taux d’événement ou une détérioration visible de la qualité de la diffusion surviennent. Refiltrez ou remixez l’échantillon lorsque cela est approprié, et ne réacquirez l’échantillon qu’après rétablissement du débit stable.

5. Saisie séquentielle et interprétation ajustée au dénominateur

1. Analysez les données de cytométrie en flux à l’aide d’un logiciel validé d’analyse de cytométrie en écoulement. Utiliser la même stratégie de gating séquentielle pour tous les spécimens afin de réduire la variabilité entre opérateurs.
2. Établir des schémas de maturation normaux et régénérants en acquérant et analysant indépendamment une banque de référence d’au moins 20 spécimens de moelle osseuse normale ou régénérante servant de modèles d’expression de base.
3. Excluez les débris en utilisant les paramètres de diffusion avant et de dispersion latérale. Isolez les cellules individuelles en appliquant une barrière de diffusion avant par rapport à la hauteur de diffusion directe.
4. Excluez les cellules non viables en utilisant la grille de colorant de viabilité indiquée dans le tableau des matériaux. Éliminer régulièrement ces cellules non viables car elles présentent une liaison anticorps non spécifique et peuvent augmenter artificiellement le bruit de fond ou imiter des populations rares et aberrantes.
   REMARQUE : Exiger un seuil de viabilité minimal de 75 % pour une analyse optimale en aval, en notant que les spécimens en dessous de cette valeur justifient une interprétation prudente concernant les artefacts potentiels d’événements rares. Définir le dénominateur leucocytaire en faisant des filtres sur les événements viables CD45-positifs avec des caractéristiques de diffusion latérale appropriées.
5. Pour les spécimens B-ALL, limitez l’analyse au compartiment précurseur CD19-positif. Mettre en place un cadre de verrouillage alternatif pour les patients recevant des thérapies ciblées anti-CD19.
6. Déplacer l’évaluation primaire vers les compartiments positifs au CD22, au CD24 ou au CD34 afin de capturer la population leucémique indépendamment de l’expression du CD19. Évaluer les schémas de maturation des CD34, CD10 et CD20 et identifier les populations aberrantes en utilisant les schémas d’expression des CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123, CD73 ou CD304.
7. Pour les échantillons AML, définissez la région blast ou précurseur en utilisant l’expression CD45, diffusion latérale, CD34 et CD117.
8. Évaluer l’expression aberrante ou asynchrone des marqueurs myéloïdes et croisés, incluant CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b et CD15.
9. Calculez la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) spécifiques à l’échantillon en utilisant le nombre total d’événements viables acquis pour CD45 positifs comme dénominateur :
    
    
10. Classez l’interprétation finale des MRD en trois catégories : MRD-positive, en dessous du LOD, ou limitée analytiquement.
    1. Attribuer le résultat comme MRD-positif lorsqu’un groupe clair et contigu d’événements aberrants dépasse le LOD spécifique à l’échantillon et démontre un immunophénotype interne cohérent distinct des populations hématopoïétiques normales ou en régénération.
       REMARQUE : Ne classez pas les événements dispersés et non regroupés comme MRD-positifs. Utiliser une approche d’analyse intégrée combinant à la fois l’immunophénotype associé à la leucémie (LAIP) suivi à partir de l’échantillon diagnostique de base et des stratégies de reconnaissance de motifs différentes de la normale (DfN).
    2. Attribuez le résultat en dessous du LOD lorsque des événements suspects rares sont présents mais n’atteignent pas le seuil de déclaration spécifique à l’échantillon.
    3. Attribuer le résultat comme limité analytiquement lorsque la taille du dénominateur est insuffisante, que l’hémodilution est substantielle, que la qualité de l’échantillon est faible, ou que les limitations pré-analytiques ou analytiques empêchent une interprétation négative et confiante.
11. Examinez tous les cas MRD positifs et borderline de faible intensité de manière indépendante par un second analyste qualifié.
12. Finaliser l’interprétation de la cytométrie en flux avant de revoir les données comparatrices moléculaires appariées, y compris les résultats quantitatifs de la réaction en chaîne de la polymérase ou du séquençage de nouvelle génération.

6. Méthodologie analytique de validation

1. Évaluer la répétabilité analytique en préparant des aliquotes dupliquées à partir de la même suspension cellulaire post-lyse. Acquérir et analyser au moins 30 spécimens appariés de manière indépendante.
2. Évaluer la linéarité dilutionnelle en préparant des dilutions séritales sur six niveaux dans la plage de faible charge attendue. Comparez les valeurs de MRD observées avec les valeurs attendues de MRD sur la série de dilution.
3. Évaluer la reproductibilité interopérateur et inter-instruments en analysant des échantillons de référence entre plusieurs opérateurs qualifiés et cytomètres à flux harmonisés.
4. Transformez les pourcentages cytométriques en flux et MRD moléculaire appariés en utilisant la transformation log10 avant la comparaison statistique. Évaluer l’accord quantitatif à l’aide de l’analyse de corrélation et de l’analyse de Bland-Altman.

Résultats

Caractéristiques de l’ensemble de données d’implémentation de routine

Au cours de la période d’étude, 197 spécimens consécutifs ont passé le dépistage d’éligibilité et l’évaluation pré-analytique de la qualité et sont entrés dans le flux de travail déclarable. La cohorte de l’étude comprenait 98 patients, dont 62 (63,3 %) atteints de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (LLA) et 36 (36,7 %) atteints de leucémie myéloïde aiguë (LMA). La ...

Discussion

L’objectif principal de cette étude était d’établir un flux de travail standardisé pour l’évaluation cytométrique à flux multicolore de la maladie résiduelle (MRD) mesurable dans la leucémie aiguë. Une évaluation fiable des MRD dépend non seulement de la sélection des panneaux d’anticorps, mais aussi d’une manipulation cohérente des échantillons, des paramètres d’acquisition et de l’interprétation des^{données 11}. Les résultats de cette étude démontrent que le trait...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acquisition buffer	Laboratory-prepared	PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µL	Final resuspension before flow cytometric acquisition
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Aberrant blast-associated phenotyping
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Cross-lineage aberrancy detection
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation-discordance assessment
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Different-from-normal myeloid pattern assessment
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
Ammonium chloride-based red blood cell lysis buffer	Laboratory-prepared / commercial supplier	Ammonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperature	Bulk red blood cell lysis
Analysis software	Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Kaluza 2.1	Data analysis and sequential gating
Automated hematology analyzer	Commercial supplier	Automated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessment	Nucleated cell concentration and viability assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Precursor B-cell definition
B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	B-lineage identification and entry into precursor compartment
B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation pattern assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs