Protocole standardisé de cytométrie à flux multicolore pour l’évaluation mesurable des maladies résiduelles dans la leucémie aiguë

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail standardisé de cytométrie à flux multicolore pour l’évaluation mesurable des maladies résiduelles dans la leucémie aiguë, intégrant le traitement contrôlé des échantillons, des paramètres d’acquisition harmonisés, des stratégies de verrouillage séquentiel et une interprétation ajustée au dénominateur afin d’améliorer la reproductibilité analytique dans les laboratoires cliniques de routine.

Résumé

La maladie résiduelle mesurable (MRD) est un indicateur pronostique important dans la prise en charge de la leucémie aiguë. Cependant, l’évaluation systématique du flux multicolore (MFC) de routine reste vulnérable à la variabilité pré-analytique et analytique, notamment l’hémodilution, la profondeur d’acquisition incohérente et l’interprétation subjective. Cet article présente un flux de travail opérationnel standardisé pour l’évaluation de routine des MRD dans la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL) et la leucémie myéloïde aiguë (LMA). Le protocole intègre des critères stricts d’acceptation des échantillons, avec une évaluation intégrée de l’hémodilution, et utilise une méthode de lyse massive des globules rouges pour la moelle osseuse et les échantillons de sang périphérique. La standardisation analytique est réalisée grâce à des panels d’anticorps à deux tubes et huit couleurs spécifiques à la maladie, des objectifs d’acquisition harmonisés nécessitant au moins 500 000 événements positifs au CD45, et des stratégies de verrouillage séquentiel fixes. De plus, le flux de travail applique des limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ajustées au dénominateur pour soutenir un système de reporting objectif à trois niveaux. La validation de 197 échantillons cliniques a démontré une forte répétabilité, une linéarité dilutionnelle robuste et une forte concordance avec des tests moléculaires orthogonaux appariés. Collectivement, ce protocole fournit un cadre pratique pour la surveillance standardisée des MRD. pour la surveillance standardisée des MRD dans les laboratoires cliniques de routine en intégrant une manipulation pré-analytique contrôlée et des paramètres analytiques harmonisés.

Introduction

Même après avoir atteint la rémission morphologique, les patients atteints de leucémie aiguë nécessitent une surveillance continue pour détecter la maladie résiduelle mesurable (MRD) afin d’évaluer avec précision le risque de rechute. Les examens morphologiques et cytopathologiques conventionnels manquent de la sensibilité nécessaire pour détecter des populations leucémiques résiduelles de faible niveau. Par conséquent, l’évaluation des MRD est devenue un élément essentiel du suivi de la maladie tant dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA) que dans la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL). Les recommandations récentes de l’European LeukemiaNet soulignent que l’évaluation fiable des MRD dans la LMA dépend de la normalisation technique et de la reproductibilité interobservateur, plutôt que de la simple disponibilité des tests ^1,2. Dans B-ALL, la cytométrie à flux multicolore (MFC) reste particulièrement importante pour les patients sans cibles moléculaires stables. Des études antérieures ont démontré que des approches cytométriques à flux multicolore standardisées utilisant des panneaux d’anticorps structurés peuvent permettre une détection résiduelle reproductible^{et sensible de la maladie 3}. La cytométrie en flux est largement utilisée en raison de sa large applicabilité, de son temps de réponse rapide et de son rapport qualité-prix. La performance des tests reste fortement dépendante de la préparation standardisée de l’échantillon, des paramètres d’acquisition et de l’interprétation des^{données 4}.

L’un des principaux défis techniques dans l’évaluation des MRD cytométriques en flux est la détection d’événements rares, fortement influencée par la profondeur d’acquisition et le nombre total d’événements. Des panneaux d’anticorps identiques peuvent produire des sensibilités analytiques différentes si des échantillons sont acquis avec des tailles de dénominateur^{incohérentes 5}. La standardisation va donc au-delà de la sélection des anticorps et nécessite un traitement harmonisé des échantillons, une lyse des globules rouges en masse, la compensation des instruments, des cibles d’acquisition et des stratégies de verrouillage. Dans les échantillons de moelle osseuse, l’hémodilution représente également une variable pré-analytique significative car la contamination sanguine périphérique peut réduire artificiellement la charge leucémique résiduelle^{apparente 6,7}. De plus, l’interprétation des événements de basse fréquence nécessite des seuils de signalement clairement définis basés sur la profondeur d’acquisition spécifique à chaque échantillon. Des études récentes ont souligné l’importance des limites de détection (LOD) et de quantification (LOD) ajustées par dénominateur (LOQ) pour améliorer la cohérence de l’interprétation MRD cytométrique^{en flux 8}.

L’objectif global de ce protocole est de fournir un flux de travail standardisé pour l’évaluation de routine des MRD basée sur la MFC dans B-ALL et AML. Le protocole intègre les critères d’acceptation des échantillons, l’évaluation de l’hémodilution, la conception de panels d’anticorps spécifiques à la maladie, la préparation d’échantillons par lyse en masse, des cibles d’acquisition harmonisées, des stratégies de verrouillage séquentiel fixes et des critères de déclaration ajustés au dénominateur dans un seul cadre opérationnel ^9,10. En combinant des procédures pré-analytiques et analytiques standardisées, cette méthode offre une approche pratique et reproductible pour la mise en œuvre clinique de routine en laboratoire du suivi des MRD. La figure 1 illustre le flux de travail standardisé pré-analytique et analytique mis en œuvre dans cette étude. Le tableau 1 résume les caractéristiques de cohorte et de spécimen des patients atteints de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (LLA) et de leucémie myéloïde aiguë (LMA) inscrits durant la période de validation sur des fenêtres de suivi prédéfinies (fin d’induction, consolidation et pré-HSCT).

Figure 1 : Flux de travail standardisé pour l’évaluation cytométrique systématique à flux multicolore de MRD. (A) Flux de travail pré-analytique montrant le criblage des échantillons et l’évaluation de la qualité sur des intervalles de suivi prédéfinis. (B) Flux de travail analytique, de la lyse globale des globules rouges et la coloration des anticorps jusqu’à la surveillance séquentielle, l’interprétation ajustée au dénominateur et le rapport final des MRD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Démographie des patients consolidée, caractéristiques cliniques des échantillons et métriques d’acquisition de routine. Ce tableau unique révisé résume les caractéristiques cliniques de base de la cohorte engagée comprenant les cas de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (B-ALL) et de leucémie myéloïde aiguë (LMA), et combine les données démographiques au niveau du patient avec les caractéristiques au niveau de l’échantillon, les intervalles de suivi du traitement, la viabilité, les scores d’hémodilution, les profondeurs d’acquisition et les classifications mesurables mesurables de la maladie résiduelle ajustée au dénominateur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des spécimens humains ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le Comité d’éthique du Second Hôpital Populaire de Neijiang (Approbation n° PXTS887192). L’étude a utilisé des échantillons cliniques résiduels dé-identifiés obtenus après des tests diagnostiques de routine. Le consentement éclairé a été renoncé car l’étude n’affectait pas les soins aux patients, l’allocation des traitements ou les procédures de collecte des échantillons. Les produits chimiques, réactifs et équipements utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Collecte de spécimens et évaluation pré-analytique

1. Collectez des aspirates de moelle osseuse comme type d’échantillon préféré pour l’évaluation de la maladie résiduelle mesurable (MRD). Utilisez des échantillons de sang périphérique uniquement lorsque l’aspiration de moelle osseuse est cliniquement contre-indiquée ou lors de vidéosurveillance et d’analyses comparatives sélectionnées.
2. Prélever l’échantillon de moelle osseuse lors du premier prélèvement aspiré dès que possible. Éviter les extractions aspirées ultérieures afin de minimiser la contamination du sang périphérique et la sous-estimation des résiduels de faibles résidus.
3. Transférer les échantillons dans des tubes d’acide éthylénédiaminetétraacétique dipotassique (K2-EDTA) ou d’anticoagulants sodium-héparine immédiatement après la collecte. Stockez et transportez les spécimens à température ambiante (18–25 °C) et protégez-les du soleil direct.
   ATTENTION : Ne réfrigérez pas les spécimens.
4. Traiter tous les spécimens dans les 24 heures suivant la collecte. Pour les études de stabilité, conserver les aliquotes pour une analyse répétée à 24 h et 48 h tout en conservant des conditions de stockage à température ambiante.
5. Vérifiez l’identifiant du patient, le type d’anticoagulant, l’intégrité de l’échantillon et le délai de prélèvement lors de la réception. Rejeter des spécimens présentant une coagulation importante, une hémolyse sévère ou une dégénérescence cellulaire marquée
6. Évaluer les échantillons de moelle osseuse pour l’hémodilution avant l’interprétation finale. Calculez un score semi-quantitatif d’hémodilution allant de 0,00 à 1,00 pour estimer la contamination du sang périphérique.
7. Déterminez cette valeur en divisant la proportion de lymphocytes matures par la somme des progéniteurs CD34-positifs, des granulocytes immatures et des lymphocytes matures, où un quotient plus élevé indique un effet dilutionnel plus important.
   REMARQUE : Calculez le score en utilisant la formule suivante :
    
   où un score plus élevé indique une contamination sanguine périphérique plus importante.
8. Classez les scores d’hémodilution comme suit : <0,20, acceptable ; 0,20–0,39, légèrement hémodiluté ; et ≥0,40, substantiellement hémodilutée.
   REMARQUE : N’attribuez pas d’interprétations définitives négatives à la MRD à des spécimens fortement hémodilutés à moins que la taille adéquate du dénominateur et l’architecture précurseur de la moelle préservée ne soient confirmées.

2. Préparation du bilan anticorps spécifique à la maladie

1. Préparez des panels d’anticorps standardisés à deux tubes et huit couleurs spécifiques à la maladie pour l’analyse B-ALL et AML. Atteindre la standardisation des panels en respectant strictement les marqueurs fixes de la colonne vertébrale sur tous les tubes pour un contrôle stable de population.
2. Utilisez des conjugués fluorochromes cohérents pour les antigènes de lignée correspondants et suivez strictement les volumes de titration recommandés par le fabricant afin de minimiser la variabilité de fluorescence d’un lot à l’autre.
3. Consultez le Tableau Supplémentaire 1 pour les combinaisons de marqueurs, les affectations des fluorochromes, les clones d’anticorps, les volumes de coloration et les paramètres d’acquisition.
4. Pour l’évaluation de B-ALL, utilisez CD19, CD45, CD34, CD10 et CD20 comme marqueurs de colonne vertébrale dans les deux tubes afin de définir les populations de précurseurs et les schémas de maturation. Ajoutez CD38, CD58 et CD81 dans le tube 1.
5. Ajouter CD66c, CD123, et soit CD73 soit CD304 dans le tube 2 selon l’immunophénotype associé diagnostique à la leucémie établi lors de l’évaluation initiale.
6. Pour l’évaluation de la LMA, utilisez CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 et HLA-DR comme marqueurs de la colonne vertébrale dans les deux tubes afin de définir les populations de blasts et de myéloïdes immatures.
7. Ajoutez CD7 et CD56 au tube 1 pour évaluer l’expression d’antigènes croisés. Ajouter CD11b et CD15 dans le tube 2 pour évaluer les anomalies de maturation des myéloïdes.

3. Préparation et coloration de la lyse en vrac

1. Transférez 2,0 mL de moelle osseuse bien mélangée ou d’échantillons de sang périphérique dans un tube de polypropylène de 15 mL. Si le volume d’échantillon est limité, utilisez un volume d’entrée minimum de 1,0 mL.
2. Ajoutez 10 mL de tampon de lyse au chlorure d’ammonium préchauffé à l’échantillon. Incubez la suspension pendant 10 minutes à température ambiante pour lyser les globules rouges.
3. Centrifugez l’échantillon à 500 × g pendant 5 minutes. Jetez le surnageant soigneusement sans déranger la pellete de cellules nucléées.
4. Résuspendez le pellet dans 2 mL de solution saline tamponnée phosphate (PBS) contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA). Répétez l’étape de lavage une fois si une contamination résiduelle par hémoglobine reste visible.
5. Déterminer la concentration des cellules nucléées à l’aide d’un analyseur hématologique automatisé ou du comptage manuel d’hémocytomètres avec exclusion du bleu de trypan. Considérons une concentration minimale de cellules nucléées de 5 × 10⁶ cellules/mL comme optimale pour l’acquisition standard.
   REMARQUE : Si le rendement cellulaire descend en dessous de ce seuil, concentrez l’échantillon par centrifugation supplémentaire à 500 × g pendant 5 minutes, puis réduisez soigneusement le volume du tampon de resuspension pour maximiser la densité cellulaire.
6. Aliquote 5 × 10⁶ cellules nucléées par tube pour la coloration de routine. Augmenter l’entrée à un maximum de 1 × 10⁷ cellules par tube pour une analyse à haute sensibilité lorsque la récupération de l’échantillon le permet ^6,7.
7. Ajoutez le cocktail d’anticorps titré individuellement et le colorant de viabilité réparable spécifié dans le tableau des matériaux à chaque tube selon la configuration validée du panneau de coloration. Le bilan validé de routine utilise 5 μL par anticorps conjugué au fluorochrome, sauf si la titrage recommandée par le fabricant indique un volume spécifique à l’anticorps différent.
8. Assurez-vous que le volume final de la réaction de coloration soit strictement maintenu à 100 μL par test afin de préserver une stœchiométrie optimale anticorps-antigène. Incubez les spécimens pendant 15 minutes à température ambiante dans le noir.
9. Lavez les cellules colorées une fois à l’aide d’un tampon de lavage et resuspendez la dernière pellete dans 500 μL de tampon d’acquisition.
10. Préparez des contrôles de compensation à une seule teinture à l’aide de billes de compensation le jour même de l’acquisition de l’échantillon.

4. Installation des instruments et acquisition des données

1. Effectuez un contrôle qualité quotidien au démarrage du cytomètre de débit avant de prétendre les échantillons du patient. Vérifiez la fluidique, l’alignement laser, les performances du détecteur et les valeurs cibles de fluorescence à l’aide de billes d’étalonnage, en suivant les instructions du fabricant.
2. Préparez des contrôles de compensation à coloration unique en utilisant les mêmes fluorochromes inclus dans les panneaux d’anticorps. Ajustez la matrice de compensation avant l’acquisition du patient et confirmez que les marqueurs de la colonne vertébrale restent dans les plages de fluorescence cibles prédéfinies.
3. Utilisez le même modèle d’acquisition, les mêmes réglages du détecteur, la même stratégie de compensation et la hiérarchie de gating pour tous les échantillons analysés pendant la période de validation.
   REMARQUE : Assurez une harmonisation adéquate entre les instruments en établissant des valeurs standardisées d’intensité médiane de fluorescence cible pour tous les détecteurs à l’aide de billes d’étalonnage spécialisées, et confirmez que des échantillons identiques produisent des profils de fluorescence comparables sur différentes plateformes avant l’acquisition des données cliniques.
4. Acquérir des données à un débit faible à modéré afin de réduire les événements coïncidents et de préserver la précision de la détection des événements rares. Surveillez continuellement le taux d’événements pendant l’acquisition.
5. Acquérir au moins 500 000 événements nucléés positifs au CD45 pour chaque résultat de MRD à déclarer. Lorsque la qualité des spécimens et la stabilité des événements le permettent, il faut étendre l’acquisition à 1,0 à 1,5 million d’événements au total, surtout lorsque des maladies résiduelles de faible niveau sont suspectées.
6. Pause ou arrêt de l’acquisition si une instabilité fluidique, des bouchons d’échantillons, des changements brusques de taux d’événement ou une détérioration visible de la qualité de la diffusion surviennent. Refiltrez ou remixez l’échantillon lorsque cela est approprié, et ne réacquirez l’échantillon qu’après rétablissement du débit stable.

5. Saisie séquentielle et interprétation ajustée au dénominateur

1. Analysez les données de cytométrie en flux à l’aide d’un logiciel validé d’analyse de cytométrie en écoulement. Utiliser la même stratégie de gating séquentielle pour tous les spécimens afin de réduire la variabilité entre opérateurs.
2. Établir des schémas de maturation normaux et régénérants en acquérant et analysant indépendamment une banque de référence d’au moins 20 spécimens de moelle osseuse normale ou régénérante servant de modèles d’expression de base.
3. Excluez les débris en utilisant les paramètres de diffusion avant et de dispersion latérale. Isolez les cellules individuelles en appliquant une barrière de diffusion avant par rapport à la hauteur de diffusion directe.
4. Excluez les cellules non viables en utilisant la grille de colorant de viabilité indiquée dans le tableau des matériaux. Éliminer régulièrement ces cellules non viables car elles présentent une liaison anticorps non spécifique et peuvent augmenter artificiellement le bruit de fond ou imiter des populations rares et aberrantes.
   REMARQUE : Exiger un seuil de viabilité minimal de 75 % pour une analyse optimale en aval, en notant que les spécimens en dessous de cette valeur justifient une interprétation prudente concernant les artefacts potentiels d’événements rares. Définir le dénominateur leucocytaire en faisant des filtres sur les événements viables CD45-positifs avec des caractéristiques de diffusion latérale appropriées.
5. Pour les spécimens B-ALL, limitez l’analyse au compartiment précurseur CD19-positif. Mettre en place un cadre de verrouillage alternatif pour les patients recevant des thérapies ciblées anti-CD19.
6. Déplacer l’évaluation primaire vers les compartiments positifs au CD22, au CD24 ou au CD34 afin de capturer la population leucémique indépendamment de l’expression du CD19. Évaluer les schémas de maturation des CD34, CD10 et CD20 et identifier les populations aberrantes en utilisant les schémas d’expression des CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123, CD73 ou CD304.
7. Pour les échantillons AML, définissez la région blast ou précurseur en utilisant l’expression CD45, diffusion latérale, CD34 et CD117.
8. Évaluer l’expression aberrante ou asynchrone des marqueurs myéloïdes et croisés, incluant CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b et CD15.
9. Calculez la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) spécifiques à l’échantillon en utilisant le nombre total d’événements viables acquis pour CD45 positifs comme dénominateur :
    
    
10. Classez l’interprétation finale des MRD en trois catégories : MRD-positive, en dessous du LOD, ou limitée analytiquement.
    1. Attribuer le résultat comme MRD-positif lorsqu’un groupe clair et contigu d’événements aberrants dépasse le LOD spécifique à l’échantillon et démontre un immunophénotype interne cohérent distinct des populations hématopoïétiques normales ou en régénération.
       REMARQUE : Ne classez pas les événements dispersés et non regroupés comme MRD-positifs. Utiliser une approche d’analyse intégrée combinant à la fois l’immunophénotype associé à la leucémie (LAIP) suivi à partir de l’échantillon diagnostique de base et des stratégies de reconnaissance de motifs différentes de la normale (DfN).
    2. Attribuez le résultat en dessous du LOD lorsque des événements suspects rares sont présents mais n’atteignent pas le seuil de déclaration spécifique à l’échantillon.
    3. Attribuer le résultat comme limité analytiquement lorsque la taille du dénominateur est insuffisante, que l’hémodilution est substantielle, que la qualité de l’échantillon est faible, ou que les limitations pré-analytiques ou analytiques empêchent une interprétation négative et confiante.
11. Examinez tous les cas MRD positifs et borderline de faible intensité de manière indépendante par un second analyste qualifié.
12. Finaliser l’interprétation de la cytométrie en flux avant de revoir les données comparatrices moléculaires appariées, y compris les résultats quantitatifs de la réaction en chaîne de la polymérase ou du séquençage de nouvelle génération.

6. Méthodologie analytique de validation

1. Évaluer la répétabilité analytique en préparant des aliquotes dupliquées à partir de la même suspension cellulaire post-lyse. Acquérir et analyser au moins 30 spécimens appariés de manière indépendante.
2. Évaluer la linéarité dilutionnelle en préparant des dilutions séritales sur six niveaux dans la plage de faible charge attendue. Comparez les valeurs de MRD observées avec les valeurs attendues de MRD sur la série de dilution.
3. Évaluer la reproductibilité interopérateur et inter-instruments en analysant des échantillons de référence entre plusieurs opérateurs qualifiés et cytomètres à flux harmonisés.
4. Transformez les pourcentages cytométriques en flux et MRD moléculaire appariés en utilisant la transformation log10 avant la comparaison statistique. Évaluer l’accord quantitatif à l’aide de l’analyse de corrélation et de l’analyse de Bland-Altman.

Résultats

Caractéristiques de l’ensemble de données d’implémentation de routine

Au cours de la période d’étude, 197 spécimens consécutifs ont passé le dépistage d’éligibilité et l’évaluation pré-analytique de la qualité et sont entrés dans le flux de travail déclarable. La cohorte de l’étude comprenait 98 patients, dont 62 (63,3 %) atteints de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (LLA) et 36 (36,7 %) atteints de leucémie myéloïde aiguë (LMA). La cohorte comprenait 64 hommes (65,3 %) et 34 femmes (34,7 %), avec un âge médian de 32 ans (plage interquartile [IQR], 13–49 ans ; plage 2–73 ans). Le pourcentage médian de blast de base était de 67,2 % (IQR, 56,9 % – 80,2 %).

La plupart des échantillons analysés étaient des aspirates de moelle osseuse (174/197, 88,3 %), tandis que les échantillons de sang périphérique en ont représenté 23/197 (11,7 %). Selon les intervalles de suivi prédéfinis, 86 échantillons (43,7 %) ont été prélevés à la fin de la thérapie d’induction, 65 (33,0 %) pendant la thérapie de consolidation et 46 (23,4 %) avant la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (TSHS) (Tableau 1).

La viabilité médiane de l’échantillon était de 88,3 % (IQR, 84,4 % – 92,6 %). Le flux de travail d’acquisition a produit une médiane de 1 116 901 événements totaux (IQR, 908 521–1 258 946) avant le nettoyage des données. Après l’exclusion analytique séquentielle des débris, des doublets coïncidents et des cellules non viables, la stratégie de verrouillage a atteint une médiane de 907 325 événements cibles simples positifs au CD45 viables (IQR, 690 112–1 095 836), avec un temps médian d’acquisition de 11,9 min. Le score médian d’hémodilution était de 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Suite à l’interprétation ajustée par dénominateur, 41 spécimens (20,8 %) ont été classés comme MRD-positifs, et 156 spécimens (79,2 %) ont été classés en dessous de la limite de détection spécifique à chaque spécimen (LOD) (Tableau 1).

Validation analytique : répétabilité, linéarité et stabilité

La performance analytique du flux de travail standardisé a été évaluée à travers des études de répétabilité, de linéarité dilutionnelle et de stabilité à court terme (Figure 2). Les aliquotes dupliquées préparées à partir des mêmes échantillons lysés en vrac ont montré une forte répétabilité, avec un coefficient de variation (CV) médian de 0,101 % et un CV du 95e percentile de 0,222 %.

Figure 2 : Validation analytique du flux de travail standardisé MRD pour cytométrie à flux multicolore. (A) Répartition de la viabilité de l’échantillon entre les échantillons analysés. (B) Corrélation entre les valeurs attendues et observées de MRD à travers des expériences de dilution en série sur analyse logarithmique. (C) Accord entre analyses réplicatives indépendantes lors de l’évaluation de la répétabilité. (D) Stabilité des mesures de MRD après stockage à température ambiante à 0 h, 24 h et 48 h. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour évaluer le comportement de détection de bas niveau, 12 expériences de dilution en série totalisant 72 observations ont été analysées dans la plage inférieure attendue de MRD. Les valeurs observées de MRD ont montré une forte concordance avec les valeurs attendues dans une analyse logarithmique (r = 0,999, ajusté^{R 2} = 0,998, pente = 1,009, interception = 0,018), indiquant une linéarité préservée sur les plages d’événements à basse fréquence.

Les tests de stabilité à court terme ont montré des réductions progressives de la viabilité de l’échantillon au fil du temps, la viabilité médiane passant de 89,1 % à 0 h à 84,9 % à 24 h et 80,6 % à 48 h. En revanche, le changement relatif absolu médian de la charge de MRD est resté limité à 24 h (6,2 %) et 48 h (12,0 %), soutenant un traitement de routine dans un intervalle de 24 h après la collecte.

Reproductibilité interopérateur et inter-instruments

La reproductibilité interopérateur et inter-instruments a été évaluée à l’aide de 24 échantillons de référence analysés entre plusieurs opérateurs et cytomètres à flux harmonisés, générant un total de 96 évaluations. L’écart relatif absolu médian par rapport aux valeurs de référence était de 13,7 %. Ces résultats démontrent une performance analytique cohérente après la standardisation de la préparation des échantillons, des paramètres d’acquisition et des stratégies de contrôle séquentiel (Tableau 2).

Tableau 2 : Indicateurs de validation analytique et de comparaison de méthodes pour le flux de travail standardisé de la maladie résiduelle mesurable. Ce tableau est limité aux résultats de validation, notamment la répétabilité intra-essai, la linéarité dilutionnelle, la stabilité à court terme, la reproductibilité interopérateur et inter-instrument, ainsi que les mesures de comparaison des méthodes moléculaires orthogonales ; elle ne duplique pas les caractéristiques démographiques des patients ni les spécimens rapportées dans le tableau 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Application clinique et comparaison des méthodes orthogonales

Une comparaison orthogonale a été réalisée à l’aide de 117 échantillons appariés, dont 75 analysés par réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR) et 42 par séquençage de nouvelle génération (NGS). Les évaluations qPCR ont principalement surveillé les transcrits de fusion spécifiques à la maladie établis au diagnostic, notamment BCR ::ABL1, RUNX1 ::RUNX1T1 et PML ::RARA. Les approches NGS ont évalué les réarrangements des gènes clonaux des immunoglobulines ou récepteurs des lymphocytes T pour la leucémie lymphoblastique et ont suivi les mutations somatiques récurrentes à l’aide de panels myéloïdes ciblés pour la leucémie myéloïde aiguë. Les valeurs de MRD cytométriques en flux ont démontré une forte corrélation avec des résultats moléculaires appariés à travers les niveaux mesurables de la maladie (r = 0,893 à l’analyse logarithmique).

L’analyse de Bland-Altman a démontré une différence moyenne logarithmique de −0,093 avec des limites d’accord allant de −0,848 à 0,663 (Figure 3). Parmi les cas discordants, un résultat faux négatif a été identifié parmi 25 échantillons moléculairement positifs. Le flux de travail a démontré une concordance en pourcentage positive de 78,1 %, une concordance négative en pourcentage de 97,6 % et un taux global de concordance de 92,3 %.

Figure 3 : Application clinique et validation orthogonale de l’évaluation standardisée des MRD. (A) Répartition des cas MRD-positifs entre groupes de maladies et intervalles de surveillance. (B) Corrélation entre les valeurs MRD cytométriques en flux et les résultats des comparateurs moléculaires appariés lors de l’analyse logarithmique. (C) Analyse de Bland-Altman comparant les mesures cytométriques en flux et les mesures MRD moléculaires appariées, avec des lignes horizontales indiquant le biais moyen et les limites de concordance à 95 % sur toute la plage analytique. (D) Répartition des résultats MRD-positifs sur les intervalles de suivi du traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Ces résultats démontrent que le flux de travail standardisé de cytométrie à flux multicolore a atteint une forte concordance avec les tests MRD moléculaires orthogonaux sur des échantillons cliniques de routine.

Tableau complémentaire 1 : Paramètres opérationnels complets pour le flux de travail standardisé de cytométrie à flux multicolore mesurable pour les maladies résiduelles. Ce tableau unifié délimite les composantes méthodologiques essentielles divisées en sections distinctes. La section A détaille les configurations spécifiques des panels d’anticorps à la maladie, dans lesquelles la sélection CD73 ou CD304 est basée sur l’immunophénotype diagnostique associé à la leucémie de base. La section B décrit les cibles standardisées de traitement pré-analytique des échantillons et d’acquisition cytométrique en flux. La section C définit les seuils de déclaration ajustés au dénominateur ainsi que les critères d’interprétation finale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’objectif principal de cette étude était d’établir un flux de travail standardisé pour l’évaluation cytométrique à flux multicolore de la maladie résiduelle (MRD) mesurable dans la leucémie aiguë. Une évaluation fiable des MRD dépend non seulement de la sélection des panneaux d’anticorps, mais aussi d’une manipulation cohérente des échantillons, des paramètres d’acquisition et de l’interprétation des^{données 11}. Les résultats de cette étude démontrent que le traitement harmonisé des échantillons, la profondeur d’acquisition contrôlée et les critères de déclaration ajustés au dénominateur peuvent améliorer la reproductibilité analytique dans des laboratoires cliniques de routine. Ces résultats sont cohérents avec les efforts récents visant à standardiser l’évaluation des MRD cytométriques à flux dans différentes institutions et^{opérateurs 12}.

Un élément important de ce flux de travail est la procédure de lyse des globules rouges en vrac à base de chlorure d’ammonium. La détection des MRD lors d’événements rares nécessite l’acquisition de grands dénominateurs cellulaires pour atteindre une sensibilité analytique adéquate. La préparation standardisée de la lyse en vrac a permis une récupération constante d’un nombre suffisant de cellules nucléées, dépassant fréquemment 1,0 à 1,5 million d’événements acquis, tout en maintenant une viabilité acceptable de l’échantillon. Des études antérieures du consortium EuroFlow ont également souligné que l’acquisition d’événements élevés est nécessaire pour soutenir la détection sensible et reproductible des^{MRD 13}. Dans les échantillons présentant une sensibilité analytique sous-optimale, le dépannage doit inclure l’évaluation du volume de l’échantillon, de la récupération cellulaire et de la profondeur d’acquisition.

Ce protocole inclut également une évaluation de routine de l’hémodilution avant d’interpréter les résultats MRD faibles niveaux négatifs. L’hémodilution reste une limitation majeure avant l’analyse dans les tests MRD à base de moelle osseuse, car la contamination sanguine périphérique peut réduire artificiellement la charge leucémique apparente. Intégrer directement un score d’hémodilution semi-quantitative dans le flux de travail de reporting offre une protection supplémentaire contre toute mauvaise interprétation comme un faux négatif. Des études antérieures ont rapporté que l’hémodilution affecte significativement la fiabilité de l’analyse MRD cytométrique en flux dans la leucémie myéloïde^{aiguë 7}. Les spécimens présentant une hémodilution substantielle (≥0,40) doivent donc être interprétés avec prudence, en particulier lorsque la profondeur d’acquisition ou la préservation des précurseurs de la moelle est insuffisante.

La comparaison orthogonale réalisée dans cette étude a démontré un fort accord global entre les méthodes d’évaluation du cytométrie en flux et celles de la MRD moléculaire. Cependant, les cas discordants soulignent également que la cytométrie en flux et les analyses moléculaires évaluent des aspects biologiques distincts de la maladie résiduelle. Des études antérieures ont montré que les déplacements phénotypiques, l’évolution clonale et l’hématopoïèse régénératrice peuvent contribuer à des divergences entre les plateformes^{analytiques 14}. Dans B-ALL, distinguer les précurseurs léukémiques résiduels des hématogones normaux reste particulièrement difficile à faible charge de la maladie et nécessite une interprétation intégrée des schémas immunophénotypiques multidimensionnels plutôt que des anomalies antigéniques^{isolées 15}. Pour cette raison, tous les cas de MRD limite et de faible niveau dans ce flux de travail ont été examinés indépendamment par un second analyste.

Cette étude présente plusieurs limites. Premièrement, la validation a été réalisée dans une seule institution à l’aide d’un nombre limité d’instruments harmonisés. Deuxièmement, les échantillons de sang périphérique n’ont été inclus que dans certaines situations cliniques car ils ne peuvent pas remplacer la moelle osseuse pour l’évaluation de routine post-traitement de la MRD dans la plupart des milieux de leucémie aiguë. De plus, certains paramètres analytiques, notamment le score d’hémodilution et l’interprétation d’événements de bas niveau, nécessitent encore une revue expérimentée par les opérateurs malgré le flux de travail standardisé. Néanmoins, le protocole fournit un cadre pratique pour la mise en œuvre clinique de routine de l’évaluation standardisée du MRD à flux multicolore^{et à flux multicolore 16,17}. En intégrant l’évaluation pré-analytique de la qualité, des stratégies d’acquisition harmonisées et des critères d’interprétation ajustés au dénominateur, ce flux de travail soutient un rapport MRD plus reproductible et cliniquement cohérent dans la pratique de laboratoire de routine.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acquisition buffer	Laboratory-prepared	PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µL	Final resuspension before flow cytometric acquisition
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Aberrant blast-associated phenotyping
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Cross-lineage aberrancy detection
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Early myeloid/blast identification
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation-discordance assessment
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Different-from-normal myeloid pattern assessment
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Myeloid lineage anchor
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Immaturity marker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Leukocyte backbone marker and denominator definition
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation and subtype discrimination
Ammonium chloride-based red blood cell lysis buffer	Laboratory-prepared / commercial supplier	Ammonium chloride-based lysis buffer; 10 mL/test; 10 min at room temperature	Bulk red blood cell lysis
Analysis software	Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Kaluza 2.1	Data analysis and sequential gating
Automated hematology analyzer	Commercial supplier	Automated hematology analyzer used for nucleated cell concentration and viability assessment	Nucleated cell concentration and viability assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD10-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI10a; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Precursor B-cell definition
B-ALL Tube 1 anti-CD19-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: SJ25C1; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	B-lineage identification and entry into precursor compartment
B-ALL Tube 1 anti-CD20-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L27; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs	Maturation pattern assessment
B-ALL Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in the routine validated panel unless antibody-specific titration differs