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Liposomes activés par la lumière et les rayons X pour l'édition génomique contrôlée et l'administration de médicaments

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DOI :

10.3791/71788

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14 août 2026

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1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes de fabrication de nanoparticules lipidiques intégrant du vertéporfine, activables par lumière visible ou rayonnement X, permettant une délivrance contrôlée dans l'espace et le temps de ribonucléoprotéines CRISPR-Cas9 et d'agents chimiothérapeutiques, avec des applications potentielles dans les domaines ophtalmologique et oncologique.

Résumé

La thérapie photodynamique (PDT) exploite l'activation d'un photosensibilisateur pour générer des espèces réactives de l'oxygène (ERO), principalement de l'oxygène singulet. Au-delà de la cytotoxicité directe, cette photochimie peut être réutilisée pour libérer à la demande des charges utiles à partir de systèmes de nanocarriers lipidiques, permettant un contrôle spatiotemporel sur la délivrance thérapeutique qui n'est pas réalisable avec des nanoparticules lipidiques conventionnelles. Ce protocole présente des méthodes de fabrication et de caractérisation de deux formulations distinctes de nanoparticules lipidiques intégrant le vertéporfine (VP) : (1) des liposomes activés par la lumière, composés de DOTAP, DOPE, de cholestérol et de VP, destinés à la délivrance de complexes ribonucléoprotéiques (RNP) CRISPR-Cas9 ; et (2) des liposomes activés par rayons X, composés de DOTAP, DOPC, de VP et de nanoparticules d'or, pour une libération contrôlée de médicaments chimiothérapeutiques. Lorsqu'ils sont activés à 690 nm (lumière visible) ou par un rayonnement clinique aux rayons X (6 MeV), le VP produit de l'oxygène singulet qui oxyde les composants lipidiques insaturés, ce qui déstabilise la membrane des nanoparticules et libère les charges encapsulées. Des protocoles sont fournis pour la formulation des liposomes par hydratation en couche mince et extrusion membranaire, la caractérisation physicochimique, l'évaluation de la libération de la charge utile déclenchée par la lumière ou les rayons X, l'inactivation génique in vitro dans des cellules humaines, ainsi que la validation in vivo à l'aide d'un système rapporteur visuel quantitatif chez le poisson-zèbre et d'un modèle de tumeur xénogreffe chez la souris. Les résultats représentatifs montrent une inactivation d'environ 326 fibres musculaires lentes par embryon de poisson-zèbre grâce à l'activation par la lumière, ainsi qu'une suppression significative de la croissance tumorale par la libération de doxorubicine déclenchée par les rayons X. Le précédent clinique de l'activation du vertéporfine à 689–690 nm dans l'œil motive l'évaluation de cette plateforme pour la délivrance ophtalmique, bien que la biodistribution rétinienne, la pharmacocinétique et la sécurité chez les grands animaux restent à établir. Ces méthodes offrent une approche expérimentale au potentiel translationnel pour la libération de charges thérapeutiques contrôlée de l'extérieur. 

Introduction

Les nanoparticules lipidiques (LNPs) se sont imposées comme la plateforme d'administration non virale la plus validée sur le plan clinique pour les thérapies à base d'acides nucléiques, comme en témoigne leur utilisation dans les vaccins à ARNm contre la COVID-191. Toutefois, les LNPs classiques libèrent leur charge après l'internalisation cellulaire grâce à l'échappement endosomal, sans offrir de contrôle externe sur le moment, le lieu ou l'ampleur de la délivrance du fardeau thérapeutique2. L'absence de contrôle spatiotemporel limite leur utilité dans les applications où une libération précise et à la demande est avantageuse sur le plan thérapeutique, notamment l'édition génique ciblée, la chimiothérapie ciblée dans les tumeurs hétérogènes, ou encore la silencing génique dosée dans des organes anatomiquement accessibles tels que l'œil3,4.

La thérapie photodynamique (PDT) offre un mécanisme bien établi pour induire de manière externe des effets biologiques. Lorsqu'ils sont activés à des longueurs d'onde spécifiques, les photosensibilisateurs produisent de l'oxygène singulet (1O2) et d'autres espèces réactives de l'oxygène (ROS) capables d'oxyder les biomolécules voisines5. Le vertéporfine (VP), un dérivé de benzoporphyrine approuvé cliniquement sous le nom de Visudyne pour le traitement photodynamique de la néovascularisation choroïdienne sous-fovéale dans la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), convient particulièrement bien comme composant photosensibilisateur dans les nanoparticules6. Le VP est activé cliniquement à 689 nm pour la thérapie photodynamique ophtalmologique, établissant ainsi un précédent bien documenté en matière de délivrance de lumière oculaire6,7,8. Le VP présente une activité photodynamique environ quatre fois supérieure à celle des dérivés de l'hématoporphyrine de première génération aux longueurs d'onde pénétrant les tissus6.

Cette double fonctionnalité, par laquelle le VP agit simultanément comme photosensibilisateur approuvé cliniquement et comme déclencheur sensible à la lumière pour la libération de cargaisons nanoparticulaires, constitue la base mécanistique des protocoles décrits ici. Intégré dans la bicouche lipidique à de faibles rapports molaires, le VP génère du 1O2 lors de l'illumination, lequel, conformément aux travaux antérieurs, est censé oxyder les chaînes acyles des phospholipides insaturés, ce qui déstabilise la membrane et libère les cargaisons encapsulées9. Le faible rayon de diffusion du 1O2 (~20 nm dans les milieux biologiques) limite la déstabilisation membranaire au voisinage immédiat du photosensibilisateur, minimisant ainsi les dommages causés à la cargaison tout en perturbant efficacement la bicouche9,10. De plus, le mode d'activation par rayons X permet de surmonter la limitation de profondeur de pénétration des tissus inhérente à la lumière visible. Lorsque des nanoparticules d'or (3–5 nm) sont co-incorporées dans la bicouche lipidique, l'irradiation clinique par rayons X (6 MeV) renforce l'activation du VP par transfert d'énergie médié par des électrons Auger, élargissant ainsi l'applicabilité à des tumeurs profondes11,12. Des mesures directes du dioxygène singulet à l'aide du Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) confirment que la production de 1O2 augmente avec la dose de rayons X et est amplifiée d'environ 1,4 fois par la co-incorporation de nanoparticules d'or par rapport au VP seul11.

Cette plateforme présente une pertinence translationnelle particulière pour la thérapie génique ophtalmologique. Les traitements anti-VEGF actuels contre la DMLA néovasculaire nécessitent des injections intravitréennes fréquentes, dont l'efficacité réelle diminue en cas de sous-traitement chronique13,14, tandis que les thérapies géniques émergentes utilisant des AAV réduisent cette contrainte mais expriment l'anti-VEGF de manière constitutive15,16 et ne peuvent donc ni être ajustées ni être interrompues, ce qui soulève des inquiétudes étant donné le lien entre la suppression prolongée du VEGF et l'atrophie géographique, l'ischémie rétinienne et la fibrose17,18. Une approche basée sur CRISPR activée par la lumière et utilisant des VP-liposomes pourrait, au contraire, permettre une inactivation du VEGF-A contrôlée par le clinicien et limitée spatialement, offrant ainsi un contrôle clinicien sur la localisation et le moment du premier événement d'édition génique, tout en conservant la durabilité de l'édition génique. Le même principe de libération déclenchée s'applique aux dystrophies rétiniennes liées à de grands gènes, telles que la maladie de Stargardt (ABCA4)19,20, ainsi qu'au mélanome uvéal, où les mécanismes convergents de la VP correspondent bien à la biologie de la tumeur21,22.

L'objectif général de ce protocole est de fournir des méthodes complètes et reproductibles pour la fabrication de nanoparticules lipidiques intégrant un VP, utilisant deux formulations distinctes, l'une activée par la lumière visible (690 nm) et l'autre par rayonnement X, ainsi que pour évaluer l'efficacité de délivrance dans des systèmes modèles in vitro et in vivo. Étant donné que ces formulations diffèrent par leur composition lipidique, leur stratégie de chargement en cargaison et leur modalité d'activation, elles sont présentées comme des protocoles séparés. Ce protocole s'adresse aux chercheurs qui étudient les plateformes de nanoparticules à libération déclenchée, les stratégies de délivrance basées sur la thérapie photodynamique, l'édition génique contrôlée spatiotemporellement, ou le délivrance de médicaments ophtalmologiques et oncologiques activée par la lumière.

Protocole

Toutes les expériences animales impliquant des zebrafish ont été réalisées dans des conditions standard conformément aux protocoles approuvés par le comité d'éthique de la recherche animale de l'Université Macquarie (ARA : 2015-034). Les expériences de xénogreffe chez la souris ont été menées conformément aux directives du comité d'éthique animal de l'Université Macquarie (numéro d'approbation 2017/001). Toutes les procédures ont été effectuées en conformité avec la loi sur la recherche animale de 1985 et le règlement sur la recherche animale de 2010.

Partie A : Liposomes VP activés par la lumière pour la livraison de CRISPR-Cas9 (d'après Aksoy et al.9)

1. Préparation de VP-liposomes activés par la lumière encapsulant le RNP CRISPR-Cas9

  1. Dissoudre le DOTAP, le DOPE, le cholestérol (Chol) et le VP dans 500 µL de chloroforme selon un rapport molaire de 1:0,94:1:0,06 dans un flacon en verre à fond rond.9.
    ATTENTION : Le chloroforme est toxique et volatil. Effectuez toutes les étapes impliquant le chloroforme sous une hotte chimique, en portant des équipements de protection individuelle appropriés, notamment des gants en nitrile et des lunettes de sécurité.
  2. Évaporer le chloroforme sous un courant de gaz argon jusqu'à ce qu'un film lipidique mince se forme sur la paroi du flacon.
  3. Placer le flacon sous vide (par exemple, dans un lyophilisateur ou un dessiccateur relié à une pompe à vide) pendant une nuit (≥12 h) afin d'éliminer complètement le solvant résiduel.
  4. Préparer la solution d'hydratation en combinant l'ARNg (concentration finale de 0,01 µM) et la protéine Cas9 (concentration finale de 0,1 mg/mL) dans 500 µL d'eau sans nucléase9. Pré-incuber l'ARNg et Cas9 à température ambiante pendant 5 min afin de permettre la formation du complexe ribonucléoprotéique (RNP) avant l'hydratation.
    REMARQUE : Le complexe RNP est chargé lors de l'étape d'hydratation, et non ajouté après la formation. Cela garantit son encapsulation au sein du cœur aqueux du liposome.
  5. Hydrater le film lipidique sec en ajoutant directement la solution RNP de 500 µL sur le film et mélanger jusqu'à homogénéisation de la suspension. Laisser la suspension lipidique hydratée pendant 2 h à température ambiante afin de permettre une hydratation complète des lipides.
  6. Extrudez la suspension multilamellaire obtenue 11 fois à travers une membrane en polycarbonate de 200 nm à l’aide d’un mini-extrudeur afin de produire des liposomes unilamellaires de taille uniforme.9.
    REMARQUE : La méthode de réduction de la taille pour cette formulation est l'extrusion, et non la sonication. Faire passer la suspension un nombre impair de fois (11) afin de s'assurer que le produit final se trouve du côté opposé de la membrane par rapport au matériau de départ, réduisant ainsi la contamination par des vésicules non extrudées.
  7. Conserver les VP-liposomes à 4 °C, à l'abri de la lumière. Utiliser dans les 48 heures suivant la préparation pour une activité optimale. Cette limite de 48 heures est conservatrice : la libération des VP reste inférieure à 3 % sur une période de 96 heures en présence de 10 % de SFB9.
    REMARQUE : Pour les applications in vitro et in vivo, préparez et manipulez les liposomes en utilisant une technique aseptique standard, et stérilisez la suspension finale par filtration à travers un filtre de 0,22 µm avant utilisation.

2. Caractérisation physicochimique des VP-liposomes

  1. Diluez la suspension de liposomes au 1/100 dans de l'eau sans nucléase. Mesurez le diamètre hydrodynamique, l'indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zêta par diffusion dynamique de la lumière (DLS). Effectuez toutes les mesures DLS en triplicat (n = 3 réplicats techniques) par échantillon et exprimez les valeurs sous la forme moyenne ± écart-type.
    REMARQUE : Les caractéristiques attendues d'une formulation réussie de la partie A sont un diamètre hydrodynamique de 167,5 ± 1,9 nm, un PDI < 0,3, un potentiel zêta de +28 ± 1,1 mV et une efficacité d'encapsulation de Cas9 d'environ 75,09 %. Les caractéristiques physicochimiques représentatives des formulations réussies sont résumées dans Tableau 1.9
  2. Pour la microscopie électronique en transmission (MET), déposez 10 µL de suspension de liposomes diluée sur une grille en cuivre recouverte de carbone. Contrastez avec de l'acétate d'uryle à 2 % pendant 20 s. Observez à 100 kV9, en acquérant au moins 10 images représentatives par lot.
ParamètrePartie A : VP-liposome
(déclenché par lumière)		Partie B : VP/AuNP-liposome
(déclenché par rayons X)
Diamètre hydrodynamique167,5 ± 1,9 nm~100–150 nm
Indice de polydispersité (PDI)<0,3< 0,3 (typique)
Potentiel zêta+28 ± 1,1 mVPositif (à base de DOTAP)
Efficacité d'encapsulationRNP Cas9 : 75,09 %Doxorubicine : chargement à distance par sulfate d'ammonium ; quantification après lyse par Triton X-100 à 0,1 %
Chargement en nanoparticules d'orNon applicable156 ± 24 AuNP par liposome (ICP-MS)
Stabilité de la libération du cargo<3 % de libération de VP sur 96 h dans 10 % de FBSStable sur 48 h à 0 %, 10 %, 25 % et 50 % de FBS et aux pH 7,4, 6,0 et 5,0
Condition d'activationIrradiation par LED à 690 nm, 0,15 mW/cm²Irradiation clinique par rayons X à 6 MeV
Cargo principalComplexe RNP CRISPR-Cas9Doxorubicine
Modalité d'activationLumière visibleRayonnement X
Application prévueÉdition génique déclenchéeLibération déclenchée de médicament chimiothérapeutique

Tableau 1 : Références de caractérisation physico-chimique et profils de stabilité des deux formulations de liposomes contenant du vertéporfine (VP). Caractéristiques représentatives des formulations, paramètres de chargement, profils de stabilité et conditions d'activation pour la formulation de liposomes à VP activée par la lumière (Partie A) et la formulation de liposomes VP/AuNP activée par rayons X (Partie B). Ces valeurs fournissent des références attendues pour le contrôle qualité lors de la préparation et de la caractérisation réussies des formulations, et peuvent être utilisées comme critères de référence lors de la reproduction des protocoles décrits ici.

3. Libération du cargo déclenchée par la lumière et mesure de l'oxygène singulet

  1. Pour les dosages de libération déclenchés par la lumière, préparez des VP-liposomes en utilisant la même formulation lipidique et le protocole d'hydratation/extrusion. Distribuez 100 µL de la suspension de liposomes dans du PBS dans un dispositif de dialyse plongé dans 12 mL de PBS agité à 80 tr/min.
  2. Irradiez les échantillons avec une source lumineuse LED de 690 nm à 0,15 mW/cm2 pendant des intervalles définis (2, 4 et 6 min)9.
  3. Prélève le dialysat externe à 0, 1, 3, 6 et 24 h, et quantifie la VP libérée par fluorescence ; obtenez la quantité totale de VP en lysant un aliquot équivalent avec 0,1 % de Triton X-100.
  4. Calculez la libération de VP comme suit : Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, où Ft, F0 et Fmax sont respectivement les valeurs de fluorescence au temps t, la valeur initiale et après lyse par le Triton (n = 3).
  5. Confirmez la désorganisation membranaire en mesurant le changement de diamètre hydrodynamique par DLS avant et après irradiation.
    REMARQUE : Protégez tous les échantillons contenant de la VP de la lumière ambiante pendant toute la préparation et le stockage. Utilisez des tubes ambrés ou enveloppez-les dans du papier d'aluminium.

4. Transfection in vitro et test de délétion génique

  1. Semez les cellules HEK293-GFP (ou une lignée rapporteuse équivalente) dans des plaques de 96 puits à une densité permettant d'atteindre environ 70 % de confluence au moment du traitement. Incubez les cellules dans un milieu complet (DMEM + 10 % de SFB + 1 % de pénicilline–streptomycine) à 37 °C et sous 5 % de CO₂2.
  2. Ajouter aux puits des liposomes VP encapsulant le RNP sgARN anti-GFP/Cas9 à 50 µg/mL. Pour l'analyse par microscopie à fluorescence, incuber pendant 2 h ; pour l'analyse par cytométrie en flux, incuber pendant 1 h.
  3. Remplacer le milieu par du milieu complet frais. Irradier les puits traités avec une lumière LED de 690 nm à 0,15 mW/cm². Pour l'analyse par microscopie à fluorescence, irradier pendant 2, 4 ou 6 minutes ; pour l'analyse par cytométrie en flux, irradier pendant 4 minutes. Inclure des témoins à l'obscurité (liposomes sans irradiation) et des témoins lumière seule (irradiation sans liposomes).
  4. Évaluer l'extinction de la GFP 48 h après le traitement par microscopie de fluorescence ou par cytométrie en flux.
    REMARQUE : Les ARN guides doivent être validés avant utilisation. Dans l'étude d'origine, les ARN guides candidats ciblant l'eGFP ont été criblés pour leur efficacité de coupure par analyse de polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP), et le guide retenu (sg_eGFP_06) a atteint une efficacité de coupure de 88,24 %. Le risque d'effets hors cible a été minimisé in silico en confirmant l'unicité du guide (analyse BLASTN contre le génome de référence à l'aide de Bowtie/Bowtie2, sans tolérance d'appariement erroné dans les dix premières bases en 3’). Un séquençage global des effets hors cible n'a pas été réalisé, étape toutefois recommandée pour une application thérapeutique.9.
  5. Pour mesurer l'efficacité d'encapsulation, centrifuger un échantillon de liposomes à 15 000 tr/min pendant 1 h à 4 °C, suivi de la filtration du surnageant à travers un filtre à seringue Whatman Anotop 10 de 20 nm.
  6. Quantifier la présence de Cas9 libre (non encapsulée) dans le filtrat par dosage protéique BCA.
  7. Calculer l'efficacité d'encapsulation selon la formule : EE (%) = [(Ctotal − Csup) / Ctotal] × 100, où Ctotal est la quantité totale de Cas9 ajoutée et Csup la Cas9 non encapsulée est récupérée dans le surnageant. Voir Tableau 1 pour des métriques représentatives de la performance de formulation et des rendements d'encapsulation attendus.

5. Validation in vivo : test de rapporteur visuel chez le poisson zèbre

  1. Préparez le mélange maître d'injection en combinant des liposomes VP encapsulant l'ARNg ciblant eGFP et la protéine Cas9 selon les rapports indiqués dans le protocole d'origine9. Le mélange maître final de 8 µL contient 3,5 µL d'ARNg (75 ng/µL), 1,0 µL de protéine Cas9 (500 ng/µL), 2,5 µL de liposomes VP et 1,0 µL de rouge de phénol. Pour le mélange maître témoin, remplacez les liposomes par 2,5 µL d'eau sans nucléase.
  2. Microinjectez 2 nL du mélange maître dans la cellule (et non dans le vitellus) d'embryons de poisson zèbre à un stade unicellulaire à l'aide d'un système de microinjection calibré9.
    ATTENTION : Toutes les manipulations sur le poisson zèbre doivent être effectuées conformément aux protocoles approuvés d'éthique animale. Manipulez les embryons délicatement afin de minimiser les dommages mécaniques durant l'injection.
  3. Au stade de 2 heures post-fécondation (hpf), exposez les embryons injectés à une lumière LED de 690 nm à une intensité de 0,15 mW/cm2 pendant des durées définies (par exemple, 0, 1, 2 et 5 min) afin d'activer la libération de la charge utile9.
  4. Au stade de 72 hpf, anesthésiez les embryons dans du Tricaine et montez-les dans de l'agarose à bas point de fusion à 1 %. À l'aide de la lignée rapporteuse transgénique smyhc1:eGFP, quantifiez l'extinction des fibres musculaires lentes par la perte de fluorescence eGFP, en utilisant un microscope à fluorescence inversé et un microscope confocal.
  5. Acquérez des images en empilement de mise au point et comptez le nombre de fibres musculaires lentes négatives pour eGFP (extinction réussie) par embryon, en analysant typiquement 16 embryons par groupe (par exemple, avec Imaris)9.
    REMARQUE : Cet essai fournit une lecture visuelle et quantitative de l'efficacité d'extinction génique. Dans la lignée rapporteuse smyhc1:eGFP, les fibres musculaires lentes sont normalement positives pour eGFP ; une extinction réussie est définie par la perte de fluorescence eGFP dans ces fibres9.

Partie B : Liposomes VP déclenchés par rayons X pour la délivrance de médicaments en chimiothérapie (d'après Deng et al.11)

6. Préparation de liposomes VP/AuNP déclenchés par rayons X et chargés en doxorubicine

  1. Mélanger 350 µL de DOTAP (100 mg/mL dans du chloroforme) et 370 µL de DOPC (100 mg/mL dans du chloroforme) dans un flacon en verre à fond rond, puis compléter jusqu'à un volume total de 1,0 mL avec du chloroforme11.
    NOTE : La partie B utilise du DOPC (1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine), et non du DOPE. Ces deux formulations diffèrent par leur lipide auxiliaire, et cette distinction est essentielle pour la reproductibilité.
  2. Ajouter 50 µL de VP (2,3 mg/mL dans du DMSO) et 40 µL d'une suspension de nanoparticules d'or (diamètre de 3–5 nm) au mélange lipidique. Cela donne environ 156 ± 24 nanoparticules d'or par liposome, tel que quantifié par ICP-MS11.
    NOTE : Les nanoparticules d'or doivent avoir un diamètre de 3–5 nm pour s'insérer dans la bicouche lipidique. Des particules plus grandes (par exemple, 50 nm) ne s'incorporent pas à la membrane et ne permettent pas le transfert d'énergie par électrons Auger nécessaire à l'activation par rayons X11.
    NOTE : La formulation de base décrite ici n'est pas ciblée. Dans l'étude d'origine, une modification optionnelle de ciblage actif a été introduite par insertion postérieure de DSPE-PEG2000-Folate afin d'orienter les liposomes vers des cellules tumorales exprimant des récepteurs au folate ; cette étape peut être ajoutée sans modifier le mécanisme fondamental de libération du VP/AuNP11.
  3. Évaporer le chloroforme sous argon et sécher sous vide toute la nuit, comme décrit aux étapes 1.2–1.3.
  4. Hydrater le film lipidique avec 1,0 mL de tampon sulfate d'ammonium 250 mM (pH 5,5). Vortexer, laisser la suspension hydratée toute la nuit, puis extruder 11 fois à travers une membrane en polycarbonate de 200 nm11.
  5. Éliminer le sulfate d'ammonium libre par dialyse contre du PBS (pH 7,4) à 4 °C avec quatre renouvellements de tampon, afin d'établir un gradient transmembranaire de sulfate d'ammonium.
  6. Charger la doxorubicine (Dox) en incubant les liposomes dialysés à un rapport massique médicament/lipide de 1:10 à 60 °C pendant 1 h11. Le gradient de sulfate d'ammonium favorise l'accumulation de la Dox à l'intérieur des liposomes.
  7. Éliminer la Dox non encapsulée par dialyse contre du PBS à 4 °C avec quatre renouvellements de tampon.
  8. Caractériser les liposomes chargés par DLS (taille attendue : ~100–150 nm) et mesurer l'efficacité d'encapsulation en lysant les liposomes avec 0,1 % de Triton X-100 et en quantifiant la fluorescence de la Dox (excitation à 485 nm, émission à 590 nm).
    NOTE : Les formulations réussies de la partie B présentent généralement un diamètre hydrodynamique d'environ 100–150 nm, un PDI < 0,3, et une incorporation d'environ 156 ± 24 nanoparticules d'or par liposome. Les caractéristiques physicochimiques représentatives sont résumées dans Tableau 1.11

7. Libération du médicament déclenchée par rayons X et cytotoxicité in vitro

  1. Irradiez des VP/AuNP-liposomes chargés avec de la calceine à l’aide d’un accélérateur linéaire clinique (faisceau de photons de 6 MeV) à des doses définies (1, 2 et 4 Gy)11. Quantifiez la libération de l’agent actif en mesurant la fluorescence de la calceine (excitation à 485 nm, émission à 510 nm) et déterminez la libération totale après disruption avec du Triton X-100 à 0,1 %."
  2. Pour les essais de cytotoxicité, semez des cellules humaines de cancer colorectal HCT116 dans des plaques de 96 puits (par exemple, 2 × 104 cellules/mL dans 10 % de FBS).
  3. Traitez les cellules avec des VP/AuNP-liposomes chargés en Dox et irradiez-les avec des rayons X comme décrit ci-dessus, en incluant des témoins avec seulement LipoDox, seulement les rayons X et non traités. Évaluez la viabilité cellulaire par le test MTS à 0, 2, 4 et 24 h après une irradiation de 4 Gy11.

8. Validation in vivo : modèle de tumeur xénogreffe chez la souris

  1. Inoculer 5 × 106 cellules HCT116 en suspension dans 100 µL de milieu McCoy’s 5A sans sérum, par voie sous-cutanée dans le flanc de souris BALB/c nues femelles âgées de 6 à 7 semaines11.
  2. Lorsque les tumeurs atteignent un volume d’environ 100 mm3, injecter par voie intratumorale des liposomes VP/AuNP chargés en Dox (équivalent 10 mg/kg de Dox) dans un volume de 20 µL11.
  3. À 24 heures après l'injection, irradier les tumeurs avec une dose de 4 Gy de rayonnement X (6 MeV) à l’aide d’un accélérateur linéaire clinique, en protégeant de manière appropriée les tissus non ciblés.
  4. Suivre le volume tumoral tous les deux jours à l’aide d’un pied à coulisse numérique. Calculer le volume tumoral selon la formule V = (π/6) × L × W2, où L correspond à la plus grande dimension et W à la largeur perpendiculaire11.
  5. À la fin de l’expérience, prélever les tumeurs, les fixer dans du formol tamponné neutre à 10 %, puis préparer des coupes cryostatiques de 6 µm pour l’analyse histologique (coloration H&E)11.

9. Analyse statistique

  1. Les données quantitatives sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (ET), sauf indication contraire.
  2. Les analyses statistiques pour les études de délétion génique chez le poisson zèbre ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur, tandis que les comparaisons entre deux groupes ont été analysées à l'aide d'un test t de Student bilatéral, comme indiqué dans les études sources. La signification statistique a été définie comme p < 0,05.
  3. Pour les études sur les liposomes déclenchés par rayons X, les données relatives à la croissance tumorale, au poids corporel, au relâchement du cargo et aux analyses histologiques ont été analysées à l'aide de tests t de Student, comme décrit dans la publication originale.
  4. La définition de n pour chaque expérience est précisée dans les légendes des figures correspondantes.
  5. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 7.0 (GraphPad Software).
    REMARQUE : Ce protocole reproduit les flux expérimentaux et des jeux de données représentatifs provenant d'études précédemment publiées. Les lecteurs doivent se référer aux publications originales pour obtenir les détails complets des analyses statistiques, le cas échéant9,11.

Résultats

Édition de gènes déclenchée par la lumière (Partie A) :

Suite au protocole de la partie A, les VP-liposomes encapsulant le complexe CRISPR-Cas9 RNP ont présenté une libération du contenu dépendante de la lumière. Une libération minimale a été observée en conditions d'obscurité, tandis qu'une irradiation à 690 nm (0,15 mW/cm2) a induit une libération dépendante de la dose, augmentant avec la durée d'illumination (Figure 1A)9. Le test rapporteur eGFP chez le poisson zèbre a fourni un indicateur visuel quantitatif de l'efficacité de l'extinction génique. Les embryons activés par la lumière ont montré une extinction de 308,37 ± 40,21 fibres musculaires lentes positives pour eGFP par embryon, contre 53,15 ± 35,38 fibres chez les témoins maintenus à l'obscurité (n = 80), avec une augmentation à 326,12 ± 36,55 fibres après 5 minutes d'irradiation (n = 60) (Figure 1B,C)9. In vitro, les VP-liposomes activés par la lumière ont permis une inhibition de GFP comparable à celle obtenue avec Lipofectamine 2000 (environ 53 % contre 50 % de réduction), tout en offrant de manière unique un contrôle spatiotemporel activé par la lumière (Figure 1C)9. Ces résultats démontrent un contrôle spatiotemporel, puisqu'une même formulation de nanoparticules a produit des efficacités d'extinction génique nettement différentes selon l'exposition à la lumière (Figure 1A–C).

Méthode d'édition génique photochimique ; CRISPR-Cas9, induction par LED, microscopie de fluorescence, résultats expérimentaux, mesure d'intensité.
Figure 1. Délivrance déclenchée par la lumière du CRISPR-Cas9 et invalidation génique spatiotemporelle chez les embryons de poisson zèbre. (A) Illustration schématique de liposomes de vertéporfine (VP) (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) encapsulant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) Cas9/ARNsg. Lorsqu'ils sont irradiés avec une lumière de 690 nm, les VP génèrent des espèces réactives de l'oxygène qui déstabilisent la membrane liposomale et provoquent la libération intracellulaire de la charge CRISPR-Cas9. (B) Images de fluorescence représentatives d'embryons de poisson zèbre smyhc1:eGFP à 72 h post-fécondation (hpf) après traitement avec des liposomes VP et des durées croissantes d'exposition à la lumière (0, 1, 2 et 5 min ; 690 nm, 0,15 mW/cm2). La perte de fluorescence eGFP indique l'invalidation des fibres musculaires lentes. Les encarts montrent des vues agrandies des régions encadrées. (C) Quantification de l'intensité de fluorescence et du nombre de fibres musculaires lentes invalidées par embryon, démontrant l'activation dépendante de la lumière du CRISPR-Cas9 et l'invalidation génique. Les données sont présentées comme moyenne ± ÉT. Les expériences sur le poisson zèbre ont été analysées par ANOVA à un facteur (n = 80 embryons pour les mesures d'intensité de fluorescence et n = 60 embryons pour l'analyse du nombre de fibres ; p < 0,0001). Les expériences de validation HEK293-GFP ont été analysées à l'aide d'un test t bilatéral (n = 4). Les barres d'échelle = 500 µm (images d'ensemble) et 100 µm (images agrandies). Adapté avec autorisation d'Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Des résultats sous-optimaux dans le test sur le poisson zèbre peuvent inclure : (a) moins de 50 fibres rompues par embryon, indiquant une qualité insuffisante des liposomes, une activité insuffisante de Cas9 ou une dose lumineuse sous-optimale ; (b) une mortalité embryonnaire dépassant 20 %, suggérant des dommages mécaniques durant la microinjection ou une phototoxicité excessive du VP ; ou (c) la présence de fibres rompues dans les témoins non irradiés, indiquant une fuite prématurée du cargo à partir de la formulation liposomale.

Administration de médicaments déclenchée par rayons X (Partie B) :

Les liposomes VP/AuNP préparés selon le protocole de la partie B ont montré une libération de calceine dépendante de la dose à des doses de 1 à 4 Gy (Figure 2A,B)11. Dans le modèle de xénogreffe HCT116, les souris ayant reçu des liposomes VP/AuNP chargés en Dox suivis d'une irradiation aux rayons X à 4 Gy ont présenté une inhibition significative de la croissance tumorale par rapport à la Dox libre, aux rayons X seuls et aux témoins de liposomes non irradiés (Figure 2C)11. L'analyse histologique des sections tumorales a révélé des zones nécrotiques plus étendues dans le groupe traité de manière combinée, évaluées par coloration H&E (Figure 2D).

Thérapie du cancer par des liposomes ciblés aux rayons X ; graphiques sur la libération de calceine, la taille de la tumeur, l'analyse de la nécrose.
Figure 2. Libération de doxorubicine déclenchée par les rayons X et inhibition de la croissance tumorale. (A) Représentation schématique de liposomes intégrant la vertéporfine (VP) et des nanoparticules d'or (AuNP), contenant de la doxorubicine (Dox). L'exposition aux rayons X active la VP par transfert d'énergie médié par les AuNP, générant de l'oxygène singulet qui déstabilise la bicouche lipidique et déclenche la libération de la charge utile. (B) Profils de libération de calceine à partir de liposomes exposés à des doses croissantes de rayons X (0–4 Gy), démontrant une libération de la charge utile dépendante de la dose pour les liposomes VP/AuNP. Les barres d'erreur représentent l'écart-type de quatre mesures. (C) Mesures du volume tumoral (à gauche) et du poids corporel (à droite) chez des souris porteuses de xénogreffes HCT116 traitées par PBS, LipoDox, rayons X seuls ou LipoDox activé par les rayons X. Les données sont présentées comme moyenne ± écart-type (n = 4 souris par groupe). La significativité statistique a été évaluée à l'aide du test t (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001). (D) Coupes tumorales représentatives colorées à l'hématoxyline et éosine (H&E) et analyse morphométrique de la surface nécrosée moyenne. Les flèches indiquent des régions nécrosées représentatives. Les boîtes à moustaches montrent la médiane et l'intervalle interquartile, les moustaches s'étendant jusqu'à 1,5 × IQR. Les données ont été analysées à l'aide du test t (n = 5). Échelle = 50 µm. Adapté de Deng et al.11 selon les termes de la licence Creative Commons Attribution 4.0 International. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Les résultats sous-optimaux dans le modèle de xénogreffe peuvent inclure : (a) aucune différence dans la croissance tumorale entre les groupes de liposomes irradiés et non irradiés, indiquant une libération insuffisante médiée par VP ou une incorporation inadéquate des nanoparticules d'or ; ou (b) une toxicité systémique (perte de poids > 15 %), suggérant une fuite de Dox des liposomes avant l'activation par rayons X.

Discussion

Plusieurs étapes de ces protocoles sont essentielles pour réussir. Dans la partie A, le rapport molaire lipidique (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) doit être strictement respecté, car la concentration de VP détermine directement l'ampleur de la production de 1O2 et, par conséquent, l'efficacité du relargage du cargo9. Le chargement du complexe RNP Cas9/ARNg pendant l'étape d'hydratation, plutôt que par complexation postérieure à la formation, est indispensable pour l'encapsulation dans le cœur aqueux. L'extrusion à travers une membrane en polycarbonate de 200 nm (11 passages) permet d'obtenir des vésicules unilamellaires homogènes ; la sonication ne doit pas être utilisée à la place, car elle pourrait dénaturer la protéine Cas9. Pour la partie B, la taille des nanoparticules d'or (3–5 nm) est cruciale, car les particules doivent être suffisamment petites pour s'insérer dans la bicouche lipidique afin de permettre un transfert efficace d'énergie par électrons Auger vers le VP sous irradiation aux rayons X11. La méthode de chargement de la doxorubicine (Dox) utilisant un gradient de sulfate d'ammonium exige un dialysage complet du sulfate d'ammonium externe avant l'ajout du médicament ; un dialysage incomplet réduirait l'efficacité du chargement.

La composition lipidique peut être adaptée à différentes applications tout en conservant le mécanisme de libération médié par VP. Par exemple, remplacer une fraction de DOTAP par un lipide PEGylé (par exemple, DSPE-PEG2000 à 5 % mol.) peut améliorer le temps de circulation lors d'une administration systémique, bien que cela réduise la charge de surface positive et puisse diminuer l'absorption cellulaire in vitro2. Si les mesures DLS montrent un PDI > 0,3, augmentez le nombre de passages d'extrusion ou vérifiez l'intégrité de la membrane. Si la génération de dioxygène singulet est faible malgré un incorporation correcte du VP, vérifiez la longueur d'onde et la densité de puissance de la source lumineuse LED à l'aide d'un wattmètre étalonné, car l'activation du VP est spécifique à la longueur d'onde (excitation maximale à 425 nm pour la bande de Soret et activation thérapeutique à 689–690 nm pour la bande Q)9. Pour le test sur zebrafish, si la mortalité des embryons dépasse 20 % dans les groupes traités, réduisez le volume d'injection ou la concentration en liposomes afin de minimiser la phototoxicité associée au VP. Un cadre structuré de résolution des problèmes, basé sur les critères du tableau 1, est le suivant. PDI > 0,3 : augmentez le nombre de passages d'extrusion et vérifiez l'intégrité de la membrane. Libération déclenchée faible ou absente malgré une incorporation correcte du VP : confirmez la sortie à 690 nm à l'aide d'un wattmètre étalonné et vérifiez le rapport molaire du VP. Moins de ~50 fibres musculaires lentes invalidées par embryon : refaites les liposomes, confirmez l'activité du RNP ou augmentez la durée d'irradiation. Perte du signal eGFP dans les témoins non irradiés : vérifiez les conditions de stockage en utilisant les liposomes dans les 48 heures suivant leur préparation et en les conservant à 4 °C à l'abri de la lumière, et confirmez la stabilité de la membrane. Dans le modèle de xénogreffe, l'absence de différence entre les groupes de liposomes irradiés et non irradiés indique la nécessité de confirmer l'incorporation de nanoparticules d'or de 3 à 5 nm et de vérifier la dose de rayons X administrée.

La limitation principale de la modalité activée par la lumière (partie A) est la profondeur de pénétration de la lumière à 690 nm, qui restreint l'activation directe aux tissus superficiellement accessibles ou à ceux pouvant bénéficier d'une délivrance de lumière par fibre optique5. La modalité activée par rayons X (partie B) surmonte cette limitation de profondeur, mais nécessite l'accès à un accélérateur linéaire clinique et expose les tissus environnants à un rayonnement ionisant, bien que celui-ci soit administré à des doses thérapeutiques11,12. Les deux formulations reposent actuellement sur le DOTAP, un lipide cationique associé à une cytotoxicité dépendante de la dose, ce qui pourrait limiter la fenêtre thérapeutique en cas d'administration systémique2. La nature transitoire de l'édition génique médiée par les RNP est un avantage en termes de sécurité, mais implique qu'un épuisement incomplet au sein d'une population cellulaire cible ne peut être renforcé par des doses répétées sur le même site sans réadministration de nanoparticules. Par ailleurs, ces protocoles ont été validés sur des lignées cellulaires et des modèles animaux de petite taille ; leur translation vers des modèles animaux plus grands, et ultimement vers des applications cliniques humaines, exigera une optimisation des formulations, des études de pharmacocinétique et une évaluation toxicologique formelle dans des conditions GLP. En particulier, ce protocole ne comprend pas de données de pharmacocinétique, de biodistribution ou de pénétration rétinienne. Bien que la pénétration de la lumière à travers les tissus oculaires et autres soit bien caractérisée dans la littérature selon des paramètres dépendants de la longueur d'onde, de la pigmentation et du type de tissu (et puisse être améliorée par des agents d'éclaircissement optique), des études quantitatives de pharmacocinétique, de biodistribution et de délivrance rétinienne restent des étapes essentielles à franchir avant de pouvoir étayer des affirmations translationnelles.

Les systèmes conventionnels de nanoparticules lipidiques (LNP), y compris ceux utilisés dans les vaccins à ARNm, libèrent leur charge de manière passive après l'internalisation cellulaire via l'échappement endosomal, sans offrir de contrôle temporel ou spatial sur la délivrance1,2. Les vecteurs viraux tels que l'AAV permettent une livraison génique efficace, mais sont limités par leur capacité d'emballage (~4,7 kb), leur immunogénicité lors de redonnages et une expression constitutive du transgène qui ne peut pas être modulée après l'administration3. La plateforme de liposomes VP remédie à ces limitations en offrant un mécanisme de libération contrôlable de l'extérieur, indépendant du type de charge, compatible avec de grandes charges (protéines, complexes RNP et petites molécules), non virale et potentiellement compatible avec des administrations répétées, sous réserve d'études de toxicologie et d'immunogénicité à doses répétées. Contrairement aux systèmes optogénétiques ou thermosensibles, l'approche basée sur le VP exploite un photosensibilisateur approuvé cliniquement, doté de données établies sur la sécurité et s'appuyant sur une infrastructure clinique existante de lasers, notamment en ophtalmologie, où le laser Visudyne à 689 nm est déjà un équipement standard6. Sang et al. ont en outre démontré que des nanoparticules hybrides lipides-polymères contenant du VP améliorent l'efficacité de la thérapie radiodynamique dans des modèles de cancer colorectal, confirmant l'adaptabilité de la génération de ROS induite par le VP à différentes architectures de nanoparticules12.

Les méthodes décrites ici présentent une pertinence particulière pour trois affections ophtalmologiques. Dans la DMLA néovasculaire, la charge liée aux injections d’anti-VEGF reste un obstacle majeur à des résultats optimaux. Des données issues de registres du monde réel montrent un sous-traitement marqué par rapport aux protocoles des essais cliniques (une moyenne de 7,3 injections contre 12 lors de la première année, avec 38,8 % des patients interrompant le traitement et des gains minimes en acuité visuelle)14, ainsi qu’un déclin visuel à long terme malgré une administration fréquente23. Les thérapies géniques par AAV en cours de développement visent à réduire cette charge — ixoberogène soroparvovecteur15, ABBV-RGX-31416 et le 4D-150 désigné RMAT (réduction de 83 % des injections)24 — mais expriment des transgènes anti-VEGF de manière constitutive et ne peuvent être ajustés ni arrêtés. Ceci constitue un risque potentiel, étant donné les preuves reliant une suppression continue du VEGF à l’atrophie géographique (étude CATT17 ; une méta-analyse portant sur 4 609 yeux18 ; et une prévalence d’atrophie atteignant 78,3 % après huit ans25). Un système de liposomes activés par la lumière transportant CRISPR-Cas9 ciblant VEGF-A pourrait, à la place, permettre une inactivation génique spatialement limitée, offrant un contrôle clinicien sur la localisation et le moment de l’édition initiale tout en conservant la durabilité de l’édition génique. Des études précliniques soutiennent la faisabilité de cette approche. La co-administration par LNP d’ARNm Cas9 et d’ARNsg ciblant VEGFA a réduit la néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) chez la souris26, des LNPs de variante PEG ont permis une édition du génome dans l’épithélium pigmentaire rétinien (RPE)27, et des LNPs guidés par peptides ont délivré de l’ARNm aux photorécepteurs chez des primates non humains28. Toutefois, aucun traitement génique rétinien basé sur des LNPs n’a encore entamé d’essais cliniques au début de l’année 202629, ce qui souligne l’opportunité translationnelle. Dans la maladie de Stargardt, la séquence codante d’environ 6,8 kb du gène ABCA4 excède la capacité d’emballage des AAV, nécessitant des stratégies à double vecteur dont l’efficacité de transduction est réduite19. Les candidats cliniques incluent les plateformes à double AAV SB-007 et VG80130, ainsi que le traitement modificateur indépendant du gène OCU410ST31. La livraison non virale d’acides nucléiques peut contourner les contraintes d’emballage des AAV. Des nanoparticules PEG-ECO transportant un plasmide ABCA4 ont réduit l’accumulation de A2E chez des souris Abca4-/-20, tandis que d’autres études ont démontré la livraison de grands construct s’ADN rétiniens32 et l’expression d’ARNm médiée par des LNPs dans les tissus oculaires33. Étant donné qu’un traitement localisé de la macula et de la fovéa suffit à préserver la vision centrale, les liposomes VP sont particulièrement adaptés pour délivrer des concentrations élevées de matériel thérapeutique génique précisément à ces régions. Dans le mélanome uvéal, le vertéporfine agit selon trois mécanismes complémentaires : cytotoxicité médiée par la thérapie photodynamique (PDT), inhibition de la voie YAP/TAZ (l’expression de YAP1 étant corrélée aux marqueurs métastatiques les plus forts, la monosomie 3 et la perte de BAP1)21, et mort cellulaire immunogène via l’activation de cGAS-STING. La combinaison de l’inhibition de YAP et de la PDT par VP avec une thérapie anti-PD-L1 a transformé des tumeurs immunologiquement froides en tumeurs immunologiquement actives, réduisant fortement la croissance tumorale et prolongeant la survie dans des modèles orthotopiques22. Ces résultats sont cohérents avec le taux de réponse de 80 % rapporté pour la PDT basée sur le vertéporfine en traitement primaire du mélanome choroïdien34. La transparence optique de l’œil pour l’activation à 689 nm, combinée à la localisation bien définie de la plupart des mélanomes uvéaux, positionne les liposomes VP comme une plateforme prometteuse pour délivrer un traitement localisé tout en réduisant potentiellement la morbidité associée aux approches actuelles de curiethérapie et de faisceau de protons.

Outre les applications ophtalmologiques et oncologiques mentionnées ci-dessus, la plateforme de liposomes VP s'applique à tout contexte thérapeutique nécessitant une libération du principe actif contrôlée de l'extérieur et déclenchée à la demande. Des applications potentielles incluent l'édition génique déclenchée par la lumière dans les affections dermatologiques accessibles à une illumination transcutanée, la libération de chimiothérapie déclenchée par rayons X synchronisée avec les protocoles cliniques de fractionnement de la radiothérapie, et l'inactivation ciblée de gènes selon un motif spatial pour des études en biologie du développement. Plusieurs systèmes d'édition génique photoactivables ont déjà été démontrés dans des tissus non rétiniens, notamment l'éditeur de base photoactivable Mag-ABE permettant une édition du génome contrôlée dans l'espace et le temps in vivo35, ainsi qu'un système de nanoparticules à conversion ascendante activées par lumière proche infrarouge (NIR) permettant une édition CRISPR-Cas9 et une thérapie photodynamique contrôlées spatialement et temporellement36. En ophtalmologie, l'intérêt croissant pour des stratégies durables de suppression du VEGF souligne davantage encore le besoin de systèmes de délivrance combinant une efficacité thérapeutique à long terme et un contrôle externe sur le moment et le lieu de l'activité biologique37. L'intégration de ces méthodes de fabrication avec les technologies émergentes de délivrance de LNPs au niveau rétinien et avec des systèmes d'édition génique photoactivables représente une convergence de composants individuellement validés, dont l'application combinée dans l'œil constitue un domaine de recherche ouvert et potentiellement à fort impact. Les travaux en cours dans notre équipe visent à optimiser les formulations pour les voies de délivrance sous-rétiniennes et intravitréennes, à évaluer les profils de sécurité dans des modèles oculaires de grands animaux, et à adapter le mode déclenché par rayons X pour une utilisation concomitante avec les protocoles standards de radiothérapie en oncologie clinique.

Déclarations de divulgation

Y.A.A. est directeur et cofondateur d'EosGene Therapeutics Pty Ltd, entreprise détentrice de brevets liés à la technologie de nanoparticules lipidiques activées par la lumière décrite dans le présent document. E.M.G. et W.D. sont cofondateurs d'EosGene Therapeutics.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent les installations et l'assistance technique fournies par la Macquarie University Zebrafish Facility (travaux sur le poisson zèbre) et par le comité d'éthique animale de l'Université Macquarie. Ce travail a été soutenu en partie par le Centre d'excellence ARC pour la BioPhotonique à l'échelle nanométrique (CE140100003). Les auteurs remercient également le soutien d'EosGene Therapeutics Pty Ltd.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Mémbtrane de filtration de 20 nm (Anotop 10 ou équivalent)Whatman (Cytiva)N/AUtilisée pour la séparation du Cas9 libre lors des mesures d'efficacité d'encapsulation
Source lumineuse LED de 690 nmThorlabsM690L4Source lumineuse pour déclencher la libération du contenu des liposomes par VP ; densité de puissance réglable
Antibiotique–Antimycotique (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Complément pour culture cellulaire ; concentration finale de 1 %
Bouteille de gaz argon et régulateurN/AN/AUtilisée pour l'évaporation du solvant lors de la préparation du film lipidique
Avanti Mini ExtruderAvanti Polar Lipids610000Système d'extrusion manuel utilisé avec des membranes en polycarbonate de 200 nm pour la standardisation de la taille des liposomes
Souris BALB/c nues (femelles, 5–6 semaines)Animal Resources CentreN/ASouris immunodéficientes utilisées pour le modèle de tumeur xénogreffe HCT116
Kit d'analyse protéique BCAThermo Fisher ScientificN/AUtilisé pour la quantification du Cas9 libre et les mesures d'efficacité d'encapsulation
Système d'imagerie Bio-Rad ChemiDoc MPBio-Rad Laboratories12003154Système d'imagerie pour gels et immunotransferts
CalceineSigma-AldrichC0875Colorant fluorescent pour les essais de libération ; auto-quenching à forte concentration
Spectrophotomètre UV-Vis-NIR Cary 5000Agilent TechnologiesN/ASpectroscopie d'absorption UV-Vis des liposomes et du vertéporfine
Cellules CCD841 CoN (épithélium colique normal humain)ATCCCRL-1790Ligne cellulaire épithéliale colique normale ; utilisée comme témoin non cancéreux
ChloroformeSigma-Aldrich288306Solvant organique pour la préparation du film lipidique
CholestérolSigma-AldrichC8667Composant de la membrane des liposomes utilisé dans la formulation activée par la lumière
Accélérateur linéaire clinique (faisceau de photons de 6 MeV)Varian Medical SystemsN/ASource clinique de rayons X pour les études d'irradiation
Pieds à coulisse numériquesN/AN/AUtilisés pour les mesures du volume des tumeurs xénogreffées
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-Aldrich472301Solvant pour la préparation du stock de vertéporfine
DOPC (1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine)Avanti Polar Lipids850375PComposant lipidique utilisé dans la formulation activée par les rayons X
DOPE (1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine)Sigma-AldrichP1223Lipide auxiliaire utilisé dans la formulation activée par la lumière
DOTAP (1,2-dioléoyl-3-triméthylammonium-propane)Avanti Polar Lipids890890PLipide cationique utilisé dans les deux formulations
Chlorhydrate de doxorubicineSigma-AldrichD1515Médicament chimiothérapeutique chargé dans les liposomes activés par les rayons X
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PLipide PEGylé utilisé dans la formulation activée par les rayons X
Milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092Milieu de culture cellulaire pour les cellules HEK293 et PC12
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144Solution de lavage
Sérum bovin fœtal (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141Complément pour culture cellulaire ; concentration finale de 10 %
Spectrofluoromètre Fluorolog-Tau3HORIBA ScientificN/ASpectroscopie de fluorescence pour la caractérisation du vertéporfine
Logiciel de superposition de mise au point (par exemple, Zerene Stacker)N/AN/AUtilisé pour la génération d'images superposées en imagerie du poisson-zèbre
Lyophilisateur (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/AUtilisé pour le séchage sous vide et l'élimination du solvant
sgRNA GFPThermo Fisher ScientificA35943ARN guide simple ciblant eGFP ; utilisé pour la validation de l'extinction génique
Nanoparticules d'or (3–5 nm, stabilisées au citrate)NanoComposixN/ARadiosensibilisateur utilisé dans la formulation activée par les rayons X
GraphPad PrismGraphPad Software7.0Analyse statistique et visualisation des données
Cellules HCT116 (carcinome colorectal humain)ATCCCCL-247Ligne cellulaire de cancer colorectal utilisée pour les études in vitro et in vivo
Cellules HEK293/GFPGenTargetSC001Ligne cellulaire stable exprimant GFP utilisée pour la validation de l'extinction génique par CRISPR
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Colorant nucléaire ; concentration de travail de 5 µg/mL
Logiciel d'analyse d'images (par exemple, Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/AUtilisé pour la quantification des fibres musculaires à contraction lente ayant subi une extinction génique
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open sourceLogiciel d'analyse d'images
Microscope à fluorescence inverséLeica MicrosystemsDMi3000Utilisé pour l'imagerie des rapporteurs chez le poisson-zèbre et l'évaluation de la fluorescence GFP
Système d'imagerie in vivo IVIS SpectrumCTPerkinElmer128201Système d'imagerie de fluorescence in vivo
Microscope électronique en transmission JEOL JEM-1400JEOLJEM-1400Imagerie en TEM des liposomes
Microscope confocal Leica SP2Leica MicrosystemsN/AImagerie confocale de l'absorption cellulaire
Agarose à bas point de fusionN/AN/AUtilisée pour le montage des embryons de poisson-zèbre pendant l'imagerie
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Réactif de transfection utilisé comme témoin positif
Logiciel Living ImagePerkinElmerN/ALogiciel d'acquisition et d'analyse d'images
Milieu McCoy 5AThermo Fisher Scientific16600082Milieu de culture cellulaire pour les cellules HCT116
Système de micro-injectionN/AN/AUtilisé pour la micro-injection aux stades unidiscellulaires des embryons de poisson-zèbre
Essai de prolifération cellulaire MTSPromegaG3582Essai de viabilité cellulaire
Spectrophotomètre NanoDropThermo Fisher ScientificND-2000Mesures de pureté et de concentration de l'ARN
Eau sans nucléaseThermo Fisher ScientificR0582Utilisée pour la préparation des complexes RNP CRISPR-Cas9
Milieu Opti-MEM à faible teneur en sérumThermo Fisher Scientific31985070Milieu de transfection
Paraformaldéhyde (4 %)Sigma-AldrichP6148Fixateur pour l'analyse histologique
Cellules PC12 (phéochromocytome de rat)ATCCCRL-1721Ligne cellulaire de type neuronal utilisée pour les études d'absorption
Filtres en membrane de polycarbonate (200 nm)Avanti Polar Lipids610006Membres d'extrusion pour le calibrage des liposomes
Kit RNeasy Plus MiniQIAGEN74134Kit d'extraction de l'ARN
Capteur fluorescent d'oxygène singulet (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002Sonde fluorescente pour la détection de l'oxygène singulet
Dispositifs de dialyse Slide-A-Lyzer MINI (cutoff de 10 kDa)Thermo Fisher Scientific69570Dispositifs de dialyse pour la préparation des liposomes et le chargement des médicaments
Colorant SYBR Gold pour gels d'acides nucléiquesThermo Fisher ScientificS11494Colorant pour gels d'acides nucléiques
Poisson-zèbre transgénique Tg(ubi:EGFP)Zebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2Poisson-zèbre transgénique utilisé pour la validation in vivo de CRISPR
TNF-α (recombinant humain)Life TechnologiesRTNFAICytokine utilisée dans les études d'induction de TNFAIP3
sgRNA TNFAIP3Thermo Fisher ScientificN/AsgRNA ciblant TNFAIP3
Méthanesulfonate de tricaine (MS-222)N/AN/AAnesthésique pour poisson-zèbre utilisé avant l'imagerie
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Détergent utilisé pour la lyse des liposomes et les essais de libération
Protéine Cas9 TrueCut v2Thermo Fisher ScientificA36498Nucléase Cas9 utilisée pour la préparation des complexes RNP CRISPR-Cas9
Trypsine-EDTA (0,25 %)Thermo Fisher Scientific25200056Réactif de dissociation cellulaire
Acétate d'uranyle (2 %)Electron Microscopy Sciences22400Coloration négative pour l'imagerie en TEM
VertéporfineSigma-AldrichSML0534-5MGPhotosensibilisateur incorporé dans les formulations de liposomes
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600Mesures de diffusion dynamique de la lumière et du potentiel zêta

Références

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