Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de recherche

Évaluation du traitement combiné au sorafénib et à la gemcitabine dans des cellules HepG2 et un modèle de xénogreffe chez la souris NOD/SCID : une étude pilote

73 vues

⸱

DOI :

10.3791/71790

⸱

28 août 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, the Fourth Affiliated Hospital of School of Medicine, and International School of Medicine, International Institutes of Medicine, Zhejiang University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le sorafénib associé à la gemcitabine présente des preuves préliminaires d'une inhibition additive de la prolifération des cellules HepG2, entraîne des modifications corrélées de l'expression de p-ERK et du VEGF, et supprime la croissance des tumeurs hépatiques chez les souris NOD/SCID.

Résumé

Le cancer du foie demeure l'une des principales causes de mortalité liée au cancer en raison de la résistance aux médicaments et des options thérapeutiques limitées. Il est urgent d'explorer des stratégies thérapeutiques afin d'améliorer les résultats. Cette étude pilote présente un protocole permettant d'évaluer les effets potentiels et les mécanismes sous-jacents de l'association du sorafénib et de la gemcitabine dans le cancer du foie. La lignée cellulaire de cancer du foie HepG2 a été utilisée, et un modèle de xénogreffe chez des souris non obèses diabétiques / immunodéficientes sévères (NOD/SCID) a été établi. Les étapes clés du protocole sont illustrées, notamment : (1) la culture des cellules HepG2 et le traitement par les médicaments ; (2) la mise en place, l'incubation et la lecture de l'absorbance dans le test MTT ; (3) l'extraction des protéines, l'électrophorèse SDS-PAGE, le transfert et l'immunodétection des protéines ERK et p-ERK ; (4) l'établissement de xénogreffes sous-cutanées chez des souris NOD/SCID ; (5) la mesure des tumeurs et le calcul de leur volume ; et (6) l'immunohistochimie de la VEGF sur des sections tumorales. Des étapes critiques, des conseils de dépannage et les spécifications du matériel sont fournis. L'association du sorafénib (3 µmol/L) et de la gemcitabine (10 µmol/L) a permis d'obtenir un taux d'inhibition de 71,23 % ± 6,76 % après 72 h, avec une valeur q de 1,35, suggérant un effet synergique à cette paire de doses spécifique dans les conditions testées. Par rapport au groupe témoin, le traitement combiné s'est associé à une réduction de l'expression de p-ERK, à une diminution du volume tumoral et à une coloration immunohistochimique de la VEGF qualitativement plus faible. Ces données montrent une association corrélative entre la diminution de l'expression de p-ERK et l'effet anti-prolifératif observé, sans établir de lien de causalité. Dans les cellules HepG2 et dans un modèle de xénogreffe chez la souris NOD/SCID, l'association du sorafénib et de la gemcitabine montre des preuves préliminaires d'un potentiel anti-prolifératif et s'accompagne d'une réduction de l'expression de la VEGF ; toutefois, cette observation ne constitue pas une preuve directe d'une activité anti-angiogénique, car aucune analyse de la densité microvasculaire ou des vaisseaux fonctionnels n'a été réalisée. Ce protocole reproductible fournit un cadre utile pour l'évaluation de combinaisons thérapeutiques dans les modèles de carcinome hépatocellulaire (HCC) et peut être adapté à d'autres régimes associant thérapie ciblée et chimiothérapie, bien que des études supplémentaires sur les mécanismes et la validation des doses soient nécessaires avant de tirer des conclusions cliniques.

Introduction

Le cancer du foie est l'un des cancers les plus fréquents et les plus mortels, et il figure également parmi les tumeurs malignes à croissance la plus rapide1,2. Bien que l'incidence du cancer du foie ait diminué, la charge globale de cette maladie continue d'augmenter. Les données épidémiologiques mondiales de 2022 ont révélé que le taux d'incidence standardisé sur l'âge du cancer du foie dans la base de données en ligne du Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 était de 15,0 pour 100 000 habitants, tandis que le taux de mortalité standardisé sur l'âge atteignait 26,7 pour 100 000 habitants, en faisant la deuxième cause principale de mortalité par cancer3. Actuellement, en raison du manque de traitement efficace contre le cancer du foie et de son début insidieux, la plupart des patients décèdent dans l'année suivant le diagnostic. Le sorafénib est le premier inhibiteur multicyclique de kinases approuvé pour une utilisation clinique, ciblant des récepteurs tyrosine kinases tels que le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) et les sérine/thréonine kinases4,5. Le sorafénib, un inhibiteur oral multicyclique de kinases, exerce des effets anti-prolifératifs et anti-angiogéniques dans le cancer du foie en ciblant plusieurs voies de facteurs de croissance. Historiquement, le sorafénib a été la première thérapie systémique de première ligne approuvée par la FDA pour les patients atteints d'un cancer du foie avancé ou non résectable6. Cependant, le paysage thérapeutique actuel des traitements de première ligne pour le carcinome hépatocellulaire (CHC) avancé s'est considérablement élargi. Les options recommandées incluent désormais la combinaison d'inhibiteurs de points de contrôle immunitaire atezolizumab et bevacizumab, le lenvatinib, ainsi que la double immunothérapie durvalumab associé à tremelimumab, entre autres. Malgré ces progrès, le sorafénib reste une option importante de première ligne, particulièrement dans les régions où les combinaisons d'immunothérapie ne sont pas facilement disponibles ou sont contre-indiquées. Étant donné son utilisation répandue dans le traitement du cancer du foie, les effets indésirables liés au médicament constituent une préoccupation7. Dans l'analyse de la base de données du système de déclaration des événements indésirables de la FDA (FAERS) entre 2006 et 2023, les effets indésirables du sorafénib concernaient principalement le système digestif, la peau et les tissus sous-cutanés, ainsi que des inconforts physiques non spécifiques tels que les infections et les lésions7. Bien que certains patients atteints d'un cancer du foie avancé puissent bénéficier du traitement au sorafénib, la majorité finit par développer une résistance ou un échec thérapeutique, entraînant un pronostic défavorable8,9,10. Malgré son utilisation, le sorafénib bénéficie seulement à environ 30 % des patients atteints de CHC ; de plus, les répondeurs développent souvent une résistance dans les 6 mois11. Les voies moléculaires impliquées dans la résistance au sorafénib incluent la voie de la kinase régulée par les signaux extracellulaires (ERK)/ERK phosphorylée (p-ERK), la protéine kinase B (Akt), la voie phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/AKT/cible de la rapamycine chez les mammifères (mTOR), le facteur inductible par l'hypoxie 1α (HIF-1α)/HIF-2α et les voies liées à l'autophagie, la voie ERK/p-ERK étant particulièrement mise en évidence et sélectionnée dans cette étude11. La gemcitabine est un analogue de la cytidine qui, une fois introduite dans l'organisme, produit du difluorocytidine diphosphate et du difluorocytidine triphosphate, ayant des effets inhibiteurs différents sur la synthèse de l'ADN12. Dans les tumeurs hépatobiliaires, la gemcitabine a été évaluée comme composant d'une chimiothérapie combinée. Toutefois, la gemcitabine a également été cliniquement associée à une résistance accrue au médicament, limitant ainsi son efficacité12,13. Par conséquent, déterminer le régime thérapeutique optimal de manière efficace et rapide s'avère extrêmement difficile. Des études récentes ont montré que la combinaison de gemcitabine et de sorafénib pourrait présenter une efficacité thérapeutique améliorée, selon une prédiction basée sur un nouveau biomarqueur de la tumeur souche14. Cependant, à notre connaissance, aucune étude n'a examiné cette combinaison spécifiquement dans le cancer du foie en utilisant des cellules HepG2 et un modèle de xénogreffe chez la souris non obèse diabétique/déficiente immunitaire sévère (NOD/SCID) de carcinome hépatocellulaire. Par conséquent, des preuves expérimentales validant directement les effets additifs du sorafénib et de la gemcitabine dans le cancer du foie font encore défaut.

Les procédures décrites dans cet article sont largement utilisées, mais rarement présentées sous une forme détaillée, visuelle et étape par étape, adaptée à la reproduction par des chercheurs débutants. Nous avons émis l'hypothèse que la combinaison de sorafénib et de gemcitabine inhiberait de manière additive la prolifération des cellules cancéreuses du foie et la croissance tumorale, et que cet effet serait associé à une régulation négative de la voie ERK/p-ERK et à une angiogenèse médiée par le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) réduite. Cette étude vise à explorer préliminairement l'effet inhibiteur du sorafénib combiné à la gemcitabine sur la prolifération de la lignée cellulaire de cancer du foie HepG2 in vitro et in vivo, ainsi que son mécanisme (Supplementary Figure 1). La nouveauté de cette étude repose sur trois aspects : (1) il s'agit de la première étude à tester spécifiquement la combinaison sorafénib-gemcitabine dans le cancer du foie en utilisant la lignée cellulaire HepG2 largement répandue et un modèle murin NOD/SCID correspondant ; (2) elle examine la voie ERK/p-ERK, peu étudiée jusqu'ici, comme mécanisme potentiel ; et (3) elle fournit des preuves expérimentales directes — et non des prédictions informatiques — de l'effet additif de cette combinaison dans le cancer du foie. Ces caractéristiques distinguent ce travail des rapports antérieurs sur les thérapies combinées menées dans d'autres types de tumeurs ou à l'aide de modèles expérimentaux différents, notamment dans le contexte des régimes à base de sorafénib.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

L'approbation éthique a été accordée par le Comité d'éthique et de bien-être animal de l'Université Zhejiang (n° d'approbation ZJU20250049).

Animaux et regroupement

Un total de 40 souris femelles NOD/SCID, âgées de 4 à 5 semaines et pesant entre 18 et 20 g, ont été achetées auprès d'un fournisseur commercial agréé (numéro de licence SCXK (Shanghai) 2013-0006) et hébergées dans des salles animales de grade sans germe spécifique (SPF). Tous les protocoles animaux ont suivi les lignes directrices standard. Pendant l'expérience, les animaux ont eu accès librement à la nourriture et à l'eau, et ont été logés par groupes (5 souris/ cage) dans une salle SPF à conditions contrôlées, avec une température maintenue à 22 ± 2 °C, une humidité de 50 % à 60 %, et un cycle lumière/obscurité de 12/12 h. Une alimentation et une hydratation libres ont été assurées, et le poids corporel a été surveillé toutes les deux semaines. Lorsque les souris présentaient des douleurs persistantes, une cachexie, des ulcères tumoraux, lorsque la taille de la tumeur atteignait une dimension maximale de 2 cm, ou d'autres problèmes de santé irréversibles, l'euthanasie était réalisée par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 0,45 % à une dose ≥ 150 mg/kg de poids corporel, suivie de la confirmation de l'arrêt de la respiration et des battements cardiaques, de la perte du réflexe cornéen, ou de l'application d'une méthode physique secondaire si nécessaire, conformément aux critères d'euthanasie approuvés par le Comité d'éthique animal. La taille de l'échantillon (n = 10 par groupe) a été déterminée par une analyse de puissance supposant une taille d'effet de 1,2 (issue d'expériences pilotes), α = 0,05 et β = 0,20 (puissance de 80 %), avec une marge supplémentaire de 20 % pour les pertes éventuelles. Les procédures d'implantation tumorale ont été effectuées avant l'attribution du traitement (voir ci-dessous pour l'établissement du xénogreffe).

Les souris ont été réparties aléatoirement en 4 groupes à l’aide de la méthode de la table de nombres aléatoires après l’implantation tumorale et la confirmation de la prise tumorale : groupe témoin, groupe sorafénib, groupe gemcitabine et groupe association de sorafénib et de gemcitabine, avec 10 souris (5 souris par cage) dans chaque groupe, afin de construire un modèle de tumeur greffée chez la souris NOD/SCID. Étant donné que les tissus tumoraux durant le processus de modélisation peuvent entraîner un état général altéré voire la mort des souris NOD/SCID, et considérant que l’analyse statistique exige généralement une taille d’échantillon efficace, au moins 10 souris ont été incluses par groupe. La répartition aléatoire a été effectuée par des techniciens indépendants et les cages ont été étiquetées ; aucune cécité n’a été appliquée lors de l’administration des médicaments ou de la mesure des tumeurs, ce qui constitue une limitation importante. Le prélèvement tissulaire restant, ainsi que les évaluations biochimiques et pathologiques, ont tous été réalisés par du personnel de laboratoire en situation de cécité. Les données ont également été analysées en cécité par des statisticiens n’ayant accès qu’à des fichiers codés jusqu’à la fin des analyses statistiques et au dévoilement des données. Tous les animaux ont été inclus dans l’analyse finale. La voie intrapéritonéale a été choisie pour les deux médicaments afin d’assurer une absorption systémique et une biodisponibilité constante ; l’administration quotidienne a été retenue sur la base d’études pharmacocinétiques antérieures ayant montré des concentrations plasmatiques durables avec ce régime. Le groupe témoin a reçu une injection intrapéritonéale de 0,2 mL de solution saline normale stérile. Dans le groupe sorafénib, 0,2 mL de sorafénib à 40 mg/kg ont été injectés par voie intrapéritonéale. Dans le groupe gemcitabine, 0,2 mL de gemcitabine à 100 mg/kg ont été administrés par voie intrapéritonéale. Groupe de traitement combiné : 0,2 mL chacun de sorafénib à 40 mg/kg et de gemcitabine à 100 mg/kg ont été administrés par voie intrapéritonéale. Chaque groupe a reçu le traitement une fois par jour pendant 20 jours consécutifs. Tous les animaux ont été inclus dans l’analyse finale, et aucune souris n’a été exclue de l’étude. Aucun décès n’a été observé dans aucun groupe durant la période de traitement de 20 jours. Le calendrier et les doses ont été choisis sur la base d’études publiées portant sur des modèles de cancers hépato-biliaires. Il convient de noter que l’administration quotidienne de gemcitabine par voie intrapéritonéale peut entraîner une toxicité. La longueur et la largeur des tumeurs greffées ont été mesurées quotidiennement, et le volume des tumeurs greffées a été calculé. Après 20 jours, les animaux ont été euthanasiés par dislocation cervicale sous anesthésie profonde, et les tissus tumoraux greffés ont été fixés dans du formol. Le poids corporel a été mesuré tous les deux jours pendant toute la durée de l’étude. Les souris ont été surveillées quotidiennement pour détecter des signes cliniques de toxicité, notamment l’érection du poil, une posture voûtée, une mobilité réduite, des diarrhées et une léthargie. Toutefois, aucune biochimie sanguine (par exemple, alanine aminotransférase, aspartate aminotransférase et créatinine) ni examen histopathologique des organes principaux n’ont été réalisés. Par conséquent, une toxicité subclinique ne peut être exclue.

Médicaments et réactifs

Le sorafénib a été dissous dans 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) et stocké à -20 °C. Avant utilisation, la solution a été décongelée et diluée pour obtenir une concentration finale de DMSO inférieure à 0,5 %, ce qui n'avait aucun effet sur la croissance cellulaire. La gemcitabine a été obtenue auprès d'une source commerciale. Le tampon de lyse pour le dosage d'immunoprécipitation radio-immunologique (RIPA), le bleu de thiazolyle, les anticorps primaires dirigés contre la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH), ERK, p-ERK et VEGF, les anticorps secondaires, le milieu de culture Dulbecco modifié (DMEM) à forte teneur en glucose, le sérum bovin fœtal et la lignée cellulaire HepG2 ont été obtenus auprès de sources commerciales.

Le sorafénib et la gemcitabine sont des agents cytotoxiques. Toutes les procédures de préparation et de manipulation des médicaments doivent être effectuées dans une hotte de sécurité biologique désignée, tout en portant des équipements de protection individuelle appropriés (blouse de laboratoire, gants en nitrile et lunettes de sécurité). Le DMSO, le méthanol, le xylène et d'autres solvants organiques utilisés dans ce protocole sont dangereux et doivent être manipulés sous une hotte aspirante afin d'éviter toute inhalation ou tout contact cutané. Les fiches de données de sécurité (FDS) de tous les réactifs doivent être consultées avant utilisation.

Culture cellulaire

La lignée cellulaire HepG2 a été réanimée et inoculée dans des flacons de culture contenant 10 mL de milieu DMEM à haute teneur en glucose (complété avec 10 % de sérum de veau fœtal, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine et 4 mmol/L de glutamine). Les cellules ont été incubées à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂. Le milieu de culture a été renouvelé tous les 2 jours, et les cellules ont été repiquées tous les 4 jours afin de maintenir une croissance logarithmique. La lignée cellulaire HepG2 a été obtenue auprès d'une source commerciale ; toutefois, aucune authentification indépendante de la lignée cellulaire (par exemple, profilage par répétitions tandem courtes) ni test de contamination par les mycoplasmes n'a été effectué dans cette étude.

Méthode MTT pour détecter le taux d'inhibition de la prolifération

La méthode au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT) a été utilisée pour déterminer le taux d'inhibition de la prolifération induite par le sorafénib et la gemcitabine sur la lignée cellulaire HepG2. Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été digérées à l’aide de trypsine 0,25 % pendant 2 minutes, puis la digestion a été arrêtée par l’ajout d’un volume égal de milieu complet. Après centrifugation à 1000 × g pendant 10 minutes, les cellules ont été remises en suspension dans le milieu complet. La densité cellulaire a été ajustée à 1 × 105 cellules/mL, et 200 µL de la suspension cellulaire ont été semés dans chaque puits d’une plaque 96-puits. Cette densité d’ensemencement a été choisie sur la base d’expériences préliminaires d’optimisation au cours desquelles des densités cellulaires allant de 5 × 103 à 5 × 104 cellules/puits ont été testées. Une densité de 2 × 104 cellules/puits a permis une augmentation linéaire de l’absorbance sur 96 heures tout en maintenant la confluence en dessous de 80 % au point final, comme confirmé par inspection visuelle au microscope inversé. Afin de s’assurer que les mesures par MTT restaient dans la plage linéaire, des expériences pilotes ont été réalisées à chaque point temporel avec des puits contrôles traités au véhicule. Le milieu a été renouvelé toutes les 48 heures afin d’éviter l’épuisement des nutriments et l’accumulation de sous-produits métaboliques. La confluence a été surveillée quotidiennement au microscope inversé. Après 96 heures, les puits témoins atteignaient environ 75 % à 80 % de confluence, et aucun signe évident d’épuisement des nutriments n’a été observé. Après l’attachement cellulaire, le milieu a été éliminé et le milieu contenant les médicaments a été ajouté. Un milieu sans médicament a été ajouté au groupe témoin non traité (contrôle véhicule pour les expériences in vivo). L’expérience a été divisée en un groupe témoin non traité, un groupe sorafénib, un groupe gemcitabine et un groupe traitement combiné. Les concentrations de sorafénib étaient de 1,5 µmol/L, 3 µmol/L, 4,5 µmol/L et 6 µmol/L, et celles de gemcitabine étaient de 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/L et 20 µmol/L. Les concentrations combinées de sorafénib et de gemcitabine étaient de 1,5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4,5 µmol/L + 15 µmol/L et 6 µmol/L + 20 µmol/L. Les cellules de chaque groupe ont été cultivées pendant 24 heures, 48 heures, 72 heures et 96 heures. Après l’incubation, 20 µL de MTT à 5 mg/mL ont été ajoutés à chaque puits, puis les cellules ont été incubées pendant 4 heures dans une étuve à cellules. Le surnageant a été soigneusement éliminé, puis 150 µL de DMSO ont été ajoutés à chaque puits, et la plaque a été agitée pendant 10 minutes afin de dissoudre complètement le formazan. La densité optique (DO) de chaque puits a été mesurée à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque multifonctionnel. L’expérience a été répétée trois fois, chaque groupe comprenant cinq puits réplicats. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type (SD) des trois réplicats biologiques. Le taux d’inhibition de la croissance cellulaire (%) = (1 - DO groupe expérimental / DO groupe non traité) × 100 %. L’interaction entre les deux médicaments a été évaluée par la valeur q, calculée selon la formule suivante : q = EAB / (EA + EB - EA × EB). Ici, EA et EB représentent les taux d’inhibition des médicaments A et B lorsqu’ils sont utilisés seuls, et EAB correspond au taux d’inhibition lorsque les deux médicaments sont utilisés ensemble. Lorsque q est supérieur à 1,15, cela indique un effet synergique entre les deux médicaments ; une valeur comprise entre 0,85 et 1,15 indique un effet additif ; et une valeur q inférieure à 0,85 indique un effet antagoniste. La méthode de la valeur q est un outil de criblage simple et ne remplace pas des analyses de synergie plus rigoureuses. Seules quelques paires de doses à rapport fixe ont été testées, ce qui limite la robustesse de la conclusion sur la synergie. Par conséquent, le terme « synergie » dans cette étude désigne une valeur q > 1,15 à des paires de doses et des points temporels spécifiques, et non une interaction additive validée sur l’ensemble de la matrice dose-réponse.

Analyse par immunotransfert de l'expression protéique de ERK et p-ERK

La culture cellulaire et le regroupement expérimental ont été réalisés comme décrit précédemment. Pour la détection de ERK et p-ERK par immunobuvardage, la dose de sorafénib était de 3 µmol/L ; la dose de gemcitabine était de 10 µmol/L ; et la dose combinée était de 3 µmol/L + 10 µmol/L. Après 72 heures de traitement, les cellules ont été lysées à l’aide d’un tampon de lyse RIPA, et les protéines totales ont été extraites de chaque groupe expérimental. La concentration en protéines a été déterminée par la méthode à l’acide bicinchoninique (BCA). Des quantités équivalentes de protéines (30 µg par puits) ont été chargées et séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) à 10 % à 120 V pendant 90 min. Les protéines ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (taille de pore de 0,45 µm) à 300 mA pendant 90 min à 4 °C. Après blocage avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20 (TBST) pendant 1 h à température ambiante, les membranes ont été incubées avec les anticorps primaires toute la nuit à 4 °C sous agitation douce. Après trois lavages avec du TBST (10 min chacun), les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat chimiluminescent amplifié (ECL) et capturées à l’aide d’un système numérique d’imagerie de gels. Les temps d’exposition ont été optimisés pour chaque anticorps afin d’éviter la saturation. La quantification densitométrique a été effectuée à l’aide du logiciel ImageJ en utilisant l’outil d’analyse de gel. L’intensité de chaque bande protéique cible a été normalisée par rapport à GAPDH comme contrôle de chargement, et l’expression de p-ERK a été en outre normalisée par rapport à l’expression totale de ERK. Aucune étape de blocage supplémentaire au-delà du lait écrémé à 5 % n’a été réalisée. Les résultats de quantification ont été exprimés en variation d’expression par rapport au groupe témoin, fixé à 1,0. Chaque expérience a été répétée indépendamment trois fois. Des immunobuvardages représentatifs sont présentés.

Détection immunohistochimique de l'expression du VEGF dans des tumeurs xénogreffées HepG2 chez des souris NOD/SCID

Pour l'établissement du xénogreffe : les cellules HepG2 en phase de croissance logarithmique ont été récoltées par trypsination, lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) et resuspendues dans du DMEM sans sérum. Un total de 2 × 106 cellules dans 0,2 mL de DMEM sans sérum (sans Matrigel) a été injecté par voie sous-cutanée dans la région axillaire droite (zone à riche vascularisation) de chaque souris NOD/SCID à l’aide d’une seringue de 1 mL afin d’établir un modèle de xénogreffe sous-cutanée HepG2 chez les souris NOD/SCID. L’implantation tumorale a été surveillée tous les deux jours. La taille de la tumeur a été mesurée tous les deux jours, et lorsque le diamètre tumoral a atteint 0,3–0,5 cm (environ 7 à 10 jours après l’injection, défini comme le point de début du traitement), les souris ont été réparties aléatoirement en quatre groupes pour l’expérience. La longueur (L) et la largeur (W) de la xénogreffe sous-cutanée ont été mesurées quotidiennement à l’aide d’un pied à coulisse numérique, et le volume tumoral (V) a été calculé selon la formule suivante : V = (L × W2) / 2. Toutes les mesures ont été effectuées par un investigateur aveugle à l’affectation des groupes. Après 20 jours, les animaux ont été sacrifiés par dislocation cervicale sous anesthésie profonde, et le tissu de xénogreffe a été fixé dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 h à température ambiante, puis inclus en paraffine. Des coupes tissulaires (épaisses de 5 µm) ont été réalisées à l’aide d’un microtome rotatif et déposées sur des lames en verre revêtues de poly-L-lysine. Pour l’immunohistochimie, les coupes ont été déparaffinées dans le xylène (trois changements, 5 min chacun) et réhydratées à l’aide d’une série d’éthanol à concentration décroissante (100 %, 95 %, 70 %, 50 % ; 3 min chacun). La récupération d’antigène a été effectuée en chauffant les coupes dans un tampon de citrate de sodium 10 mM au micro-ondes pendant 15 min, suivie d’un refroidissement à température ambiante pendant 20 min. L’activité peroxydasique endogène a été bloquée avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % dans le méthanol pendant 10 min à température ambiante. La liaison non spécifique a été bloquée avec un sérum de chèvre normal à 5 % dans le PBS pendant 1 h à température ambiante. Les coupes ont ensuite été incubées avec un anticorps primaire anti-VEGF (dilution 1 : 200) toute la nuit à 4 °C dans une chambre humide. Après lavage avec du PBS (trois fois, 5 min chacun), les coupes ont été incubées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (1 : 500) pendant 1 h à température ambiante. Le signal a été révélé à l’aide du substrat 3,3′-diaminobenzidine (DAB). Les coupes ont été contre-colorées à l’hématoxyline pendant 30 s, déshydratées, clarifiées et montées sous lame à couvre-objet à l’aide d’un milieu de montage permanent. L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un microscope inversé à fluorescence en mode champ clair à un grossissement ×100. Des images représentatives sont présentées à titre d’illustration qualitative.

Toutes les pointes, tubes et déchets de culture cellulaire contaminés ont été collectés comme déchets biologiques et stérilisés par autoclavage avant leur élimination. Les déchets chimiques, incluant les solutions contenant des médicaments, le DMSO, le xylène et le méthanol, ont été rassemblés dans des récipients de déchets séparés et étiquetés, puis éliminés conformément à la réglementation institutionnelle locale relative aux déchets chimiques dangereux.

Analyse statistique

Le logiciel SPSS 19.0 a été utilisé pour l'analyse statistique. Les données expérimentales ont été exprimées en moyenne ± écart-type (ET) à partir de trois réplicats biologiques indépendants pour les expériences in vitro, et en moyenne ± écart-type (ET) à partir de n = 10 souris par groupe pour les expériences in vivo. Pour les comparaisons entre deux groupes, des tests t non appariés bilatéraux ont été utilisés. Pour les comparaisons entre plusieurs groupes, une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d'un test post hoc de Tukey a été utilisée. Les valeurs p < 0,05, p < 0,01 et p < 0,001 ont été indiquées.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

L'effet inhibiteur du sorafénib et de la gemcitabine sur la prolifération des cellules HepG2

Le sorafénib et la gemcitabine ont inhibé de manière dépendante de la dose la prolifération des cellules HepG2, comme indiqué dans le Tableau 1. La thérapie combinée a montré des taux d'inhibition significativement plus élevés à tous les points temporels par rapport à la monothérapie. Le test au MTT mesure l'activité métabolique, qui est corrélée au nombre de cellules ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Le cancer du foie a un taux de mortalité élevé en raison de son début insidieux, de sa progression rapide et du faible nombre de traitements efficaces3,15. Le cancer du foie avancé présente souvent une résistance à la chimiothérapie et à la radiothérapie, et les options actuelles, notamment la résection chirurgicale et la transplantation hépatique, restent insuffisantes15,16. La combinaison de deux ou plu...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs n'ont aucune reconnaissance à exprimer.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Système numérique d'imagerie de gelBio-Rad Laboratories, Inc., USA1708280
Milieu DMEM à haute teneur en glucoseHyClone, USASH30243.01
Anticorps monoclonal de lapin anti-ERKSanta Cruz, USAsc-94
Sérum de veau fœtalZhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., Chine11011-8611/11011-8615
Microscope à fluorescence inverséOlympus, JaponIX73
Anticorps polyclonal de lapin anti-GAPDHSanta Cruz, USAsc-25778
GemcitabineEli Lilly and Company95058-81-4
Anticorps secondaire de chèvre anti-lapinShanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., ChineD111018
Logiciel ImageJ National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Version 1.8.0_112
Lecteur de microplaquesThermo Fisher Scientific Inc., USAMK3
Anticorps monoclonal de lapin anti-p-ERKSanta Cruz, USA9106
Centrifugeuse réfrigéréeChangsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd.DL-5M
Solution de lyse RIPAInstitut de recherche en biotechnologie Biyuntian, ChineP0013B
Microtome rotatifLeica, AllemagneCM3050
SorafenibSociété Bayer, Allemagne284461-73-0
Thiazolyl Blue (MTT)Sigma, USAM5655
Incubateur à trois gazThermo Fisher Scientific Inc., USA51026402
Anticorps monoclonal de lapin anti-VEGFBioLegend, USAB199116

Références

  1. Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
  2. Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
  3. Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
  4. Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
  5. Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
  6. Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
  7. Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
  8. Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
  9. Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
  10. Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
  11. Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
  12. Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
  13. Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
  14. Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
  15. Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
  16. Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
  17. Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
  18. Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
  19. Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
  20. Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Explorer plus d’articles

Cancer du foieSorafenib GemcitabineSouris NOD SCIDEssai MTTExtraction de protéinesSDS-PAGEExpression d'ERKImmunohistochimie du VEGF
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.