Génération de neurones GABAergiques à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’humain en utilisant l’expression d’ASCL1/DLX2 induite par doxycycline à AAVS1

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour générer des neurones GABAergiques à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’humain en intégrant des transgènes inductibles par doxycycline dans le locus de port sûr AAVS1 . L’expression stable et homogène des transgènes offre une approche efficace pour une différenciation directe en neurones GABAergiques tout en limitant le silence des transgènes, un problème courant avec les approches lentivirales.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes induites par l’humain (hiPSC) offrent une opportunité sans précédent de modéliser les maladies neurologiques humaines in vitro. La génération fiable de populations neuronales définies, telles que les neurones de l’acide gamma-aminobutyrique (GABAergique), est essentielle pour ces études. Ce protocole détaille une méthode robuste pour différencier les hiPSC en neurones GABAergiques à l’aide d’un système induit par doxycycline. Cette approche repose sur l’intégration stable de transgènes codant pour les facteurs de transcription ASCL1 et DLX2 dans le locus d’intégration virale adéno-associé 1 (AAVS1.) de refuge sûr via un knock-in médié par CRISPR/Cas9. Cette intégration ciblée évite le silence du transgène souvent observé lors de l’intégration lentivirale aléatoire. Le protocole couvre le maintien des hiPSC, le processus de nucléoféction pour l’intégration des transgènes, la sélection de puromycine pour enrichir les cellules conçues avec succès, ainsi que la procédure de différenciation étape par étape. Lors de l’induction avec la doxycycline, les hiPSC modifiés quittent rapidement le cycle cellulaire, acquièrent la morphologie neuronale et expriment les marqueurs de la lignée GABAergique dans les 21 jours. Les étapes clés incluent la neuro-induction et la maturation ultérieure utilisant des facteurs de croissance spécifiques, ainsi que des approches potentielles pour améliorer l’adhésion cellulaire pendant la maturation. Cette méthode standardisée permet d’enrichir des populations de neurones induits exprimant des marqueurs de lignée GABAergique, fournissant un outil précieux pour la recherche en neurosciences et la modélisation cellulaire.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes induites par l’humain (hiPSC) offrent une plateforme unique pour modéliser les maladies neurologiques humaines in vitro. et pour étudier les mécanismes moléculaires complexes qui stimulent le développement et la^{dégénérescence 1}. Cette technologie permet de générer des modèles cellulaires spécifiques au patient pour étudier un large éventail de pathologies, allant des anomalies neurodéveloppementales précoces dans les ciliopathies^{syndromiques 2} aux altérations épigénomiques subtiles observées dans la maladie^{d’Alzheimer sporadique 3}. Par conséquent, la différenciation dirigée des hiPSC est devenue une pierre angulaire des neurosciences moléculaires modernes.

Pour saisir efficacement les nuances des processus neurologiques humains, il est essentiel de générer des sous-types neuronaux hautement spécifiques et purs. Par exemple, des populations neuronales définies sont nécessaires pour élucider les rôles transcriptionnels spécifiques de protéines comme MECP2 chez les neurones^{humains 4}, ou pour évaluer les vulnérabilités ciblées des neurones sensoriels perifériques aux infections virales, telles que le SARS-CoV-2⁵. De plus, la construction de microenvironnements complexes et physiologiquement pertinents, comme l’intégration de microglies fonctionnelles dans des organoïdes cérébraux 3D, repose fondamentalement sur la génération robuste et prévisible de lignées neuronales et gliales^{distinctes 6}. Parmi ces sous-types, les neurones GABAergiques suscitent un intérêt particulier en raison de leur rôle inhibiteur crucial dans le système nerveux central et de leurs implications dans divers troubles neurologiques et^{psychiatriques 7}. L’objectif global de cette méthode est de fournir un protocole fiable, efficace et reproductible pour la différenciation dirigée des hiPSC en neurones induits exprimant des marqueurs de lignée GABAergique. Les protocoles traditionnels de différenciation dirigée pour les neurones GABAergiques, qui reposent sur des molécules de signalisation extrinsèques, peuvent être longs, très variables et entraîner des populations cellulaires^{hétérogènes 8}.

Pour surmonter ces limites, la programmation directe médiée par facteur de transcription est apparue comme une alternative^{puissante 9}. Ce protocole utilise un système d’expression inductible par doxycycline pour stimuler l’expression des facteurs de transcription proneuronaux ASCL1 et DLX2¹⁰. En ciblant ces transgènes vers le locus de port sûr du site d’intégration virale adéno-associé 1 (AAVS1.) à l’aide de CRISPR/Cas9, cette méthode contourne le problème courant du silence des transgènes associé à l’intégration lentivirale^{aléatoire 10}. La construction du donneur comprend un reporter fluorescent, tel que mCherry, pour surveiller les cellules transgène-positives après sélection. Cette stratégie vise à soutenir une expression transgène plus homogène que les approches d’intégration aléatoire, bien que la stabilité de l’expression et la reproductibilité de la différenciation doivent être validées pour chaque ligne modifiée. Cette méthode standardisée génère des populations enrichies de neurones induits exprimant des marqueurs de lignée GABAergiques en environ 21 jours, soit une période plus courte que celle des approches traditionnelles à petites^{molécules 8,10}. Ce protocole est très approprié pour les chercheurs qui ont besoin de populations neuronales évolutives et constantes pour des applications en aval telles que la microscopie à haut contenu, la transcriptomique unicellulaire ou les tests physiologiques fonctionnels.

Protocole

ATTENTION : Les cultures humaines de hiPSC doivent être manipulées comme des matériaux potentiellement bio-dangereux selon les procédures institutionnelles de biosécurité. Effectuer toutes les procédures de culture hiPSC humaine dans une armoire de sécurité biologique certifiée de classe II en utilisant une technique stérile. Tous les déchets contenant des cellules humaines, des milieux exposés à des cellules humaines et du matériel plasmidique CRISPR/Cas9 doivent être décontaminés conformément aux directives locales de biosécurité avant leur élimination. La doxycycline, la puromycine, le DMSO et d’autres réactifs chimiques doivent être manipulés avec des gants et une protection appropriée des yeux et de la peau, et les déchets doivent être éliminés selon les procédures institutionnelles concernant les déchets chimiques. L’extrait de membrane du sous-sol (EMB) doit être manipulé selon une technique stérile et stocké sur glace avant utilisation afin d’éviter une polymérisation prématurée. Le stockage de l’azote liquide et la manipulation cryoviale doivent être effectués avec des gants cryogéniques appropriés, une protection faciale et une attention pour éviter les brûlures à froid ou l’explosion de fioles lors de la décongélation.

REMARQUE : Avant l’édition médiatisée par CRISPR/Cas9 et la différenciation neuronale, les cultures hiPSC doivent répondre à des critères de contrôle qualité prédéfinis. Les cellules doivent être confirmées négatives pour le mycoplasme, présenter un caryotype normal ou un profil d’intégrité génomique acceptable, et maintenir une expression robuste de marqueurs de pluripotence, notamment OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 et/ou SSEA4. Les cultures doivent présenter une morphologie typique compacte de colonie hiPSC, avec un rapport nucléaire/cytoplasmique élevé, des bordures définies et une différenciation spontanée minimale. Seules les cultures en prolifération active dans la plage de passage recommandée doivent être utilisées, et les cellules ne doivent pas dépasser le nombre maximal de passage défini par le laboratoire, généralement inférieur à 40, sauf validation contraire. Les cultures présentant une morphologie anormale, une différenciation spontanée excessive, une croissance faible, une contamination confirmée ou des preuves d’instabilité génomique doivent être exclues des expériences d’édition et de différenciation. Tous les matériaux nécessaires à ce protocole, y compris les recettes de supports, sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des réactifs et des plaques de culture

1. Préparez le milieu de congélation en combinant 40 mL de sérum de remplacement knock-out (KOSR) et 10 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans un tube conique de 50 mL.
2. Homogénéisez le milieu de congélation en pipettant 10 fois. Conservez la solution à 4 °C pendant jusqu’à 1 mois.
3. Diluez l’extrait de membrane basale (BME) dans le milieu Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) de Dulbecco à une concentration finale de 80 μg/mL.
   REMARQUE : Avant la dilution, vérifiez la concentration de la solution BME reçue en utilisant le numéro de lot sur le site du vendeur.
4. Ajoutez 1 mL de BME dilué par puits dans une plaque à 6 puits. Ramenez immédiatement la température BME d’origine à 4 °C pendant jusqu’à 1 mois.
5. Inclinez la plaque pour répartir la solution uniformément sur toute la surface des puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de zones non revêtues.
6. Faites couver l’assiette pendant au moins 30 minutes à 37 °C avant utilisation.
   REMARQUE : Il n’y a pas de temps maximal d’incubation. Si l’incubation dure plus d’un jour, assurez-vous que le DMEM/F-12 ne s’évapore pas. La solution BME utilisée pour un puits ne peut être réutilisée qu’une seule fois pour recouvrir un second puits. La manipulation de l’EMB à température ambiante doit être brève en raison de sa polymérisation rapide.

2. Entretien et passage des hiPSC

REMARQUE : Dans ce protocole, le support de maintenance hiPSC désigne mTeSR plus. mTeSR plus est le milieu recommandé pour l’entretien régulier, le passage à la nucléofection, la récupération après la nucléofection et la sélection de la puromycine.

1. Effectuez un passage hiPSC environ tous les 4 à 6 jours lorsque les cellules atteignent 60 % de confluence.
2. Aspirez le milieu de culture des puits à l’aide d’une pipette aspirante.
3. Ajoutez 1 mL de ReLeSR au puits et incubez pendant 30 secondes à température ambiante.
4. Aspirez le réactif de dissociation et incubez la plaque pendant 8 minutes à 37 °C.
5. Ajoutez doucement 1 mL de médium d’entretien hiPSC à l’aide d’une pipette de 5 mL. Collectez la suspension de la cellule dans un tube de 50 mL.
6. Mélangez 10 μL de suspension à cellules avec 10 μL de bleu de trypan dans un tube de microcentrifuge. Chargez 10 μL du mélange sur une contre-lames cellulaire pour déterminer la concentration cellulaire viable.
7. Aspirez le revêtement BME d’un puits préalablement préparé. Ajouter 2 mL de milieu d’entretien hiPSC complété par un inhibiteur de la kinase en spirale associée à la Rho (ROCK) (Y-27632 ; 10 μM final).
8. Ensemencer 100 000 hiPSC dans le puits, en visant une viabilité de >90 %. Déplacez la plaque en huit pour assurer une distribution homogène des cellules.
9. Incubez les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂.
10. Après 24 heures, remplacer le milieu par 2 mL de mTeSR frais plus un milieu sans inhibiteur de roche.
    REMARQUE : Un changement transitoire de la morphologie cellulaire (allongement cellulaire) est attendu en présence de l’inhibiteur ROCK. Vérifiez que les cellules retrouvent leur morphologie caractéristique après leur extraction.

3. Nucléofection des hiPSC

1. Faites passer les cellules lorsque la confluence atteint environ 60 %.
   REMARQUE : Dans ce protocole, environ 60 % de confluence correspond à des colonies hiPSC en croissance active couvrant un peu plus de la moitié de la surface du puits, avec un espace visible entre les colonies et une différenciation spontanée minimale. Les colonies ne doivent pas être envahies par la végétation, fusionner de façon étendue, ni présenter des centres denses et multicouches au moment de la nucléofection.
2. Assurez-vous que le dispositif de nuccléofection est activé et que le supplément de nucléofection est ajouté à la solution de nucléofection P3. Prépare un seau à glace.
3. Ajouter 110 μL de la solution de nucléofection P3 dans un tube de microcentrifuge placé sur la glace.
4. Ajouter 1 μg du plasmide CRISPR/Cas9 et 1 μg du plasmide donneur contenant la cassette ASCL1-P2A-DLX2 induisible par la doxycycline dans le tube. Mélangez doucement sans créer de bulles.
5. Préparez la plaque de destination en aspirant le BME à partir de deux puits revêtus. Ajoutez 2 mL de milieu d’entretien hiPSC contenant un inhibiteur de ROCK dans chaque puits, et incubez la plaque à 37 °C.
6. Dissociez les hiPSC à 60 % de confluence à partir d’un puits d’une plaque à 6 puits comme décrit aux étapes 2.2 à 2,5. Transférez la suspension dans un tube stérile et centrifugez pendant 5 minutes à 500 x g à température ambiante.
7. Écartez le surnageant et remettez la pellete cellulaire en suspension dans les 110 μL de solution de nucléofection P3 contenant les plasmides. Pipette doucement pour éviter la formation de bulles.
8. Transférez 100 μL de la suspension cellulaire dans une cuvette de nucléofection posée sur la glace.
9. Insérez la cuvette dans le dispositif nucléofecteur et exécutez le programme CB-150 pour les hiPSC.
10. Récupérez immédiatement les cellules à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique. Transférez des volumes égaux de la suspension de la cellule dans les deux puits préalablement préparés.
11. Distribuez les cellules en mode huit et incubez à 37 °C.
12. Après 24 heures, remplacer le milieu par mTeSR plus un inhibiteur de ROCK sans médium. Vérifiez l’efficacité de la nucléofection en observant la fluorescence si applicable.

4. Sélection des antibiotiques

ATTENTION : La puromycine est toxique. Manipuler avec un équipement de protection individuelle approprié et éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles.

REMARQUE : Avant de sélectionner des hiPSC éditées, déterminez la concentration optimale de puromycine pour chaque ligne de hiPSC. Semez des hiPSC non modifiés à 100 000 cellules par puits dans une plaque de 6 puits recouverte de BME dans un milieu de maintenance hiPSC complété par un inhibiteur ROCK. Après 24 heures, remplacer le milieu par un nouveau milieu d’entretien hiPSC contenant de la puromycine à 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 et 1,5 μg/mL. Remplacer quotidiennement le milieu contenant de la puromycine et surveiller la morphologie cellulaire ainsi que la survie par microscopie en champ clair pendant 5 jours. La concentration sélectionnée doit éliminer tous les hiPSC non modifiés en 3 à 5 jours tout en minimisant la toxicité excessive. Dans ce protocole, la concentration optimale de puromycine est généralement de 0,4 à 0,6 μg/mL.

1. Attendre 3 voies après la nucléofection, généralement environ 1 à 2 semaines selon le taux de récupération et de croissance, afin de permettre la perte de plasmides non intégrés avant d’initier la sélection.
2. Effectuez un passage cellulaire et semez 100 000 cellules par puits.
3. Après 24 heures, ajoutez de la puromycine à la concentration déterminée par la courbe de kill, généralement 0,4–0,6 μg/mL.
4. Maintenez la sélection de puromycine pendant la durée déterminée, généralement environ 5 jours.
5. Valider la population sélectionnée par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux afin d’estimer la proportion de cellules rapporteur-positives.
   REMARQUE : Procéder uniquement aux populations regroupées présentant une expression de rapporteur globalement homogène, idéalement > 80 à 90 % de cellules rapporteurs positives. Si l’expression du rapporteur reste en mosaïque, prolongez la sélection, répétez l’enrichissement ou envisagez l’isolation clonale avant la différenciation.
6. Confirmez la correction de la ciblisation d’AAVS1 par PCR de jonction avant d’initier la différenciation neuronale.
7. Lorsque la validation rigoureuse est requise, vérifiez les produits PCR par séquençage Sanger et évaluez le nombre de copies du transgène par qPCR, ddPCR ou un autre test de numéro de copie approprié.
8. Évaluer l’intégration aléatoire à l’aide d’essais basés sur PCR pour les séquences de colonne vertébrale plasmidique ou une analyse d’intégration génomique plus large, selon l’application en aval prévue.
9. Confirmer que la population sélectionnée de hiPSC reste mycoplasma-négative, conserve la morphologie typique des colonies de hiPSC et maintient une croissance robuste après la sélection de puromycine.
10. Réévaluer l’intégrité génomique par caryotypage, réseau SNP ou autre test validé, en particulier lorsque des cellules modifiées seront utilisées pour la modélisation de la maladie, des tests fonctionnels ou des études à long terme.
11. Évaluer les effets potentiels hors cible de CRISPR/Cas9 par un séquençage ciblé de sites hors-cibles prédits ou, si nécessaire, par des approches génomiques plus larges.
    REMARQUE : N’utilisez pas de cultures pour la différenciation si elles présentent une morphologie anormale, une mauvaise récupération après sélection, une expression persistante du rapporteur mosaïque, des anomalies génomiques confirmées ou un échec d’intégration de l’AAVS1 . Dans ce protocole, des hiPSC sélectionnés conçus sont utilisés comme population regroupée et peuvent être cryopréservés avant l’induction de la doxycycline, une fois l’expression du rapporteur, le ciblage, la morphologie et la croissance d’AAVS1 validés. La cryoconservation après induction de la doxycycline ou pendant la maturation neuronale ne fait pas partie du flux de travail standard et doit être validée empiriquement avant utilisation.

5. Différenciation en neurones gaba-ergiques

1. Préparez le nombre nécessaire de puits recouverts de BME. Notez qu’un bien semé au jour 0 donnera un puits de neurones GABAergiques.
2. Préparez 6,9 mL de milieu de neuro-induction par puits, en complétant avec de la doxycycline (1 μg/mL). Incluez un volume excédentaire de 15 % pour compenser les erreurs d’évaporation ou de pipetage.
   REMARQUE : La doxycycline est utilisée à une concentration finale de 1 μg/mL, à partir du jour 0, et maintenue tout au long de la différenciation et de la maturation. Un milieu frais contenant de la doxycycline est préparé à chaque changement de milieu pour maintenir une induction constante du transgène. Cette dose a été choisie car elle produisait une expression robuste des rapporteurs et une conversion neuronale efficace dans nos mains. Une réponse doso-doso-doxycycline formelle n’a pas été réalisée dans ce protocole ; par conséquent, les laboratoires adaptant la méthode peuvent tester empiriquement 0,1 μg/mL doxycycline si l’induction du transgène s’avère sous-optimale.
3. Le jour 0, dissociez les hiPSC modifiés et ensemencez 200 000 cellules dans les puits préparés recouverts de BME. Incuber à 37 °C.
4. Les jours 1, 2 et 3, aspirez le milieu et ajoutez 2 mL de nouveau milieu neuro-inducteur contenant de la doxycycline.
   REMARQUE : Au troisième jour, l’expansion cellulaire devrait diminuer nettement, et des structures de type dendritique pourraient commencer à apparaître. Si une confirmation expérimentale de la sortie du cycle cellulaire est nécessaire, une immunocoloration Ki-67 ou une incorporation EdU/BrdU peuvent être réalisées aux jours 3–4.
5. Au jour 4, préparez un milieu de neuromaturation contenant un facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), un facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) et une neurotrophine-3 (NT-3), chacun à une concentration finale de 10 ng/mL, la doxycycline à 1 μg/mL, et le PluriSln à 20 μM.
6. Aspirez le milieu de neuro-induction. Ajoutez soigneusement 2 mL du milieu de neuromaturation goutte par goutte le long de la paroi du puits pour éviter de perturber les neurones nouvellement formés.
7. Au jour 7, aspirez le milieu et ajoutez doucement 2 mL de milieu de neuromaturation contenant les neurotrophines et la doxycycline, mais en omettant l’inhibiteur de survie des cellules pluripotentes.
8. Pour un entretien à long terme, remplacer complètement le milieu de neuromaturation tous les 3 à 4 jours, en adaptant la fréquence en fonction de la densité cellulaire.
   REMARQUE : Le jour 21 est le critère standard pour évaluer l’identité neuronale GABAergique. Au jour 21, les cellules devraient présenter des caractéristiques neuronales GABAergiques, y compris DLX1.et continuent de faire mûrir leurs réseaux axonaux. Une densité d’ensemencement de 200 000 cellules/puits a été sélectionnée empiriquement pour produire des colonies bien espacées tout en évitant la surpopulation et la mort cellulaire associée à la maturation. Des densités de 150 000 à 300 000 cellules/puits sont compatibles, les densités plus faibles étant préférées pour la morphologie et les densités plus élevées pour la récupération des matériaux. Pour réduire le décollement, effectuer des changements plus fréquents de demi-moyen à l’aide d’une pipette de 1 000 μL à faible débit sans incliner la plaque. Si nécessaire, les cellules peuvent être replacées une fois après l’induction de doxycycline de 3 jours, avant l’ajout du milieu de maturation, en utilisant des revêtements renforcés tels que la poly-L-lysine/laminine ou la laminine-521. Il faut éviter toute transmission supplémentaire après le début de la maturation.
9. Les cultures peuvent être maintenues au-delà du jour 21 pour une maturation prolongée si les réseaux restent attachés, viables et exempts de colonies proliférantes de type hiPSC. Après le jour 21, effectuez des changements de demi-moyen tous les 3 à 4 jours avec un nouveau milieu de neuromaturation contenant de la doxycycline et des facteurs neurotrophes.
   REMARQUE : Utilisez des cultures pour les tests en aval une fois que la morphologie neuronale et les réseaux de neurites sont stables, que le décollement est minime, et qu’aucune colonie indifférenciée n’est visible. Dans nos mains, les cultures sont généralement utilisées entre le 21e et le 35e jour.

Résultats

L’application réussie de ce protocole aboutit à une population enrichie de neurones induits présentant des caractéristiques moléculaires GABAergiques. La stratégie repose sur l’insertion ciblée d’une cassette ASCL1-P2A-DLX2 induisible par la doxycycline dans le locus AAVS1 (Figure 1A). Après sélection des hiPSC modifiés, l’induction par doxycycline est utilisée pour entraîner la différenciation neuronale GABAergique, comme indiqué ...

Discussion

La génération réussie des neurones GABAergiques repose fortement sur plusieurs étapes cruciales dans ce protocole. Le maintien de hiPSC de haute qualité et indifférenciés est primordial ; La différenciation spontanée avant la nucléofection réduit drastiquement l’efficacité d’intégration et la pureté neuronale^{en aval 8}. De plus, une détermination précise de la courbe de destruction de la puromycine est essentielle pour garantir l’élimination complète des cellules n...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	Pour l'électroporation/nucléofection des hiPSC.
6-well culture plates	Sarstedt	83.3920300	Plaques traitées pour la culture de tissus pour l'entretien et la différenciation des hiPSC.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78005	Protéine humaine recombinante pour la maturation neuronale; préparez selon les instructions du fabricant et utilisez à une concentration finale de 10 ng/mL.
Cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Utilisé pour le comptage des cellules.
Centrifuge	VWR	76468-134	Pour le pelletage cellulaire.
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i ou équivalent	Incubateur de culture cellulaire maintenant une température de 37 °C, une atmosphère humidifiée et 5% de CO2.
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	Fioles cryogéniques stériles pour la congélation des hiPSC; des cryotubes équivalents à filetage externe de 1,8–2,0 mL peuvent être utilisés.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	Bio-Techne	BME001-05	Matrice de revêtement BME standard utilisée dans le protocole. Vérifiez la concentration de stock spécifique au lot à partir du certificat d'analyse Bio-Techne et diluez dans DMEM/F-12 à une concentration de travail de 80 µg/mL.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	Milieu basal utilisé pour la dilution du BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich	D2650	Cryoprotecteur utilisé dans la préparation du milieu de congélation.
Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette	Custom plasmid	Addgene accession pending	Plasmid donneur AAVS1 personnalisé contenant la cassette ASCL1-P2A-DLX2 inductible par doxycycline et les éléments de sélection/rapporteur. Fournissez la carte du plasmide et la séquence complète en tant que fichier supplémentaire ou sur demande.
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Utilisé pour induire l'expression ASCL1-P2A-DLX2. Préparez une solution de stock stérile, aliquotez, protégez de la lumière, conservez congelé et utilisez à une concentration finale de 1 µg/mL.
Ethanol (70%)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Pour la stérilisation à l'intérieur de l'armoire de sécurité biologique; utilisez de l'éthanol à 70% approuvé par l'institution ou équivalent.
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve R4	Microscope utilisé pour l'imagerie en contraste de phase et en fluorescence de l'expression du rapporteur et de la morphologie neuronale.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78058	Protéine humaine recombinante pour la maturation neuronale; préparez selon les instructions du fabricant et utilisez à une concentration finale de 10 ng/mL.
hiPSC line PGP1	EditCo Bio	PGP1 human iPSC line	Ligne hiPSC humaine à consentement ouvert commercialement disponible utilisée dans ce protocole; enregistrez le numéro de passage et le statut de QC avant l'édition et la différenciation.
Image-analysis software	ImageJ/Fiji	Open-source; version used should be reported	Pour la quantification de la fluorescence et le traitement d'images représentatives.
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Utilisé dans la préparation du milieu de congélation.
Laminin-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Réactif de dépannage facultatif uniquement. N'est pas une partie du protocole de revêtement standard; peut être utilisé comme alternative ou matrice de double revêtement si la détachement neuronal persiste.
Liquid nitrogen dewar	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus ou équivalent	Stockage à long terme des hiPSC congelées en phase vapeur ou en azote liquide selon les procédures de sécurité cryogénique institutionnelles.
Mr. Frosty™ Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Pour la congélation à vitesse contrôlée des cellules à -80 °C.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	Milieu de maintenance sans nourrice pour les hiPSC.
Neuro-induction medium	STEMCELL Technologies	08582	Milieu de neuro-induction commercial utilisé pour l'induction neuronale précoce.
Neuro-maturation base medium (BrainPhys™ Neuronal Medium)	STEMCELL Technologies	05790	Milieu de base pour la maturation neuronale; complétez avec BDNF, GDNF, NT-3, doxycycline et PluriSln-1 comme décrit dans le protocole.
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)	STEMCELL Technologies	78074	Protéine humaine recombinante pour la maturation neuronale; préparez selon les instructions du fabricant et utilisez à une concentration finale de 10 ng/mL.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit	Lonza	V4XP-3024	Kit contenant la Solution P3 et les cuvettes pour la nucléofection des hiPSC.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiotique optionnel pour réduire le risque de contamination bactérienne.
Plasmocin™ prophylactic	InvivoGen	ant-mpp	Antibiotique optionnel pour prévenir la contamination par mycoplasmes.
PluriSIn-1	STEMCELL Technologies	72822	Inhibiteur de survie des cellules pluripotentes pour éliminer les hiPSC non différenciées; préparez le stock selon les instructions du fabricant et utilisez à une concentration finale de 20 µM.
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803	Antibiotique utilisé pour la sélection; préparez une solution de stock stérile, aliquotez, conservez congelé et déterminez la concentration finale de travail par courbe de mortalité, généralement 0,4–0,6 µg/mL.
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmid	Addgene	85802	Plasmide CRISPR/Cas9 utilisé pour le ciblage AAVS1; incluez la séquence gRNA AAVS1 dans la carte du plasmide ou les informations supplémentaires.
qPCR analysis software	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	QuantStudio Design & Analysis Software ou équivalent	Pour l'extraction de Ct et l'analyse RT-qPCR; rapportez la version du logiciel utilisée.
qPCR master mix	Thermo Fisher Scientific