Un modèle de surcharge de fer basé sur le citrate d’ammonium ferrique avec des relevés associés à la ferroptose dans les myoblastes C2C12

Résumé

Ici, nous présentons un modèle rapide de surcharge de fer à base de citrate d’ammonium ferrique dans les myoblastes C2C12 qui provoque une charge en fer, des modifications moléculaires associées à la ferroptose, et une perte précoce de viabilité sensible à la ferrostatine.

Résumé

La ferroptose est une forme dépendante du fer de mort cellulaire régulée, impliquée dans le vieillissement et les maladies dégénératives. Nous avions déjà constaté que les cellules souches musculaires vieillies accumulent du fer intracellulaire et subissent une mort ferroptotique lors de leur activation. Ici, nous décrivons un modèle simple in vitro qui utilise du citrate d’ammonium ferrique pour générer une surcharge de fer dans les myoblastes murins de C2C12. Le traitement au citrate d’ammonium ferrique a augmenté la charge ferrifère intracellulaire, comme le montrent des transcripts de ferritine lourde et légère à chaîne élevée, une augmentation de la protéine ferritine et un signal accru provenant d’un colorant de fer labile à cellules vivantes. L’exposition au citrate d’ammonium ferrique (FAC) a également entraîné des changements moléculaires associés à la ferroptose, notamment une augmentation de l’expression de Slc40a1 et Hmox1 et une réduction de la protéine peroxydase 4 de la glutathione. La diminution associée à la FAC de la glutathion peroxydase 4 a été partiellement inversée par la déféroxamine. À 12 heures, le citrate d’ammonium ferrique cytotoxique a réduit la viabilité cellulaire, et cet effet a été sauvé par la ferrostatine-1, compatible avec un composant sensible à la ferroptose de la mort cellulaire. À des moments ultérieurs, une variabilité accrue et une plage dynamique réduite du test limitent l’interprétabilité des mesures de viabilité. Ainsi, ce protocole fournit un modèle rapide et évolutif de la charge ferrique en fer médiée par le citrate d’ammonium ferrique, qui peut être utilisé pour étudier les réponses associées à la ferroptose et tester des interventions modificant le fer ou la ferroptose dans les cellules musculaires.

Introduction

La ferroptose est une forme de mort cellulaire régulée (DCR), moléculairement distincte des autres DCR. Il a été découvert pour la première fois à l’aide de l’érasteine, une petite molécule létale sélective pour le SRA (sarcome du rat), qui a été identifiée comme provoquant une mort cellulaire non^{apoptotique 1}. Dans leurs travaux fondamentaux, Dixon et al. ont d’abord décrit son mécanisme comme dépendant du fer, et ont ainsi inventé le terme ferroptose, signifiant « chute (mort) par le fer¹ ». Sur le plan moléculaire, la ferroptose se manifeste par une accumulation excessive de fer, une peroxydation lipidique accrue et une accumulation d’espèces réactives de l’oxygène, entraînant la mort cellulaire². Elle se distingue de manière unique du stress oxydatif et d’autres formes de RCD par son indépendance vis-à-vis de l’activation de la caspase, caractéristique de l’apoptose, et l’absence de la protéine kinase réceptrice interagissant phosphorylée 3 (RIPK3) et de la pseudo-kinase à domaine de lignée mixte (MLKL), qui ne sont observées que dans la nécroptose³. De plus, la ferroptose peut aussi être soulagée grâce aux antioxydants lipidiques ferrostatine-1 et liproxstatine-1, ainsi qu’au chélateur de fer^{déferoxamine 4}. Bien que la ferroptose soit similaire à d’autres types de RCD en ce que toutes aboutissent finalement à la mort des cellules, sa présentation la rend mécanistiquement distincte des autres formes de RCD.

L’étude de la ferroptose a gagné en popularité au cours de la dernière décennie, principalement grâce à des efforts continus sur le terrain pour identifier de nouvelles caractéristiques et développer de nouveaux outils pour étudier ses mécanismes sous-jacents et sa contribution aux maladies^{humaines 5}. Un corpus récent de preuves suggère que la surcharge de fer et la ferroptose sont des contributeurs peu étudiés à la fragilité liée à l’âge^{et à la sarcopénie 6,7,8}. Nous avons récemment montré que les cellules souches musculaires vieillies (MuSC) sont particulièrement sensibles à la mort ferroptotique résultant d’une inflammation chronique qui supprime un programme génétique antioxydatif par le silence^{épigénétique 9}. Nous avons constaté que les MuSC âgés accumulent un niveau aberrant de fer élémentaire intracellulaire, environ 30 fois supérieur à celui de leur homologue adulte. Bien que la ferroptose ait été associée à des maladies impliquant de nombreux organes et tissus — principalement ceux liés au vieillissement — son rôle physiologique reste incertain et mérite une investigation approfondie.

Bien que notre étude précédente ait montré que les MuSC vieillissants sont sensibles à la mort ferroptotique lors de leur activation, la contribution spécifique de la charge en fer à ce phénotype reste à clarifier. Ici, nous établissons un modèle simple de surcharge de fer dans des myoblastes de C2C12 traités avec du citrate d’ammonium ferrique (FAC) et nous demandons si un excès de fer est suffisant pour générer des modifications moléculaires associées à la ferroptose et une perte de viabilité sensible à la ferrostatine. Les cellules C2C12 fournissent un système progéniteur musculaire murien facile d’entretien, évolutif et facilement^{disponible 10}. Nous prévoyons que cette approche offrira une plateforme pratique pour étudier les réponses au stress provoquées par le fer dans les cellules musculaires et pour tester des interventions modifiant les phénotypes associés à la ferroptose.

Protocole

1. Préparation des cellules C2C12

1. Cellules de dégel
   REMARQUE : Toutes les étapes de la culture cellulaire doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité stérile.
   1. Préparez un tube conique contenant 9 mL de milieu complet tiède (milieu Eagle modifié de Dulbecco avec un taux élevé de glucose et pyruvate + 10 % de sérum fœtal bovin + 1 % de pénétocoque/streptococcique).
   2. Décongelez un flacon de cellules C2C12 congelées (~1 million) en ajoutant 800 μL de milieux complets préchauffés au flacon à partir du stock principal de mieux. Faites un pipet lentement.
   3. Une fois que le média ajouté à la fiole décongelante est froid, retirez-le et ajoutez-le au tube conique. Remplacez-le par le même volume de substrat chaud que le tube. Continuez à pipetter de haut en bas et à échanger le milieu jusqu’à ce que les cellules congelées soient remises en suspension.
   4. Pipoyez le contenu du flacon dans le tube conique de mieux. Inversez pour mélanger, puis ajoutez le contenu dans un plat traité en culture cellulaire de 10 cm. Incubez à 37 °C pendant 4 heures.
   5. Vérifiez les cellules au microscope pour vous assurer qu’elles sont attachées. Les cellules attachées apparaîtront allongées, tandis que les cellules flottantes sont circulaires et bougent lorsque la plaque bouge.
      REMARQUE : En supposant que les cellules plaquées soient saines, la plupart doivent être attachées.
   6. Aspirez le substrat pour éliminer les cellules mortes et les débris. Remplacez par 10 mL de milieux complets tièdes et retournez dans l’incubateur. Laissez-la incuber toute la nuit, ou jusqu’à ce que la plaque atteigne 80 % de confluence.
2. Ensemencement des cellules C2C12 pour le traitement au fer
   1. Une fois la confluence souhaitée atteinte, aspirez le milieu cellulaire. Ajoutez 2 mL de PBS goutte dans la plaque, en veillant à ce que toute la surface soit couverte ; aspirer.
   2. Ajoutez 2 mL de tripsine à 0,25 % dans les cellules. Incubez à 37 °C pendant 5 à 10 minutes, ou jusqu’à ce que les cellules se détachent. Une fois détachées, les cellules apparaîtront circulaires au microscope, et la trypsine ainsi que la suspension cellulaire seront troubles et épaissis.
   3. Neutralisez la trypsine en ajoutant 8 mL de DMEM complet et tiède. Utilisez une pipette sérologique pour bien mélanger la solution et laver la plaque. Transférez la suspension de la cellule dans un tube conique.
   4. Inversez doucement le tube 3 à 5 fois. Retirez le volume approprié et comptez les cellules en utilisant la méthode préférée (compteur cellulaire, hémocytomètre, etc.).
   5. Réaliser une suspension de cellules suffisante pour semer le nombre désiré de puits/plaques pour n = 3 pour chaque condition : plaque de 10 cm (pour western blot) : 100 000 cellules/plaque, plaque à 6 puits (pour qPCR) : 50 000 cellules/puits, plaque de 96 puits (pour la coloration de fer labile et luminescence) : 1 000 cellules/puits. Laissez les cellules incuber à 37 °C toute la nuit.
3. Application du traitement au fer sur les cellules ensemencées
   1. Le jour du traitement, ajouter du citrate d’ammonium ferrique (FAC ; formule = C₆H₁₁FeNO₇⁺³ ; MW = 265 g/mol) pour compléter le DMEM aux concentrations suivantes dans des conditions stériles : Sévère : 180 μM (0,0477 mg/mL), Cytotoxique : 1 800 μM (0,477 mg/mL).
      REMARQUE : Envisagez également d’ajouter des contrôles, incluant, mais sans s’y limiter au véhicule, la déferoxamine sévère + 150 μM (un chélateur de fer), le véhicule + 150 μM de déferoxamine, et/ou le véhicule + RSL3 (un inducteur de ferroptose ; contrôle positif. Il convient également de noter que le DMEM peut contenir une petite quantité de nitrite de fer (III) nonahydrate, une source de fer ferrique, à la base. Le lecteur doit interpréter les concentrations recommandées de FAC comme étant complémentaires à toute fonte ferrique déjà présente dans le milieu de culture du véhicule.
   2. Inversez pour mélanger jusqu’à ce que le FAC se dissolve dans un milieu complet.
      REMARQUE : Puisque le FAC est soluble dans l’eau, aucun DMSO ou solvant supplémentaire n’est nécessaire. L’ajout de FAC peut modifier le pH de la solution, donc si un changement drastique de couleur du milieu est observé, il est recommandé de mesurer le pH pour garantir la viabilité des cellules lors de l’ajout du milieu traité à la culture.
   3. Aspirez les milieux des cellules. Ajouter le même volume de milieux complets complétés en fer aux conditions de traitement, et de milieux complets non traités aux puits/plaques du véhicule. Incuber à 37 °C pendant la durée souhaitée avant de procéder au test de choix : test de fer labile : traitement FAC 2 h, qPCR et western blot : traitement FAC 12–24 h, test de luminescence : traitement FAC 12 h.

2. qPCR

1. Isolement de l’ARNm pour la qPCR
   ATTENTION : Le réactif d’extraction d’ARN et le chloroforme présentent des risques respiratoires. Manipuler uniquement dans une hotte à fumée en portant un équipement de protection adéquat (blouse de laboratoire, gants jetables résistants aux produits chimiques et protection oculaire).
   1. Au banc, aspirez le milieu des cellules. Lavez les cellules deux fois avec du PBS stérile et aspirez soigneusement tout liquide restant.
   2. Dans une hotte à fumée, ajoutez le réactif d’extraction ARN aux cellules dans les volumes suivants : plaque à 6 puits : 250 μL/puits, plat de 10 cm : 1 mL/antenne.
   3. En travaillant sur de la glace dans la hotte à fumée, utilisez un grattoir à cellules pour gratter doucement les cellules lysées. Veillez à gratter soigneusement toutes les parties de la plaque pour maximiser le rendement ARN.
   4. Pipetez le lysat dans des tubes microfuge stériles, prérefroidis et sans ARNase. Laissez-les reposer à température ambiante pendant 5 minutes.
   5. Pour chaque mL du réactif d’extraction, ajoutez 200 μL de chloroforme À L’INTÉRIEUR D’UNE HOTTE À FUMÉE. Secouez vigoureusement les échantillons pendant au moins 30 secondes pour combiner le réactif d’extraction et le chloroforme. Laissez-les reposer à température ambiante pendant 5 minutes.
      REMARQUE : Après ce temps, la séparation de phase aura lieu, avec la phase aqueuse claire (qui contient l’ARN) au-dessus.
   6. Centrifugez les échantillons pendant 15 minutes à 12 000 × g à 4 °C. Entre-temps, identifiez les nouveaux tubes autoclavés et ajoutez 500 μL (par mL de réactif d’extraction) d’isopropanol dans des tubes sur glace.
   7. Transférez uniquement la phase aqueuse dans chaque tube correspondant. Mélangez doucement par inversion, puis laissez reposer à température ambiante pendant 10 minutes. Si un faible rendement est attendu, ajoutez 2 μL de GlycoBlue pour visualiser la pellete.
   8. Centrifugez pendant 15 minutes à 12 000 × g à 4 °C.
      REMARQUE : L’ARN précipité peut être visible au fond du tube.
   9. Versez soigneusement l’excès d’isopropanol dans un bécher de déchets désigné. Ajoutez 1 mL d’éthanol de qualité moléculaire, 100 %, goutte à goutte sur le tube, en faisant attention à ne pas déloger la pellete. Centrifugez pendant 5 minutes à 7 500 × g à 4 °C.
   10. Verse de l’éthanol. Inversez les tubes et laissez le bouchon ouvert sur un essuie-tout. Laissez sécher le pellet jusqu’à ce qu’il soit dépourvu de gouttelettes (~15–30 min).
       REMARQUE : Le pellet peut devenir translucide si le GlycoBlue n’a pas été ajouté.
   11. Resuspendez le pellet dans 25 μL d’eau stérile sans ARNase. Quantifier la concentration d’ARN par spectrophotométrie UV-visible. Normaliser à une concentration uniforme entre les échantillons permettant un maximum de 1 μg d’ARN dans 16 μL par échantillon.
2. Synthèse de cDNA pour la qPCR
   REMARQUE : Effectuer toutes les étapes sur glace pour maximiser le rendement ARN/ADNc.
   1. Échantillons de dégel. Lavez la zone de travail avec un nettoyant RNAse.
   2. Ajouter 1 μg d’ARN de chaque échantillon à un tube de bande PCR correspondant.
   3. Ajoutez 4 μL du mélange d’ADNc à chaque tube. Si nécessaire, ajoutez de l’eau stérile pour atteindre un volume total de 20 μL. Faites passer les mélanges sous les paramètres suivants du thermocycleur : 25 °C pendant 5 minutes, 42 °C pendant 30 minutes, 85 °C pendant 5 minutes, 4 °C à l’infini.
3. Exécution de qPCR
   1. Diluez l’ADNc 1:10 dans de l’eau stérile avant d’effectuer d’autres réactions.
      REMARQUE : l’ADNc peut être congelé à -20 °C pendant 1 mois ou à -80 °C pendant 6 mois.
   2. Diluez les amorces à une concentration de 10 μM avec de l’eau stérile. Incluez les contrôles appropriés et/ou les gènes de ménage (par exemple, B2M, TBP1).
   3. Faites des mélanges maîtres pour chaque gène de ménage et gène d’intérêt afin qu’il y ait suffisamment de mélange de réaction pour faire passer chaque condition d’ADN en triple lière. La recette du master mix (par réaction) est la suivante : 2x mélange PCR : 10 μL, amorce directe (10 μM) : 1 μL, amorce inversée (10 μM) : 1 μL, eau stérile : 8 μL.
   4. Placez une plaque de réaction qPCR dans un bloc métallique refroidi à 96 puits. Ajouter 5 μL d’ADN c dilué à chaque puits d’échantillon et 20 μL de mélange maître de réaction à chaque puits. Inspectez chaque puits pour vous assurer que tous reçoivent le même volume, couvrez la plaque avec un scellant de plaques, et utilisez un outil à bord plat pour lisser les bulles.
   5. Centrifugez la plaque à 1 000 × g et 4 °C pendant 1 minute. Placez la plaque dans une machine qPCR, en vous assurant qu’elle est chargée dans la bonne orientation.
   6. Sur le logiciel qPCR, désignez les identités d’échantillon et de gène d’intérêt pour chaque puits. Envisagez de créer un modèle si vous prévoyez d’exécuter plusieurs réplications avec la même configuration.
   7. Exécutez le programme qPCR (durée : ~1:36 h) présenté dans le tableau 1.
   8. Exportez les résultats sous forme de fichier . CSV ou . Fichier XLSX. Si la machine qPCR utilisée permet à l’utilisateur de choisir les valeurs à exporter, vérifiez que les valeurs CT sont incluses dans le fichier exporté.
   9. Utilisez les valeurs moyennes de CT pour chaque condition et gène d’intérêt — comparées aux valeurs CT des gènes de maintien dans la condition correspondante — pour calculer le changement de pli de chaque gène. Normalisez le changement de pli de la condition du véhicule à 1,0.

3. Tache occidentale

1. Isolation de la protéine pour Western blot
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes sur la glace pour maximiser le rendement en protéines.
   1. Dans une armoire de biosécurité, aspirez un milieu de culture. Rincez les cellules avec suffisamment de PBS froid pour couvrir le fond de la plaque de culture. Aspire, puis recommence.
   2. Ajouter un tampon RIPA complété avec des cocktails inhibiteurs de protéase et d’inhibiteurs de phosphatase pour prévenir la dégradation des protéines. Utilisez 75 μL de solution RIPA pour la culture dans une plaque à 6 puits, ou 200 μL de solution RIPA dans une plaque de 10 cm.
   3. En travaillant sur glace, utilisez un grattoir à cellules pour détacher doucement les cellules lysées de la plaque. Prenez un soin particulier d’enlever les cellules de toutes les parties de la plaque, y compris les bords. La solution paraîtra claire et quelque peu visqueuse.
   4. Pipeter la suspension à cellules RIPA dans des tubes microfuge refroidis. Centrifugez les échantillons pendant 10 minutes à la vitesse maximale de 4 °C. Transférez le surnageant (le lysat de protéines) dans un tube pré-refroidi. Jetez la pastille.
   5. Quantifiez la concentration en protéines en effectuant un test de Bradford ou BCA. Normaliser les échantillons à 1 μg/μL dans de l’eau pure enrichie par cocktail sur glace enrichie par inhibiteurs de protéases et phosphatases.
   6. Diluez les lysats dans le tampon de Laemmli, garantissant ainsi l’uniformité des concentrations finales de protéines sur les échantillons. Faites bouillir des lysates à 95 °C pendant 10 minutes pour dénaturer la protéine. Pour de meilleurs résultats, utilisez pour le western blotting immédiatement après la préparation. Sinon, stockez les protéines dans Laemmli à -20 °C à court terme (≤ 1 mois) ou à -80 °C sur le long terme.
2. Préparation des gels d’acrylamide pour SDS-PAGE
   ATTENTION : L’acrylamide est une neurotoxine et ne doit être manipulée qu’en portant des équipements de protection appropriés (blouse de laboratoire, gants résistants aux produits chimiques et protection oculaire).
   1. Déterminez les protéines d’intérêt et leur taille en consultant le site web de l’entreprise concernant le(s) anticorps(s) à utiliser. Utilisez la taille prédite de la ou des protéines d’intérêt pour décider du pourcentage d’acrylamide que le ou les gels devraient contenir aussi.
      REMARQUE : 10 % à 15 % de l’acrylamide fonctionne bien pour la plupart des poids moléculaires.
   2. Assemblez le support de coulage gel et le cadre selon les instructions du fabricant.
   3. Pour le gel résolvant, combinez de l’acrylamide, de l’eau stérile, 1,5 M de tampon de tris/HCl pH8,8 et 10 % de dodécylsulfate de sodium dans un tube conique dans les volumes appropriés pour le nombre et le pourcentage d’acrylamide des gels à préparer, selon le tableau 2, qui liste les composants nécessaires pour 2 gels. Mélange par inversion.
   4. Ajoutez une solution de persulfate d’ammonium à 10 % et du TEMED au mélange. Inversez pour mélanger.
   5. Ajoutez immédiatement la solution au cadre de gel moulée, en remplissant jusqu’à ce que le volume de solution dans le cadre de gel soit juste en dessous de la quantité nécessaire pour atteindre le fond du peigne, si celui-ci devait être inséré.
   6. Ajoutez immédiatement 100 à 200 μL d’éthanol pur goutte dans le gouffre sur le gel durci. Si les lysats protéiques doivent être décongelés et/ou dénaturés, complétez cela pendant cette période d’incubation. Dégel les protéines sur glace.
      REMARQUE : Cela dispersera la solution afin que le gel ne durcisse pas de manière inégale.
   7. Une fois durci, versez l’éthanol. Pour le gel d’empilement, combinez de l’acrylamide, de l’eau stérile, 0,5 M de tampon de Tris/HCl pH6,8 et 10 % de dodécylsulfate de sodium dans un tube conique dans les volumes appropriés pour le nombre et le pourcentage d’acrylamide des gels à préparer, selon le tableau 2, qui liste les composants nécessaires pour deux gels. Mélange par inversion.
   8. Ajoutez la solution de persulfate d’ammonium à 10 % et le TEMED au mélange. Mélange par inversion.
   9. Ajoutez immédiatement la solution d’empilement au cadre de gel jusqu’à ce que le volume atteigne le sommet. Ajoutez le peigne gel immédiatement après avoir versé le gel. Laissez reposer ~ 1 heure ou jusqu’à ce que la forme des puits ne change pas lorsque le support de gel est légèrement bercé.
3. Gels de chargement
   1. Remplir la(s) chambre(s) d’électrophorèse avec un tampon de passage jusqu’à la ligne de remplissage appropriée pour le nombre de gels à utiliser.
   2. Transférez le cadre en gel avec les peignes encore à l’intérieur vers la chambre d’électrophorèse. Ajoutez plus de buffer de course dans l’espace entre les gels jusqu’à ce que ce réservoir soit plein. Retirez doucement les peignes des gels immergés.
   3. Pipette 5 à 10 μL d’échelle dans un puits de chaque gel.
   4. Pipetez 5 à 20 μL de protéines extraites et des échantillons tampon de Laemmli dans chaque puits. Ajoutez 5 à 10 μL de tampon de Laemmli 1x à tout puits vides.
      REMARQUE : Le volume que vous ajoutez peut nécessiter une optimisation en fonction de la prévalence de la ou des protéines d’intérêt et/ou de l’efficacité des anticorps.
4. Exécution de SDS-PAGE
   1. Connectez la chambre d’électrophorèse à une boîte électrique. Réglé pour fonctionner à 150 V pendant 45 minutes.
      REMARQUE : Selon la configuration, un temps supplémentaire ou une tension plus élevée peut être nécessaire pour que la migration complète se produise, donc ajustez si nécessaire.
   2. Une fois que la protéine a migré à l’extrémité du gel (là où le lanceur de gel et le cadre du gel se rejoignent au bas de l’appareil), arrêtez la course et éteignez le bloc d’alimentation.
5. Complétion du transfert de protéines
   REMARQUE : Cette section a été développée à l’aide d’un appareil de transfert rapide de protéines.
   1. Versez le tampon de transfert dans un bac gel. Ajoutez une pile de transfert, suivie d’une membrane de nitrocellulose et d’une autre pile de transfert au liquide pour former un sandwich avec la membrane au centre. Assurez-vous que la pile de sandwiches est complètement immergée dans le tampon de transfert.
   2. Allumez l’appareil de transfert rapide de protéines et sélectionnez le protocole approprié pour le nombre de gels et la taille de la ou des protéines d’intérêt.
      REMARQUE : 1,3 A et 25 V pendant 10 minutes ont été jugés efficaces, mais une optimisation peut être nécessaire.
   3. Retirez la pile de transfert supérieure avec des pinces et laissez l’excès de liquide s’écouler dans le bac de gel. Déplacez la pile vers l’appareil de transfert de protéines et posez-la aussi plate et droite que possible ; Utilisez un rouleau ou un tube conique pour lisser les plis. Répétez avec la membrane.
   4. Utilisez un outil à extrémité émoussée pour séparer doucement les moitiés supérieure et inférieure du cadre de coulée. Transférez le gel à la membrane de l’appareil de transfert de protéines.
   5. Utilisez des pinces pour soulever la pile de transfert restante du bac à gel. Évacuez l’excès de liquide, puis placez-le au-dessus de la membrane et de l’autre pile. Fermez la boîte à gel et lancez le programme.
6. Blocage et coloration avec des anticorps
   1. Ouvre la boîte de gel et utilise des pinces pour retirer la pile du dessus, puis enlève le gel. Confirmez qu’il y a des bandes provenant de l’échelle sur la membrane. Coupez la membrane pour n’inclure que la plage de taille qui vous intéresse.
   2. Transférez la membrane dans une boîte à blots propres. Ajoutez 5 mL de tampon de blocage, ou assez pour recouvrir la membrane. Bloquez sous agitation à température ambiante pendant 1 heure.
   3. En attendant, préparez-vous à la coloration par anticorps en ajoutant la concentration recommandée d’anticorps primaires à 5 mL d’albumine sérique bovine à 2 % dans un tampon de lavage par membrane. Colorez aussi pour les protéines de maintenance (c’est-à-dire GAPDH, β-actine).
   4. Retirez de l’agitation et versez le tampon de blocage. Ajoutez 5 mL de la solution primaire d’anticorps. Incuber dans l’obscurité sous agitation à 4 °C pendant la nuit (~12–16 h).
      REMARQUE : À l’avenir, toutes les étapes doivent être effectuées dans l’obscurité.
   5. Lavez la membrane 3 x 5 minutes sous agitation à température ambiante avec un tampon de lavage.
   6. Ajoutez la concentration recommandée d’anticorps secondaire à 5 % de BSA dans le tampon de lavage. Préparez 5 mL de solution pour chaque membrane.
   7. Verse l’excès de tampon de lavage. Ajoutez 5 mL de solution secondaire d’anticorps à chaque blot. Incubez dans l’obscurité sous agitation à température ambiante pendant 1 heure.
   8. Lavez la membrane 3 x 10 min sous agitation à température ambiante avec un tampon de lavage. Image immédiatement.
7. Détection et analyse des protéines d’intérêt
   1. Imagez les protéines en utilisant la plateforme de votre choix.
   2. Utilisez ImageJ ou une autre plateforme pour quantifier l’intensité de chaque bande d’intérêt.

4. Dosage de colorant labile au fer

1. Coloration labile par teinture de fer
   1. Compléter toute la section 1, ensemencer les cellules dans une plaque à 96 puits sous traitement au fer pendant 2 heures. Assurez-vous qu’il existe au moins trois puits pour chaque condition de traitement au fer, ainsi que des contrôles négatifs (véhicule ; milieu de culture + 150 μM du déferoxamine chélateur de fer) et positifs (milieu de culture + 180 μM FAC + co-traitement par colorant de fer labile).
   2. Préparez une dilution suffisante à 1:200 de la solution stock de 1 mM de colorant labile en fer dans un milieu sans sérum pour obtenir 200 μL par puits échantillon.
   3. Aspirez à partir du support culturel. Laver deux fois avec du PBS.
   4. Ajoutez la solution colorante à chaque puits et incubez pendant 1 heure à 37 °C.
   5. Laver une fois avec du PBS. Remplacez-le par PBS.
   6. Photographiez les cellules à l’aide du canal rouge lointain d’un microscope à fluorescence (646/662 nm). Sauvegardez et exportez les images sous forme de . TIF des fichiers.
2. Analyse des colorations
   1. Ouvrez les images dans ImageJ.
   2. Ouvrez la fenêtre de mesure en appuyant sur m. Dans la fenêtre de mesure, sous Résultats | Définir les mesures, sélectionner la surface, la densité intégrée et la valeur grise moyenne. Sélectionnez OK.
   3. Utilisez l’outil Polygone pour dessiner autour de chaque cellule de l’image. Appuyez sur m après chaque cellule pour ajouter les mesures à la fenêtre de mesure.
   4. Une fois toutes les cellules de l’image quantifiées, copiez-collez toutes les valeurs dans un tableur. Utilisez l’outil cercle pour effectuer au moins trois mesures de fond dans des zones non occupées par des cellules.
   5. Utilisez la formule suivante pour calculer la fluorescence totale des cellules corrigées (CTCF) pour chaque cellule :
      CTCF = densité intégrée – (aire de la cellule sélectionnée x valeur grise moyenne des lectures de fond)
   6. Comparez les valeurs CTCF des cellules traitées au fer à celles des cellules véhicules. Une augmentation du CTCF indique une augmentation des taux de fer labile.

5. Dosage de luminescence cellulaire

1. Traitement des cellules pour un test de luminescence
   1. Complétez la section 1, en vous assurant que le nombre de puits correspond à n = 3 pour chaque condition que vous souhaitez inclure. Ajoutez au moins trois puits de contrôle sans cellules (uniquement avec un support complet). 100 μL de cellules et de milieux au total doivent être ajoutés à chaque puits.
   2. Après avoir incubé les cellules non traitées toute la nuit, appliquez les traitements et contrôles selon les souhaits. Veillez à inclure une condition du véhicule (non traitée), des conditions avec FAC uniquement, cytotoxique + 10 μM ferrostatine-1 (agent anti-ferroptotique), véhicule + 1 μM RSL3, et/ou véhicule + 10 μM ferrostatine-1 + 1 μM RSL3. Incuber pendant la durée souhaitée (12 à 24 heures pour maximiser les effets du traitement tout en évitant une mort cellulaire excessive).
2. Complétion du test de luminescence
   1. Après le traitement des cellules, dégelez les composants tampons de luminescence à température ambiante. Combinez les composants nécessaires et conservez dans l’obscurité jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Voir les instructions du kit pour les besoins de stockage de température.
   2. Une fois le traitement terminé, suivez les instructions du kit pour traiter les cellules.
      REMARQUE : Cela inclura probablement un équilibre à température ambiante, suivi de l’ajout du tampon de luminescence et d’une période finale d’incubation courte à température ambiante. Une fois le tampon de luminescence ajouté, toutes les étapes doivent être effectuées dans l’obscurité.
   3. Complétez et enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques ou d’un instrument similaire.
      REMARQUE : Pour ce protocole, un temps d’intégration de 0,3 s a été utilisé.
   4. Normaliser les valeurs de luminescence des puits expérimentaux à la luminescence moyenne des puits de contrôle sans cellules.
      REMARQUE : Des valeurs de luminescence plus élevées indiquent un nombre plus élevé de cellules vivantes.

Résultats

Sur la base de travaux antérieurs de nos et d’autres, nous avons émis l’hypothèse qu’augmenter la quantité de fer extracellulaire générerait une surcharge de fer intracellulaire dans les cellules musculaires murines et nous permettrait de surveiller les réponses associées à la ferroptose en aval. Nous avons donc développé le flux de travail C2C12 décrit à la Figure 1, dans lequel les cellules étaient exposées à des concentrations définies de citrate d’ammonium ferrique pendant 2 à 24 heures, selon le test en aval.

La première étape pour valider notre modèle a été de confirmer que le FAC pouvait pénétrer dans les cellules. En utilisant les amorces validées décrites dans le tableau 3, nous avons réalisé la qPCR pour les chaînes lourdes et légères de la ferritine et déterminé que l’augmentation de l’apport de fer était corrélée à des niveaux élevés d’ARNm de ferritine (Figure 2A,B). Au niveau des protéines, une augmentation similaire des niveaux de ferritine était visible avec une augmentation de la concentration de FAC, bien que cela ne semblait pas dépendant de la dose (Figure 2C). De même, la coloration des cellules C2C12 vivantes traitées par FAC a montré que celles traitées avec une dose cytotoxique de fer — ainsi que celles traitées simultanément par la dose sévère et la coloration labile au fer en tant que contrôle positif — présentent visuellement et quantitativement un stockage de fer accru par rapport aux cellules non traitées et à celles exposées uniquement au chélateur de fer déferoxamine (DFO ; Figure 2D). Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que le fer introduit via le FAC dans le milieu cellulaire pénètre effectivement dans les cellules.

Une fois établi que la FAC augmentait la charge intracellulaire en fer, nous avons ensuite cherché à déterminer si la surcharge de fer s’accompagnait de changements moléculaires et fonctionnels associés à la ferroptose. Le FAC a augmenté l’expression de Slc40a1 (ferroportine) (Figure 3A) et Hmox1 élevé (Figure 3B). La FAC a également diminué la protéine GPX4, et cette réduction a été partiellement inversée par la déferoxamine (Figure 3C). Le traitement avec RSL3 a produit une réduction similaire de GPX4, situant la réponse FAC dans un contexte moléculaire plus large associé à la ferroptose. Sur le plan fonctionnel, une dose cytotoxique de FAC a réduit la viabilité basée sur la luminescence à 12 heures, et cette perte précoce de viabilité a été sauvée par la ferrostatine-1 (Figure 3D). En revanche, à 24 heures, la séparation entre les conditions devient moins marquée et plus variable (Figure 3E). Bien que les échantillons traités à la ferrostatine-1 restent élevés par rapport au FAC cytotoxique seul, la plage dynamique globale du test est réduite à ce stade ultérieur. Ensemble, ces données montrent que le traitement par FAC provoque une surcharge de fer, des modifications moléculaires associées à la ferroptose, et une réduction de la viabilité sensible à la ferrostatine dépendante du temps dans les cellules C2C12.

Figure 1 : Résumé graphique du modèle de surcharge de fer. Dans ce modèle, les cellules C2C12 sont ensemencées et laissées incuber toute la nuit avant le traitement avec diverses doses physiologiquement significatives de milieu de culture infusé au fer et une analyse moléculaire directe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Stockage accru de fer labile et synthèse de ferritine après l’ajout de citrate d’ammonium ferrique. Les niveaux d’ARNm de (A) chaîne lourde de ferritine et (B) chaîne légère de ferritine augmentent avec l’ajout de citrate d’ammonium ferrique dans le système. (C) Les niveaux de protéines FTH1 augmentent avec l’ajout de fer ferrique dans le système. (D) Les niveaux de fer labile augmentent dans les cellules C2C12 traitées avec du fer ferrique avant et en même temps qu’une coloration avec un colorant labile de fer rouge profond, par rapport au contrôle véhicule + déferoxamine. La condition de cotraitement indique un traitement simultané avec un milieu de culture + 180 μM de FAC + colorant de fer labile. Les barres d’erreur sont +/- SD. Abréviations : FTH1 = chaîne lourde de ferritine ; FTL1 = chaîne légère de ferritine ; DFO = déferoxamine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Modifications moléculaires associées à la ferroptose et réduction dépendante du temps de la viabilité cellulaire après l’ajout de FAC. Les niveaux d’ARNm (A) ferroportine (Slc40a1) et (B) Hmox1 augmentent après un traitement FAC. (C) La protéine GPX4 diminue après le traitement FAC et en présence du témoin positif RSL3 ; la déferoxamine inverse partiellement la diminution associée au FAC de GPX4. (D) Luminescence des cellules C2C12 après un traitement de 12 heures avec FAC, RSL3 et/ou ferrostatine-1, normalisée vers des puits sans cellules (uniquement en milieu). (E) Luminescence normalisée des cellules C2C12 traitées après un traitement de 24 heures avec FAC, RSL3 et/ou ferrostatine-1. Les barres d’erreur sont +/- SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Attendez la scène
1	Augmentez à 50 °C à 1,6 °C/s, maintenez pendant 2 minutes
2	Augmentez à 95 °C à 1,6 °C/s, maintenez pendant 10 minutes
Étape PCR (Run x 40)
1	Maintenez à 95 °C pendant 15 s
2	Baissez à 60 °C à 1,6 °C/s, maintenez pendant 1 minute
Étape de courbe de fusion
1	Augmentez à 95 °C à 1,6 °C/s, maintenez pendant 15 s
2	Baissez à 60 °C à 1,6 °C/s, maintenez pendant 1 minute
3	Augmentez à 95 °C à 0,15 °C/s, maintenez pendant 1 s

Tableau 1 : programme qPCR (durée : ~1:36 h) dans la section 2 du protocole.

	Gel de résolution			Gel d’empilement
Composant	10%	12.50%	15%
Acrylamide (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
Eau stérile (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Tris/HCl, 1,5 M pH 8,8 (mL)	4.2			-
Tris/HCl, 0,5 M pH 6,8 (mL)	-			1.25
10 % de dodécyle sulfate de sodium (μL)	166			50
0,1 g/mL de persulfate d’ammonium (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

Tableau 2 : Résumé des composants et volumes nécessaires pour une installation réussie des gels de résolution et d’empilement pour western blot. Les volumes fournis suffisent pour deux gels et peuvent être ajustés en conséquence. Les pourcentages indiquent la quantité d’acrylamide dans le mélange.  REMARQUE : APS et TEMED doivent être ajoutés en dernier et seulement lorsqu’ils sont prêts à être coulés, car ils déclencheront le processus de polymérisation en gel.

Gene Target	Symbole génétique	Fonction	Espèces	Séquence avant	Séquence inverse
Bêta-2-microglobuline	B2m	Gène de la maison	Mouse	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
Protéine de liaison boîte TATA	À suivre	Gène de la maison	Mouse	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Chaîne lourde de ferritine	FTH1	Sous-unité de la protéine de stockage du fer, ferritine	Mouse	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA
Chaîne légère de ferritine	Ftl1	Sous-unité de la protéine de stockage du fer, ferritine	Mouse	AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT
Héme oxygénase 1	Hmox1	Convertit la biliverdine en bilirubine en présence d’hémi, de CO2 et de fer ; Des niveaux élevés sont présents dans la ferroptose	Mouse	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ferroportine 1	SLC40a1	Transporte l’excès de fer hors des cellules	Mouse	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Tableau 3 : Liste des amorces qPCR validées pour le transport du fer et les gènes de ferroptose d’intérêt. Les amorces sont spécifiques à la souris en raison de leur utilisation dans l’ARNm provenant des cellules C2C12.

Discussion

L’objectif de cette étude était d’établir un modèle pratique in vitro de la surcharge de fer chez les progéniteurs musculaires murins et de définir des conditions dans lesquelles les réponses associées à la ferroptose peuvent être détectées de manière fiable. Grâce à ce flux de travail, nous montrons que le traitement au citrate d’ammonium ferrique conduit à une accumulation robuste de fer intracellulaire, accompagnée d’une expression accrue de la ferritine et d’un signal de fer labile élevé. La charge en fer est également associée à des changements moléculaires compatibles avec le stress lié à la ferroptose, notamment une augmentation de l’expression de Slc40a1 et Hmox1 et une diminution de la protéine GPX4. Sur le plan fonctionnel, l’exposition aux FAC cytotoxique induit une réduction de la viabilité cellulaire qui est sauvée par la ferrostatine-1 à des moments précoces, soutenant la présence d’un composant sensible à la ferroptose contribuant à la mort cellulaire observée.

La dose de fer et la durée du traitement sont des paramètres critiques qui influencent directement l’interprétabilité de ce système. Entre nos mains, les premiers moments (environ 12 heures) offrent la séparation la plus claire entre les conditions, permettant à la ferrostatine-1 de sauver la cytotoxicité induite par le FAC de manière reproductible. À des moments ultérieurs (par exemple, 24 heures), la viabilité globale diminue et la variabilité augmente selon les conditions, réduisant la plage dynamique du test. Cela est cohérent avec la perte cellulaire cumulative et l’adaptation de la population survivante, comme une capacité antioxydante accrue ou une manipulation modifiée du fer.

L’administration de fer ferrique (Fe³⁺) plutôt que de fer ferreux (Fe²⁺), ainsi que la concentration de fer administrée et la durée du traitement, sont également des aspects critiques du protocole. L’utilisation du fer ferrique est essentielle car le fer ferrique est facilement absorbé par la transferrine, le principal transporteur responsable de l’importation de fer^{ferrique 11}. Bien que le fer ferreux puisse être absorbé par d’autres transporteurs (notamment le transporteur métallique divalent DMT1), dans ce contexte, le fer ferrique semblait être incorporé plus efficacement que le fer^{ferreux 12}. Les concentrations de FAC choisies pour ce protocole ont été sélectionnées en raison de leur pertinence physiologique et de leur utilisation dans des modèles similaires^{passés 13,14}. La durée du traitement au fer, soit 24 heures, était également basée sur des modèles similaires de nous et d’autres. Cependant, dans certains contextes (notamment les tests de coloration labile sur le fer et la luminescence cellulaire), 24 heures s’avéraient être une durée de traitement trop longue. Dans ces cas, un traitement de 24 heures entraînait une mort cellulaire si importante qu’aucune conclusion n’a pu être tirée en raison de la destruction du matériel cellulaire. Par exemple, RSL3 est un agent de peroxydation lipidique si puissant qu’une durée de traitement de 12 h suffisait à induire la peroxydation lipidique tout en assurant simultanément que les effets de la surcharge de fer étaient visibles (Figure 3C-E). De plus, pour le colorant de fer labile, les cellules n’ont été traitées avec FAC que pendant 2 h avant la coloration (après avoir tenté de colorer après 2, 4 et 24 heures de traitements fer) afin de capturer la réponse initiale à la surcharge de fer avant que la destruction cellulaire excessive ne puisse survenir (Figure 2D). Dans l’ensemble, il semble que les changements au niveau des gènes et des protéines aient été mieux mesurés après 12 à 24 heures de traitement au fer, probablement parce que ces changements mettent plus de temps à s’activer aux cellules, tandis que la coloration était préférable après une durée de traitement plus courte.

D’autres ont développé des modèles similaires. Un groupe a généré un modèle C2C12 traité au fer ferrique pour étudier le rôle de l’axe p53-Slc7a11 dans la ferroptose. Ils ont constaté que le traitement par fer ferrique pendant 48 heures augmentait la peroxydation lipidique et diminuait les niveaux de Slc7a11 , indiquant une ferroptose¹³. Un autre modèle similaire — cette fois utilisant des cellules C2C12 traitées au sulfate de fer pour étudier la relation entre la voie de la ligase ubiquitine Akt-FoxO3-E3 et la ferroptose — impliquait un traitement par fer sur 4 h¹⁴. Un fil conducteur entre ces deux points est qu’ils impliquent un traitement au fer des cellules C2C12 différenciées en myotubes, plutôt que de rester dans leur état de myoblast plus proche de cellules souches. Cela rend notre système particulièrement pertinent pour l’accumulation de fer observée précédemment dans les MuSC.

Bien qu’il s’agisse d’une méthode simple pour étudier les effets de la surcharge de fer sur les muscles in vitro, la méthode présente des limites car elle n’a été utilisée que dans le contexte des cellules C2C12. Des travaux antérieurs ont montré que les cellules souches musculaires sont sensibles à la surcharge de fer pendant le vieillissement, ce qui suggère qu’une méthode similaire pourrait être valable dans ce^{contexte 9}.

Pris ensemble, ce modèle démontre que la surcharge de fer est suffisante pour induire un ensemble reproductible de changements moléculaires associés à la ferroptose et une réduction de la viabilité sensible à la ferrostatine dans les cellules C2C12. Bien que des tests orthogonaux supplémentaires puissent affiner davantage la classification de la mort cellulaire dans des contextes spécifiques, les réponses moléculaires et pharmacologiques combinées observées ici sont compatibles avec le stress cellulaire associé à la ferroptose. Nous prévoyons que cette approche facilitera des études mécanistes sur la dysrégulation du fer dans le vieillissement musculaire et les maladies.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Conserver à -20 °C. Décongeler sur glace.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Est une neurotoxine. Manipuler uniquement avec des EPI appropriés (blouse de laboratoire, gants, protection oculaire).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Agent polymérisant pour le coulage de gel d'acrylamide sous forme de solution à 10% poids/volume dans de l'eau stérile. Le poudre est stable à température ambiante, mais la solution doit être conservée à long terme à -20 °C et à court terme à 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Utiliser à une concentration de 1:2000 dans 2% BSA + tampon de lavage. Fonctionne à 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Suivre les instructions du fabricant pour l'utilisation. Soyez avisés que les standards doivent être conservés à 4 °C après une première utilisation.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Utiliser à une concentration de 1:1000 dans 2% BSA + tampon de lavage. Fonctionne à 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Utiliser dans la préparation du tampon de Laemmli.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Conserver à 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Conserver dans la phase vapeur de l'azote liquide.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Conserver à -20 °C. Décongeler sur glace.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Puisqu'ils sont plus grands, les utiliser pour l'extraction des cellules de plaques de 10 cm et plus.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Puisqu'ils ont une petite tête, ils sont mieux adaptés pour retirer les cellules des plaques à puits multiples.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Utiliser uniquement dans une hotte et éliminer les déchets dans un récipient séparé.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Dissoudre 1 comprimé dans 500 µL d'eau stérile pour créer une solution à 100×.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Modèle version CBS 170-120 V. Utiliser pour la culture cellulaire.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	Le DFO est un chélateur de fer, donc l'ajout à des cellules diminue la teneur en fer. Dissoudre dans l'eau pour une concentration en stock de 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Utiliser pour la coloration du fer labile et la reconstitution.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Ajouter à 5% BSA dans le tampon de lavage à un ratio de 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Ajouter à 5% BSA dans le tampon de lavage à un ratio de 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Préparer la solution de stock en ajoutant 50 µL de DMSO à un aliquot à température ambiante. Sensible à la lumière. Concentration en stock: 1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Séquestre les sous-produits de la peroxydation des lipides, inhibant la ferroptose in vitro. Dissoudre dans le DMSO pour une concentration en stock de 10 mM.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Utiliser pour suppléer le DMEM pour la culture cellulaire de C2C12. Ajoutée à 10% en volume.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Utiliser à une concentration de 1:1000 dans 2% BSA + tampon de lavage. Fonctionne à ~20 kDa.
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	Utiliser dans la préparation du tampon de Laemmli 6x.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Utiliser pour visualiser le pellet pendant la purification de l'ARN.
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	Prêt à l'emploi