Interprétation des variants cliniques avec l'Integrative Genomics Viewer (IGV) pour les pathologistes moléculaires

Résumé

Le logiciel Integrative Genomics Viewer (IGV) offre une interface riche et intuitive pour examiner les données sous-jacentes au repérage des variants cliniques. Nous présentons ici cinq vignettes illustrant comment distinguer rapidement les événements pathogènes réels des artefacts, renforçant ainsi la confiance diagnostique des praticiens réalisant l'interprétation moléculaire d'analyses de séquençage à haut débit.

Résumé

Le visualiseur génomique intégratif (IGV) est un outil essentiel en génomique clinique, permettant la visualisation et l'interprétation de données de séquençage complexes. L'application de connaissances cliniques combinée à l'évaluation visuelle des résultats de séquençage constitue le moyen principal par lequel les pathologistes moléculaires et autres professionnels évaluent et finalisent les cas. Divers outils logiciels peuvent aider, mais leur relation avec les données sous-jacentes doit être comprise et appliquée de manière systématique. Cette étude présente des notions fondamentales sur les types de fichiers de données de séquençage de nouvelle génération (NGS) (par exemple, FASTQ, BAM, VCF), accompagnées d'une discussion sur leur format et leur objectif. Nous décrivons ensuite les fonctionnalités d'IGV qui exploitent les subtilités de ces fichiers. Nous utilisons une série de cas pratiques sélectionnés selon des vignettes cliniques, au travers desquelles le lecteur interagira avec des données de séquençage NGS clinique à l'aide du logiciel IGV, afin d'examiner divers types de variants cliniquement pertinents par rapport au génome de référence humain. Ces vignettes cliniques ont été sélectionnées pour illustrer certains des aspects complexes de l'interprétation des données génomiques, et montrer comment l'utilisation d'IGV dans un flux de travail courant peut fournir des informations interprétatives supplémentaires sur les variants, allant au-delà des appels de variants générés par les algorithmes classiques de logiciels bioinformatiques. L'inspection visuelle des variants génomiques à l'aide des outils intégrés à IGV peut révéler des indices contextuels subtils (c'est-à-dire la fréquence allélique du variant, le biais de brin, le contexte tissulaire spécifique) susceptibles d'influencer l'interprétation des variants génomiques. Bien que cette étude se concentre sur l'utilisation d'IGV pour la détection et l'interprétation de variants somatiques, les applications proposées peuvent être étendues au contexte germinatif, notamment pour l'analyse de variants complexes et la détection de mosaiques.

Introduction

Les soins en oncologie ont été profondément transformés ces dernières années par l'utilisation des technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour guider le diagnostic, le pronostic et le choix du traitement¹. L'analyse par NGS est devenue la norme dans la prise en charge de plusieurs types de tumeurs afin de : 1) établir un diagnostic de tumeur définie sur la base de critères moléculaires, 2) utiliser les résultats de biomarqueurs indépendants du type tumoral pour orienter les décisions thérapeutiques, et 3) déterminer la stratification du risque pour des types tumoraux spécifiques^2,3. Des résultats précis et rapides issus des analyses par NGS et d'autres biomarqueurs sont devenus un élément essentiel de la prise en charge et de la planification thérapeutique des patients en oncologie.

Les tests de séquençage à haut débit (NGS) sont généralement effectués soit dans de grands laboratoires de référence, soit dans des laboratoires hospitaliers ou universitaires, lorsque les institutions disposent de l'expertise et des ressources suffisantes pour développer et maintenir ces tests. L'organisation Génomique pour les Laboratoires Universitaires (Genomics Organization for Academic Laboratories, GOAL) a été conçue comme un réseau collaboratif axé sur le partage des connaissances universitaires et des coûts de réactifs⁴. Un effort important du consortium GOAL a porté sur des séances de formation concernant les composantes essentielles à l'examen et à la rédaction de rapports d'études cliniques. Ces séances, conçues comme des ateliers pratiques, incluent un atelier interactif sur le visualiseur génomique intégratif (integrative genomics viewer, IGV) afin de démontrer ses fonctionnalités de base et avancées en médecine génomique.

IGV est un outil de visualisation de données conçu pour permettre aux utilisateurs d'examiner facilement les données de séquençage à haut débit (NGS) et d'autres grands ensembles de données, étant donné que la plupart des données NGS sont vastes et difficiles à manipuler sans interface graphique⁵. IGV n'a pas été initialement conçu pour l'analyse clinique des variants. Toutefois, en raison de sa facilité d'utilisation pour tous les professionnels en biologie moléculaire, quel que soit leur niveau d'expérience en bioinformatique, il a été largement adopté par de nombreux laboratoires dans le cadre des processus complexes d'examen des données⁶. Cette étude a été élaborée afin de diffuser ces informations à la communauté plus large des professionnels des laboratoires de génomique.

Le besoin clinique d'utiliser l'IGV dans le cadre d'un flux de travail clinique comprend la détection des erreurs de séquençage, la gestion des complexités liées à l'appel des variants génomiques et d'autres altérations récurrentes pour lesquelles une visualisation supplémentaire peut aider à une interprétation appropriée des données⁷. L'utilisation de l'IGV nécessite des fichiers bioinformatiques standards provenant d'une étude de séquençage à haut débit (NGS)⁸. Les fonctionnalités principales du logiciel IGV permettent la visualisation des données de séquençage et exigent la configuration d'un ensemble de préférences et d'options pour l'interprétation clinique des variants (Fichier supplémentaire 1).

Le flux de travail du séquençage en courtes lectures est caractérisé par les formats normalisés de fichiers FASTQ, de cartes d'alignement binaires (BAM) et d'appels de variants (VCF). Le séquençage à haut débit (NGS) atteint son grand débit en générant simultanément des millions de courtes lectures. Bien que cette stratégie accélère considérablement la production de données, chaque lecture ne constitue qu'un fragment de l'ADN ou de l'ARN d'origine. Elle est fixée à une position donnée sur la cellule d'écoulement (flow cell) du NGS par sa séquence adaptateur. Les informations de séquence et de qualité des bases issues du traitement optique sont enregistrées dans des fichiers FASTQ. Ces lectures brutes correspondent à des séquences de nucléotides accompagnées de leurs scores de qualité par base. Par conséquent, une des premières étapes du traitement des lectures brutes consiste à aligner chaque lecture sur un génome de référence⁸. Lorsqu'une position spécifique du génome de référence est attribuée à chaque lecture avec la probabilité d'alignement la plus élevée, les lectures correspondant à la même position s'accumulent ("pile up") à chaque locus, et ces données sont stockées dans un fichier BAM conformément aux spécifications du format de cartographie d'alignement de séquences (SAM) (disponibles à l'adresse https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf ; dernière vérification : 30/09/2025) (Figure 1A). Ces informations peuvent être examinées visuellement à l'aide d'un navigateur génomique tel qu'IGV. Comme illustré dans la Figure 1B, la comparaison des lectures entre elles ou avec la séquence de référence permet de détecter des différences ou des divergences entre les séquences de nucléotides. Les résumés uniquement de ces positions "variantes" couvrant l'ensemble du génome sont regroupés dans un fichier VCF, qui peut donc être beaucoup plus petit qu'un fichier BAM tout en contenant une grande partie des informations utiles nécessaires à l'analyse des variants. Pour cette raison, le fichier VCF constitue couramment la sortie finale des pipelines d'appel de variants (Figure 1C). Ainsi, tandis que les fichiers FASTQ contiennent les données brutes de lectures et de qualité, le fichier BAM fournit des informations sur la fiabilité avec laquelle ces lectures s'alignent sur le génome, et le fichier VCF représente les différences entre la séquence de référence et la séquence de l'échantillon, offrant une quantité de données beaucoup plus facile à analyser pour une éventuelle interprétation ou rapport.

Les six vignettes cliniques de cette étude illustrent des scénarios analytiques courants associés à la détection de variants somatiques dans les laboratoires moléculaires, ainsi que les problèmes qui compliquent la compréhension et l'interprétation correctes des données sous-jacentes. Dans l'ensemble, ces vignettes ont été choisies pour illustrer des scénarios interprétatifs de plus en plus sophistiqués et montrer comment l'utilisation de fonctionnalités avancées dans IGV permet de mieux décrire les caractéristiques génomiques complètes. Bien que cette étude se concentre sur l'interprétation des variants somatiques, ces fonctionnalités s'appliquent également à l'utilisation d'IGV pour la visualisation et l'interprétation des altérations germinales⁶. À noter que les termes utilisés dans cet article sont fondés sur la chimie de séquençage par synthèse et, le cas échéant, sur d'autres termes ou concepts analogues propres à d'autres plateformes.

Chaque vignette clinique commence par un bref contexte clinique, suivi d'instructions sur la manière d'analyser la ou les variantes et de répondre à la question suivante : quelle variante (le cas échéant) est réelle, et quelle variante (le cas échéant) est un artefact. Le contexte clinique, ainsi que les caractéristiques spécifiques des données de séquençage, sont essentiels pour répondre à cette question.

Protocole

Les données présentées ici sont un mélange de données de séquençage à haut débit (NGS) simulées et réelles provenant de patients. Cependant, toutes les données issues des patients sont désidentifiées par un mélange de suppression des étiquettes et d'extraction des lectures à un seul locus. Ce protocole suit les lignes directrices applicables du comité d'éthique de la recherche sur les êtres humains de toutes les institutions des auteurs.

1. Téléchargement de la version la plus récente de l'Integrative Genomics Viewer (IGV)

REMARQUE : IGV est un programme gratuit téléchargeable permettant de visualiser divers génomes, notamment le génome humain (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV est régulièrement mis à jour pour inclure de nouvelles versions de transcrits, de caractéristiques et de pistes, la version la plus récente apparaissant généralement en haut de la liste.

1. Téléchargez sur le bureau le fichier disponible à partir de l'adresse URL ci-dessus, intitulé « IGV pour Windows, Java inclus », ce qui peut nécessiter des identifiants administratifs selon l'établissement.
2. Sélectionnez la version du génome humain qui sera utilisée pour les analyses mentionnées dans les rapports (par exemple, hg19 ou hg38), disponibles dans IGV.
   NOTE : Cette étude a utilisé IGV 2.19.7. Dans ce protocole, la version pour Windows avec Java inclus a été téléchargée. IGV a été exécuté avec l'allocation de mémoire par défaut de 8 Go de RAM. Les paramètres recommandés dans l'onglet préférences d'IGV et d'autres sections d'IGV sont indiqués dans le Fichier supplémentaire 1.

2. Comprendre les vignettes cliniques et télécharger les fichiers nécessaires

1. Accédez au dépôt GitHub : Tous les fichiers sont disponibles au téléchargement dans le dépôt GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
   NOTE : Il existe un fichier de session dans le dépôt GitHub pour chaque vignette, et le chargement de ce fichier de session élimine la nécessité de charger les fichiers séparément et de naviguer vers le locus en question, car le fichier de session gère ces étapes.
2. Chargez un fichier de session via le menu Fichier. Cliquez sur Fichier > Ouvrir la session, puis sélectionnez le fichier de session approprié.

3. Configuration de la piste de couverture

REMARQUE : Dans IGV, la fenêtre principale comprend une "piste de couverture". Dans certains contextes, même une faible fraction de lectures contenant des variants spécifiques du cancer peut être cliniquement significative. Pour cette raison, il est essentiel d'obtenir une profondeur de lecture très élevée sur les régions du génome analysées. Si seulement 2 % des lectures contiennent un variant donné, une profondeur de lecture de plusieurs centaines, voire de milliers, peut être nécessaire pour appeler le variant de manière convaincante — d'où l'expression "séquençage profond".

1. Veiller à la présence de la piste de couverture : Dans le menu supérieur, cliquer sur Affichage > Préférences, puis sélectionner l'onglet Alignements. En haut de l'onglet, une case intitulée « Afficher la piste de couverture » doit être cochée. Vérifier qu'elle est bien activée.
2. Veiller à définir un seuil de variante à faible niveau cliniquement significatif : Accéder à l'onglet Alignements comme indiqué à l'étape 3.1 et faire défiler la page jusqu'à ce que la case intitulée Fraction allélique de la couverture soit visible. Saisir la valeur 0.01 dans cette case, puis cliquer sur Enregistrer (la fenêtre des préférences doit se fermer après avoir cliqué sur Enregistrer).

4. Configuration des lectures en soft-clipping

REMARQUE : Ce paramètre est extrêmement utile pour détecter des variants structuraux plus importants, tels que des réarrangements géniques, des modifications du nombre de copies ou des événements combinés d'insertion–délétion. Les vignettes avancées — comme celles axées sur les amplifications et délétions d'EGFR — montrent comment les lectures partiellement alignées peuvent confirmer la présence de variants structuraux qui pourraient autrement être manqués par les méthodes classiques d'appel de variants.

1. Activer les chevauchements souples : Dans le menu supérieur, cliquez sur Voir > Préférences, et sélectionnez le Alignements onglet. Faites défiler vers le bas jusqu'à la zone Afficher les bases en retrait et veiller à ce qu'il soit coché (Fichier supplémentaire 1) pour révéler les lectures partiellement alignées — celles dont les extrémités ne s'alignent pas proprement sur la référence et sont "rogné" éteint.

5. Vignettes cliniques

1. Vignette n°1 : Différencier une véritable variante pathogène de KRAS (homologue de l'oncogène viral du sarcome de Kirsten chez le rat) d'un artefact de séquençage.
   NOTE : Le cas A concerne un homme de 65 ans présentant un adénocarcinome pulmonaire nouvellement diagnostiqué, dont l'évaluation histologique a estimé environ 80 % de cellules tumorales. Le profilage par séquençage à haut débit (NGS) a révélé une variante KRAS NM_004985.5 c.34G>T (p.G12C), une mutation conductrice connue dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). La variante faux-sens résultante KRAS c.34G>T (p.G12C) est présente dans environ 13 % des adénocarcinomes pulmonaires et confère une éligibilité à des thérapies ciblées⁹. Le cas B concerne une femme de 54 ans atteinte d'un sarcome connu (environ 50 % de tumeur et 50 % de tissu normal). La même variante KRAS c.34G>T (p.G12C) a été identifiée dans cet échantillon. Toutefois, comme la variante KRAS c.34G>T (p.G12C) est rarement signalée dans les sarcomes, sa présence suscite une suspicion d'artefact de séquençage. 
   1. Procédure IGV (fichier de session KRAS.xml)             
      1. Charger les données : Sélectionner Hg19 dans le menu déroulant du génome, charger le fichier bam nommé kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, puis se rendre à l'adresse chr12:25 398 281–25 403 833 pour se concentrer sur la région du gène KRAS. Noter que le fichier d'index (ayant le même nom que le fichier bam, mais avec l'extension .bai) doit se trouver dans le même répertoire que le fichier bam.  
      2. Analyser la couverture et la fréquence allélique variant (VAF) : Examiner le codon 12 de l'exon 2 (NM_004985.5) et cliquer sur la position de la variante dans la piste de couverture pour afficher la profondeur de lecture à cette position. Observer une substitution G→T (événement de transversion) avec une VAF de 35 % à 40 %, fortement compatible avec une mutation conductrice clonale hétérozygote (Figure 2A), particulièrement dans un contexte de cellularité tumorale d'environ 80 %.   
      3. Rechercher un biais de brin : Colorer selon le brin (voir Document Supplémentaire 1, étape 4) afin de révéler une distribution quasi égale entre brin direct (rouge) et brin inverse (bleu) dans l'échantillon pulmonaire.  
      4. Répéter les étapes 5.1.1.1–5.1.1.3 pour le cas B, l'échantillon de sarcome : Charger le fichier bam nommé kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, puis noter une VAF <1 % et un soutien quasi exclusif par le brin direct, indiquant un artefact de PCR ou d'alignement (Figure 2B).
2. Vignette n°2 : Résoudre une mauvaise classification d'une variante multinationale (MNV).
   NOTE : Une femme de 50 ans atteinte d'un mélanome métastatique subit un profilage tumoral basé sur le NGS. L'analyse identifie une mutation potentielle BRAF (proto-oncogène B-Raf, kinase sérine/thréonine) c.1798_1799delinsAA. Bien que la mutation BRAF NM_004333.6 : c.1799T>A (p.V600E) soit plus fréquente dans diverses tumeurs solides, la mutation BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) est relativement spécifique du mélanome, car la lumière UV peut induire des transitions C>T au sein des dipyrimidines¹⁰. Selon les règles HGVS, deux variants ponctuels (SNV) en cis doivent être nommés comme une seule MNV. Dans de nombreux cas, un pipeline bioinformatique peut identifier incorrectement cette variante complexe comme deux SNV adjacents en cis : BRAF c.1798G>A et BRAF c.1799T>A. En raison de considérations techniques (liées au variant caller) et biologiques (distinction cis vs trans), il existe un risque que la mutation soit signalée incorrectement au moment de la validation, sauf si les données sont visualisées lors de l'analyse clinique.      
   1. Procédure IGV (fichier de session BRAF.xml)           
      1. Charger les données : Sélectionner Hg38 dans le menu déroulant du génome, charger le fichier bam nommé kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, puis se rendre à l'adresse chr7:140 453 136–140 753 336. Noter que le fichier d'index (ayant le même nom que le fichier bam, mais avec l'extension .bai) doit se trouver dans le même répertoire que le fichier bam.
      2. Zoomer sur le codon 600 de BRAF : Observer un changement dinucléotidique GT→AA basé sur les positions adjacentes de la piste de couverture, qui apparaissent vertes et bleues plutôt que grises, compatible avec p.V600K. 
      3. Parcourir à la recherche de deux SNV individuels pour déterminer s'ils sont en cis ou en trans : Noter que les deux SNV sont cartographiés sur les mêmes lectures et sont en cis.  
      4. Analyser le brin et la couverture : Colorer les lectures pour montrer un soutien quasi équilibré entre brin direct et brin inverse (voir Document Supplémentaire 1, étape 4), et une VAF dépassant 50 %, compatible avec une mutation conductrice clonale. Un seuil de couverture de 0,01 (voir Document Supplémentaire 1, étape 3 pour la configuration) garantit que les sous-clones partiels (s'ils existent) resteront visibles (Figure 2C).  
      5. Prendre en compte le contexte et la nomenclature des MNV : Les deux changements nucléotidiques sont adjacents. Selon le consensus d'experts, on désigne comme une seule variante "complexe" ou "delins" les SNV situés à moins de 50 pb l'un de l'autre et cartographiés sur la même lecture de séquence¹¹. 
3. Vignette n°3 : Étudier une insertion dans l'exon 9 de KIT (proto-oncogène KIT, récepteur à activité de tyrosine kinase) dans un tumeur stromale gastro-intestinale (GIST)
   NOTE : Un patient masculin de 58 ans atteint d'une tumeur stromale gastro-intestinale subit une résection, et un test NGS est prescrit. Les résultats montrent une variante possible dans KIT. Les mutations de KIT sont fréquemment conductrices dans les GIST, présentes dans environ 75 % des cas, et sont ciblables. Après les mutations activatrices de l'exon 11, les mutations activatrices de l'exon 9 de KIT sont les conductrices les plus fréquentes identifiées, bien que les GIST portant une mutation de l'exon 9 et ceux portant une mutation de l'exon 11 présentent des comportements différents en ce qui concerne la sensibilité aux inhibiteurs de la tyrosine kinase¹². 
   1. Procédure IGV (fichier de session KIT.xml)
      1. Charger les données : Sélectionner le génome Hg19, charger le fichier BAM nommé KITdupmod2.bam, et s'assurer que le fichier d'index (ayant le même nom que le fichier bam, mais avec l'extension .bai) est dans le même répertoire. Se rendre à l'adresse chr4:55 592 144-55 592 257, correspondant à une portion de l'exon 9 du gène KIT.
      2. Réduire la vue : Faire un clic droit sur la piste d'alignement et sélectionner Serré pour condenser l'affichage (Figure 3A).
      3. Localiser l'insertion : Identifier le marqueur d'insertion, en forme de flèche, immédiatement au-dessus de la piste de couverture, situé entre les positions 55 592 178 et 55 592 179, indiquant une courte insertion (Figure 3B,C).
      4. Interagir avec l'insertion : Cliquer sur la flèche pour agrandir la vue, puis cliquer sur l'une des lectures dont les bases comblent l'intervalle afin d'en afficher les détails dans une fenêtre contextuelle. Comparer la séquence insérée avec la séquence de référence pour déterminer s'il s'agit d'une duplication (Figure 3D,E).
      5. Examiner la couverture : Cliquer sur la piste de couverture immédiatement adjacente au marqueur d'insertion pour afficher le nombre de lectures soutenant l'insertion, qui peut être comparé au nombre total de lectures afin de déterminer la fréquence allélique variant (VAF) approximative, ici d'environ 28 %.
      6. Vérifier la présence d'un biais de brin : Trier les lectures par brin et visualiser les bases en « soft clip » (voir Document Supplémentaire 1, section 3) pour observer une région d'intérêt adjacente à l'insertion dans les lectures inverses (Figure 3F).
4. Vignette n°4 : Étudier une délétion de l'exon 19 de EGFR (récepteur du facteur de croissance épidermique) dans un cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).
   NOTE : Une femme de 70 ans atteinte d'un NSCLC nouvellement diagnostiqué subit une résection chirurgicale de la tumeur. Un NGS est prescrit sur un fragment de tissu contenant une pureté tumorale suffisante, et les résultats montrent une variante possible dans EGFR. De nombreuses mutations de EGFR sont sensibles aux inhibiteurs de la tyrosine kinase, et cette variante peut avoir un impact sur le traitement et le pronostic du patient¹³.
   1. Procédure IGV (fichier de session EGFR.xml)
      1. Charger les données : Sélectionner le génome Hg19, charger le fichier bam nommé EGFRE746_A750delmod.bam, s'assurer que le fichier d'index (ayant le même nom que le fichier bam, mais avec l'extension .bai) est dans le même répertoire, puis se rendre à l'adresse chr7:55 242 420-55 242 513, correspondant à une portion de l'exon 19 du gène EGFR.
      2. Étudier la délétion à l'aide de la piste de couverture : Examiner la piste de couverture pour identifier une petite région de couverture réduite, non située aux extrémités des lectures (Figure 4A,B). L'analyse de la piste de couverture révèle une couverture moindre sur une petite portion de l'exon 19.
      3. Étudier la délétion à l'aide des lectures : Agrandir la vue d'alignement pour afficher les lectures présentant un écart d'alignement, représenté par une ligne noire au sein de la lecture (Figure 4C,D).
      4. Prendre en compte le contexte génomique : Examiner la séquence nucléotidique de référence impliquée dans la délétion et dans la région immédiatement adjacente. Évaluer l'appel de délétion en tenant compte de la position dans la séquence de référence, car les délétions dans des régions homopolymériques ou répétitives peuvent représenter un artefact de séquençage, particulièrement lorsqu'elles sont présentes à faible fréquence allélique variant. Voir la section Visualisation d'une petite délétion du Document Supplémentaire 2 pour une description détaillée de la procédure.
5. Vignette n°5 : Étudier les altérations de EGFR chez une patiente atteinte d'un glioblastome.
   NOTE : Une femme de 77 ans atteinte d'un glioblastome de type sauvage IDH subit un test de séquençage à haut débit (NGS). Ses résultats indiquent un gain potentiel du nombre de copies d'EGFR et une réarrangement potentiel d'EGFRvIII (délétion des exons 2–7). Les deux altérations — amplification d'EGFR et altération d'EGFRvIII — ont une importance pronostique et thérapeutique dans le glioblastome. De plus, ces deux altérations coexistent fréquemment, ce qui signifie que la présence de l'une peut étayer la validité de l'autre lorsqu'elles sont détectées à de faibles niveaux.
   1. Procédure IGV (fichier de session copynumber.xml) :
      1. Charger les données : Sélectionner le génome Hg38, charger le fichier de segmentation nommé proband.seg et les échantillons comparateurs, c1.seg-c9.seg, en les glissant-déposant dans la fenêtre IGV. Se rendre au chromosome 7.
         NOTE : Les fichiers de segmentation générés par CNVKit sont fournis en téléchargement. La procédure complète d'utilisation de CNVKit pour générer la quantification du nombre de copies dépasse le cadre de cette étude. Brièvement, CNVKit version 0.9.9 (disponible à https://github.com/etal/cnvkit) a été utilisé avec une référence groupée prédéfinie constituée d'échantillons normaux euploïdes. L'entrée consiste en un fichier bed contenant 9 144 emplacements de sondes du squelette CNV, répartis sur l'ensemble du génome. Une considération importante ici est que les détails spécifiques des entrées et paramètres du pipeline de nombre de copies sont moins importants que le fait que tous les échantillons soient traités selon un protocole identique, ce qui facilite la reconnaissance des biais systémiques.
      2. Évaluer la carte thermique : Comparer l'intensité colorimétrique relative entre l'échantillon d'intérêt (localiser la ligne de la carte thermique correspondant à cet échantillon, étiquetée proband) et les autres échantillons (c1-9) afin de distinguer les véritables changements du nombre de copies des artefacts.
         NOTE : La comparaison visuelle verticale d'un locus entre tous les échantillons permet d'identifier des anomalies (différences qualitatives basées sur les différences de couleur entre les lignes plutôt que des différences quantitatives) à un locus donné dans chaque échantillon par rapport au fond. Se référer à la Figure 5 et à la section Visualisation des changements du nombre de copies du Document Supplémentaire 2 pour les étapes détaillées.
6. Vignette n°6 : Étudier EGFRvIII chez une patiente atteinte d'un glioblastome.
   NOTE : La même patiente présente également des signes d'un réarrangement d'EGFRvIII (délétion des exons 2–7). Les deux altérations — amplification d'EGFR et altération d'EGFRvIII — ont une importance pronostique et thérapeutique dans le glioblastome. De plus, ces deux altérations coexistent fréquemment, ce qui signifie que la présence de l'une peut étayer la validité de l'autre lorsqu'elles sont détectées à de faibles niveaux.
   1. Procédure IGV (fichier de session egfr_vIII.xml) :
      1. Charger les données : Sélectionner le génome Hg19, charger le fichier bam du patient nommé proband.bam, s'assurer que le fichier d'index (ayant le même nom que le fichier bam, mais avec l'extension .bai) est dans le même répertoire, puis se rendre vers le gène EGFR.
      2. Visualiser les points de cassure d'EGFRvIII : Ajuster l'affichage pour examiner individuellement les points de cassure candidats (en amont de l'exon 2 et en aval de l'exon 7 pour EGFRvIII), puis effectuer un tri par base  (ou utiliser le raccourci Ctrl-s sous Windows/Linux ou Cmd-s sous Mac) aux points de cassure pour visualiser les accumulations de lectures en « soft clip ».
      3. Aligner les lectures avec BLAT : Faire un clic droit sur une séquence en « soft clip » et sélectionner BLAT sequence (IGV utilise les paramètres par défaut de UCSC, voir https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html pour les paramètres par défaut de BLAT). Cliquer sur la première ligne et observer la piste Blat qui apparaît en bas de la section des pistes IGV.
         NOTE : Même une seule lecture s'alignant sur la jonction exon 1/intron 1 et sur la jonction intron 6/exon 7 peut suffire comme preuve d'EGFRvIII, à condition d'éliminer toute contamination croisée provenant d'un autre échantillon comme cause de cette lecture. Se référer à la Figure 6 et à la section Visualisation d'un réarrangement structural du Document Supplémentaire 2 pour les étapes détaillées.

Résultats

À noter, cette étude se concentre sur la description des nuances de l'analyse des variants dans IGV pour la rédaction de rapports cliniques. La rédaction finale du rapport clinique doit dépender du pipeline validé, des critères de qualité et de la politique de reporting propres à chaque laboratoire. Une discussion complète de ce sujet important dépasse le cadre de la présente étude ; toutefois, des normes et des lignes directrices recommandées ont été établies par le Collège américain de génétique médicale et de génomique et l'Association pour la pathologie moléculaire⁷ et sont régulièrement mises en œuvre dans les laboratoires cliniques.

Interprétation du cas clinique n°1 :

Étant donné la forte fréquence allélique du variant (VAF), la répartition équilibrée entre les brins et l'incidence connue du KRAS c.34G>T (p.G12C) dans le cancer du poumon (Figure 2A), le variant du cas A peut conduire à une thérapie ciblée et, à ce titre, est essentiel à signaler sur le plan clinique. Malgré une détection positive du même variant KRAS c.34 G>T dans le deuxième cas (sarcome) (Figure 2B), plusieurs signes d'alerte indiquent une fausse détection : (1) la fraction allélique du variant (VAF) rapportée est d’environ 1 %, bien inférieure à ce que l’on pourrait attendre pour un événement fondateur dans un échantillon dont la cellularité tumorale est estimée à 20 %, même faible, et (2) les lectures soutenant ce variant présentent un biais de brin, apparaissant presque exclusivement sur le brin sens. Conjointement à l’absence de plausibilité biologique pour ce type de cancer, les éléments disponibles suggèrent que la découverte dans le cas B est un artefact.

Interprétation du cas clinique n°2 :

Ce vignette illustre plusieurs erreurs distinctes dont les cliniciens doivent être conscients. Premièrement, les logiciels d'appel de variants peuvent, à juste titre ou non, identifier des variants génétiques adjacents soit comme deux SNV, soit comme un seul MNV (Figure 2C). Cela est dû à la différence dans la mise en œuvre de l'algorithme d'appel de variants prenant en compte l'haplotype dans les logiciels d'appel de variants somatiques. Seuls quelques logiciels d'appel de variants, plus récemment publiés, intègrent cette fonctionnalité^14,15. Deuxièmement, des variations techniques et nomenclaturales telles que celles-ci sont transmises à des bases de données externes par des centres de séquençage utilisant différents pipelines bioinformatiques. Elles peuvent donc contenir plusieurs descriptions différentes de ce qui devrait être répertorié comme un seul variant génétique. À moins qu'une phase de phasage des bases de données soit effectuée régulièrement, cela peut entraîner divers effets indésirables pour l'interprétation clinique ultérieure. Pris ensemble, ces sources possibles d'erreur peuvent concourir à produire un rapport erroné pour le patient. Ce scénario complexe souligne l'intérêt de la visualisation des variants à l'aide de logiciels de haute qualité tels qu'IGV.

Interprétation du cas clinique n°3 :

Étant donné la prise en charge multi-lecture pour la duplication et le mécanisme connu d'activation constitutive de KIT avec des duplications de l'exon 9 dans les GIST, on peut conclure que cela KIT la variante c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) est réelle et non un artefactFigure 3). Les mutations du gène KIT sont des facteurs oncogéniques fréquents dans les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST), présentes dans environ 90 % des cas. Une caractérisation précise des variants est essentielle ici, car bien que les mutations activatrices de l'exon 11 soient les plus fréquentes, les GIST portant des mutations de l'exon 9 présentent un comportement différent en ce qui concerne la sensibilité aux inhibiteurs de tyrosine kinase, modifiant ainsi l'approche thérapeutique. Étant donné l'importance clinique de KIT mutations dans les GIST, cette variante doit être incluse dans le rapport final.

Interprétation du cas clinique n°4 :

Étant donné la piste de couverture, l'apparence typique de petite délétion, le soutien des lectures et le mécanisme connu d'activation constitutive des délétions de l'exon 19 d'EGFR dans le CBNPC, on peut conclure que cette variante EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) est réelle et non un artefact (Figure 4). De nombreuses mutations d'EGFR, y compris cette délétion bien connue de l'exon 19, sont très sensibles aux inhibiteurs de la tyrosine kinase. Compte tenu de l'importance clinique des mutations d'EGFR dans les CBNPC, cette variante devrait être incluse dans le rapport final.

Interprétation du cas clinique n°5 et du cas clinique n°6 :

Les cartes thermiques confirment l'amplification de EGFR et la jonction de cassure entre les exons 1 et 8, évaluée à l'aide de BLAT, qui valide les deux découvertes chez ce patient (Figure 5 et Figure 6). L'amplification de EGFR est généralement considérée comme un facteur pronostique d'une maladie plus agressive, et le réarrangement du gène EGFRvIII est un biomarqueur spécifique du GBM et potentiellement ciblable^16,17.

Certains flux de travail peuvent être reproduits à l’aide de fichiers enregistrés dans la branche principale du dépôt GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (mis à jour le 6/9/2026), qui contient six fichiers de session, un pour chaque vignette, cinq paires de fichiers bam et bai, un pour chaque vignette utilisant un fichier d’alignement, et 10 fichiers seg pour la cinquième vignette, qui utilise des fichiers de segments plutôt que des fichiers d’alignement.

Figure 1 : Normes de fichiers de séquençage à haut débit (NGS) et flux de travail de séquençage. (A) Les courtes lectures générées sur une cellule de flux sont suivies par des mesures optiques et stockées au format FASTQ, qui inclut à la fois les données de séquence et les scores de qualité par base. Ces lectures sont ensuite triées et alignées sur un génome de référence, produisant un fichier BAM dans lequel chaque lecture est « empilée » à son locus correspondant. (B) Les différences entre le génome de référence et les lectures (par exemple, mutations ponctuelles, petites insertions/délétions) sont identifiées par des algorithmes d'appel de variants. (C) Enfin, les variants détectés sont regroupés dans un fichier VCF, qui résume leurs positions, les bases de référence et alternatives, ainsi que d'autres données d'annotation. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Visualisation basée sur IGV des variants KRAS c.34G>T (p.G12C) et BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (A) Visualisation d’un variant réel (KRAS c.34G>T (p.G12C)) dans IGV, montrant une profondeur de lecture élevée (des milliers de lectures) et environ 35–40 % des lectures portant un changement G→T. Les lectures sens (rouge) et antisens (bleu) sont équilibrées, suggérant une mutation hétérozygote authentique. (B) Artéfact suspecté dans un tissu non pertinent, présentant un variant avec un faible soutien par les lectures (1 % de fréquence allélique variant, VAF). La majorité des lectures du variant apparaissent sur le brin sens (rouge), indiquant un biais de brin. (C) Un variant complexe, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K), observé dans IGV, révélant une substitution de deux bases (GT→AA) en cis. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Visualisation d'une petite insertion. (A) La vue « écrasée » de l'exon 9 de KIT dans IGV permet d'identifier la région d'intérêt. (B) Région d'intérêt (cadre rouge) identifiée en visualisant la barre d'insertion et les bases en clips doux. (C) Réglage de la vue « Élargie » dans IGV pour permettre la visualisation de l'insertion. (D) Le clic sur la barre d'insertion (cadre rouge) affiche la séquence insérée. (E) La séquence insérée est comparée à la séquence de référence afin d'identifier les bases dupliquées. (F) Tri des lectures par brin lu, montrant que les bases en clips doux correspondent à l'insertion dans les lectures inverses. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Visualisation d'une petite délétion. (A) Vue « compressée » de l'exon 19 de EGFR, montrant la délétion présente dans de nombreuses lectures. (B) Utilisation de la piste de couverture pour examiner le nombre de lectures aux positions situées dans la région de la délétion et à proximité. (C) Vue « élargie » montrant la délétion et permettant d'identifier le nombre de bases supprimées. (D) La comparaison avec la séquence de référence (cadre rouge) permet d'identifier les bases délétées. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Visualisation d'un gain de nombre de copies. (AUn fichier seg contient six colonnes : identifiant de l'échantillon, chromosome, début, fin, nombre de marqueurs dans le segment et moyenne du segment.BLe chargement direct des fichiers seg dans IGV permet une visualisation pratique.C) Visualisation des données dans une vue à l'échelle du génome. Chaque échantillon apparaîtra sous forme d'une ligne de données, les couleurs indiquant les valeurs, le rouge pour >0 et bleu pour <0, les couleurs plus intenses reflétant des valeurs plus éloignées de 0. Après ouverture de l'échantillon d'intérêt et de neuf échantillons aléatoires provenant du même lot, les résultats apparaissent sous forme d'une carte thermique multiparamétrique comportant dix lignes. L'échantillon d'intérêt est mis en évidence en bas, dans le cadre rouge. (D) Rétrécir la vue vers les EGFR locus, une barre rouge apparaît dans l'échantillon d'intérêt en bas, tandis que des barres blanches ou bleues représentent les échantillons aléatoires. Cette différence de couleur entre l'échantillon d'intérêt et les échantillons aléatoires dans les autres lignes montre que l'appel d'amplification dans l'échantillon d'intérêt est supérieur au niveau de fond ou au bruit à ce locus.E) En élargissant la vue au chromosome 7, un contraste est observé entre le locus contenant EGFR dans notre échantillon et pas dans les échantillons aléatoires. Le EGFR l'amplification apparaît sous forme d'une fine bande rouge dans l'échantillon du bas.F) Rétrécir la vue vers les MET locus, l'amplification du gène MET est répliquée à des degrés variables parmi les neuf échantillons aléatoires ainsi que dans l'échantillon d'intérêt, suggérant que cet appel d'amplification est un artefact. Cela met en évidence la différence d'aspect entre un appel réel de nombre de copies au niveau du EGFR locus et un artefact. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Visualisation d'une réarrangement du gène EGFRvIII. Avant d'aborder ce cas, assurez-vous que la visualisation des bases en soft-clipping a été configurée (voir le Fichier supplémentaire 1 pour plus de détails). (A) Accédez au premier point de jonction candidat et définissez l'affichage de la piste d'alignement sur « Comprimé ». (B) Parcourez le locus en appliquant de manière itérative le raccourci de tri par base « contrôle-s », jusqu'à ce qu'un empilement de lectures similaires en soft-clipping devienne visible en haut de la piste d'alignement. Plus la quantité de lectures en soft-clipping similaires (encadré en rouge) est importante dans l'empilement, plus la confiance dans un réarrangement structurel est élevée. (C) L'outil BLAT extrait la séquence des bases en soft-clipping et identifie l'emplacement de cette séquence dans le génome, accompagné d'un score quantitatif mesurant le degré de similarité entre la séquence et une séquence cible spécifique dans une base de données. La sélection d'une ligne particulière permet de naviguer vers cet emplacement. (D) L'utilisation à nouveau de la fonction de tri par base « contrôle-s » met en évidence un empilement de lectures en soft-clipping, cette fois-ci sur le côté opposé des lectures. Pour confirmer qu'il n'existe aucune base supplémentaire dans l'échantillon par rapport à la référence hg38, effectuez un clic droit sur une lecture présentant une série de bases en soft-clipping, puis soumettez à nouveau ces bases en soft-clipping à l'analyse BLAT. Le tableau résultant affiche le premier point de cassure de la jonction, c'est-à-dire le locus initialement visualisé, correspondant à la jonction entre l'exon 1 et l'intron 1. (E) La sélection de la première ligne ramène au premier point de cassure. Les bases situées à la jonction de l'alignement de référence BLAT sont identiques aux bases en soft-clipping utilisées comme requête, indiquant que l'ensemble de la série de lectures en soft-clipping est intégrée dans l'alignement de la séquence de référence. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Configuration recommandée pour IGV.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Protocoles condensés.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L'analyse précise des variants pour les rapports cliniques dépend d'algorithmes bioinformatiques complexes et de l'intégration d'une revue visuelle des variants complexes à l'aide d'IGV^5,6. Cette étude a été conçue pour compiler une ressource concise des paramètres recommandés afin de visualiser les altérations génomiques simples et complexes dans IGV (Fichier Supplémentaire 1). Cette étude se concentre sur les altérations somatiques courantes et sur la manière de les examiner dans IGV.

Le protocole commence par l'évaluation d'une mutation par substitution simple (Figure 2A) et d'une mutation par substitution complexe (Figure 2C), en accordant une attention particulière à la détermination du caractère réel de la découverte identifiée par rapport à un artefact. Il aborde ensuite une insertion simple (Figure 3) et une délétion simple (Figure 4), en soulignant l'aspect de ces modifications dans IGV. Enfin, il traite des modifications génomiques complexes, notamment les altérations du nombre de copies (Figure 5) et les réarrangements structuraux (Figure 6). Des flux de travail condensés mettant en évidence les étapes clés pour chacune de ces caractéristiques sont résumés dans le Fichier Supplémentaire 2. Cette étude vise à familiariser le lecteur avec l'apparence des différentes altérations génomiques dans IGV⁵.

Notons que l'IGV n'est pas utilisé comme outil de pipeline pour détecter indépendamment des variants. Bien que cela dépasse le cadre de cet article, il est fortement recommandé aux laboratoires de recherche, et obligatoire pour les laboratoires cliniques, d'établir des politiques et procédures concernant les variants à déclarer en fonction des limites de validation des tests en ce qui concerne la fraction allélique des variants et la profondeur de couverture, la nécessité d'une confirmation orthogonale pour certains variants dans certaines circonstances, les complexités liées à la gestion des versions des logiciels de bioinformatique, ainsi que les variations inter-observateurs dans l'interprétation visuelle^1,7.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BLAT	Recherche BLAT dans le génome	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	Page web autonome BLAT. L'API BLAT est disponible dans IGV, aucune installation supplémentaire requise
CNVKit	GitHub	https://github.com/etal/cnvkit	Dépôt public GitHub contenant CNVKit, disponible gratuitement au téléchargement. Les instructions pour télécharger et exécuter CNVKit sont également disponibles ici.
Fichier de segments comparateur n°1 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur n°2 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur n°3 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur n°4 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur n°5 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur n°6 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur n°7 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur n°8 pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg	Fichiers de nombre de copies
Fichier de segments comparateur pour la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg	Fichiers de nombre de copies
Séquence du génome humain	Séquence du génome humain	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gz	Fichier fasta téléchargeable contenant l'assemblage du génome humain Hg38.  Ce fichier est disponible dans IGV, aucun téléchargement supplémentaire n'est nécessaire
Séquence du génome humain	Séquence du génome humain	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz	Fichier fasta téléchargeable contenant l'assemblage du génome humain Hg19. Ce fichier est disponible dans IGV, aucun téléchargement supplémentaire n'est nécessaire
Ensemble logiciel IGV	Logiciel IGV	https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exe	Version 2.19.7 du logiciel IGV avec Java (JDK 21), gratuit à télécharger. Ce lien est destiné à Windows, mais des liens pour Linux et Mac sont également disponibles.
Fichier de segments pour le cas de la vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg	Fichiers de nombre de copies
Dépôt GitHub du tutoriel	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main	Dépôt GitHub public contenant tous les fichiers nécessaires pour reproduire les six vignettes
Vignette n°1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml	Fichiers de session
Index bai de la vignette n°1, cas A	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam.bai	Fichiers d'alignement
Fichier d'alignement bam de la vignette n°1, cas A	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam	Fichiers d'alignement
Index bai de la vignette n°1, cas B	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam.bai	Fichiers d'alignement
Fichier d'alignement bam de la vignette n°1, cas B	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam	Fichiers d'alignement
Vignette n°2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml	Fichiers de session
Vignette n°2  index bai	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai	Fichiers d'alignement
Vignette n°2  fichier d'alignement bam	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam	Fichiers d'alignement
Vignette n°3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml	Fichiers de session
Fichier d'index bai de la vignette n°3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai	Fichiers d'alignement
Fichier d'alignement bam de la vignette n°3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam	Fichiers d'alignement
Vignette n°4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml	Fichiers de session
Fichier d'alignement de la vignette n°4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam	Fichiers d'alignement
Vignette n°4 index bai	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai	Fichiers d'alignement
Vignette n°5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml	Fichiers de session
Vignette n°6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml	Fichiers de session
Vignette n°6 index bai	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai	Fichiers d'alignement
Fichier d'alignement bam de la vignette n°6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam	Fichiers d'alignement