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Article de méthode

Fabrication et caractérisation de patchs à micro-aiguilles dissolvables chargés de 3BDO pour la repousse capillaire chez les souris C57BL/6

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DOI :

10.3791/71814

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25 août 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la fabrication, la caractérisation et l'application de patchs de microneedles biodégradables chargés en 3BDO pour la délivrance transdermique de médicaments dans un modèle de repousse des poils chez la souris.

Résumé

Les traitements conventionnels contre l’alopécie androgénétique (AGA) présentent des limites, ce qui motive le développement de nouvelles approches de délivrance. Ce protocole décrit la fabrication, la caractérisation et l’application de patchs de microneedles (MN) biodégradables chargés en 3BDO et composés d’acide hyaluronique/chitosane (HA/CS) dans un modèle murin C57BL/6 de repousse des cheveux. La méthode utilise un procédé de moulage en deux étapes dans un moule en polydiméthylsiloxane (PDMS) afin de concentrer le 3BDO au niveau des pointes des microneedles tout en formant une couche de soutien en HA/CS sans médicament. Le patch est caractérisé par microscopie électronique à balayage (MEB), essais mécaniques, tests d’insertion cutanée et de dissolution, tests de libération in vitro, tests antibactériens, essais de cytotoxicité et évaluation in vivo de la repousse des cheveux. Après insertion, les pointes des microneedles se dissolvent, libérant localement le 3BDO. L’évaluation in vivo a montré que le groupe traité avec les MN chargés en 3BDO présentait une repousse des cheveux plus uniforme que les groupes recevant une injection sous-cutanée ou le groupe témoin. Ce protocole permet également d’évaluer la morphologie du patch, ses performances d’insertion et sa biocompatibilité locale. Cette méthode fournit un flux de travail préclinique pour évaluer la délivrance par microneedles du 3BDO dans le cadre d’applications de repousse des cheveux.

Introduction

L’alopécie androgénétique (AGA) est l’un des troubles alopéciques cliniques les plus fréquents, caractérisé principalement par un amincissement progressif et une perte des cheveux du cuir chevelu. Sa prévalence au cours de la vie reste élevée chez les hommes, ce qui en fait un problème de santé majeur nécessitant une solution urgente1,2. Actuellement, les traitements cliniques de l’AGA sont principalement classés en deux catégories : les interventions pharmacologiques et la transplantation chirurgicale, chacune présentant des inconvénients notables. Les médicaments thérapeutiques de première intention, tels que le finastéride et la minoxidil, exercent certains effets bénéfiques, mais sont associés à des effets indésirables certains, tels que des troubles sexuels, des démangeaisons du cuir chevelu et une sécheresse du cuir chevelu1,3. Bien que la greffe de cheveux puisse permettre une régénération capillaire locale, elle est limitée par un coût élevé du traitement, une quantité insuffisante de cheveux dans les zones donneuses et des taux de survie des greffons variables, ce qui rend difficile sa diffusion généralisée en pratique clinique1. Compte tenu de ces limites, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant efficacité, sécurité et observance par les patients.

Le 3BDO est un activateur de mTOR de petite taille qui entre en concurrence avec la rapamycine4. Il est largement utilisé comme inhibiteur de l'autophagie dans divers systèmes5,6,7. Par exemple, un traitement prolongé par le 3BDO pourrait améliorer la fonction de la mémoire en réduisant le nombre d'autophagosomes8. De plus, des preuves croissantes suggèrent que le 3BDO pourrait agir indépendamment comme activateur de mTOR. Par exemple, le 3BDO a entravé la mort des cellules endothéliales et le développement de l'athérosclérose chez la souris, indépendamment de l'activité de mTOR9. Toutefois, son rôle potentiel dans la croissance des follicules pileux n'a pas encore été rapporté. De manière notable, dans nos études préliminaires, le 3BDO s'est révélé favoriser la repousse des cheveux. Cependant, les méthodes traditionnelles de délivrance topique des médicaments présentent des limites évidentes. Le stratum corneum de la peau limite l'efficacité transdermique, rendant difficile la délivrance des médicaments au site cible des follicules pileux dans le derme. Bien que les gels transdermiques puissent prolonger le temps de rétention du médicament, ils peuvent laisser des résidus indésirables. L'efficacité clinique des deux stratégies thérapeutiques mentionnées ci-dessus reste sous-optimale10,11.

Les microneedles (MNs) constituent une technologie innovante et indolore de délivrance de médicaments dont l'avantage principal réside dans leur capacité à pénétrer facilement le stratum corneum et à délivrer précisément des médicaments dans le microenvironnement périfolliculaire, à la jonction entre l'épiderme et le derme. De plus, les MNs se caractérisent par une utilisation pratique, une invasivité minimale et un coût raisonnable12,13,14. Afin de résoudre le problème de la délivrance transdermique du 3BDO appliqué localement, un patch de microneedles a été élaboré en utilisant l'acide hyaluronique (HA) comme matrice et le chitosane (CS) comme composant fonctionnel. L'incorporation du CS vise à conférer au système une fonctionnalité dotée d'un potentiel antibactérien. Par ailleurs, l'application de HA sur la peau de souris alopéciques peut stimuler de manière significative le développement des follicules pileux15. Ce protocole décrit donc la fabrication et la caractérisation d'un système de microneedles solubles chargées en 3BDO, ainsi que son application dans un modèle murin C57BL/6 dépilé pour l'étude de la repousse des poils. Ce modèle s'avère utile pour évaluer les réponses en matière de repousse des poils après dépilation, mais il ne permet pas à lui seul d'établir l'efficacité clinique dans l'alopécie androgénétique (AGA).

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Protocole

L'étude a été approuvée par le comité d'éthique pour l'expérimentation animale de l'Université médicale de Shandong & Académie des sciences médicales du Shandong (W202112030345). Toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux lignes directrices et réglementations en vigueur.

1. Fabrication de patchs 3BDO@MN

  1. Préparation de la formulation CS/HA
    1. Prélever 1 g de poudre de CS (degré de désacétylation ≥ 95 %) et l'ajouter à 20 mL d'eau distillée, puis agiter à température ambiante (TA) pendant 10 min.
    2. Ajouter progressivement 0,4 mL de solution d'acide acétique à 2 % (v/v) (masse moléculaire 60,05) et continuer à agiter pendant 2 h.
      ATTENTION : L'acide acétique concentré est corrosif. Réaliser la dilution et la manipulation sous hotte aspirante, et porter des gants jetables et des lunettes de protection afin d'éviter tout contact avec la peau et les muqueuses.
    3. Ajouter ensuite 2 g de poudre d'HA, puis centrifuger la formulation mixte à 1 207 × g (environ 3 000 tr/min) pendant 5 min afin d'assurer une dissolution complète.
      ​REMARQUE : La formulation CS/HA doit être préparée fraîchement et peut être conservée au réfrigérateur à 4 °C pendant un maximum de 24 h.
  2. Préparation de la formulation CS/HA chargée en 3BDO
    1. Ajouter la solution prédissoute de 3BDO (2 mg/mL) dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)
      ATTENTION : Le DMSO est perméable à la peau. Porter des gants pendant l'opération afin d'éviter tout contact cutané direct, puis ajouter la solution à la formulation CS/HA. Mélanger pour assurer une dissolution complète.
    2. Centrifuger la formulation mixte à 1 207 × g pendant 5 min afin d'éliminer les bulles d'air éventuellement piégées.
      ​REMARQUE : Si des bulles persistent après centrifugation, laisser reposer la formulation pendant 5 min, puis centrifuger à nouveau.
  3. Fabrication des patchs 3BDO@MN
    1. Utiliser un moule en polydiméthylsiloxane (PDMS) pour microaiguilles, comportant un réseau de 20 × 20 pointes coniques d'une hauteur de 600 µm, d'un diamètre de base de 250 µm et d'un pas de 550 µm.
    2. Traiter la surface du moule PDMS à l'aide d'un nettoyeur à plasma afin de la rendre complètement hydrophile.
    3. Ajouter 1 mL de la formulation 3BDO@CS/HA dans le moule PDMS. Placer le moule dans une chambre à vide et appliquer le vide pendant 10 min pour faciliter l'infiltration de la formulation visqueuse dans les microcavités.
    4. Centrifuger le moule à 134 × g pendant 5 min à température ambiante afin de garantir que la formulation remplit toutes les cavités. Utiliser un racloir métallique stérile pour retirer soigneusement l'excès de formulation de la surface du moule, en laissant un plan parfaitement plat.
    5. Déposer le mélange matriciel CS/HA sans 3BDO sur la surface du moule. Centrifuger à 134 × g pendant 5 min à température ambiante afin de former une couche de soutien uniforme.
    6. Placer le moule dans une étuve à 36 °C et 37 % d'humidité, et le laisser sécher toute la nuit (environ 12 à 16 h).
    7. Détacher le patch de microaiguilles complètement sec du moule après que celui-ci ait refroidi à température ambiante.
      REMARQUE : Conserver les patchs 3BDO@MN fabriqués au réfrigérateur à 4 °C jusqu'à leur utilisation.

2. Caractérisation des patchs 3BDO@MN

  1. Monter le patch 3BDO@MN préparé sur un support à l’aide d’un ruban adhésif conducteur en carbone double face.
    1. Recouvrir par pulvérisation cathodique l’échantillon monté d’une fine couche d’or (ou de platine) afin d’améliorer la conductivité électrique.
    2. Insérer le support de l’échantillon dans la chambre à vide d’un microscope électronique à balayage à émission de champ (MEB-EC).
    3. Régler la tension d’accélération et la distance de travail afin d’obtenir une imagerie haute résolution. Observer la morphologie globale du réseau et la topographie fine de la surface des MN individuelles.
    4. Acquérir des micrographies MEB représentatives. Mesurer la longueur des MN et le diamètre de la pointe.
  2. Essai de résistance mécanique
    1. Placer le patch MN à plat sur le plateau d’essai de l’analyseur de texture. S’assurer que le substrat est parfaitement plat et que les pointes des aiguilles sont orientées strictement vers le haut.
    2. Fixer solidement une sonde cylindrique plate (25 mm de diamètre) sur la cellule de charge de l’appareil.
    3. Abaisser la sonde verticalement jusqu’à ce qu’elle soit positionnée juste au-dessus des pointes des MN. Éviter tout contact physique entre la sonde et les pointes avant le début de l’essai.
    4. Régler les paramètres spécifiques de l’essai dans le logiciel : fixer la vitesse de descente à 0,05 mm/s et la distance de déplacement cible à 0,7 mm.
  3. Essai de dissolution
    1. Étaler la peau dorsale de rat sur un plateau de dissection et sécher la surface de la peau par tamponnement. Maintenir la peau à plat et sans plis.
    2. Placer les patchs MN secs, pointes des aiguilles vers le bas, sur la surface de la peau, puis appliquer une pression verticale uniforme afin d’assurer l’insertion des MN dans la peau.
    3. Retirer les patchs de la peau à des intervalles de temps prédéterminés (5, 10, 30 et 60 s) et les sécher pendant 5 min.
    4. Observer la morphologie résiduelle par MEB dans les mêmes conditions d’imagerie.
  4. Essais de libération du médicament in vitro
    1. Ajouter 500 µL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans chaque puits d’une plaque à 6 puits. Placer les MN chargés en 3BDO dans chaque puits de manière à ce qu’ils soient en contact avec le PBS.
    2. Incuber les plaques à température ambiante (RT). À chaque point temporel, prélever 500 µL de PBS pour la quantification de la concentration en 3BDO.
    3. Reconstituer immédiatement chaque puits avec 500 µL de PBS frais afin de maintenir des conditions d’écoulement.
    4. Calculer le pourcentage cumulatif de 3BDO libéré en fonction de la charge totale initiale de médicament dans les MN.
  5. Essais antibactériens
    1. Retirer les stocks cellulaires bactériens (E. coli et Staphylococcus aureus) du stockage à -80 °C, puis ajouter 10 µL de chaque stock bactérien dans 5 mL de milieu LB.
    2. Incuber le milieu inoculé dans un agitateur-incubateur à 37 °C et 250 tr/min pendant environ 16 h (pendant la nuit).
    3. Ajuster le milieu de culture bactérien avec du milieu LB à une OD620 initiale de 0,01.
    4. Effectuer une dilution de la solution mère de CS dans de l’eau stérile afin de préparer des solutions de CS à six concentrations (1, 5, 10, 50, 100 et 500 mg/mL), avec trois réplicats pour chaque concentration.
    5. Répartir les échantillons en trois groupes : groupe témoin, groupe contrôle et groupe CS. Pour le groupe témoin, ajouter 200 µL de LB. Pour le groupe contrôle, ajouter 180 µL de solution bactérienne et 20 µL d’eau stérile. Pour le groupe CS, ajouter 180 µL de solution bactérienne et 20 µL de la solution de CS correspondante à la concentration choisie.
    6. Incuber à 37 °C pendant 20 h.
    7. Mesurer et enregistrer l’OD620 de chaque puits de la plaque à 96 puits à l’aide d’un lecteur de plaques à absorbance, à 0 h et à 20 h.
  6. Évaluations de la cytotoxicité
    1. Ensemencer 100 µL de suspension cellulaire épidermique ou dermique dans une plaque à 96 puits (2 × 103 cellules par puits).
    2. Ajouter 10 µL des traitements respectifs dans les puits désignés afin de constituer quatre groupes : un groupe contrôle (milieu de culture), un groupe 3BDO (concentration finale de 1 µM), un groupe extrait MN et un groupe 3BDO+extrait MN, avec 3 réplicats pour chaque groupe.
    3. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 24 h.
    4. Ajouter 10 µL de solution de travail du kit Cell Counting Kit-8 (CCK-8) dans chaque puits.
      NOTE : Éviter la formation de bulles dans les puits, car elles pourraient fausser les mesures d’absorbance.
    5. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 2 h.
    6. Lire l’absorbance à 450 nm pour tous les puits à l’aide d’un spectrophotomètre microplaque.
    7. Analyser les données et calculer le taux de survie cellulaire.

3. Expériences sur les animaux

  1. Préparation et traitement des animaux expérimentaux
    1. Anesthésier des souris mâles C57BL/6 âgées de 7 semaines à l'isoflurane, et assurer une thermorégulation pendant l'anesthésie.
      ATTENTION : L'isoflurane est un anesthésique volatil. Travailler dans un environnement bien ventilé afin d'éviter une inhalation excessive.
    2. Appliquer un lubrifiant ophtalmique sur les yeux des souris pour les protéger du dessèchement.
    3. Raser les poils du dos des souris à l’aide d’un rasoir électrique, sur une surface d’environ 2 × 2 cm2.
    4. Appliquer la crème dépilatoire, attendre 5 à 10 secondes, puis l’essuyer. Nettoyer la peau avec un coton imbibé de solution saline afin d’éliminer tout résidu de crème dépilatoire et de poils.
    5. Couper les patchs MN et les mettre de côté.
    6. Répartir aléatoirement les souris rasées en cinq groupes (n = 5 par groupe) et traiter comme suit :
      1. Groupe témoin non traité : raser uniquement les poils sans aucun traitement supplémentaire.
      2. Groupe patch MN vide : traiter la peau rasée avec des patchs MN sans 3BDO, selon le même calendrier que le groupe 3BDO@MN.
      3. Groupe patch 3BDO@MN : traiter la peau rasée avec des patchs 3BDO@MN aux jours 1, 3, 5, 7, 9, 11 et 13.
      4. Groupe d’injection sous-cutanée de PBS : administrer une injection sous-cutanée de solution PBS quotidiennement sur la zone dorsale rasée des souris.
      5. Groupe d’injection sous-cutanée de 3BDO : administrer une injection sous-cutanée de solution 3BDO quotidiennement sur la zone dorsale rasée des souris.
    7. Placer les patchs 3BDO@MN sur la peau rasée, puis appliquer une pression verticale uniforme afin d’assurer l’insertion des MN dans la peau. Fixer les patchs 3BDO@MN à l’aide d’un bandage élastique et utiliser une pince droite pour maintenir le bandage en place.
      ​REMARQUE : Les différents schémas posologiques ont été choisis en fonction des caractéristiques de délivrance spécifiques à chaque stratégie : le patch 3BDO@MN assure une libération localisée et prolongée, tandis que l’injection sous-cutanée délivre le 3BDO sous forme de dose en bolus.
    8. Observer les souris tout au long de l’expérience afin de s’assurer qu’elles se réveillent complètement de l’anesthésie.
  2. Prélèvement des échantillons et évaluation de la repousse des poils
    1. Photographier quotidiennement la peau dorsale des souris afin de suivre la repousse des poils.
    2. Évaluer la repousse des poils en mesurant le diamètre du follicule pileux, la couverture capillaire et la densité des poils au jour 15. Quantifier le pourcentage de couverture capillaire dans la zone traitée à l’aide du logiciel ImageJ.

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Résultats

Ce protocole décrit la fabrication et la caractérisation du patch 3BDO@MN. Figure 1 présente le schéma du processus de fabrication du patch 3BDO@MN. Le 3BDO a été mélangé à la formulation CS/HA, puis le mélange matriciel a été ajouté au moule MN en PDMS et centrifugé pour remplir les extrémités des aiguilles. Le mélange matriciel CS/HA sans 3BDO a été ajouté à la surface du moule et centrifugé pour remplir la couche de soutien. Après un séchage complet, les patchs ont été dé...

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Discussion

Actuellement, les traitements cliniques de l'AGA sont principalement classés en interventions pharmacologiques et en greffes chirurgicales. Dans cette étude, les MN chargées de 3BDO ont favorisé la repousse des cheveux dans un modèle murin C57BL/6. Toutefois, les méthodes conventionnelles de délivrance de médicaments présentent des limites, telles qu'une distribution inégale du médicament. Le protocole clé de cette étude est une méthode en deux étapes pour fabriquer des MN chargées de 3BDO. L'HA et le CS sont les composa...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82273554), le projet de développement scientifique et technologique médical et sanitaire de la province du Shandong (n° 202304030716), le Programme national de formation à l'innovation et à l'entrepreneuriat pour étudiants universitaires de Chine (n° 202410439001) et le projet de développement de l'innovation scientifique et technologique de Tai’an (n° 2023NS232).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3BDOYuanye Bio-Technology Co., Shanghai, Chine890405-51-3Préparation de la formulation CS/HA chargée en 3BDO
Plaque 6-puitsCorning Incorporated, États-UnisREF 3516Essai antibactérien et essai de libération in vitro du médicament
Éthanol à 75 %Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.1202050004Désinfection
Plaque 96-puitsCorning Incorporated, États-UnisREF3599Évaluations de la cytotoxicité cellulaire et essai antibactérien
Souris C57BL/6Charles River Laboratories7 semainesExpériences animales
Kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8)Dojindo, JaponCK04Évaluations de la cytotoxicité
CentrifugeuseThermo Fisher Scientific75007204Centrifugation de la formulation
Chitosane (CS) Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd9012-76-4Préparation de la formulation CS/HA
Crème dépilatoireVeet3059944023307Dépilation
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd67-68-5Préparation de la formulation CS/HA chargée en 3BDO
Balance électroniqueRadwagAS 220.R2Pesée de poudre
Escherichia coli (E. coli)ATCC/Essai antibactérien
Poudre d'acide hyaluronique (HA)Bloomage Biotechnology Co. Chine9067-32-7Préparation de la formulation CS/HA
Logiciel ImageJNational Institutes of Health/Analyse statistique
Agitateur-incubateurThermo Scientific  50163013Incubation bactérienne
Vaporisateur d'isofluraneGene&IAMSAnesthésie animale
Milieu LBSigma Life ScienceL3022Essai antibactérien
Agitateur magnétiqueHangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.SP-16Agitation de la formulation
Spectrophotomètre microplaque Multiskan SkyHighThermo Fisher Scientific/Mesure de DO
ÉtuveShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9260ASéchage des microneedles
Parafilm MAmcor PM-996Fermeture des microneedles
Solution tampon phosphate (PBS)BiosharpBL302AEssai de libération du médicament in vitro
Staphylococcus aureus (S. aureus)ATCC/Essai antibactérien
Analyseur de texture universel TAShanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd/Essai de résistance mécanique
Chambre à videShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDZF-6050Séchage sous vide

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