Ce protocole décrit une méthode définie à base d’hydrogel pour générer des organoïdes mammaires humains qui récapitulent des caractéristiques clés de la morphogenèse mammaire dans un système de culture tridimensionnel contrôlé.
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Article de méthode
Une méthode définie à base d’hydrogel pour générer des organoïdes mammaires humains tridimensionnels qui récapitulent la morphogenèse mammaire
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Le développement de systèmes modèles humains physiologiquement pertinents qui récapitulent l’architecture tissulaire et la dynamique de l’état cellulaire reste un défi majeur dans l’étude du développement mammaire et des premiers événements de la carcinogenèse. Les cultures bidimensionnelles conventionnelles et de nombreux systèmes tridimensionnels ne parviennent pas à saisir l’organisation structurelle et les indices microenvironnementaux qui définissent la glande mammaire humaine. Ici, nous décrivons une méthode reproductible pour générer des organoïdes mammaires humains tridimensionnels à partir de cellules épithéliales primaires intégrées dans une matrice hydrogel définie composée de collagène de type I, laminine, fibronectine et acide hyaluronique. Ce système soutient la progression des cellules uniques à travers des étapes clés de la morphogenèse mammaire, incluant l’expansion des progéniteurs, le schéma épithélial, la formation de structures lobulaires terminales en forme d’unité, ainsi que l’émergence d’un compartiment mésenchymatique, sur une période de culture de 21 jours. Nous proposons un protocole étape par étape pour la préparation de l’hydrogel, l’ensemencement cellulaire et les conditions de culture. La méthode est compatible avec l’imagerie à haut contenu et l’analyse quantitative du nombre d’organoïdes, de la répartition de la taille et de la complexité architecturale. Cette plateforme permet des études mécanistes de la plasticité épithéliale et des perturbations environnementales, fournissant un système évolutif et biologiquement pertinent pour étudier les premiers changements tissulaires associés au risque de cancer du sein.
Introduction
Comprendre le développement des glandes mammaires humaines et les premiers événements qui prédisposent les tissus à la transformation maligne nécessite des systèmes expérimentaux qui récapitulent fidèlement l’architecture tissulaire, la hiérarchie cellulaire et la signalisation microenvironnementale. Bien que les cultures épithéliales bidimensionnelles aient fourni d’importantes perspectives mécanistiques, elles manquent du contexte structurel nécessaire pour modéliser l’organisation épithéliale et lamorphogenèse 1. Les systèmes de culture tridimensionnelles existants, y compris ceux basés sur des extraits de membranes basales, ont fait progresser le domaine mais restent limités par une composition variable, un contrôle incomplet des composants de la matrice extracellulaire et un soutien incohérent de l’architecture tissulaired’ordre supérieur 1. De plus, de nombreux systèmes organoïdes basés sur des extraits de membranes basales sont limités par leur incapacité à soutenir de manière cohérente l’émergence d’une organisationtissulaire 1. En particulier, de nombreux systèmes reposent sur des composants stromales exogènes plutôt que de permettre le développement endogène de microenvironnements de soutien, limitant ainsi leur capacité à modéliser les interactions épithéliaux–mésenchymates qui sont au cœur du développement tissulaire et des maladies. Ces limitations restreignent l’étude reproductible des processus développementaux, de la plasticité épithéliale et des effets des perturbations environnementales ou moléculaires sur l’organisation tissulaire.
Pour remédier à ces limites, nous avons développé un modèle d’organoïde mammaire humain tridimensionnel défini à base d’hydrogel qui permet aux cellules épithéliales primaires de générer des structures organisées au sein d’une matrice extracellulairedéfinie 2,3,4,5,8. L’hydrogel est composé de collagène de type I, de laminine, de fibronectine et d’acide hyaluronique, des composants sélectionnés selon leurs rôles établis dans le développement des glandes mammaires et la morphogenèse épithéliale. Ces molécules de matrice extracellulaire interagissent avec des récepteurs cellulaires distincts, notamment les intégrines, les récepteurs du domaine discoidin, CD44 et RHAMM, et sont connues pour réguler la polarité épithéliale, la morphogenèse ramifiée, le maintien des cellules souches, la mécanotransduction et l’organisation tissulaire dans la glandemammaire 6,7. Des études antérieures décrivant ce système hydrogel ont démontré que l’incorporation de ces composants de la matrice extracellulaire améliorait nettement la morphogenèse ductal-lobulaire et la maturation épithéliale par rapport aux conditions basées uniquement sur le collagène ou à base deMatrigel 3,8. De plus, les propriétés physiques de cette formulation hydrogel avaient été précédemment caractérisées par microscopie à force atomique, démontrant que l’hydrogel composite à matrice extracellulaire présentait une rigidité moindre et un gonflement accru par rapport aux gels uniquement en collagène (module de Young : 256,7 ± 20,0 Pa contre 559,2 ± 204,0 Pa, respectivement), ce qui correspond à un environnement matriciel plus tendre et plushydraté 8.
Il est important de noter que ce modèle soutient l’émergence d’un compartiment mésenchymatique qui apparaît aux côtés des structures épithéliales, fournissant un soutien structurel et de signalisation endogène qui reflète plus étroitement l’organisation tissulairenative 3. La pertinence physiologique de ce système hydrogel a été évaluée par comparaisons directes avec des cultures organoïdes conventionnelles à base de matrigel en utilisant à la fois des analyses morphologiques et transcriptomiques. Des études antérieures ont démontré que les cultures hydrogel soutenaient une formation plus organisée du tissu ductal-lobulaire et une différenciation multilignée que les cultures à base de Matrigel tout en préservant la réactivitéhormonale 8. Plus récemment, des analyses intégrées de séquençage d’ARN unicellulaire comparant des organoïdes dérivés de l’hydrogel, des organoïdes cultivés dans le Matrigel et le tissu mammaire humain primaire ont démontré que les organoïdes cultivés à l’hydrogel reproduisent plus fidèlement la hiérarchie épithéliale, la diversité cellulaire et les interactions épithélio-mésenchymatose présentes dans le tissu mammaire humainnatif 3. En revanche, les organoïdes cultivés dans Matrigel étaient enrichis pour des états basaux hybrides prolifératifs et manquaient de populations de type stromal, ce qui correspondait à l’auto-assemblage épithélial plutôt qu’à l’organogenèse dirigée.
Le protocole décrit ici fournit une méthode reproductible et évolutive pour générer des organoïdes à partir de tissu humain primaire, avec des étapes optionnelles pour l’épuisement et la dissociation des fibroblastes vers des cellules uniques. Parce que cette plateforme est compatible avec l’imagerie en direct, l’imagerie à haut contenu, l’analyse morphométrique quantitative, le suivi cellulaire et les études de perturbation génétique, elle peut être intégrée aux approches en aval évaluant le nombre d’organoïdes, la taille, l’architecture et la dynamique de croissance. Cette plateforme fournit donc un système biologiquement pertinent pour étudier le développement mammaire humain, la plasticité épithéliale, les interactions épithéliaux-microenvironnements et les réponses au niveau tissulaire face aux perturbations développementales, moléculaires ou environnementales.
Un aperçu schématique du flux de travail, incluant le traitement tissulaire, la préparation de l’hydrogel, la culture organoïde, la progression du développement et les analyses en aval, est présenté à la Figure 1, tandis que les morphologies organoïdes représentatives générées via cette plateforme sont montrées à la Figure 2.
Figure 1. Aperçu du flux de travail de génération d’organoïdes à base d’hydrogel. (A) Organigramme résumant le flux de travail du protocole, incluant la collecte de tissus, le traitement des tissus, la cryopréservation, la récupération et la préparation cellulaire optionnelle, la préparation à l’hydrogel, la culture d’organoïdes, le développement d’organoïdes et les applications analytiques en aval. (B) Schéma visuel illustrant les principales étapes du protocole de génération d’organoïdes à base d’hydrogel, incluant le traitement et la préparation des tissus, la récupération et la préparation cellulaire optionnelle, ainsi que la préparation à hydrogel et l’ensemencement des organoïdes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 2. Morphologies organoïdes représentatives générées dans le système hydrogel défini. Images représentatives en champ clair d’organoïdes dérivées de différents tissus humains cultivés dans la matrice hydrogel définie. Les organoïdes mammaires générés à partir de cellules épithéliales uniques dérivées de la mammoplastie de réduction ont été imagés au jour 21 de la culture. Les organoïdes de xénogreffe dérivés du patient générés à partir de fragments tumoraux ont été imagés au jour 16 de la culture. Les organoïdes glandulaires salivaires générés à partir de fragments épithéliaux ont été imagés au troisième jour de la culture. Les organoïdes rénaux générés à partir de fragments épithéliaux ont été imagés au 17e jour de culture. Barres d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocole
Les tissus primaires qui auraient autrement été jetés comme déchets médicaux après une intervention chirurgicale ont été obtenus conformément à toutes les lois pertinentes en utilisant des protocoles approuvés par les commissions d’examen institutionnelles du Maine Medical Center et du Tufts Medical Center. Tous les tissus ont été anonymisés avant le transfert et n’ont pas pu être retracés jusqu’à des patients spécifiques. Pour cette raison, cette recherche a obtenu le statut d’exemption par le Comité sur l’utilisation des humains comme sujets expérimentaux du Massachusetts Institute of Technology et des sciences de la santé de l’Université Tufts (IRB #13521). Tous les patients inscrits à cette étude ont signé un formulaire de consentement éclairé acceptant de participer à l’étude et de publier les résultats.
1. Traitement et préparation des tissus
REMARQUE : Effectuer toutes les procédures impliquant des tissus humains conformément aux directives institutionnelles en matière de biosécurité et d’éthique. Consultez les schémas de flux de travail présentés aux figures 1A et 1B pour un aperçu visuel des étapes du protocole et du flux de préparation des organoïdes avant le début de la procédure.
- Préparez le MEGM à l’aide d’un milieu basal épithélial mammaire complété avec 52 μg/mL d’extrait hypophysaire bovin, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique humaine, 5 μg/mL d’insuline, 500 ng/mL d’hydrocortisone, 1 % (v/v) de GlutaMAX, et 1 % (v/v) antibiotique-antimycotique (100X).
- Préparez le milieu de dissociation en ajoutant 1,5 mg/mL de collagénase A (stockée à −20°C) et 100 U/mL d’hyaluronidase (stockée à 4°C) au milieu de croissance épithéliale mammaire (MEGM).
- Recevoir du tissu mammaire humain obtenu par mastectomies prophylactiques et mammoplasties de réduction dans les 24 heures suivant l’excision, non fixé dans une solution physiologique tamponnée phosphate (PBS), et maintenu à 4°C. Pesez le tissu sur une balance de précision pour déterminer le poids total du tissu.
- Placez le mouchoir dans une armoire de biosécurité stérile. Réduisez mécaniquement le tissuen 3 à 5 mm 3 fragments à l’aide de scalpels stériles. Transférez environ 2 à 3 g de tissu haché dans un tube conique de 15 mL. Ajoutez 10 mL de médium de dissociation à chaque tube.
- Incubez les tubes à 37°C sur un rotateur orbital à 8 tr/min pendant 12 à 18 heures pour digérer enzymatiquement le tissu. Considérons la digestion comme terminée lorsqu’aucun gros fragment tissulaire ne subsiste et qu’une suspension homogène de matière uniformément fragmentée est visible dans tout le milieu.
- Laissez les fragments épithéliaux se déposer par gravité pendant 5 minutes. Confirmez qu’aucun fragment visible ne reste suspendu dans le milieu et qu’un comprimé distinct est présent. Décantez soigneusement et jetez le surnageant sans déranger la boule.
REMARQUE : Le surnageant contient des cellules stromales et des composants de la matrice, et peut être lavé et utilisé ou conservé pour d’autres études. - Resuspendez le granule dans un milieu de lavage de 10 mL contenant 5 % de sérum fœtal bovin (FBS) dans du PBS. Centrifugez à 250 × g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse à seau pivotant à température ambiante.
- Répétez l’étape de lavage trois fois supplémentaires ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair et débarrassé de débris visibles.
- Resuspendez le dernier pellet dans un milieu de congélation composé de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans du MEGM à un volume de 1 mL par gramme de poids tissulaire initial.
ATTENTION : Le DMSO est nocif au contact ou à l’inhalation. Utilisez l’équipement de protection individuelle approprié et utilisez une cagoule de sécurité chimique si les directives institutionnelles l’exigent. - Aliquote 1 mL de suspension dans chaque cryovial. Placez les cryovials à −80°C dans un récipient de congélation avant de les stocker à long terme dans de l’azote liquide.
REMARQUE : Cette étape représente un point de pause. Conservez les échantillons à −80°C avant de les transférer dans des conditions de stockage à long terme.
2. Récupération et préparation cellulaire optionnelle
- Dégel et reprise initiale
- Retirez les tissus cryopréservés de la réserve à −80°C après congélation pendant au moins 24 heures, ou du stockage à long terme de l’azote liquide. Immergez immédiatement le cryovial jusqu’au bouchon dans un bain-marie à 37°C et décongelez rapidement pendant 1 minute pour minimiser la mort cellulaire.
REMARQUE : Agitez doucement le cryovial pendant la décongélation pour assurer un réchauffement uniforme. - Une fois complètement décongelé, transférez immédiatement le contenu du cryovial dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de MEGM. Centrifugez à 250 × g pendant 5 minutes.
- Retirez les tissus cryopréservés de la réserve à −80°C après congélation pendant au moins 24 heures, ou du stockage à long terme de l’azote liquide. Immergez immédiatement le cryovial jusqu’au bouchon dans un bain-marie à 37°C et décongelez rapidement pendant 1 minute pour minimiser la mort cellulaire.
- Épuisement optionnel des fibroblastes
REMARQUE : La déplétion des fibroblastes par pré-plaque est une étape d’enrichissement optionnelle utilisée pour réduire les populations stromales ou fibroblastiques rapidement adhérentes lorsque l’on souhaite une population de départ plus enrichie en épithéliaux. Cette étape n’est pas nécessaire pour la formation des organoïdes et peut être ajustée selon l’objectif expérimental.- Réinjectez le pellet dans 10 mL de MEGM.
- Transférez le tissu en suspension dans un bol de culture cellulaire de 10 cm. Incubez à 37°C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ pendant 90 minutes pour permettre l’attache des fibroblastes.
REMARQUE : Ne pas déranger la cuve de culture pendant l’incubation afin d’assurer une adhérence efficace des fibroblastes. - Recueillez les cellules non adhérentes contenant du surnageant à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL tout en inclinant doucement la plaque de culture à environ 45°. Rincez doucement l’assiette avec 5 mL de PBS et mélangez le rinçage avec le surnageant collecté.
- Centrifugez la suspension combinée à 250 × g pendant 5 minutes pour récupérer le matériau enrichi en épithélial.
REMARQUE : Les cellules adhérentes à la plaque sont enrichies en fibroblastes des glandes mammaires, et peuvent être propagées séparément en ajoutant un milieu composé de DMEM + 10 % de FBS et d’antibiotiques.
- Dissociation optionnelle aux cellules uniques
- Resuspendez le pellet dans 500 μL de solution enzymatique de dissociation préchauffée (37°C) composée de 0,25 % de trypsine. Les réactifs de dissociation alternatifs peuvent nécessiter une optimisation. Transférez la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Triturez l’échantillon 20 fois à l’aide d’une pipette P1000 pour favoriser la dissociation.
ATTENTION : Les réactifs de dissociation enzymatique peuvent être nocifs. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié et évitez le contact visuel ou de la peau. - Incubez le tube à 37°C pendant 3 à 5 minutes. Dissociez mécaniquement l’échantillon immédiatement après l’incubation en triturant 20 fois à l’aide d’une pipette P1000.
- Ajoutez 1 mL de lave-lavage contenant du sérum pour neutraliser la réaction enzymatique. Centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes.
- Resuspendez le pellet dans une solution de dispase de 300 μL (5 U/mL) et une solution de DNase de 30 μL (1 mg/mL). Incubez à 37°C pendant 3 à 5 minutes.
- Dissociez mécaniquement l’échantillon en pipettant 15 à 20 fois. Ajoutez 700 μL de laver contenant du sérum à la suspension.
- Filtrez la suspension de cellules à travers un filtre de 40 μm dans un tube propre. On peut utiliser soit une passoire standard à cellules de 40 μm, soit une tamoire à pointe de pipette Flowmi. Les filtres Flowmi peuvent réduire la perte d’échantillons lorsqu’on travaille avec un nombre limité de cellules.
- Déterminer le nombre cellulaire viable en utilisant l’exclusion du bleu de trypan. Mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec du bleu de trypan à un ratio 1:1 et chargez 10 μL du mélange dans une chambre de comptage cellulaire ou une lame de comptage. Déterminez la viabilité cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
- Centrifugez la suspension à 500 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
- Resuspendez la granule cellulaire dans le MEGM à la concentration souhaitée pour l’ensemencement de l’hydrogel.
REMARQUE : Pour les expériences d’ensemencement monocellulaire, les entrées typiques varient d’environ 1 000 à 5 000 cellules par hydrogel de 200 μL, selon l’objectif expérimental et les caractéristiques de l’échantillon du donneur. Les densités de semis plus faibles sont généralement utilisées pour l’imagerie en temps réel et les études de morphogenèse afin de faciliter le suivi du développement individuel des organoïdes, tandis que les densités plus élevées sont couramment utilisées pour les analyses moléculaires finales, y compris la collecte d’ARN et de protéines.
- Resuspendez le pellet dans 500 μL de solution enzymatique de dissociation préchauffée (37°C) composée de 0,25 % de trypsine. Les réactifs de dissociation alternatifs peuvent nécessiter une optimisation. Transférez la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Triturez l’échantillon 20 fois à l’aide d’une pipette P1000 pour favoriser la dissociation.
3. Préparation de l’hydrogel et ensemencement des organoïdes
- Préparation des stocks et calculs de volume
- Placez la solution de laminine (1,18 mg/mL), la solution d’acide hyaluronique (1 mg/mL dans de l’eau stérile), la solution de fibronectine (2 mg/mL dans de l’eau stérile) et la PBS 1× sur de la glace avant utilisation. Stockez les aliquotes de laminine et de fibronectine à −80°C et stockez la solution d’acide hyaluronique à 4°C. Décongelez lentement les composants gelés sur la glace à 0°C–4°C avant utilisation.
- Préparez une solution de supplément extracellulaire à matrice extracellulaire à 25 ×. Pour préparer 1 mL, combinez 425 μL de laminine, 250 μL d’acide hyaluronique, 250 μL de fibronectine et 75 μL de PBS dans un tube maintenu sur glace. Mélangez doucement en inversant le tube 3 à 4 fois. Conservez la solution à 4°C pendant jusqu’à 1 mois.
- Déterminez le volume et la composition finale de l’hydrogel souhaités avant la préparation. Préparez au moins 20 % de volume excédentaire pour compenser les pertes de matériaux lors du pipetage et du transfert.
REMARQUE : La formulation hydrogel se compose de collagène I, d’une concentration finale de 1× de compléments de matrice extracellulaire (provenant d’un stock de 25×), et de 12,5 % (v/v) d’hydroxyde de sodium de 0,1 N par rapport au volume de collagène I pour la neutralisation du pH et la polymérisation.
REMARQUE : Les concentrations finales d’hydrogel sont 1,7 mg/mL de collagène I, 20 μg/mL de laminine, 20 μg/mL de fibronectine et 10 μg/mL d’acide hyaluronique. - Calculez le volume requis de collagène I (V) en utilisant la formule suivante :
Ici, Cfinal = 1,7 mg/mL, Vtotal correspond au volume final d’hydrogel souhaité, et Cstock est la concentration de la solution de collagène. Utilisez des concentrations de stock de collagène comprises entre 2 et 12 mg/mL.
REMARQUE : La concentration de stock de collagène peut varier selon les lots. Des concentrations plus élevées augmentent la viscosité et doivent être pipettées lentement. - Calculez le volume de 0,1 N sodium hydroxyde (V NaOH) en utilisant la formule suivante :
VNaOH = 0,125 x V collagène
Préparez une solution de travail à 0,1 N hydroxyde de sodium en diluant 1 N d’hydroxyde de sodium dans de l’eau stérile. - Calculez le volume du supplément de matrice extracellulaire (VES) à l’aide de la formule suivante :
- Calculez le volume restant à remplir avec le milieu de croissance en utilisant la formule suivante :
Milieu de croissance V = V total - (Vcollagène + VNaOH + VES + V-cellules / tissu)
REMARQUE : Déterminez le volume de cellules ou de fragments de tissu pour chaque expérience individuellement. Utilisez une plage typique de 10–100 μL dans le volume autorisé. Le comptage précis des fragments n’est pas effectué car la taille et la composition des fragments varient considérablement entre les préparations. Standardiser l’ensemencement par une évaluation visuelle de l’abondance et de la distribution des fragments.
- Préparation du mélange maître hydrogel
- Placez le collagène I, le supplément de matrice extracellulaire, l’hydroxyde de sodium (0,1 N) et le milieu de croissance sur la glace à 0°C–4°C. Maintenez tous les composants à basse température pour éviter une polymérisation prématurée.
- Ajoutez le volume calculé de collagène I dans un tube de microcentrifuge refroidi.
- Ajoutez le volume calculé de milieu de croissance pré-refroidi à la solution de collagène.
- Ajoutez le volume calculé de 0,1 N hydroxyde de sodium pour neutraliser la solution.
REMARQUE : L’optimisation précédente a établi que ces conditions produisent le pH du gel approprié ; par conséquent, un test de pH de routine du mélange hydrogel n’est pas requis.
REMARQUE : Effectuez rapidement toutes les étapes suivantes pour prévenir la polymérisation prématurée du collagène. - Mélangez la solution en secouant vigoureusement le tube à un rythme d’environ un secouement par seconde pendant au moins 6 secousses.
- Ajoutez le volume calculé de supplément de matrice extracellulaire au mélange.
- Ajoutez le volume calculé de cellules individuelles ou de fragments de tissu à l’aide d’une pipette P1000 ou d’une pointe de pipette à large calibre. Mélangez immédiatement en secouant comme décrit à l’étape 3.2.5 et passez immédiatement à l’étape suivante.
- Dépôt d’hydrogel
- Pipettez le mélange d’hydrogel dans des cuves de culture au volume désiré par puits. Utilisez 200 μL d’hydrogel par puits pour les lames à chambre à 4 puits, 100 μL par puits pour les lames à 8 puits, et 20 μL par puits pour les plaques à 96 puits.
- Étalez l’hydrogel en une fine tampon sur la surface lors de l’utilisation de lames à chambre. Placez la pointe de la pipette au bord central supérieur du puits de chambre et faites glisser la pointe sur la surface tout en distribuant le gel pour obtenir un tampon uniforme. Pour les plaques à 96 puits, placez la pointe de la pipette au centre du puits tout en maintenant le contact avec la surface et distribuez le gel centralement pour maintenir une structure en dôme. Évitez de pipeter de l’air dans le gel car cela créerait des bulles.
- Incubez les vases de culture à 37°C dans un incubateur humidifié avec 5 % deCO2 pendant 60 minutes pour permettre une polymérisation complète.
REMARQUE : Les conditions de polymérisation décrites ici ont été optimisées pour les formats de culture utilisés dans cette étude. Des ajustements mineurs du temps de polymérisation peuvent être nécessaires selon la géométrie du récipient de culture, le volume d’hydrogel et les conditions d’incubation.
- Culture et entretien
- Ajoutez du MEGM préchauffé dans chaque puits. Ajustez le volume selon le format de culture utilisé.
- Détachez doucement l’hydrogel de la surface de culture à l’aide d’une pointe de pipette pour permettre au gel de flotter. Faites glisser la pointe de la pipette autour du périmètre du gel et soulevez-la doucement sous l’hydrogel polymérisé pour le libérer de la surface.
- Remplacez le MEGM deux fois par semaine par un médium frais préchauffé. Maintenir les cultures dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂ pendant environ 3 à 4 semaines et interrompre les cultures avant que l’effondrement complet de l’hydrogel ne se produise. Identifier les hydrogels effondrés par l’apparition de structures denses, opaques, semblables à des bouchons, résultant d’une extension cellulaire étendue à l’intérieur du gel (voir exemples représentatifs dans la Figure supplémentaire 1).
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Résultats
L’exécution réussie de ce protocole aboutit à la formation de structures organoïdes tridimensionnelles présentant une morphologie épithéliale organisée et des caractéristiques architecturales spécifiques aux tissus. Les organoïdes commencent à se former dans les 3 à 7 jours suivant la plantation et continuent de se développer tout au long de la période de culture. La caractérisation antérieure de ce système organoïde hydrogel a démontré la formation d’organoïdes reproductibles chez plusi...
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Discussion
Le protocole décrit ici permet la génération reproductible d’organoïdes mammaires humaines tridimensionnelles au sein d’un microenvironnement hydrogel défini qui soutient les caractéristiques clés de la morphogenèsemammaire 3. Plusieurs étapes sont cruciales pour le succès de cette méthode. Premièrement, le traitement tissulaire et la dissociation enzymatique doivent être soigneusement contrôlés pour préserver la viabilité épithéliale tout en minimisant la surdige...
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Déclarations de divulgation
C.K. est cofondateur et consultant de Naveris.
Remerciements
Nous remercions chaleureusement Karla Murga, Daniela Requena et Megan Maloney du Tufts Biomedical Repository pour leur soutien tissulaire. Cette recherche a été soutenue par la Find The Cause Breast Cancer Foundation et le Tufts CTSI NIH Clinical and Translational Science Award (UM1TR0043, G.R.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-664 | Tubes stériles pour le traitement des tissus et la centrifugation |
| 40 μm cell strainer | VWR | 732-2757 | Dispositif de filtration pour la préparation de suspensions cellulaires |
| 40 μm cell strainer for low volumes | Bel-Art | 136800040 | Dispositif de filtration pour la préparation de suspensions cellulaires |
| Automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Dispositif utilisé pour compter les cellules et déterminer leur viabilité |
| Bovine pituitary extract | Thermo Scientific | 13028014 | Supplément pour les milieux de culture de cellules épithéliales |
| Cell counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | Glissements à double chambre utilisés pour le comptage des cellules |
| Centrifuge | N/A | N/A | Centrifugeuse de table/s doit avoir une capacité de vitesse d'au moins 500 x g et l'accommodation de tubes de 15 mL et 1,5 mL. |
| Collagen I | Millipore Sigma | 08-115 | Protéine de matrice extracellulaire utilisée pour la formation d'hydrogel |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | 11088793001 | Enzyme utilisé pour la dissociation des tissus |
| Cryovials | Corning | 976171 | Vials stériles pour le stockage cryogénique des échantillons |
| Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates) | Corning | 354104 354108 3603 | Plateformes pour le dépôt d'hydrogel et la culture d'organoïdes. |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 317275 | Cryoprotecteur utilisé dans le milieu de congélation |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Enzyme utilisé pour la dissociation secondaire des tissus |
| DNase I | Roche | 10104159001 | Enzyme utilisé pendant la dissociation cellulaire. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437 | Supplément de sérum utilisé dans les milieux de lavage et de neutralisation |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Composant de protéine de matrice extracellulaire |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050061 | Supplément pour les milieux de culture de cellules épithéliales |
| Human epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | Supplément pour les milieux de culture de cellules épithéliales |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Supplément pour les milieux de culture de cellules épithéliales |
| Hyaluronic acid | Millipore Sigma | 385908 | Composant de matrice extracellulaire pour la formulation d'hydrogel |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Enzyme utilisé pour la dissociation des tissus |
| Incubator | Thermo Scientific | 3598 | Dispositif utilisé pour l'incubation de la culture cellulaire |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Supplément pour les milieux de culture de cellules épithéliales |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Composant de protéine de matrice extracellulaire |
| Mammary epithelial basal medium | Thermo Scientific | M171500 | Milieu de croissance pour les cellules épithéliales |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | 3451 | Tubes utilisés pour les réactions à petit volume |
| Orbital rotator | Thermo Scientific | 400110 | Rotateur utilisé pour la dispersion des tissus pendant la dissociation enzymatique |
| P1000 pipette | Gilson | P1000 | Dispositif utilisé pour mélanger et transférer des volumes jusqu'à 1 000 μL |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | Supplément d'antibiotique pour les milieux de culture de cellules épithéliales |
| Phosphate-buffered saline | Gibco | 20012-027 | Solution tampon utilisée pour le lavage et le rinçage |
| Precision balance | Mettler Toledo | ML303E | Balance utilisée pour le pesage des tissus |
| Serological pipette | Nunc | 170356N | Pipette utilisée pour la récolte des cellules épithéliales non adhérentes |
| Sodium hydroxide (1 N) | Fisher Chemical | SS261 | Réactif utilisé pour la neutralisation du collagène |
| Sterile scalpels | Bard-Parker | 372615 | Outils utilisés pour la découpe mécanique des tissus |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | Colorant utilisé pour l'évaluation de la viabilité cellulaire |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200056 | Réactif enzymatique utilisé pour la dissociation cellulaire |
| Water bath (37 °C) | VWR | 10LA | Dispositif utilisé pour le décongélation contrôlée des échantillons |
Références
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