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Article de méthode

Essai ELISpot pour la quantification des cellules sécrétant des anticorps totales et antigène-spécifiques dans le sang et la moelle osseuse de macaques rhésus immunisés

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DOI :

10.3791/71836

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21 août 2026

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1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

Dans cet article

Résumé

Le test ELISpot sur cellules B est une méthode validée permettant de quantifier l'ampleur et la durabilité des plasmocytes à longue durée de vie spécifiques aux antigènes, produisant les immunoglobulines IgG, IgM et IgA, ainsi que l'ensemble des cellules sécrétrices d'anticorps (ASC), tant dans le sang (reflétant les plasmablastes à durée de vie courte après une immunisation) que dans la moelle osseuse où les ASC sont plus durables.

Résumé

L'évaluation de nouveaux antigènes vaccinaux et adjuvants repose traditionnellement sur la mesure des titres d'anticorps, qui nécessitent un certain temps pour se développer après l'immunisation. La quantification des cellules sécrétrices d'anticorps (ASC) après les immunisations primaires et de rappel fournit une mesure plus précoce et mécanistiquement informative de l'immunité humorale induite par le vaccin, et peut faciliter l'optimisation des formulations vaccinales et des stratégies d'immunisation. Ici, un protocole permettant de dénombrer les ASC provenant de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) et de cellules de la moelle osseuse (BM) de macaques rhésus est décrit ; ces macaques constituent un modèle préclinique important pour la recherche sur les vaccins contre le VIH. Ce test immunoenzymatique en sandwich sur membrane (ELISpot) permet de quantifier à la fois les ASC spécifiques à l'antigène et les ASC totales d'immunoglobulines IgG, IgM et IgA, en mesurant leurs fréquences absolues et relatives. Dans le sang périphérique, le test capte la réponse maximale des plasmablastes après immunisation, tandis que dans la moelle osseuse, il détecte l'accumulation de plasmocytes spécifiques à l'antigène appartenant à différents isotopes, évaluant ainsi la durabilité des ASC à longue vie. Ce protocole propose une approche robuste et reproductible pour évaluer les combinaisons d'immunogènes et d'adjuvants dans les études précliniques de vaccins, et fournit des données précieuses pour soutenir la translation de candidats vaccins prometteurs vers le développement clinique.

Introduction

Les cellules sécrétant des anticorps (ASC) sont des composants clés de l'immunité adaptative et comprennent à la fois les plasmablastes à durée de vie courte, qui sont produits rapidement après une immunisation, et les plasmocytes à durée de vie longue, responsables de la production durable d'anticorps. Les plasmablastes sont détectables de manière transitoire dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes secondaires, atteignant des fréquences maximales à des moments définis après l'immunisation, variables selon la formulation du vaccin et l'espèce hôte (généralement les jours 4 à 5 chez le macaque rhésus et environ le jour 7 chez l'humain). En revanche, les plasmocytes matures sont à longue durée de vie et résident principalement dans les tissus lymphoïdes secondaires et la moelle osseuse (BM). Un vaccin efficace doit induire à la fois une réponse immunitaire humorale et une réponse immunitaire à médiation cellulaire robustes. La mesure des réponses de rappel, reflétée par l'expansion rapide des plasmablastes dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) après une immunisation de rappel, fournit des informations précieuses sur l'ampleur de la réponse immunitaire induite par le vaccin. L'objectif global de ce protocole est de fournir une méthode robuste permettant de quantifier les réponses précoces des plasmablastes ainsi que celles des plasmocytes à longue durée de vie après une immunisation spécifique de Env chez le macaque rhésus.

Dans un dosage par immunospot lié à des enzymes (ELISpot), les cellules sécrétrices d'anticorps (ASC) sont cultivées dans des plaques de 96 puits à fond en membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) ou en ester mixte de cellulose (MCE), revêtues d'antigène (Ag), ce qui permet aux cellules viables de sécréter des protéines capturées directement sur la surface de la membrane. Les protéines capturées sont ensuite détectées à l'aide d'anticorps selon un format classique de dosage immuno-enzymatique sandwich. Dans les dosages ELISpot chromogéniques, les taches sont produites par la transformation du substrat 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC) par la peroxydase de raifort (HRP) en un précipité coloré insoluble, permettant ainsi la visualisation et le dénombrement des cellules ASC individuelles. L'ELISpot présente plusieurs avantages importants, notamment la capacité de détecter des réponses spécifiques à l'antigène ex vivo, une évaluation fonctionnelle très sensible des cellules immunitaires individuelles, ainsi qu'une surveillance quantitative des réponses immunitaires des lymphocytes T et B dans les études précliniques comme cliniques1,2,3.

Ici, un protocole ELISpot pour les cellules B est décrit afin de quantifier les cellules sécrétrices d'anticorps (ASC) totales et spécifiques aux antigènes, produisant les isotopes IgG, IgM et IgA, parmi les PBMC et les cellules du  moelle osseux de macaques rhésus. Le protocole détaille toutes les étapes critiques, y compris le revêtement des plaques, le blocage, l'ensemencement cellulaire, le développement du test, le dénombrement des taches et l'analyse des données, afin de caractériser la cinétique des réponses des plasmablastes et des plasmocytes totaux et spécifiques à Env. Cette méthode offre une approche reproductible pour évaluer et comparer l'immunogénicité de différentes formulations d'antigènes et d'adjuvants dans les études précliniques de vaccins, et contribue à l'optimisation des stratégies vaccinales en vue de leur translation clinique ultérieure.

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Protocole

Les macaques rhésus utilisés dans ce protocole provenaient des colonies libres de pathogènes spécifiques (SPF) du New Iberia Research Center et étaient hébergés au Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, du University of Texas MD Anderson Cancer Center. Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales étaient conformes au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le comité institutionnel d'éthique en matière de soins et d'utilisation des animaux du University of Texas MD Anderson Cancer Center (Protocole n° 2616RN00).

Ce protocole représente une optimisation de la technique décrite dans des études précliniques antérieures d'immunisation4,5,6,7, développée pour détecter les réponses des cellules sécrétrices d'anticorps (ASC). Le protocole ci-dessous décrit la procédure ELISpot utilisant des PBMC et des préparations cellulaires de MO fraîches provenant de macaques rhésus inclus dans un protocole expérimental de vaccin contre le VIH.

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures des sections 1 à 4 dans une hotte de sécurité biologique de classe II certifiée en utilisant une technique aseptique. Utilisez des pipettes multicanaux chaque fois que possible.

1. Préparation des plaques ELISpot

  1. Revêtir les plaques ELISpot
    1. Revêtir les plaques d'immunoglobulines totales (Ig) 1 et 3 avec 100 µL/puits de 5 µg/mL d'anticorps anti-IgG + IgM + IgA de singe non conjugué de chèvre dilué dans du DPBS stérile. Incuber les plaques à 4 °C pendant au moins 8 h, de préférence toute la nuit (Figure 1A,C).
    2. Revêtir les plaques spécifiques à l'antigène 2 et 4 avec 100 µL/puits de 20 µg/mL de lectine Galanthus nivalis (GNL) diluée dans du DPBS. Incuber les plaques à 4 °C pendant au moins 8 h, de préférence toute la nuit (Figure 1B,D).
    3. Conserver les plaques revêtues à 4 °C jusqu'à utilisation.
  2. Laver et bloquer les plaques d'immunoglobulines totales
    1. Éliminer la solution de revêtement des plaques 1 et 3 en retournant rapidement chaque plaque au-dessus d'un récipient de déchets. Tapoter fermement la plaque retournée sur du papier absorbant pour éliminer le liquide résiduel.
    2. Laver chaque plaque deux fois avec 200 µL/puits de PBS contenant 0,05 % de Tween 20. Puis laver les plaques deux fois avec 200 µL/puits de DPBS pour éliminer le détergent résiduel.
      REMARQUE : Le Tween 20 est cytotoxique. L'éliminer complètement avant de semer les cellules.
    3. Ajouter 200 µL/puits de RPMI-10 dans chaque puits. Incuber les plaques pendant 2 h à 37 °C dans un incubateur humidifié.
  3. Laver et bloquer les plaques spécifiques à l'antigène
    1. Éliminer la solution de revêtement GNL des plaques 2 et 4 en retournant rapidement chaque plaque au-dessus d'un récipient de déchets. Tapoter fermement les plaques retournées sur du papier absorbant pour éliminer le liquide résiduel.
    2. Laver chaque plaque quatre fois avec 200 µL/puits de DPBS.
      REMARQUE : Ne pas utiliser de PBS contenant du Tween 20 pour les plaques revêtues de GNL.
    3. Ajouter 200 µL/puits de RPMI-10 dans chaque puits. Incuber les plaques pendant 2 h à 37 °C dans un incubateur humidifié.
    4. Jeter la solution de blocage. Laver chaque plaque quatre fois avec 200 µL/puits de DPBS.
    5. Ajouter 100 µL/puits d'antigène CH505 SOSIP à une concentration finale de 5 µg/mL. Incuber les plaques pendant 2 h à 37 °C.
    6. Jeter la solution d'antigène et laver chaque plaque quatre fois avec du DPBS stérile.
      REMARQUE : Laisser le DPBS dans les puits après le dernier lavage afin d'empêcher la membrane MCE de sécher avant le semis des cellules.

2. Préparation des échantillons : isolement des PBMC et des cellules mononucléées de la moelle osseuse

  1. Isoler les PBMC à partir de sang total
    1. Centrifuger des tubes de sang EDTA de 10 mL à 450 x g pendant 20 min à température ambiante sans appliquer le frein.
    2. Éliminer le plasma et ajouter 4 mL de DPBS sans Ca2+ ni Mg2+. Mélanger délicatement à l’aide d’une pipette serologique de 10 mL.
    3. Superposer soigneusement le sang dilué sur 4 mL de Ficoll dans un tube de centrifugation de 15 mL. Centrifuger à 800 x g pendant 30 min à température ambiante en utilisant une accélération lente et une décélération lente.
    4. Transférer la couche blanche contenant les cellules mononucléées du sang périphérique dans un tube de 15 mL propre. Ajouter 8–10 mL de DPBS et centrifuger à 450 x g pendant 10 min à température ambiante.
    5. Jeter le surnageant et resuspendre délicatement le culot cellulaire.
    6. Ajouter 2 mL de tampon de lyse au chlorure d’ammonium potassium (ACK) à la suspension cellulaire. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
      ATTENTION : Ne pas dépasser une période d’incubation de 5 min, car une exposition prolongée au tampon de lyse ACK réduit la viabilité cellulaire.
    7. Arrêter la lyse des érythrocytes en ajoutant 10 mL de DPBS contenant 2 % de sérum bovin fœtal (FBS). Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à température ambiante.
    8. Jeter le surnageant et resuspendre les cellules dans du RPMI-10.
    9. Compter les PBMC à l’aide d’une méthode de numération cellulaire appropriée et s’assurer que la viabilité est >90 %, par exemple par coloration au bleu de trypan.
    10. Ajuster un aliquot à 5 × 106 cellules/mL pour les dosages ELISpot spécifiques à l’antigène. Ajuster un second aliquot à 1 × 106 cellules/mL pour les dosages ELISpot d’immunoglobulines totales.
  2. Isoler les cellules mononucléées de la moelle osseuse
    1. Placer un filtre cellulaire de 70 µm dans un tube de centrifugation de 50 mL. Humidifier préalablement le filtre avec 1 mL de DPBS.
    2. Ajouter 4 mL de DPBS à 1 mL d’aspirat de moelle osseuse. Mélanger soigneusement à l’aide d’une pipette serologique.
    3. Faire passer la suspension de moelle osseuse à travers le filtre cellulaire de 70 µm. Rincer le filtre avec 2 mL de DPBS avant de le jeter.
    4. Superposer la suspension filtrée sur 4 mL de Ficoll dans un tube de centrifugation de 15 mL. Centrifuger à 800 x g pendant 30 min à température ambiante en utilisant une accélération lente et une décélération lente.
    5. Transférer la couche de cellules mononucléées dans un tube de 15 mL propre. Ajouter 8–10 mL de DPBS et centrifuger à 450 x g pendant 10 min à température ambiante.
    6. Jeter le surnageant et resuspendre délicatement le culot cellulaire.
    7. Ajouter 2 mL de tampon de lyse ACK à la suspension cellulaire. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
      ATTENTION : Ne pas dépasser le temps de lyse recommandé afin de préserver la viabilité cellulaire.
    8. Arrêter la lyse des érythrocytes en ajoutant 10 mL de DPBS contenant 2 % de FBS. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min à température ambiante.
    9. Jeter le surnageant et resuspendre les cellules dans du RPMI-10.
    10. Compter les cellules mononucléées de la moelle osseuse à l’aide d’une méthode de numération cellulaire appropriée et s’assurer que la viabilité est >90 %, par exemple par coloration au bleu de trypan.
    11. Ajuster un aliquot à 5 × 106 cellules/mL pour les dosages ELISpot spécifiques à l’antigène. Ajuster un second aliquot à 1 × 106 cellules/mL pour les dosages ELISpot d’immunoglobulines totales.

3. Ensemencement et incubation des cellules

  1. Ensemencer les plaques d'immunoglobulines totales
    1. Retirer le milieu de blocage des plaques 1 et 3 en retournant rapidement chaque plaque au-dessus d'un récipient de déchets. Tapoter fermement les plaques retournées sur du papier absorbant pour éliminer le milieu résiduel.
    2. Ajouter 100 µL de RPMI-10 dans chaque puits de la première rangée et 133 µL de RPMI-10 dans chaque puits des deuxième et troisième rangées. Ces opérations sont réalisées en doubles techniques.
    3. Ajouter 100 µL de suspension de PBMC (1 × 106 cellules/mL) dans le premier puits de chaque colonne de la plaque 1. Disposer les échantillons selon la disposition de la plaque [par exemple, puits A1–A6 pour le macaque rhésus 1 (RM1) et A7–A12 pour le macaque rhésus 2 (RM2)].
    4. Ajouter 100 µL de suspension de cellules de moelle osseuse (1 × 106 cellules/mL) dans le premier puits de chaque colonne de la plaque 3. Disposer les échantillons selon la disposition de la plaque.
    5. Préparer des dilutions sérielles au tiers en transférant 67 µL d'un puits à l'autre et en mélangeant soigneusement après chaque transfert. Poursuivre la dilution sérielle dans les puits désignés, puis jeter les derniers 67 µL afin de maintenir un volume final de 133 µL par puits.
    6. Incuber les plaques toute la nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2.
      ​REMARQUE : Éviter de déplacer ou de perturber les plaques pendant l'incubation afin de prévenir l'apparition de doubles taches.
  2. Ensemencer les plaques spécifiques à l'antigène
    1. Retirer le DPBS des plaques 2 et 4 en retournant rapidement chaque plaque au-dessus d'un récipient de déchets. Tapoter fermement les plaques retournées sur du papier absorbant pour éliminer le tampon résiduel.
    2. Ajouter 100 µL de RPMI-10 dans chaque puits de la première rangée et 133 µL de RPMI-10 dans chaque puits des deuxième et troisième rangées.
    3. Ajouter 100 µL de suspension de PBMC (5 × 106 cellules/mL) dans le premier puits de chaque colonne de la plaque 2. Ajouter les échantillons selon la disposition de la plaque.
    4. Ajouter 100 µL de suspension de cellules de moelle osseuse (5 × 106 cellules/mL) dans le premier puits de chaque colonne de la plaque 4. Ajouter les échantillons selon la disposition de la plaque.
    5. Préparer des dilutions sérielles au tiers en transférant 67 µL d'un puits à l'autre et en mélangeant soigneusement après chaque transfert. Poursuivre la dilution sérielle dans les puits désignés, puis jeter les derniers 67 µL afin de maintenir un volume final de 133 µL par puits.
    6. Incuber les plaques toute la nuit à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2.
      NOTE : Éviter de perturber l'incubateur pendant l'incubation, car les vibrations peuvent provoquer des doubles taches ou des artefacts en queue de comète.

4. Traiter les plaques ELISpot

  1. Traiter les plaques d'immunoglobulines totales
    1. Retirer les plaques de l'incubateur après environ 18 h d'incubation.
    2. Jeter les cellules et le milieu de culture en retournant rapidement chaque plaque au-dessus d'un récipient de déchets contenant 10 % d'eau de javel. Tapoter fermement les plaques retournées sur du papier absorbant pour éliminer le liquide résiduel.
      NOTE : Effectuer les étapes de traitement restantes en conditions non stériles.
    3. Laver chaque plaque quatre fois avec 200 µL/puits de DPBS contenant 0,05 % de Tween 20.
      NOTE : Laisser le tampon du dernier lavage dans les puits afin d'éviter que les membranes ne s'assèchent.
    4. Alternativement, laver les plaques à l’aide d’un laveur automatique de microplaques lors du traitement d’un grand nombre de plaques.
    5. Préparer la solution d'anticorps de détection en diluant les anticorps anti-IgG et anti-IgM de singe biotinylés à 1:1 000 et l'anticorps anti-IgA de singe biotinylé à 1:500 dans du DPBS contenant 0,05 % de Tween 20 et 1 % de FBS.
    6. Éliminer le tampon du dernier lavage en tapotant les plaques sur du papier absorbant. Ajouter 100 µL/puits d'anticorps anti-IgG dilué aux colonnes 1 et 2, 7 et 8, d'anticorps anti-IgM dilué aux colonnes 3 et 4, 9 et 10, et d'anticorps anti-IgA dilué aux colonnes 5 et 6, 11 et 12.
      NOTE : Traiter une plaque à la fois afin d'éviter que les membranes ne s'assèchent.
    7. Incuber les plaques pendant 2 h à température ambiante.
    8. Jeter la solution d'anticorps de détection et laver les plaques quatre fois avec du DPBS contenant 0,05 % de Tween 20.
    9. Préparer le conjugué enzymatique en diluant l'avidine-HRP à 1:1 000 dans du DPBS contenant 0,05 % de Tween 20 et 1 % de FBS.
    10. Ajouter 100 µL/puits d'avidine-HRP diluée dans chaque puits. Incuber les plaques pendant 2 h à température ambiante, à l’abri de la lumière.
    11. Jeter la solution d'avidine-HRP et laver les plaques quatre fois avec du DPBS contenant 0,05 % de Tween-20.
      ​NOTE : Laisser le tampon du dernier lavage dans les puits jusqu’à la fin du développement du substrat.
  2. Traiter les plaques spécifiques à l'antigène
    NOTE : La procédure est similaire à celle utilisée pour les plaques d'immunoglobulines totales. Toutefois, effectuer toutes les étapes de lavage avec du DPBS sans Tween 20 afin de préserver le revêtement de GNL.
    1. Retirer les plaques de l'incubateur après environ 18 h d'incubation.
    2. Jeter les cellules et le milieu de culture en retournant rapidement chaque plaque au-dessus d'un récipient de déchets contenant 10 % d'eau de javel. Tapoter fermement les plaques retournées sur du papier absorbant pour éliminer le liquide résiduel.
      NOTE : Effectuer les étapes de traitement restantes en conditions non stériles.
    3. Laver chaque plaque quatre fois avec 200 µL/puits de DPBS.
      NOTE : Laisser le tampon du dernier lavage dans les puits afin d'éviter que les membranes ne s'assèchent.
    4. Préparer la solution d'anticorps de détection en diluant les anticorps anti-IgG et anti-IgM de singe biotinylés à 1:1 000 et l'anticorps anti-IgA de singe biotinylé à 1:500 dans du DPBS contenant 1 % de FBS.
    5. Éliminer le tampon du dernier lavage en tapotant les plaques sur du papier absorbant. Ajouter 100 µL/puits d'anticorps anti-IgG dilué aux colonnes 1 et 2, 7 et 8, d'anticorps anti-IgM dilué aux colonnes 3 et 4, 9 et 10, et d'anticorps anti-IgA dilué aux colonnes 5 et 6, 11 et 12.
      NOTE : Traiter une plaque à la fois afin d'éviter que les membranes ne s'assèchent.
    6. Incuber les plaques pendant 2 h à température ambiante.
    7. Jeter la solution d'anticorps de détection et laver les plaques quatre fois avec 200 µL/puits de DPBS.
    8. Préparer le conjugué enzymatique en diluant l'avidine-HRP à 1:1 000 dans du DPBS contenant 1 % de FBS.
    9. Ajouter 100 µL/puits d'avidine-HRP diluée dans chaque puits. Incuber les plaques pendant 2 h à température ambiante, à l’abri de la lumière.
    10. Jeter la solution d'avidine-HRP et laver les plaques quatre fois avec 200 µL/puits de DPBS.
      NOTE : Laisser le tampon du dernier lavage dans les puits jusqu’à la fin du développement du substrat.
  3. Effectuer le lavage automatisé (facultatif)
    1. Amorcer le laveur automatique de microplaques avec du DPBS conformément aux instructions du fabricant.
    2. Sélectionner le programme de lavage ELISpot prédéfini et effectuer toutes les étapes de lavage avec du DPBS.
      NOTE : Utiliser du DPBS pour tous les lavages automatisés afin d'éviter de devoir amorcer à plusieurs reprises l'appareil avec différents tampons de lavage.
    3. Utiliser les paramètres du laveur indiqués dans Tableau 1 pour le laveur de microplaques.

5. Détection

  1. Préparer la solution de substrat
    1. Préparer le substrat de travail AEC immédiatement avant utilisation en ajoutant une goutte de solution chromogène à chaque 1 mL de solution de substrat. Mélanger soigneusement par vortexage.
      NOTE : Préparer environ 40 mL de substrat de travail pour quatre plaques de 96 puits.
  2. Développer les plaques ELISpot à température ambiante
    1. Traiter une plaque à la fois. Éliminer le tampon de lavage final et ajouter immédiatement 100 µL/puit de substrat de travail AEC.
    2. Surveiller visuellement le développement des taches jusqu'à ce que des taches rouges bien distinctes apparaissent, généralement en 2 à 4 min.
      ATTENTION : Ne pas sur-développer les plaques, car un développement excessif augmente la coloration de fond et compromet la résolution des taches.
    3. Arrêter la réaction enzymatique en rinçant soigneusement la plaque sous un filet d’eau courante.
    4. Laver la plaque quatre à cinq fois avec de l’eau du robinet. Retirer l’excès d’eau à l’aide de papier absorbant.
    5. Retirer le collecteur inférieur de la plaque et laisser sécher les plaques à l’air pendant environ 24 h avant de compter les taches.
      NOTE : Arrêter la réaction dès que les taches deviennent visibles dans les puits contenant les concentrations cellulaires les plus élevées afin d’éviter un sur-développement.
    6. Répéter les étapes 5.2.1 à 5.2.5 pour chaque plaque restante.

6. Quantification des taches

  1. Acquérir des images ELISpot
    1. Numériser chaque plaque à l'aide d'un lecteur ELISpot équipé d'un logiciel d'acquisition d'images.
    2. Sélectionner le modèle de plaque approprié, définir les puits à analyser et acquérir les images conformément aux instructions du logiciel.
    3. Enregistrer les données brutes et exporter les images des plaques au format TIFF à des fins d'archivage.
  2. Compter les cellules sécrétant des anticorps
    1. Examiner les décomptes automatiques de taches pour chaque puit.
    2. Vérifier manuellement chaque puit afin d'identifier les taches fusionnées ou divisées de manière incorrecte. Marquer manuellement les taches individuelles si nécessaire afin d'obtenir des décomptes précis.
      REMARQUE : Une vérification manuelle est recommandée car les grandes taches peuvent être comptées plusieurs fois par le logiciel d'analyse automatisée.
    3. Enregistrer les décomptes de taches accompagnés des facteurs de dilution correspondants dans un tableur, comme indiqué dans Tableau 2.
    4. Analyser séparément les puits en double pour les IgG, IgM et IgA avant de calculer le nombre moyen de taches pour chaque dilution.
    5. Calculer le nombre de cellules sécrétant des anticorps par million de cellules initiales en multipliant le nombre moyen de taches par le facteur de dilution correspondant.
      REMARQUE : Utiliser des facteurs de dilution de 15×, 45× et 135× pour les dosages d'immunoglobulines totales, et de 3×, 9× et 27× pour les dosages spécifiques à l'antigène.
    6. Effectuer tous les calculs à l'aide d'un logiciel de tableur et générer les graphiques à l'aide d'un logiciel de représentation graphique statistique.

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Résultats

Dans cet essai ELISpot sur les lymphocytes B, les cellules sécrétant des anticorps (ASC) ont été détectées à l'aide de CH505 SOSIP, un trimère soluble de glycoprotéine d'enveloppe (Env) du VIH-1, utilisé comme antigène d'enrobage dans une étude vaccinale visant à induire des anticorps neutralisants largement actifs (bnAbs) contre le VIH-1. Figure 1 illustre la disposition des plaques ELISpot utilisée pour quantifier séparément les ASC totales et spécifiques à l'antigène. Cette disposition in...

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Discussion

L'ELISpot à cellules B est une méthode sensible permettant de détecter les réponses des cellules sécrétrices d'immunoglobulines totales et d'anticorps spécifiques de l'antigène (ASC) dans le sang, le plasma et les cellules de la moelle osseuse8,9,10,11. Plusieurs étapes sont essentielles pour garantir la reproductibilité du protocole. Premièrement, les membranes doivent être recouvertes avec pr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucun intérêt financier à déclarer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les animaux ainsi que le personnel soignant du Keeling Center for Comparative Medicine and Research pour leurs soins, ainsi que de nombreux anciens membres d'équipe et collaborateurs pour les améliorations successives apportées à la procédure. Ce projet de vaccin contre le VIH chez les primates non humains a bénéficié d'un financement provenant des subventions NIH 5R01AI183472 attribuée à MBZ et R24OD010947 attribuée à FJV.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lysis ACKQuality Biological118-156-101500 ml
Filtre de 70µmFisher22363548Filtre stérile pour cellules, adapté aux tubes coniques de 50 mL
Substrat de travail AECBD Biosciences551951Réactifs pour 10 plaque(s)
Analyse : ExcelMicrosoft OfficeVersion 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel pour Microsoft 365
Analyse : GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersion 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti-IgA Rhésus biotinyléeNHPRRAB-3086851lyophilisée
Anti-IgG de singe biotinyléeRocklandP/N 617-106-012lyophilisée
Anti-IgM de singe biotinyléeRocklandP/N 617-106-007lyophilisée
Milieu de blocageRéactifs préparés en laboratoireformulé en interneRPMI-10
Tampon pour la dilution de l'anticorps secondaire et de la PRVRéactifs préparés en laboratoireformulé en interneDPBS 1X avec 1 % de FBS
Centrifugeuse Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, Fabrication : 2013, rotor TX-750 et 75003608 (seau rond)
Tampon de revêtementRéactifs préparés en laboratoireformulé en interneDPBS 1X
DPBSGibco14190-1361X
Plaques ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50Lot de 50 plaques
Sérum de veau fœtal (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL non conjuguéVector LaboratoriesL-1240-5lyophilisé
Péroxydase de raifort (PRV) - AvidineVector LaboratoriesA-20045 mg/mL prêt à l'emploi
Lecteur Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N : 2000Imagerie et analyse automatisées pour les tests ELISpot et Fluorospot
Pénicilline/StreptomycineGibco15140-122100X
Laveur de plaquesBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRSLaveur de microplaques 405 TS
RPMI-10Réactifs préparés en laboratoireformulé en interneRPMI-1640 + 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life SciencesP7949500 ml
Anticorps polyclonal de chèvre non conjugué anti-IgG+IgA+IgM de singe IgG/IgM/IgALS-BioC347340lyophilisé
Tampon de lavage (plaques spécifiques à l'antigène)Réactifs préparés en laboratoireformulé en interne(DPBS 1X uniquement)
Tampon de lavage (plaques d'Ig totales)Réactifs préparés en laboratoireformulé en interne(DPBS 1X + 0,05 % de Tween 20)

Références

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  2. Haralambieva IH, Ovsyannikova IG, Kennedy RB, Poland GA. Detection and Quantification of Influenza A/H1N1 Virus-Specific Memory B Cells in Human PBMCs Using ELISpot Assay. Methods Mol Biol. 2018;1808:221-236.
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