Article de méthode

Flux de travail standardisé pour l'imagerie à haut contenu et le traitement des données

DOI :

10.3791/71863

⸱

21 août 2026

 ,  , 
1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour l'imagerie à haut contenu et le traitement des données standardisés de cellules marquées au propidium iodure (PI) et à l'Hoechst 33342 afin d'effectuer une analyse reproductible de la viabilité cellulaire à l'aide de flux de travail automatisés d'acquisition et d'analyse d'images.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour répondre aux défis posés par la faible reproductibilité due aux variations opérationnelles dans l'imagerie en recherche scientifique et à la complexité de l'analyse d'un grand nombre d'échantillons à l'aide de méthodes conventionnelles, nous présentons un protocole de coloration des cellules HT22 par l'iodure de propidium (PI) et l'Hoechst 33342, suivi de l'acquisition d'images et de l'analyse des données à l'aide d'un système d'imagerie à contenu élevé. Ce flux de travail vise à établir des paramètres robustes pour les réglages d'imagerie et des normes strictes de contrôle qualité. Il illustre les réglages d'imagerie de l'appareil ainsi que le flux opératoire pour trois méthodes de traitement d'image proposées par l'instrument : Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live) et Custom Module Editor (CME). Les méthodes de traitement d'image sont comparées et validées par rapport à la méthode traditionnelle ImageJ afin de garantir leur efficacité. L'étude conclut en proposant un flux de travail pour l'utilisation du système d'imagerie à contenu élevé afin de déterminer la viabilité cellulaire par la méthode de double coloration au PI et à l'Hoechst. En standardisant l'ensemble du processus d'imagerie et de traitement des données, cette étude améliore considérablement la reproductibilité et la fiabilité de l'imagerie en recherche scientifique, offrant ainsi un soutien méthodologique solide pour la comparaison des données entre laboratoires et contribuant à l'avancement de la recherche scientifique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système d'imagerie à haut contenu constitue un outil essentiel dans la recherche scientifique moderne, permettant une imagerie à grande vitesse et une évaluation multiparamétrique de cellules lésées ou non lésées1,2,3. Il joue un rôle irremplaçable dans diverses disciplines. Dans le domaine des sciences de la vie, il aide les chercheurs à explorer le monde microscopique des cellules et des tissus4,5. Par exemple, la détection précise de molécules et de structures marquées par fluorescence permet une visualisation claire des structures fines cellulaires et des changements dynamiques6. Dans la recherche en neurosciences, il permet d'obtenir des images tridimensionnelles de neurones, facilitant l'analyse des connexions complexes et des mécanismes de transduction du signal au sein des réseaux neuronaux, et fournissant des indices cruciaux pour comprendre les fonctions cérébrales et la pathogenèse des maladies neurologiques7,8,9.

Malgré les avantages considérables de la technologie des systèmes d'imagerie à contenu élevé, plusieurs problèmes persistent concernant son processus d'acquisition d'images. À l'étape de préparation des échantillons, un haut degré de subjectivité est observé. En ce qui concerne la préparation des échantillons biologiques, des procédés tels que la manipulation des cellules et la coloration manquent de normes appropriées. En matière de paramètres d'imagerie, des différences notables existent quant aux temps d'exposition et au choix des plaques de culture entre les laboratoires et les différents modèles de microscopes à contenu élevé. Lors de la phase de traitement des données, il existe un manque de normalisation, allant de la réduction du bruit et de l'ajustement du contraste des images brutes jusqu'à l'identification des paramètres et à la détermination des caractéristiques cibles. Ces problèmes conduisent directement à des biais dans les résultats d'imagerie microscopique, provoquant une crise de reproductibilité.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise une lignée cellulaire commerciale (HT22, ATCC) et ne concerne ni sujets humains ni tissus humains primaires. Aucun animal n'a été utilisé dans cette étude.

1. Préparation normalisée des échantillons

  1. Préparer les cellules HT22
    1. Lorsque la confluence des cellules HT22 atteint 80 %10,11, jeter l'ancien milieu. Utiliser de la trypsine à 0,25 % pour détacher les cellules, en incubant pendant 1 à 2 min à température ambiante.
    2. Ajouter le milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) à un volume égal à 3 fois celui de la trypsine à 0,25 % afin d'arrêter le détachement. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
    3. Centrifuger à 175 x g pendant 3 min à température ambiante, puis jeter le surnageant. Resuspendre les cellules dans du DMEM complet pour obtenir une suspension monocellulaire.
    4. Compter les cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Ensemencer 5 000 cellules par puits dans 100 µL de milieu complet dans une plaque de 96 puits12.
    5. Incuber la plaque à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 24 h. Réaliser le regroupement des échantillons, l’administration des traitements et les opérations de coloration dans la plaque de 96 puits selon le plan expérimental.
      ​REMARQUE : Utiliser une plaque de 96 puits compatible avec le système d’imagerie. Choisir une plaque dont l’épaisseur et la géométrie du fond conviennent aux spécifications du fabricant. Les plaques à fond en verre (épaisseur du fond de 130 à 170 µm) sont recommandées lorsque la qualité d’image doit être optimale13,14,15,16.
  2. Procédure de coloration
    1. S’assurer que les cellules forment une monocouche unique bien dispersée et n’excèdent pas une confluence de 70 % afin de minimiser le recouvrement cellulaire (Figure 1B).
    2. Regrouper les échantillons selon les exigences expérimentales et procéder à la coloration après traitement. Préparer les solutions de colorant fraîches avec une concentration finale de 6,684 µg/mL pour l’iodure de propidium (PI) et de 10 µg/mL pour l’Hoechst 3334217,18.
    3. Jeter l’ancien milieu de la plaque de 96 puits et laver chaque puits deux fois avec 100 µL de PBS. Ajouter la solution de colorant fraîche et incuber pendant 30 min à l’abri de la lumière à température ambiante pour la coloration.
    4. Laver chaque puits deux fois avec 100 µL de PBS, puis ajouter du DMEM.
      REMARQUE : Selon les plans expérimentaux, les paramètres de chargement des échantillons et de coloration peuvent varier.

2. Spécifications d'imagerie et réglages des paramètres

  1. Normes des paramètres d'imagerie
    ​REMARQUE : Cette étude illustre uniquement le flux de travail d'imagerie en champ large pour l'instrument après coloration par PI et Hoechst 33342.
    1. Allumez l'instrument, puis démarrez l'ordinateur. Ouvrez le logiciel d'analyse fourni avec l'appareil.
    2. Chargez la plaque 96 puits dans l'instrument. Sélectionnez le champ de vision contenant les échantillons à imager.
    3. Dans les paramètres Objectif et Caméra, réglez le grossissement sur « 20XPh1SPlanFluorELWDADM » (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), le binning de la caméra sur « 2 » et le mode d'acquisition sur « Widefield ».
    4. En mode plaque, sélectionnez les paramètres correspondants de la plaque 96 puits et ajustez les paramètres de la plaque selon les données dimensionnelles du produit.
    5. Dans l'option Site, sélectionnez généralement 9 champs par puits pour une imagerie dense. Dans les options de mise au point automatique, choisissez Activer la mise au point basée sur le laser.
    6. Ajustez les paramètres de mise au point automatique laser sous Autofocus, en fonction de l'épaisseur moyenne du fond de la plaque mesurée à partir d'au moins trois puits échantillons. Ajustez l'épaisseur du fond, la variation maximale d'épaisseur du fond, la variation maximale entre puits adjacents, la variation maximale intra-puits et la variation maximale de la plaque en conséquence.
    7. Sous Longueurs d'onde, réglez le nombre de longueurs d'onde à 3. Pour la première illumination, sélectionnez DAPI. Dans Correction d'éclairage, choisissez « Auto Correction for FL » (Figure 2B).
    8. Après avoir trouvé l'image, réglez l'exposition initiale (ms) à 20–30. Observez les images capturées et ajustez continuellement l'exposition pour obtenir une intensité de fluorescence modérée sans sur-exposition, et réglez la profondeur de bit à 16 (Figure 2A).
    9. Choisissez Laser avec décalage z pour l'ajustement de la mise au point. Si la mise au point n'est pas nette, cochez Utiliser la pile Z, cliquez sur Calculer le décalage, puis sélectionnez une distance focale appropriée. Cochez Confocal numérique (info) et réglez les paramètres d'ajustement pour Augmenter la netteté et Réduire le bruit à 0,200.
      NOTE : Si l'exposition ou la netteté de l'image n'est pas satisfaisante, ajustez l'exposition et recalculez les paramètres de décalage.
    10. Pour la deuxième illumination, sélectionnez Cy3. Appliquez les mêmes réglages que dans les étapes 2.1.7 à 2.1.9.
    11. Pour la troisième illumination, sélectionnez TL 25. Appliquez les mêmes réglages que dans les étapes 2.1.7 à 2.1.9.
      NOTE : Réglez la correction d'éclairage en fonction du canal, et TL 25 doit sélectionner Auto Correction for TL. Dans Longueurs d'onde, le canal TL doit être configuré pour le positionnement cellulaire et l'observation morphologique.
    12. Dans l'onglet Exécuter, nommez la plaque selon la convention de dénomination : nom de la plaque-type cellulaire-ID de l'expérience-date-grossissement de l'objectif-type d'imagerie. Confirmez les paramètres liés au canal d'imagerie sous Description.
    13. Cliquez sur Acquérir la plaque pour démarrer l'imagerie. Une fois l'imagerie terminée, éteignez le logiciel, l'instrument et l'ordinateur dans cet ordre.
      ​REMARQUE : Par la suite, l'ordinateur peut être utilisé uniquement pour l'exportation des images, le traitement des données et l'analyse des résultats.
  2. Normes et exigences opérationnelles d'imagerie
    1. Centre le champ de vision dans le puits afin d'éviter les effets de bord (Figure 1A). Pendant la configuration des paramètres d'imagerie, utilisez le témoin positif présentant l'intensité de fluorescence la plus élevée comme référence. En outre, lors de la mise au point, choisissez un champ de vision contenant une monocouche cellulaire, propre et sans débris.
    2. Pour la caméra, maintenez strictement les valeurs des pixels en dessous de 60000 (la valeur maximale étant 65535) afin d'éviter la saturation, qui peut entraîner une perte irréversible d'information. Si des taches ou zones trop brillantes apparaissent, réduisez l'exposition. En même temps, ne maintenez pas le temps d'exposition trop bas ; sinon, le bruit dominera l'image.
    3. Pour les signaux de fluorescence faibles, privilégiez une légère augmentation de l'exposition plutôt que d'augmenter fortement les paramètres, afin d'éviter les dommages irréversibles dus au photoblanchiment.
      NOTE : Pour l'imagerie en champ clair, ces principes peuvent être légèrement assouplis, mais l'accent principal reste mis sur l'intégrité du signal et la protection de l'échantillon.
    4. Assurez-vous que les contours périphériques de l'échantillon sont clairement discernables et que les structures internes fines (telles que les granules, fibres, organites) présentent des textures bien définies, sans flou, et que la lumière diffusée de fond est uniformément répartie, sans taches lumineuses localisées ni halos flous. Évitez strictement la sur- et la sous-mise au point.
    5. Assurez-vous de disposer de groupes normaux, positifs, négatifs et expérimentaux, et que chaque groupe de traitement comporte au moins 3 puits parallèles. Il est recommandé d'organiser les puits parallèles verticalement.

3. Traitement et analyse des images

REMARQUE : Ce document décrit trois méthodes de traitement d'images fournies par le logiciel compagnon de l'appareil, toutes adaptées au protocole de coloration utilisé dans cette étude. Bien que ces méthodes partagent le même principe fondamental de reconnaissance, elles diffèrent par leurs techniques de traitement spécifiques et les types de résultats obtenus. Le flux de travail de traitement d'image était identique dans tous les cas : Ouvrir le fichier → Charger l'image d'origine avec la méthode de traitement correspondante → Régler les paramètres de canal appropriés → Générer un masque → Définir le type de données de mesure dans Mesurer → Exécuter l'analyse → Observer les résultats → Exporter les données.

  1. Ouvrir le logiciel d’analyse fourni avec l’appareil → Vérifier la plaque → Sélectionner la plaque.
  2. Dans la vue Date, sélectionner l’agencement des puits et choisir un champ de vision du groupe positif comme référence.
  3. Sous Exécuter l’analyse, sélectionner le programme de traitement correspondant et définir les paramètres de traitement d’image ou exporter l’image.
  4. Après avoir défini et enregistré les paramètres, sélectionner Exécuter sur tous les puits / Exécuter sur les sélections / Exécuter sur le site affiché selon l’objet de réglage des paramètres.
  5. Une fois que l’ordinateur a terminé le traitement des données, sous l’onglet Mesures, sélectionner le programme de traitement de données correspondant dans Analyse et choisir différents résultats de mesure dans Mesure pour vérifier les données.
  6. Cliquer sur Ouvrir le journal pour commencer l’exportation des données. Définir les détails suivants dans les paramètres pour les trois méthodes de traitement d’image :
    1. Méthode de traitement d’image une : Score cellulaire multi-longueurs d’onde
      1. Sélectionner le programme Score cellulaire multi-longueurs d’onde et configurer les paramètres. Définir le Nombre de longueurs d’onde. Choisir Standard pour l’algorithme.
      2. Définir les paramètres de reconnaissance pour tous les noyaux en fonction des résultats de coloration par PI. L’image source W1 par défaut est le canal DAPI.
      3. Définir la largeur minimale approximative à 8–10 µm et la largeur maximale approximative à 30–35 µm, en fonction de la taille des objets individuels à reconnaître.
      4. Définir l’intensité au-dessus du fond local à 2 000–10 000 niveaux de gris. Utiliser Aperçu pour tester et ajuster les paramètres en fonction des résultats de reconnaissance.
      5. Définir les paramètres W2 en fonction des résultats de coloration par Hoechst 33342. Nommer ce canal. L’image source W2 est Cy3.
      6. Dans Zone colorée, sélectionner la région colorée par ce canal comme Noyau. Suivre les mêmes paramètres que dans les étapes 3.6.1.3–3.6.1.4 pour les réglages suivants. Dans Configurer le journal récapitulatif ou Configurer le journal de données (Cellules), sélectionner la configuration de paramètres correspondante en fonction des paramètres de résultats souhaités.
        NOTE : En général, Configurer le journal récapitulatif est utilisé pour définir les types de données requis, tandis que Configurer le journal de données (Cellules) est utilisé lorsqu’un marquage spécifique des cellules individuelles est nécessaire.
      7. Effectuer un test d’exécution pour observer la reconnaissance. Si les résultats de reconnaissance sont satisfaisants, enregistrer les paramètres.
    2. Méthode de traitement d’image deux : Vivant-Mort
      1. Sélectionner le programme Vivant-Mort et commencer à configurer les paramètres. Définir séquentiellement les paramètres de longueur d’onde 1 et de longueur d’onde 2.
      2. Sous Paramètres de longueur d’onde 1, définir la Source de longueur d’onde 1 sur DAPI. L’algorithme par défaut est « Standard ».
      3. Définir le type de cellule colorée sur Toutes les cellules et la zone colorée sur Noyau en fonction des conditions de coloration. Définir la largeur minimale approximative, la largeur maximale approximative et l’intensité au-dessus du fond local en utilisant les mêmes paramètres que la méthode Score cellulaire multi-longueurs d’onde.
      4. Cocher Séparer les objets en contact et utiliser Aperçu pour tester.
      5. Sous Paramètres de longueur d’onde 2, définir la Source de longueur d’onde 2 sur Cy3.
      6. Définir le type de cellule colorée sur Mort et la zone colorée sur Noyau en fonction de la coloration spécifique. Définir la largeur minimale approximative, la largeur maximale approximative et l’intensité au-dessus du fond local en utilisant les mêmes paramètres que la méthode Score cellulaire multi-longueurs d’onde.
      7. Cliquer sur Configurer le journal récapitulatif et sélectionner la configuration de paramètres en fonction des types de données requis. Effectuer un test d’exécution pour observer la reconnaissance. Si les résultats de reconnaissance sont satisfaisants, enregistrer les paramètres.
    3. Méthode de traitement d’image trois : mode développeur CME
      1. Sélectionner le programme Module personnalisé (CME) et commencer à configurer les paramètres. Configurer les noms d’image et les canaux.
        NOTE : Pour faciliter les paramètres ultérieurs, les définir généralement sur les noms de canaux utilisés lors de l’imagerie.
      2. Dans Trouver des objets, ouvrir Seuil simple pour définir la reconnaissance pour l’ensemble.
      3. Définir la Source en correspondance avec le nom de l’image. En fonction de la plage de valeurs de gris 16 bits, remplir 0 à Seuil bas et 65535 à Seuil haut.
      4. Nommer le résultat du traitement dans Résultat, appliquer et observer la situation de marquage. Dans Trouver des objets, ouvrir Trouver des taches pour générer un résultat de masque.
      5. Définir la Source en correspondance avec le nom de l’image, comme dans Seuil simple. Définir la largeur minimale approximative, la largeur maximale approximative et l’intensité au-dessus du fond local selon les paramètres de la méthode Score cellulaire multi-longueurs d’onde.
      6. Nommer le résultat du traitement dans Résultat, appliquer et observer le résultat de marquage. Pour le résultat de reconnaissance Trouver des taches, utiliser l’outil Modifier les objets pour filtrer, agrandir, rétrécir et inverser.
      7. Sous Mesurer, définir Modifié. Dans Entrées de mesure, saisir 1 pour Valeur de surface standard et cocher Créer superposition d’objets.
      8. Dans Objets à mesurer, sélectionner la source des objets marqués dans Masque des objets et l’image source à mesurer dans Image à mesurer. Choisir le nom de mesure correspondant en fonction des paramètres de résultat de traitement requis, appliquer et observer le résultat de reconnaissance des paramètres.
      9. Après avoir confirmé les paramètres, enregistrer la configuration.
    4. Méthode générale : ImageJ
      ​NOTE : Analyser les résultats d’imagerie à l’aide de la méthode ImageJ pour les images fluorescentes19, puis effectuer une analyse comparative avec les trois méthodes de cet instrument.
      1. Ouvrir le logiciel ImageJ. Importation d’image : Fichier → Ouvrir → Sélectionner l’image en niveaux de gris d’origine à analyser.
      2. Convertir l’image en 8 bits : Image → Type → 8 bits. Reconnaissance de la valeur de gris : Image → Ajuster → Seuil → Par défaut, Rouge → Cocher Fond foncé → Définir → OK.
        NOTE : Si la reconnaissance de la zone rouge est insatisfaisante, remplacer Par défaut par l’un des 16 modèles de reconnaissance ImageJ intégrés ou ajuster le curseur dans la boîte de dialogue.
      3. Définir les paramètres : Analyser → Définir les mesures. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cocher Surface, Valeur moyenne de gris, Densité intégrée, Limiter au seuil, Afficher l’étiquette, Rediriger vers Aucun par défaut, et saisir 2 pour Nombre de décimales (0-9). Cliquer sur OK.
      4. Analyser les résultats de reconnaissance : Analyser → Mesurer. Enregistrer les résultats : Dans la boîte de dialogue des résultats qui s’affiche, Fichier → Enregistrer sous, et sélectionner l’emplacement d’enregistrement.
  7. Exportation d’image
    1. Sélectionner un champ de vision de puits positif de haute qualité comme standard de référence.
      NOTE : Les exigences de base en matière de qualité sont l’authenticité, la mise au point précise, une exposition adaptée (16 bits) et un contraste approprié (un rapport signal/bruit plus élevé est préférable). Les exigences de haute qualité incluent des caractéristiques nettes, un contraste marqué, une praticité, des changements morphologiques intuitifs et des points clés mis en évidence.
    2. Sous Exécuter l’analyse, sélectionner ExportPro dans la section Analyse, puis démarrer Configuration de l’analyse. Dans Sélectionner les options de sortie, choisir Canal individuel, Superposition en couleurs, réduire l’image (facultatif) et Barre d’échelle (facultatif) en fonction des besoins de l’image.
    3. Sélectionner les images des canaux fluorescents à exporter pour chaque champ de vision. Dans Canal individuel, sélectionner une couleur pour chaque canal, par exemple Bleu pour le canal DAPI et Monochrome pour le canal TL.
    4. Dans Superposition en couleurs, sélectionner dans l’ordre les canaux correspondant à CHAMP CLAIR, ROUGE, BLEU et VERT (Sélectionner la longueur d’onde de couleur pour la superposition en couleurs). Définir le Nombre à 100 ; observer l’image d’aperçu et accepter le résultat d’aperçu.
    5. Dans Sortie, sélectionner le dossier où les images exportées seront stockées dans Exporter vers le dossier. Démarrer l’exécution.
      NOTE : Les images d’un même lot ne doivent pas être exportées séparément ; un lot d’images désigne un ensemble d’images provenant de quatre échantillons de base : contrôle négatif, contrôle positif, groupe témoin de base et groupe expérimental cible, toutes obtenues dans des conditions expérimentales strictement identiques.
  8. Comparaison des méthodes de traitement d’image
    1. Sélectionner 9 champs de vision et comparer le comptage manuel traditionnel des cellules mortes et vivantes avec les méthodes Score cellulaire multi-longueurs d’onde, Vivant-Mort, CME et ImageJ pour le comptage des cellules vivantes, des cellules mortes et du rapport entre cellules mortes et vivantes. Utiliser GraphPad Prism version 10.1 pour effectuer une ANOVA à un facteur, accompagnée du test de comparaisons multiples de Tukey, afin d’analyser les différences.
    2. Sélectionner 81 champs de vision et comparer les différences en matière de comptage cellulaire, de surface et d’intensité entre les méthodes Score cellulaire multi-longueurs d’onde, Vivant-Mort, CME et ImageJ. Utiliser GraphPad Prism version 10.1 pour effectuer une ANOVA à un facteur, accompagnée du test de comparaisons multiples de Tukey, afin d’analyser les différences.
      NOTE : Les expériences de culture cellulaire et de coloration doivent être réalisées dans une cabine de sécurité biologique. Éliminer les liquides usés, les pointes et autres déchets expérimentaux conformément aux réglementations du laboratoire. Assurer une protection complète tout au long de l’expérience.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Impact de la préparation standardisée sur la qualité de l'imagerie

Les paramètres de la plaque ont été configurés pour garantir que l'appareil puisse localiser de manière fiable la couche d'images cellulaires. Des échantillons préparés en une seule couche de cellules avec une confluence modérée ont facilité la mise au point de l'image à différentes amplifications objectives et amélioré la reconnaissance des images ainsi que l'analyse quantitative. Une préparation standardisée des échantillons et des paramètres de plaque optimisés ont efficacement réduit les effets de bord, le recouvrement des cellules et d'autres facteurs contribuant à une mauvaise qualité d'imagerie (Figure 1).

Comparaison des fonctions des méthodes de calcul d'image

La méthode de double coloration par l'iodure de propidium et l'Hoechst 33342 a été utilisée pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Les méthodes Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead et CME ont correctement traité ces images en identifiant les objets à partir de l'intensité de fluorescence et de la taille des objets, tandis qu'ImageJ identifiait les objets selon les valeurs de niveaux de gris. Les résultats de marquage obtenus avec ces méthodes étaient généralement comparables (Figure 3A–E).

La méthode de comptage cellulaire multi-longueurs d'onde nécessitait une coloration nucléaire afin d'identifier toutes les cellules (Figure 4A). Elle peut traiter jusqu'à 7 canaux d'imagerie et calculer des paramètres tels que le nombre de cellules, la surface et la densité optique.

La méthode Live-Dead était plus souple que la méthode de comptage cellulaire multilongueur d'onde. Les deux canaux offrent des modules de coloration nucléaire, de coloration cytoplasmique ou de coloration combinée nucléaire-cytoplasmique permettant d'identifier toutes les cellules, les cellules vivantes ou les cellules mortes. La fonction de séparation des objets en contact sépare les objets superposés, permettant ainsi le calcul du nombre de cellules, de la surface et de la densité optique. Toutefois, comme elle traitait uniquement des données à deux canaux, elle convenait particulièrement bien aux tests de viabilité cellulaire doublement colorés au PI/Hoechst 33342 (Figure 4B).

La méthode CME reposait sur une logique de traitement d'image définie par l'utilisateur. Le nombre de canaux traités correspondait au nombre de canaux acquis. Les résultats de reconnaissance ont été affinés à l'aide de fonctions telles que Remplir les trous, Inverser les objets, Agrandir les objets, Rétrécir les objets, Opérations logiques, Supprimer les objets de bordure, Conserver les objets marqués, Agrandir les objets sans les toucher, Marquer les centres des objets, Transformation en lignes de crête (Watershed), Supprimer les objets marqués et Filtre de masque afin d'éliminer les impuretés et autres sources d'interférence. Cette méthode permettait également le calcul de plusieurs paramètres d'objets pour une analyse multidimensionnelle.

ImageJ ne traitait pas plusieurs canaux simultanément. Pour les lots d'images présentant des variations importantes du fond, un traitement manuel et un ajustement du seuil étaient nécessaires, ce qui augmentait la subjectivité et réduisait la reproductibilité.

Analyse des différences dans les résultats du traitement

Une analyse comparative des méthodes de traitement d'image n'a révélé aucune différence significative quant au nombre total de cellules, au nombre de cellules mortes ou au ratio de cellules mortes par rapport à l'ensemble des cellules, entre les méthodes de comptage cellulaire multilongueur d'onde, de type vivant-mort, de CME, d'ImageJ et du comptage manuel traditionnel, sur 9 champs observés (Figure 5A–C, Fichier supplémentaire 1).

De même, aucune différence significative n'a été observée dans le rapport entre la zone de cellules mortes et la zone cellulaire totale entre les méthodes de scoring cellulaire multi-longueurs d'onde, Live-Dead, CME et ImageJ. Cependant, une différence significative a été observée dans le rapport de l'intensité moyenne de fluorescence des cellules mortes par rapport à celle de l'ensemble des cellules entre les méthodes de scoring cellulaire multi-longueurs d'onde, Live-Dead et CME, basée sur des données obtenues à partir de 81 champs de vision (Figure 5D–F).

Sur la base de ces résultats, un protocole normalisé pour le système d'imagerie à contenu élevé a été établi (Figure 6).

figure-results-1
Figure 1 : Résultats d'imagerie de faible qualité. (A) Le champ de vision est proche du bord du puits, révélant des ombres dues au bord du puits (cellules BV2 dans ce cas). (B) Les flèches a et b indiquent un recouvrement des cellules dans le canal DAPI et le canal TL, avec une confluence cellulaire excessive, voire une double couche ou des cellules en suspension. (C) Le champ de vision ne contient aucune cellule ; les paramètres de la plaque sont incorrects ; la mise au point n'est pas sur la couche cellulaire, ou les cellules ne sont pas colorées, ce qui entraîne l'absence d'image dans ce champ de vision. Échelle = 100 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Paramètres de configuration de l'imagerie. (A) La flèche a indique l'icône de profondeur de bit. (B) La flèche b indique la position de la correction d'ombrage. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Résultats du même champ observé identifiés par plusieurs méthodes. (A) Résultats du masque de quantification cellulaire multi-longueur d'onde : les zones grises et rouges représentent tous les noyaux cellulaires identifiés dans le canal DAPI, les zones rouges correspondant aux noyaux de cellules mortes identifiés dans le canal Cy3. (B) Résultats du masque vivant-mort : les zones vertes et rouges représentent tous les noyaux cellulaires identifiés dans le canal DAPI, la zone rouge correspondant aux noyaux de cellules mortes identifiés dans le canal Cy3. (C) Résultat du masque CME : les zones jaunes et bleues représentent tous les noyaux cellulaires identifiés dans le canal DAPI, la zone bleue correspondant aux noyaux de cellules mortes identifiés dans le canal Cy3. (D) Résultat du masque ImageJ dans le canal DAPI. (E) Résultat du masque ImageJ dans le canal Cy3. Échelle = 100 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Pages partielles de réglage des paramètres. (A) L'emplacement indiqué par a montre que le premier canal du comptage cellulaire multi-longueur d'onde ne peut sélectionner que le noyau ; (B) b et c indiquent que l'essai Viabilité/Décès ne peut traiter que deux canaux, permettant une double coloration PI/Hoechst 33342 pour les cellules mortes et vivantes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Différences dans les résultats du traitement des images de fluorescence. (A) Différences dans le nombre total de cellules parmi les cinq méthodes de traitement. (B) Différences dans le nombre de cellules mortes parmi les cinq méthodes de traitement. (C) Différences dans le rapport entre les cellules mortes et l'ensemble des cellules parmi les cinq méthodes de traitement. (D) Différences dans le rapport entre les cellules mortes et l'ensemble des cellules parmi les quatre méthodes de traitement. (E) Différences dans le rapport entre la surface des cellules mortes et la surface totale des cellules parmi les quatre méthodes de traitement. (F) Différences dans le rapport entre l'intensité moyenne de fluorescence des cellules mortes et celle de l'ensemble des cellules selon les quatre méthodes de traitement. Toutes les barres d'erreur sur les graphiques représentent les écarts types. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Procédure opératoire normalisée. Flux opérationnel résumant le protocole standardisé pour la préparation des échantillons, la coloration par fluorescence, l’imagerie à haut contenu, le traitement des images, l’exportation des images et l’analyse des données. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1. Données brutes relatives à l'analyse du nombre de cellules, de la surface et de l'intensité de fluorescence présentées dans la Figure 5. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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En utilisant la méthode de double coloration par PI et Hoechst pour déterminer la viabilité cellulaire, par exemple, l'instrument à haut débit peut calculer rapidement et de manière hautement performante la viabilité cellulaire au sein d'un même lot à l'aide de modules algorithmiques intégrés. Cette méthode présente plusieurs avantages, notamment un faible volume d'échantillon, un coût réduit, des dommages cellulaires minimes, une faible photodégradation de la fluorescence, une résistance à l'extinction et la possibilité de capturer plusieurs images. De plus, le temps d'acquisition d'images pour une plaque de 96 puits est généralement d'à peine 30 à 45 minutes20.

Dans le protocole expérimental, afin de garantir la qualité de l'imagerie, concentrez-vous sur les étapes suivantes : Premièrement, assurez une densité adéquate de la culture pour éviter une densité cellulaire excessive, qui pourrait remplir l'image de cellules, ou insuffisante, ce qui pourrait entraîner l'arrachement des cellules lors des étapes de coloration et de lavage. Deuxièmement, lavez soigneusement le colorant afin d'éviter que des résidus n'affectent l'imagerie. Pour les cellules faiblement adhérentes, manipulez l'ajout et le retrait des liquides délicatement et lentement avant et après la coloration, en évitant l'ajout vertical. Utilisez un ajout par la paroi latérale pour éviter la perte de cellules au centre du champ d'observation, en portant une attention particulière au détachement des cellules mortes lors des tests de viabilité. Envisagez de centrifuger la plaque d'échantillons pour réduire les erreurs expérimentales si nécessaire. Troisièmement, choisissez un temps d'exposition approprié. Un temps d'exposition trop long augmentera le temps total d'acquisition d'images et pourrait manquer la fenêtre de détection, entraînant potentiellement une surexposition de certaines cellules ou une reconnaissance du fond. Un temps d'exposition trop court peut entraîner une information d'image incomplète, avec perte de certains détails caractéristiques.

Si une image nette ne peut être obtenue pendant l'acquisition, remonter le problème jusqu'à l'état des cellules, aux résidus de colorant, aux paramètres de réglage et à d'autres facteurs. Pendant l'expérience, s'il n'y a pas de cellules au fond du puits, aucune image ne sera détectée dans le champ de vision. Si deux couches cellulaires ou plus, irrégulières, se forment au fond du puits, la mise au point devient difficile, ce qui donne une image floue. Un excès de résidu de colorant peut entraîner un fond intense, rendant l'image cible moins visible. De grandes zones de résidus peuvent masquer les cellules présentes dans le champ, tandis que de petites particules de résidu, de taille comparable à celle des cellules, peuvent interférer avec la reconnaissance et la segmentation ultérieures des images. Si la hauteur de la plaque et celle des puits ne sont pas réglées conformément aux spécifications du fabricant pour la plaque 96 puits, aucune image ne sera trouvée dans le champ de vision, ou la position de l'échantillon peut se décaler, risquant d'endommager l'objectif.

Compte tenu de la souplesse et de la simplicité d'utilisation, ainsi que des bons résultats de traitement des données, le module de traitement d'image optimal pour la méthode de double coloration PI et Hoechst est Live-Dead. Ce programme est spécifiquement optimisé pour les colorants PI et Hoechst et, par rapport aux autres méthodes et logiciels, est simple à utiliser, effectue des calculs rapides et permet un chargement facile par lots des images dans la base de données avec des paramètres constants. Les résultats sont plus comparables que ceux obtenus avec le logiciel couramment utilisé actuellement, ImageJ. Différents modes expérimentaux peuvent utiliser des méthodes propriétaires correspondantes ou le mode de calcul général Multi-Wavelength Cell Scoring ; les méthodes propriétaires sont plus pratiques, tandis que le mode de calcul général impose moins de restrictions quant aux méthodes de coloration. Différents protocoles de coloration nécessitent différents modules de traitement d'image optimaux. Il convient de développer des méthodes de calcul adaptées aux objectifs expérimentaux. La méthode ExportPro pour l'exportation des images est simple et facile à apprendre, permettant la prévisualisation d'objets de référence. Elle est adaptée aux débutants, dotée d'une interface graphique qui explique clairement la signification des paramètres et simplifie les mesures, réduisant ainsi les obstacles liés à l'analyse multi-logiciels et permettant de gagner du temps sur l'apprentissage des outils.

Cette étude n'a validé qu'un protocole de coloration de base. À titre de référence, d'autres protocoles expérimentaux qui diffèrent sensiblement de celui-ci doivent encore être validés par rapport à la nouvelle norme.

Le système d'imagerie à haut contenu constitue une plateforme technologique fondamentale qui intègre l'imagerie haute résolution, la détection synchrone multiparamétrique, l'analyse quantitative automatisée et le criblage à haut débit21,22,23. La conception intégrée des capacités d'imagerie et de calcul de l'appareil devrait permettre le développement et l'établissement de protocoles expérimentaux et de modèles computationnels correspondants pour un plus grand nombre d'expériences d'imagerie existantes7,24, améliorant ainsi la cohérence et la comparabilité des données obtenues par différents opérateurs, à différents moments et entre différentes séries.

Déclarations de divulgation

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Tous les auteurs déclarent qu'il n'existe aucun conflit d'intérêts. Lors de la traduction du manuscrit, Zhipu AI a été utilisé uniquement pour la traduction et non pour générer des données de recherche, des résultats expérimentaux ou un contenu académique central. Les auteurs assument l'entière responsabilité du contenu du manuscrit.

Remerciements

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Les auteurs remercient le soutien fourni par la fondation de l'École de l'université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu. Les auteurs remercient le soutien provenant de la subvention MPRC2022034. Ce financement est utilisé pour développer une méthode d'imagerie dynamique en 3D des bactéries intestinales dans le Decoction Erchen pour traiter des souris obèses simples. Les auteurs reconnaissent la plateforme de recherche fournie par l'Institut innovant de médecine et de pharmacie chinoises de l'université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu et par l'Institut d'études interdisciplinaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de centrifugation de 1,5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
Pointes de pipette de 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
Tube de centrifugation de 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
Pointes de pipette de 2,5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
Pointes de pipette de 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
Tube de centrifugation de 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
Plaque de culture cellulaire à 96 puitsCorning Incorporated3599
Pipette monocanal réglable, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Pipette monocanal réglable, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Pipette monocanal réglable, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Pipette monocanal réglable, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
Boîte de culture cellulaireCorning Incorporated430167
Flacons cryogéniquesLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)Life Technologies Limited11966-025Dans cette étude, le DMEM complet a été préparé à l’aide de 10 % de SFB, 1 % de solution de pénicilline-streptomycine et 89 % de DMEM.
Incubateur CO2 ESCO CelCultureEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Sérum de veau fœtal (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.164210-50
Colorants fluorescents Hoechst 33342Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
Cellule HT22Procell Life Science & Technology Co.,Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ est l’un des logiciels de traitement d’image utilisés dans le manuscrit.
Système d’imagerie à contenu élevé ImageXpress Micro ConfocalMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalDans le manuscrit, utiliser « Système d’imagerie à contenu élevé » comme substitut au nom de l’instrument.
Centrifugeuse réfrigérée à basse vitesseHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
Logiciel d’acquisition et d’analyse d’images à contenu élevé MetaXpressMolecular Devices, LLCLe logiciel est un complément du système d’imagerie à contenu élevé ImageXpress® Micro Confocal. Dans le manuscrit, « Le logiciel d’analyse fourni avec l’appareil » fait référence à ce logiciel.
Armoire à flux laminaire vertical OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Solution de pénicilline-streptomycineProcell Life Science & Technology Co.,Ltd.PB180120
Solution d’iodure de propidium (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Solution de trypsine-EDTABasalMedia Technology Co.,Ltd.S310KJ

Références

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Flux de travail d imagerieViabilit cellulaireMarquage PI HoechstCellules HT22M thodes de traitement d imageScoring cellulaire multi longueurs d ondeEssai de viabilit mortComparaison avec ImageJ
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