Un protocole efficace d’élevage et de microinjection pour la modification génétique de la mouche stable, Stomoxys calcitrans

Summary

Ce protocole décrit une méthode fiable de microinjection d’embryons pour intégrer du matériel génétique étranger dans le génome de mouche stable, un système de criblage fluorescent pour surveiller le développement embryonnaire post-injection, ainsi qu’un substrat d’élevage larvaire composé d’agar de jaune d’œuf enrichi en charbon actif inoculé avec Escherichia coli qui soutient le développement de l’œuf à l’adulte.

Abstract

Les mouches d’écurie sont des nuisibles sanguinaires du bétail, des animaux de compagnie et des humains, et on les trouve sur tous les continents sauf l’Antarctique. Les morsures douloureuses des adultes masculins et féminins induisent des comportements liés au stress chez le bétail, entraînant une perte de poids et des pertes économiques substantielles pour les producteurs. Les mouches d’écurie mâles et femelles sont toutes deux des sang-mangeants obligatoires, ce qui pose un défi à la technique des insectes stériles et à d’autres stratégies de gestion des ravageurs nécessitant une libération massive des mâles. Les stratégies actuelles de gestion stable des mouches nuisibles ne parviennent souvent pas à contrôler adéquatement les populations de mouches. Bien que de nombreuses méthodes de manipulation génétique pour introduire du matériel génétique exogène ou provoquer des knockouts génétiques aient été développées pour les moustiques, Drosophila et d’autres groupes d’insectes modèles, les méthodes de transformation génétique des mouches écrasées restent limitées. Ce protocole décrit une approche fiable et améliorée pour introduire du matériel génétique étranger dans les mouches stables, utilisant un variant hyperactif de la transposase piggyBac et un nouveau milieu solide d’élevage larvaire qui soutient la récupération, l’éclosion, l’alimentation et le criblage fluorescent après microinjection embryonnaire.

Introduction

Les mouches d’écurie (Stomoxys calcitrans L., 1758) sont des ravageurs économiques importants et des vecteurs de maladies du bétail ^1,2,3 et ont une distribution cosmopolite à l’échelle mondiale. Les stratégies de gestion intégrée des ravageurs (MII) échouent souvent à contrôler adéquatement les populations de mouches^{stables 2,3}, entraînant des pertes annuelles estimées à plus de 2 milliards de dollars américains rien^{qu’aux États-Unis 3}. De plus, la résistance aux insecticides a été documentée dans des populations de mouches stables^{en Europe 4,5} et a également été rapportée aux^{États-Unis 6}. Par conséquent, les approches de lutte génétique telles que la technique des insectes stériles (SIT) et les systèmes de transmission génétique représentent des ajouts souhaitables aux programmes traditionnels de MIP.

Les efforts antérieurs pour développer des méthodes de lutte génétique chez les mouches stables, y compris la génération de souches de sexage génétique pour le SIT, reposaient sur la sélection génétique et la translocation induite^{par la radiation 7,8}. Ces approches sont laborieuses et limitées à des modifications non transgéniques. Par la suite, O’Brochta et al.⁹ a démontré que l’utilisation du système de transposase d’Hermès permettait d’intégrer des transgènes dans S. calcitrans ; cependant, le protocole a permis une faible efficacité de transformation, avec environ 0,11 % des embryons injectés produisant une descendance transgénique, et a produit une faible expression du marqueur de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) sous le contrôle d’un promoteur^{exogène 9}.

D’autres approches de manipulation génétique, y compris les systèmes CRISPR-Cas, n’ont pas encore été largement appliquées chez les mouches stables, en partie à cause de la difficulté à pénétrer le chorion résilient des embryons de mouches stables. Le chorion externe dur est comparable à celui des autres mouches^{musclées 10,11}. Les tentatives d’injection à travers le chorion à l’aide d’aiguilles en quartz ou d’enlever le chorion avec un ruban adhésif double face ont échoué, nécessitant un traitement avec une solution oxydante (hypochlorite de sodium à 3 %, NaOCl), ce qui réduit le taux d’éclosion des œufs.

Les mouches stables peuvent être maintenues à long terme en laboratoire, et les stades immatures sont généralement élevées dans des substrats cellulosiques fermentés tels que des copeaux de bois, du son de blé ou de la paille complétée en azote, y compris des compléments de protéine de veau ou des flocons de poisson¹². Cependant, ces substrats présentent plusieurs inconvénients lorsqu’ils sont utilisés pour l’élevage d’embryons microinjectés. Leur opacité et leur haute autofluorescence rendent difficile l’identification des larves positives à GFP après l’éclosion et l’enfouissement dans le substrat. De plus, bien qu’une certaine présence bactérienne soit nécessaire à la survie^{larvaire 13}, les milieux fermentés introduisent des communautés bactériennes et fongiques imprévisibles qui peuvent endommager ou consommer les embryons avant l’éclosion. Ces limitations ont empêché la récupération des larves transformées utilisant les méthodes d’injection et d’élevage précédemment^{décrites 9,} soulignant la nécessité d’un protocole d’injection plus fiable permettant également le dépistage fluorescent tout au long du développement.

Voici un protocole de microinjection reproductible qui intègre des améliorations dans la sélection des transposases, la méthodologie d’injection, ainsi que les milieux de criblage et d’élevage. Ces modifications facilitent le développement de mouches stables génétiquement modifiées pour des applications telles que les souches de sexage génétique pour le SIT, les gène drives et les knockouts génétiques médiés par CRISPR-Cas. Les améliorations clés incluent l’utilisation de la transposase hyperactive^{piggyBac 14} sous le contrôle du promoteur stable de choc thermique (hsp)83, la dessiccation embryonnaire pour minimiser la perte d’ooplasme après injection, ainsi que l’élimination du ruban adhésif et de l’huile d’halocarbone lors de l’injection embryonnaire.

La récupération des embryons injectés a été encore améliorée en remplaçant les milieux d’élevage en vrac par des plaques d’agar nutritive plates et pigmentées, inoculées avec une pelouse d’Escherichia coli. Cette formulation d’agar offre deux avantages majeurs. Premièrement, il fournit une source alimentaire bactérienne monogénique prévisible pour le développement larvaire. Deuxièmement, elle fournit un fond à fort contraste et faible autofluorescence qui facilite l’observation de la morphologie, du développement et de l’expression de la GFP chez les larves de première génération (G0). Les mouches domestiques et les mouches d’écurie se développent et se nymphosent normalement sur des plaques d’agar à base de jaune d’œuf inoculées par E. ^{coli 13,15}. La formulation décrite ici incorpore de la poudre de charbon actif comme additif non réactif et sûr pour les aliments afin de réduire davantage la fluorescence de fond.

Protocol

Toutes les expériences et opérations ont été réalisées avec l’approbation du Comité de Biosécurité Institutionnelle de Texas A&M (protocole IBC2019-081). Les réactifs, produits chimiques et outils utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Élevage de mouches pour la production d’œufs

1. Préparation des cages pour adultes
   1. Réglez le thermostat d’une chambre d’incubation à 28°C et mélangez 3 kg de chlorure de sodium avec ~5 L d’eau du robinet dans une plaque de 10 L, dissoudant ~50 % du sel.
   2. Placez cette cuve à saumure non couverte au fond de la chambre incubatrice pour maintenir une humidité d’environ 80 % d’humidité relative à l’humidité relative. Maintenez un cycle jour-nuit 16:8 dans la chambre ou la pièce.
   3. Tapisser le fond des cages à insectes (cages en acier inoxydable/aluminium de 30 x 30 cm avec filet en maille) de deux couches d’essuie-tout et placez un gobelet à condiments jetables de 45 mL rempli de sucre de table granulé par-dessus la couche d’essuie-tout (Figure 1A).
      REMARQUE : Les essuie-tout aident à absorber les taches de mouche, et le sucre fournit une source de nourriture avant l’alimentation sanguine.
   4. Remplissez un bécher Griffin de 250 mL d’environ 100 mL d’eau du robinet à température ambiante et versez un carré de tissu en coton noir de 20 cm x 20 cm (coupé à partir d’une taie d’oreiller ou draps noirs simples) dans l’eau jusqu’à humidifier le tissu. Ajustez le tissu noir pour que ses bords s’étendent de 1 à 2 cm au-delà du bord du bécher (Figure 1B).
      REMARQUE : Ce tissu humide fournit à la fois de l’eau liquide et une surface d’oviposition pour les mouches adultes. La mort peut survenir rapidement si les adultes n’ont pas accès à une source d’humidité.
   5. Transférez entre 500 et 1 500 nymphes de mouches étables dans un petit plat ou un bécher et placez-les dans la cage à insectes. Placez la cage adulte dans la chambre d’élevage humide (étape 1.1.1) et surveillez quotidiennement l’éclosion. Une fois les adultes émergés, commencez à se nourrir quotidiennement avec du sang bovin citaté (section 1.2).
2. Nourrir les mouches adultes
   1. Préparez le sang bovin citaté en ajoutant une concentration finale de 10,9 mM de dihydrate de citrate trisodium au sang bovin fraîchement collecté.
   2. En résumé, suspendez ~12,8 grammes de sel de citrate dans un volume minimal d’eau déionisée et ajoutez à 4 litres de sang prélevés à l’abattoir local.
      REMARQUE : Les récipients de sang doivent avoir des couvercles vissés (par exemple, bouteilles carrées, à large bouche, grip de 4L) et être soigneusement nettoyés avec du savon tiède et de l’eau avant utilisation. À l’abattoir, évitez de prélever le premier ~1 litre de sang bovin d’un animal abattu afin de minimiser la contamination par les poils, la transpiration, la saleté et d’autres coagulants.
   3. Congelez le sang bovin citaté dans 200 mL d’aliquotes et décongelez selon les besoins, en gardant les aliquotes décongelées au réfrigérateur à 4°C pendant jusqu’à une semaine.
   4. Fournir ~40 mL de sang à température ambiante pour 600 mouches à chaque cage adulte.
   5. Le sang peut être offert dans un contenant à condiments ou un bécher, et une éponge en gaze en coton pliée et non stérile doit être insérée dans le vaisseau pour évacuer le sang. Agitez la mèche jusqu’à ce que le coton soit complètement saturé et insérez-le dans la cage.
      REMARQUE : Le sang doit être changé quotidiennement à partir de 24 heures après l’éclosion.
3. Collecte d’œufs
   1. Une fois les œufs observés sur le tissu en coton noir, retirez le tissu du bécher et lavez les œufs dans un contenant plastique peu profond séparé de ~700 mL à l’aide d’une bouteille de lavage (Figure 2A). L’oviposition se produit généralement lorsque les mouches ont 7 à 10 jours.
      REMARQUE : Vérifiez aussi les coupes de sang pour les œufs et recueillez les ovules égarés qui pourraient y être déposés.
   2. Collectez les œufs sur du papier filtre via filtrage sous vide. Cela se fait en plaçant un papier filtre noir dans un entonnoir de Buchner, en appliquant un vide, puis en versant les œufs de l’étape 1.3.1 sur la montage.
   3. Ensuite, transférez les œufs dans un cylindre gradué ou un tube de microcentrifuge gradué de 1,7 mL à l’aide d’une bouteille de lavage et notez le volume d’œufs collectés (Figure 2B).
      REMARQUE : Évitez l’immersion prolongée des œufs dans l’eau, car la mortalité commence à augmenter ~10 minutes après l’immersion.
4. Préparation des milieux larvaires en vrac
   1. Collectez des matériaux pour des milieux larvaires en vrac (Figure 3A), comme indiqué dans le Tableau 1.
   2. Dans un bécher de 1000 mL, ajoutez le complément de protéine de veau et toute l’eau du robinet. Laissez réhydrater toute la nuit à température ambiante.
   3. Ajoutez le son de blé et la vermiculite dans un autre contenant de mélange plus grand.
   4. Après une réhydratation nocturne, remuez soigneusement le complément de veau réhydraté pour défaire les grumeaux, puis versez le mélange dans le contenant avec du son de blé et de la vermiculite. Mélangez soigneusement jusqu’à obtenir un son homogène et que tout le son de blé soit enrobé de la bouillie de compléments pour veaux.
   5. Transférez le milieu en vrac dans un récipient de stockage alimentaire en polypropylène formant une couche de ~8 cm de profondeur couvrant tout le fond du récipient (Figure 3B).
   6. Ajouter ~1 000 embryons (environ 0,2 mL d’œufs pour 2,2 L de milieux en vrac) en collectant des embryons via .filtration sous vide sur un papier filtre circulaire de 90 mm de diamètre, puis le placement avec les œufs face cachée au centre du bac à substrat (Figure 3B, C).
   7. Couvrez le papier filtre de ~1 cm de substrat pour retenir l’humidité (Figure 3C) et couvrez le récipient d’un rectangle surdimensionné en tissu de coton noir, avec 5 cm de tissu en coton dépassant le bord du récipient.
   8. Faites un grand trou (~12 cm de diamètre) dans le couvercle du contenant alimentaire pour permettre l’échange gazeux et fixez le couvercle sur le bac à matériaux tout en retenant le tissu de coton noir entre le récipient et le couvercle (Figure 3D).
      REMARQUE : Cela sert de joint, empêchant l’espace entre le couvercle et le contenant d’emprisonner les larves du^1er stade dans les gouttelettes de condensation.
   9. Placez le bac de substrat fini dans la chambre d’élevage des adultes jusqu’à la nymphose et surveillez le développement larvaire (Figure 4) (la nymphose a lieu en ~10 jours selon la température du milieu et la densité larvaire).
      REMARQUE : Le revêtement en tissu doit être suffisamment fin pour empêcher le passage des larves de premier stade, mais suffisamment perméable pour empêcher la formation de condensation sur les parois intérieures des bacs de substrat, ce qui peut piéger et noyer les larves.
5. Séparation des chrysalides
   1. Retirez le tissu des poupouses et récupérez les nymphes avec une cuillère ou une cuillère.
      REMARQUE : Les nymphes de mouches stables apparaissent sous forme de cylindres rouge-brun non mobiles, de 4 à 7 mm de long, contrairement aux larves mobiles jaune-blanc. Les chrysalides s’accumulent généralement sur le périmètre extérieur des parois du récipient ou sur des positions humides et surélevées dans leur bac de substrat lorsque les mouches commencent la métamorphose, passant de larves à nymphes puis à adultes.
   2. Pondez 500 à 1 500 nymphes à ~1 cm de profondeur sur un plat et placez dans une nouvelle cage propre comme décrit à la section 1.1 pour propager la génération suivante.

Figure 1 : Matériaux d’élevage des mouches adultes. (A) Cage d’élevage des mouches adultes montrant la coupe de saccharose (S) et la coupe d’oviposition (O). (B) Coupe d’oviposition préparée avec un tissu de coton noir saturé d’eau, s’étendant légèrement au-delà du bord du bécher. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Collecte des œufs. (A) Collecte des œufs à partir du tissu d’oviposition à l’aide d’une bouteille de lavage. (B) Récupération des œufs par filtration sous vide sur du papier filtre à fort contraste. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Matériaux pour milieux larvaires en vrac
Réactif	Messe (g)
Eau	900
Son de blé	230
Supplément pour le mollet	100
Vermiculite (grossier A4)	70
Matériaux pour les solutions de déchorionation
Solution	Composition
Bain oxydant	Hypochlorite de sodium à 3 % dans de l’eau déionisée
Bain de lavage	Triton X-100 solution 0,02 % dans l’eau déionisée
Rincez	Eau déionisée
Matériaux pour le criblage et les plaques d’élevage en agar noir
Réactif	Messe (g)
Eau	500
Jaunes d’œufs en poudre	18
Charbon actif	4
Chlorure de sodium	1

Tableau 1 : Réactifs pour les milieux larvaires en vrac, les solutions de déchorionation et les plaques d’agar noir. Des réactifs utilisés pour la préparation de milieux larvaires en vrac pour le maintien de la colonie, ainsi que pour la composition des solutions servant à affaiblir et à retirer le chorion des embryons de mouches stables, et les matériaux nécessaires à la préparation de 500 mL de milieu de criblage et d’élevage d’agar noir.

Figure 3 : Préparation de milieux larvaires en vrac. (A) Matériaux utilisés pour la préparation de milieux larvaires en vrac : complément de protéine de veau (CM), son de blé (WB), vermiculite (VM), contenant de stockage (SC), couvercle (L) et joint en tissu (FG). (B) Un mélange approfondi des composants du support. (C) Poser le papier filtre (EP) couvert d’œufs face cachée sur la surface du média et couvrir avec un support supplémentaire pour éviter la dessiccation. (D) Installation du joint en tissu de coton entre le récipient et le couvercle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Développement larvaire dans des milieux en vrac. Les contenants transparents permettent de surveiller le développement larvaire et l’état du milieu. Les larves (L) sont visibles sur les parois du récipient, le couvercle et à l’intérieur du substrat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Préparation à l’injection : dé-chorionisation et dessiccation

1. Placez un tissu en coton noir humidifié dans un bécher comme décrit à l’étape 1.1.4 et transférez-le dans une cage pour adultes pendant 25 minutes afin de collecter les œufs. Rincez les œufs sur un tamis en acier inoxydable de 106 μm à l’aide d’un flacon de lavage.
   REMARQUE : Une période de collecte de 25 minutes donne généralement environ 400 œufs.
2. Laissez les embryons reposer sans être dérangés sur le tamis pendant 30 minutes supplémentaires.
3. Pendant que les embryons vieillissent, préparez 150 mL chacune des solutions oxydantes, de lavage et de rinçage décrites dans la section « Matériaux pour les solutions de déchorionation » du tableau 1 (Figure 5). Utilisez un volume suffisant pour recouvrir les embryons d’environ 1 cm de solution.
4. Immergez le tamis contenant les embryons dans le bain oxydant pendant 2 minutes et agitez doucement les embryons à l’aide d’une pipette Pasteur (Figure 6A).
   REMARQUE : L’aspiration répétée et la distribution de solution pour créer un vortex circulaire aident à concentrer les embryons au centre du tamis et empêchent les embryons fraîchement déchorionés d’adhérer aux parois du tamis.
5. Retirez le tamis du bain oxydant et tapez l’excès de solution. Transférez le tamis dans la solution de lavage et agitez par aspiration puis en distribuant pendant 2 minutes.
6. Transférez le tamis contenant les embryons dans la solution de rinçage et agitez comme décrit à l’étape 2.4 pendant 2 minutes. Retirez le tamis de la solution de rinçage et retirez l’excès d’eau.
7. Placez une toile de verre stérile sur le tamis et, sous un microscope de dissection, utilisez un pinceau en nylon à pointe fine pour transférer les embryons (Figure 6B) du tamis au bord de la gaine. Placer les embryons proches les uns des autres sans les laisser se toucher, le pôle postérieur plus large faisant face au bord de la toile de couverture. Évitez de plier, déformer ou déchirer les embryons lors du transfert.
8. Préparez une chambre de dessiccation en recouvrant le fond d’une fiole de 1 L avec 100 mL de dessicant sulfate de calcium et en scellant la fiole avec un bouchon en caoutchouc.
   REMARQUE : Après 24 heures d’équilibre, la chambre de dessiccation atteint généralement une humidité relative de <5 % à 23 °C.
9. Retirez l’excès d’eau de la gaine et placez la gaine contenant des embryons déchorionés sur le désicant. Refermer la fiole avec un bouchon en caoutchouc et dessécher les embryons pendant 8 minutes.
10. Retirez la toile de couverture de la chambre de dessiccation et placez-la sur l’étage du microscope sous un objectif de 20× pour la microinjection.

Figure 5 : Solutions de déchorionation. De gauche à droite : tamis en acier inoxydable, solution oxydante, solution de lavage et solution de rinçage utilisés pour la déchorionation embryonnaire. L’hypochlorite de sodium est maintenu sous forme de solution standard à 6 % protégée de la lumière, et le Triton X-100 est maintenu sous forme de solution d’origine à 10 × et dilué à une concentration finale de 0,02 % avant utilisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Déchorionation embryonnaire. (A) L’aspiration douce et la distribution de solution génèrent un vortex qui concentre les embryons au centre du tamis et réduit l’adhésion aux parois du tamis. (B) Embryon déchorioné émergeant du chorion translucide après rinçage. Le pôle antérieur (extrémité plus étroite) émerge généralement avant le pôle postérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Microinjection

1. Retirez des aiguilles de microinjection en quartz à partir de capillaires en verre filamentés de 100 mm (I.D. 0,7 mm, O.D. 1,0 mm) en utilisant les paramètres listés dans le Tableau 2. Conservez les aiguilles dans un endroit sans poussière jusqu’à utilisation.
   REMARQUE : Des aiguilles borosilicates de géométrie similaire peuvent également être utilisées.
2. Préparez un tampon d’injection (0,1 % p/v phénol rouge dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS), pH 7,4) et filtrez-stérilisez à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
3. Préparez 20 μL de mélange d’injection en combinant 10 μg chacun de plasmide auxiliaire piggyBac et plasmide donneur, qui contient la charge génétique entre les répétitions terminales inversées gauche et droite de PiggyBac, avec 4 μL de tampon d’injection. Diluez jusqu’à une concentration finale de 500 ng/μL à l’aide d’eau sans nucléase.
   REMARQUE : Le plasmide auxiliaire comprend la séquence promoteur hsp83 de 3,1 kb en amont du codon de départ hsp83. et la séquence codante hyperactive de la transposase piggyBac.
4. Transférez le mélange d’injection dans un filtre à seringue PTFE de faible volume de 0,20 μm et placez le filtre dans l’ouverture d’un tube microcentrifuge de 0,5 mL (Figure 7A). Centrifugez à ≥11 000 x g pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que tout le mélange d’injection soit passé par le filtre. Conservez le mélange d’injection inutilisé à -20 °C.
5. Remplissez une aiguille de microinjection en quartz avec environ 2 μL de mélange injectable à l’aide d’une pointe de pipette à micro-gel (Figure 7B). Évitez d’introduire des bulles d’air lors du chargement.
   REMARQUE : Orientez l’aiguille de microinjection parallèlement à l’axe long de l’embryon et maintenez un décalage angulaire horizontal et vertical zéro pour minimiser la déchirure et le cisaillement.
6. Tapotez doucement la pointe de l’aiguille contre le bord d’une lame en verre jusqu’à ce que le mélange d’injection passe à travers la pointe de l’aiguille (Figure 7C).
   REMARQUE : Cassez progressivement la pointe de l’aiguille pour créer la plus petite ouverture nette qui permet tout de même le flux injection-mélange.
7. Injectez l’embryon par le pôle postérieur immédiatement après la dessiccation en utilisant environ 700 hPa de pression d’injection et 300 hPa de contre-pression.
8. Percer doucement l’embryon et injecter environ un dixième du volume embryonnaire avec le mélange injectable (Figure 7D–F).
   REMARQUE : Minimiser la pénétration de l’aiguille pour diminuer la perturbation de la membrane vitelline et prévenir la perte d’ooplasme lors du retrait de l’aiguille.
9. Transférez la gaine de couverture dans une boîte de Petri doublée d’un papier filtre noir stérile et humidifié de 90 mm immédiatement après l’injection et faites éclore à température ambiante pendant 48 heures.
   REMARQUE : Effectuer toutes les injections dans les 2 heures suivant l’oviposition pour cibler les embryons avant le stade syncytial.
10. Examinez les embryons pour l’éclosion toutes les 12 à 16 heures. Transférer les larves nouvellement écloses et la gaine de verre sur une plaque d’agar inoculée et conditionnée préparée comme décrit à la section 4.

Paramètre	Chaleur	Fil	Vel	Del	Tirez
Valeur	825	5	60	150	175

Tableau 2 : Paramètres de tirage de l’aiguille. Paramètres utilisés pour générer des aiguilles de microinjection en quartz.

Figure 7 : Microinjection d’embryons. (A) Filtration du mélange injectable à l’aide d’un filtre à seringue imbriqué dans un tube microcentrifuge de 0,5 mL. (B) Chargement du mélange d’injection filtré dans une aiguille de microinjection à l’aide d’une pointe de pipette à chargement gel. (C) Géométrie terminale d’une aiguille de microinjection en quartz. (D) Alignement de l’aiguille avec le pôle postérieur de l’embryon. (E) Pénétration de la surface de l’embryon tout en minimisant la perturbation de la membrane vitelline. (F) Injection d’environ un dixième du volume embryonnaire suivie d’un retrait par aiguille. Une transparence accrue indique un déplacement de l’ooplasme par le mélange injecté. Barre d’échelle = 400 μm (D–F) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Préparation de la plaque traitée

1. Formulation du milieu agar
   1. Préparez le milieu décrit dans la section « Matériaux pour le criblage et les plaques d’élevage de l’agar noir » du tableau 1 et l’autoclave pendant 15 minutes à 121 °C. Versez l’agar à 40 °C ou conservez-le à température ambiante avant de le réchauffer et de le distribuer dans des boîtes de Petri de 90 mm.
      REMARQUE : Faites tourner vigoureusement avant de verser pour resuspendre les particules solides.
2. Inoculation des plaques
   1. Diluez une culture de 24 h d’Escherichia coli en OD600 = 0,200 dans un bouillon Luria-Bertani et dispensez 200 μL sur une plaque d’agar refroidie et solidifiée. Étalez la culture uniformément à l’aide de billes de verre stériles ou d’un écarteur de verre et laissez la plaque absorber l’excès d’humidité (Figure 8A, B).
      REMARQUE : Utilisez des plaques d’agar dans le délai d’un mois suivant le versement ou jetez-les pour garantir une croissance fiable des bactéries et des larves.
3. Conditionnement des plaques
   1. Pliez 6 × 6 cm de feuilles de papier filtre noir pour créer 6 à 10 rainures ondulées et stérilisez par cuisson ou autoclavage. Placez un papier filtre ondulé stérile de façon aseptique sur la boîte de Petri inoculée et humidifiez-la avec plusieurs gouttes d’eau stérile (Figure 8C).
   2. Stériliser en surface les larves de type sauvage (WT) non traitées et non injectées et transférer 10 larves dans le papier filtre humidifié.
      REMARQUE : Stériliser les embryons de WT en les immergeant dans de l’eau de Javel à 10 % (0,6 % de NaOCl) pendant 1 minute, puis un rinçage dans de l’eau déionisée stérile pendant 2 minutes.
   3. Placez un papier filtre de 90 mm entre le couvercle et le corps de la boîte de Petri pour servir de joint.
   4. Laissez les larves de WT conditionner les plaques pendant 24 h avant d’ajouter des embryons injectés sur des bâtons de verre (Figure 8C). Retirez les larves de WT après l’éclosion des premiers embryons injectés.

Figure 8 : Préparation de la plaque d’agar et récupération post-injection. (A) Inoculation des plaques d’agar avec une OD600 = 0,2 culture d’Escherichia coli à l’aide de billes de verre stériles. (B) Absorption de l’excès d’humidité de surface avant le transfert embryonnaire. (C) Placement d’un joint de papier filtre de 90 mm entre le couvercle et le corps de la boîte de Petri. (D) Criblage des larves pour les marqueurs fluorescents sur des plaques d’agar conditionnées. Les embryons injectés sont récupérés sur un papier filtre de 90 mm saturé en eau déionisée, placé dans le couvercle d’une boîte de Petri inversée et incubés pendant 48 heures avant de les transférer sur des plaques de criblage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Results

En utilisant ce protocole, 431 embryons de mouches stables ont été déchorionés et injectés avec le plasmide donneur piggyBac-Hsp83 et le plasmide auxiliaire Hsp83 à une concentration finale de 500 ng/μL. Sur les 431 embryons injectés, 18 larves ZsGreen-positives (4,2 %) et 8 Zs-Green-negative (1,9 %) ont éclos 48-76 h après l’injection lorsqu’elles ont été criblées sur des plaques d’agar au carbone noir (Tableau 3). Au total, 26 des 431 embryons injectés ont éclos (6,0 %), et 16 des 26 larves écloses ont survécu jusqu’à l’âge adulte (61,5 %).

Espèces	Type d’injection	Construction	# injecté	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	ZsGreen(+) Pupae	ZsGreen(-) Pupae	ZsGreen(+) Adultes	ZsGreen(-) Adultes	# Adultes produisant des descendants ZsGreen(+)
Stomoxys calcitrans	Insertion de transposase	Hsp83 :hy-pBac (aide, 500 ng/uL) Hsp83 : zsGreen (donneur, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Insertion de transposase	Hsp83 :hy-pBac (aide, 500 ng/uL) Hsp83 : zsGreen (donneur, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tableau 3 : Statistiques sur les injections. Taux de survie, de transformation et de récupération après microinjection d’embryons.

Sur les 18 larves G0 ZsGreen-positives, 12 ont survécu jusqu’à la nymphose (66,7 %) et 10 se sont éclosées à l’âge adulte. Six adultes ZsGreen positifs (1,4 % des embryons injectés, 60 % des survivants fertiles de G0) ont produit une descendance ZsGreen positive. Ces descendants (Figure 9A–E) étaient auto-croisés et maintenaient la fluorescence pendant six générations au moment de la rédaction.

Parmi les huit larves ZsGreen-négatives, six ont survécu jusqu’à l’âge adulte (75 %). Aucun des adultes non fluorescents n’a produit de descendants fluorescents.

Figure 9 : Criblage fluorescent des mouches transgéniques. (A) Comparaison des larves F1 exprimant ZsGreen et celles de WT. (B) Fluorescence visible à travers la cuticule nymphale, permettant un dépistage transgénique au stade nymphal. (C,D) Comparaison de trois larves et nymphes exprimant ZsGreen (à gauche) avec trois larves et nymphes WT (à droite) sous éclairage à lumière blanche (C) et fluorescence (D). (E) Mouche adulte transgénique F1 exprimant ZsGreen (à gauche) comparée à une mouche adulte WT (à droite). Barres d’échelle = 1 mm (A), 2 mm (B,E) et 3 mm (C,D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

La transformation génétique des espèces d’insectes non modèles reste un goulot d’étranglement majeur dans le développement et l’évaluation des stratégies de lutte génétique contre les ravageurs et vecteurs des arthropodes.

Pour les mouches stables, le protocole décrit ici réduit le temps, les ressources, la main-d’œuvre et la variabilité liés à l’injection et à l’élevage des mouches G0 après microinjection embryonnaire. De plus, l’utilisation de plaques de criblage en agar noir permet d’observer directement le développement tout au long du cycle de vie, facilitant l’identification et la correction des problèmes survenant lors de l’injection, de la récupération et de l’élevage larvaire. En utilisant les constructions plasmidiques évaluées dans cette étude, le protocole a généré des lignées de mouches transgéniques stables avec moins d’embryons injectés que les méthodes précédemment^{rapportées 9}. Bien que dépassées dans le cadre de cet article sur les méthodes, la confirmation et la localisation des sites d’insertion des transgènes peuvent être réalisées à l’aide d’approches établies telles que la PCR inverse et la PCR par splinkerette.

Un protocole d’injection efficace facilite également de futures études en génomique fonctionnelle, y compris la caractérisation des promoteurs à l’aide de reporters fluorescents ; compétence vectorielle, par analyse génétique inverse des gènes associés à la transmission des pathogènes ; caractérisation des nucléases, y compris l’évaluation de CRISPR-Cas9 et d’autres nucléases programmables chez des mouches stables ; la recherche sur la résistance aux insecticides par la modification des allèles candidats à la résistance ; et des recherches sur la biologie fondamentale, incluant les gènes impliqués dans l’alimentation sanguine, l’accouplement et le développement. Notre protocole élimine également le besoin d’injections d’embryons immergées dans le pétrole et de chambres d’humidité oxygénées pour la récupération post-injection de l’embryon, comme documenté dans la littérature antérieure sur la transformation domestique de Musca et de Lucilia cuprina ^{piggyBac 16,17}.

Plusieurs paramètres sont essentiels à la réussite de la transgenèse. La dessiccation embryonnaire et le moment de l’injection sont particulièrement importants car l’ADN plasmidique doit être introduit avant la cellularisation afin d’assurer son incorporation dans les cellules précurseurs de la lignée germinale. Cependant, le moment précis de la formation du syncytium chez les embryons de mouches stables reste inconnu. De plus, le taux de développement embryonnaire est influencé par la température, et le calendrier de développement des embryons de mouches stables dans différentes conditions environnementales n’a pas été entièrement caractérisé. De futures recherches sur les taux de développement et l’embryogenèse des souches de mouches stables en laboratoire pourraient fournir des éclairages pour optimiser les protocoles de microinjection et de transformation, augmentant ainsi encore l’efficacité et la reproductibilité des protocoles. Cependant, d’ici là, déterminer la fenêtre d’injection optimale reste une limitation méthodologique qui peut affecter l’efficacité de la transformation. Lorsque les taux de survie sont faibles, le dépannage peut être réalisé en comparant les taux d’éclosion et de survie adulte entre les embryons non traités, les embryons déchorionés, les embryons injectés avec du PBS stérilisé par filtre, et les embryons WT élevés sur des plaques d’agar. La littérature antérieure décrivant la transformation de Musca domestique a donné 14 événements d’intégration sur 1 668 injections (0,84 % des injections)¹⁶, et la transformation du ravageur mouton Lucilia cuprina a établi 3 lignées transgéniques à partir d’environ 900 injections d’embryons (0,33 % des injections⁾¹⁷, suggérant que le protocole de transformation stable des mouches décrit dans ce protocole (6 événements d’intégration sur 431 injections, 1,4 % des injections) offre une amélioration de l’efficacité de l’injection par rapport à d’autres espèces de diptériens ravageurs dans la littérature.

Le promoteur constitutif de la mouche stable hsp83 a fourni une expression robuste de ZsGreen tout au long du développement et a soutenu l’expression de la transposase hyperactive piggyBac au début de l’embryogenèse, améliorant ainsi la visibilité des marqueurs fluorescents et l’efficacité de la transformation par rapport à un protocole de transformation⁹ précédemment rapporté. Le plasmide auxiliaire utilisé dans cette étude a été généré en sous-clonant 3,1 kb d’ADN génomique immédiatement en amont du codon de départ hsp83 en un vecteur plasmidique minimal en amont de la séquence codante hyperactive de la transposase piggyBac. Le rapport plasmide aidant/cargo a été établi empiriquement à 1:1 en masse et a été utilisé tout au long de l’étude. Bien que des rapports plasmidiques supplémentaires n’aient pas été évalués, des rapports alternatifs pourraient également s’avérer efficaces.

Les améliorations décrites ici pourraient être applicables aux protocoles de transgenèse pour d’autres arthropodes. De plus, le système de criblage et d’élevage basé sur l’agar est actuellement appliqué à l’injection et au dépistage d’embryons de la mouche soldat noire (Hermetia illucens). Le protocole peut être particulièrement utile pour les efforts de transgenèse chez d’autres mouches muscides, notamment Musca domestica et Haematobia irritans, en raison de leur écologie larvaire similaire et de leur développement dans des substrats fibreux en décomposition. L’utilisation de plaques d’agar inoculées par Escherichia coli pourrait offrir une approche pratique pour le suivi post-injection tout en permettant aux chercheurs d’évaluer le développement embryonnaire, la morphologie larvaire, l’expression des marqueurs, les taux d’éclosion et la récupération globale. Adapter la composante bactérienne du milieu à la biologie de l’espèce cible pourrait encore renforcer l’utilité de cette approche pour développer et optimiser les protocoles de transgenèse.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Chambre de dessiccation
Bacto Agar	Difco	281230	Agar pour plaques de gélose noire
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Tissu de coton noir pour les récipients de collecte d'œufs et garniture en tissu pour les bacs d'élevage des larves
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Dessiccateur pour la chambre de dessiccation
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Média de larve en vrac
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Microscope d'injection
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Source de nutriments pour les plaques de gélose noire
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bactérie utilisée sur les plaques de gélose noire
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Fourniture de pression pour microinjection
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Transfert d'embryons
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Capillaires pour tirer les aiguilles
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Manipulation des échantillons
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Maintien des embryons pendant la déchoriation
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Solution d'eau de Javel pour éliminer le chorion
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Conteneur de média de larve en vrac
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Collecte d'embryons
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	Bouillon LB pour la culture d'E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Microscope pour le déplacement et l'alignement des embryons
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Utilisé pour charger le mélange d'injection dans les aiguilles
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Micromanipulateur pour l'injection
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Utilisé pour filtrer le mélange d'injection
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Tampon d'injection
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigment pour les plaques de gélose noire
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Dispositif pour tirer les aiguilles à partir des capillaires
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Tampon d'injection
Petri plates	VWR	391-0609	Petites boîtes de Petri pour les plaques d'œufs noirs sur gélose
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Colorant pour l'injection
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Bouchon de chambre de dessiccation
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Média de larve en vrac
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Lamelles en verre carrées pour la microinjection
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Lampe fluorescente et filtres pour le criblage des larves
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Répartition des bactéries sur les plaques
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Lavage des embryons pendant la déchoriation
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Déchorionage des embryons
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Lavage des embryons sur les surfaces