Un modèle d’angiogenèse tridimensionnel basé sur des billes microporteuses utilisant des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines

Résumé

Ce protocole décrit un modèle d’angiogenèse tridimensionnel basé sur des billes microporteuses utilisant des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines. Le test permet de visualiser directement la pousse endothéliale et la formation de structures semblables à la lumière, et peut être appliqué à des études sur les mécanismes angiogéniques et des interventions thérapeutiques.

Résumé

L’angiogenèse est un processus biologique en plusieurs étapes impliquant l’activation, la migration, l’allongement, la formation de la lumière, la ramification et l’anastomose. Les systèmes de culture bidimensionnelle conventionnels sont utiles pour l’évaluation préliminaire de médicaments, gènes ou conditions de culture, mais ils ne reproduisent pas adéquatement l’organisation spatiale de la morphogenèse endothéliale au sein d’une matrice extracellulaire tridimensionnelle. Le protocole actuel décrit un test d’angiogenèse tridimensionnel basé sur des billes microporteuses utilisant des cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC). Les HUVEC sont d’abord ensemencés sur des billes microporteuses contenant du collagène porcin de type I dénaturé chimiquement couplé, puis intégrés dans une matrice membranaire basale. Les fibroblastes muqueuseux buccaux sont ensuite ensemencés sur le gel pour fournir un soutien paracrine à la germination endothéliale et à la formation de structures vasculaires. Le milieu de culture est remplacé tous les deux jours, et le comportement de germination ainsi que les phénotypes angiogéniques sont surveillés par microscopie inversée. Dans des conditions de culture appropriées, les pousses endothéliales émergent en quelques jours, suivies de la formation de structures semblables à la lumière et de connexions entre germes. Cette méthode offre une plateforme pratique et reproductible pour les études in vitro de la morphogenèse endothéliale et peut être appliquée à des recherches sur la manipulation génique, l’intervention pharmacologique et la modélisation des maladies.

Introduction

La pousse endothéliale est un événement clé dans l’angiogenèse et implique l’émergence, la migration, la prolifération et l’alignement des cellules endothéliales à partir de structures vasculaires préexistantes, suivies de la formation de la lumière et de l’établissement de réseaux vasculaires^{interconnectés 1,2}. Bien que les systèmes de culture bidimensionnelle conventionnels et les tests de formation de tubes à base de gel soient techniquement simples, ils sont limités dans leur capacité à reproduire le remodelage spatial des cellules endothéliales dans un microenvironnement^{tridimensionnel 3,4}. Le test classique de germination tridimensionnel basé sur des billes de microporteurs reproduit plusieurs stades d’angiogenèse in vitro, notamment la germination endothéliale, l’élongation, la formation de la lumière et l’assemblage du réseau, et est donc devenu une méthode largement utilisée pour la recherche sur l’angiogenèse.

Dans le protocole actuel, un modèle de germination tridimensionnel basé sur des perles de microporteurs utilisant des cellules endothéliales normales de la veine ombilicale humaine est établi. Basée sur des tests de germination de billes microporteuses endothéliales ^{précédemment rapportés 5,6,7}, cette méthode préserve la structure de base du revêtement cellulaire endothélial sur les billes de micro-porteurs, l’intégration dans une matrice tridimensionnelle, et la culture de superposition de fibroblastes, tout en remplaçant le gel de fibrine conventionnel par une matrice membranaire basale pour simplifier la procédure et faciliter l’imagerie de routine. La matrice membranaire basale a été sélectionnée dans ce protocole modifié pour plusieurs raisons pratiques et biologiques. Expérimentalement, il fournit une matrice tridimensionnelle prête à l’emploi qui permet une formation rapide de gels, un simple plongement de billes et une observation microscopique de routine pratique sans les étapes de polymérisation supplémentaires requises pour la préparation du gel de fibrine. Biologiquement, la matrice membranaire basale contient des composants extracellulaires qui soutiennent l’adhésion, la migration, l’extension des germes et la formation de structures luminaires des cellules endothéliales. Par conséquent, cette modification convient aux études nécessitant une visualisation directe du comportement de germination endothéliale, la comparaison des phénotypes angiogéniques et l’évaluation d’interventions pharmacologiques ou génétiques dans un environnement de culture tridimensionnelle. Cependant, comme la matrice membranaire basale diffère du gel de fibrine par la composition de la matrice, les propriétés mécaniques, la dégradabilité et les indices bioactifs, le présent test doit être interprété comme un modèle de germination modifié basé sur des perles de microporteurs plutôt que comme un remplacement direct du test classique basé sur la fibrine. Ces différences liées à la matrice peuvent influencer la cinétique de la germe, la stabilité de la lumière et la morphologie du réseau, et doivent être prises en compte lors de la comparaison des résultats entre différents systèmes d’angiogenèse tridimensionnelle. Ce modèle convient à l’observation du comportement de pousse endothéliale en trois dimensions et peut être appliqué à des études d’intervention pharmacologique, de manipulation génétique et de mécanismes angiogéniques.

Protocole

Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine utilisées dans ce protocole ont été isolées et cultivées à partir de tissus du cordon ombilical humain collectés auprès du Département d’obstétrique du Premier Hôpital du Peuple de la province du Yunnan. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs avant la collecte de l’échantillon. Toutes les procédures impliquant des matériaux d’origine humaine ont été approuvées par le Comité d’éthique médicale du First People’s Hospital de la province du Yunnan (n° d’approbation KHLL2023-KY198). Les fibroblastes mucosaux buccaux humains (HOMF) ont été généreusement fournis par le groupe de recherche du Dr Jiemei Zhai à l’Hôpital stomatologique affilié de l’Université médicale de Kunming. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des cellules

1. Cultivez des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) dans un milieu de croissance cellulaire endothéliale complétés avec un sérum bovin fœtal supplémentaire (FBS) jusqu’à une concentration finale de 10 % à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂. Les cellules utilisées pour le test doivent être exemptes de contamination, présenter une croissance stable et être en phase de croissance logarithmique. Utilisez les cellules aux passages 4 à 6.
2. Cultivez des fibroblastes mucosaux buccaux humains (HOMF) dans un milieu basal à haute glycémie complétés avec un sérum bovin fœtal à 10 % (FBS) à 37 °C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂. Utilisez les cellules aux passages 4 à 6.
3. Avant de revêtir la bille de micro-vecteurs, vérifiez que les deux types cellulaires sont à une confluence appropriée. Évitez les cultures trop confluentes ou une digestion enzymatique excessive, car elles peuvent nuire à la germination ultérieure.

2. Préparation des billes micro-porteurs

1. Hydratez 0,5 g de billes microporteuses sèches dans 50 mL de PBS pendant au moins 3 heures. Après lavage, resuspendez les billes dans 50 mL de PBS pour obtenir une suspension de micro-billes de 10 mg/mL, correspondant à environ 3 × 10⁴ billes/mL.
2. Transférez la suspension dans une bouteille en verre siliconé, stérilisez-la en autoclavant à 115 °C pendant 15 minutes, puis conservez-la à 4 °C jusqu’à utilisation.
3. Avant le revêtement des cellules endothéliales, retirez la solution de stockage et lavez les billes avec du PBS stérile. Équilibrez les billes dans un milieu de croissance cellulaire endothélial à 37 °C pendant au moins 30 minutes.
4. Suspendez doucement les billes équilibrées immédiatement avant l’utilisation pour éviter la sédimentation et l’agrégation des billes.
5. Avant de revêtir la cellule, examinez une petite aliquote de la suspension à billes sous un microscope inversé. Ne procédez que lorsque les billes sont complètement hydratées, suspendues uniformément et exemptes d’agrégats visibles ou de particules fragmentées.

3. Revêtement des cellules endothéliales sur des billes microporteuses

1. Détacher les HUVEC à l’aide de la trypsine et resuspendre les cellules dans un milieu endothélial de croissance.
2. Enrobez les billes de micro-transporteurs à une densité de 1 500 cellules par bille. Mélangez 3 ×^{10 6} HUVEC avec 2 000 billes de microporteurs dans 1,5 mL de milieu de croissance endothélial.
3. Transférez le mélange cellule-billes dans un tube microcentrifuge et incubez pendant 12 heures dans un incubateur de culture cellulaire. Pendant toute la période d’incubation de 12 heures, inversez doucement le tube une fois toutes les 20 minutes afin de maintenir un contact adéquat entre les cellules et les billes et de favoriser une attache uniforme des cellules endothéliales.
4. Après 12 h, transférez les billes enduites dans un flacon^{de 25} cm de 2 cellules contenant 4 mL de milieu de croissance endothéliale et poursuivez l’incubation toute la nuit afin de permettre une fixation ferme des cellules endothéliales à la surface de la bille microporteur.
5. Avant d’incruster, examinez les billes revêtues représentatives sous un microscope inversé. Procéder à l’inclusion matricielle seulement lorsque plus de 80 % des billes examinées présentent une couche cellulaire endothéliale continue et relativement uniforme à la surface de la bille, avec un minimum de cellules libres, aucun amas cellulaire évident et aucune agrégation sévère des billes. Les billes avec un revêtement irrégulier, de gros groupes cellulaires ou une agrégation extensive ne doivent pas être utilisées pour l’encastrement.
6. Si les perles adhèrent au fond de la flasque, secouez doucement la fiole pour les libérer. Évitez la pipetage vigoureuse, qui peut provoquer l’agrégation des billes ou le décollement cellulaire.

4. Incorporation des billes revêtues dans une matrice tridimensionnelle

1. Transférez les billes microporteuses endothéliales recouvertes de cellules dans un tube centrifuge de 15 mL et laissez les billes se déposer par gravité. Retirez l’excès de médium et ajoutez un volume approprié de substrat frais.
2. Mélangez la suspension des billes microporteuses avec une matrice membranaire de base prérefroidie à un ratio 1:1 (v/v) pour obtenir une concentration finale de 500 billes/mL.
3. Ajoutez 100 μL de suspension à billes matricielles au centre de chaque puits d’une plaque à 24 puits, permettant au mélange de former une gouttelette de gel en forme de dôme sans toucher la paroi du puits. Mélangez doucement la suspension juste avant de la distribuer et évitez d’introduire des bulles d’air.
4. Laissez la plaque à 24 puits à température ambiante pendant 5 minutes pour permettre la gélification initiale et la stabilisation de la gouttelette de gel. Ensuite, incubez la plaque à 37 °C à 5 % de CO₂ pendant 15 minutes, puis une incubation supplémentaire de 15 minutes en position inversée pour assurer une gélification complète et une formation correcte du gel.
5. Une fois le gel complètement solidifié, procéder immédiatement à la culture de superposition de fibroblastes.

5. Culture de superposition de fibroblastes

1. Resuspendez 3 × 10⁴ fibroblastes muqueuseux oraux humains (HOMF) dans 1 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales et ajoutez doucement la suspension cellulaire le long de la paroi de chaque puits, permettant ainsi aux cellules de se répartir sur la surface du gel sans perturber directement le dôme du gel.
2. Poursuivre l’incubation dans un milieu de croissance cellulaire endothélial à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂. Les fibroblastes muqueuseux buccaux humains sont utilisés comme cellules de soutien car ils fournissent des signaux paracrins d’origine stromale qui favorisent l’extension, la stabilisation et le remodelage vasculaire des pousses endothéliales dans le système de culture tridimensionnelle.

6. Entretien de la culture et observation microscopique

1. Remplacez le substrat de culture tous les deux jours. Lors des changements de milieu, aspirez lentement le milieu usé et ajoutez un substrat de culture frais le long de la paroi du puits pour éviter de perturber le gel.
2. Observez les cultures quotidiennement ou un jour sur deux au microscope inversé en utilisant le mode champ clair ou contraste de phase. Pour une analyse quantitative longitudinale, sélectionnez plusieurs champs de vision dans chaque puits au jour 7 et photographiez les mêmes champs prédéfinis aux jours 9 et 11.
3. Dans des conditions de culture optimales, une pousse endothéliale évidente est généralement observée aux jours 4 à 6, des structures luminaires apparaissent aux jours 5 à 7, et des réseaux microvasculaires interconnectés se forment progressivement après le jour 7.
4. Définissez la germination réussie comme la présence de multiples extensions endothéliales se développant radialement de la surface de la bille vers la matrice tridimensionnelle environnante. Un germe ne doit être compté que lorsqu’il s’étend clairement au-delà de la surface de la bille et reste connecté à la couche endothéliale associée à la perle.
5. Définissez la formation de structures luminaires comme l’apparence de structures endothéliales allongées avec un espace clair central visible ou une morphologie tubulaire. Les connexions entre germes sont définies comme des contacts directs ou des structures continues formées entre des germes adjacents.
6. Les cultures présentant une mort cellulaire étendue, une agrégation sévère des biles, une structure gelée perturbée, des bulles abondantes, un effondrement de la matrice ou uniquement des protubérances cellulaires courtes et irrégulières doivent être considérées comme sous-optimales et exclues de l’analyse quantitative.

7. Acquisition d’images et analyse quantitative

1. Sélectionnez plusieurs champs de vision dans chaque puits au jour 7 et acquérez des images à partir des mêmes champs prédéfinis les jours 9 et 11. Les images doivent être collectées en utilisant le même grossissement, les mêmes réglages d’exposition et les mêmes conditions d’image, à tous les moments précis.
2. Quantifiez le nombre de pousses par bille microporteur et la zone vascularisée.
   1. Pour la mesure de la surface vascularisée, utilisez un logiciel d’analyse d’images open source. Ouvrez l’image acquise et délimitez manuellement la frontière de la région vascularisée d’intérêt (ROI) à l’aide de l’outil polygonal ou de sélection à main levée. Ajoutez le ROI sélectionné au gestionnaire de ROI.
   2. Pour la visualisation, utilisez un plugin de visualisation par région d’intérêt pour afficher le ROI défini. Permettre la mesure de la surface dans les paramètres de mesure et mesurer le ROI sélectionné pour obtenir la surface vascularisée. Appliquez les mêmes paramètres d’analyse à toutes les images.
   3. Pour l’analyse du taux angiogénique, utilisez la zone vascularisée au jour 7 comme référence, et calculez le changement relatif de la surface vascularisée aux jours 9 et 11.
3. Comptez le nombre de pousses individuelles indépendamment par trois observateurs, et utilisez la valeur moyenne pour l’analyse.

Résultats

Angiogenèse dans le modèle tridimensionnel HUVEC

Dans les cultures établies avec succès, les cellules endothéliales sont uniformément réparties à la surface des billes microporteurs, et aucune agrégation évidente des billes n’est observée. L’observation dynamique a montré une pousse endothéliale progressive et la formation de réseaux microvasculaires aux jours 7, 9 et 11 (Figure 1A). L’analyse quantitative a égale...

Discussion

Le protocole actuel décrit un modèle modifié de germination endothéliale tridimensionnelle basé sur des billes microporteurs. La Figure 3 offre un aperçu schématique du flux de travail expérimental. Le protocole a été adapté à partir du test classique d’angiogenèse rapporté par Nakatsu et Hughes et optimisé pour répondre aux objectifs de la présente étude ^8,9. Dans le système classique, les c...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Claire, sans nucléase
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Fond conique, stérile, emballé dans un sac
24-well cell culture plate	Haier	612003	Fond plat, traité pour la culture tissulaire, emballé individuellement, pour la culture de cellules adhérentes
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Diapositive jetable pour compteur de cellules automatisé, 50 diapositves/boîte
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Utilisé pour la culture cellulaire à 37 °C avec 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Poudre sèche; perles de microsupport de dextran recouvertes de collagène
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Plugin de visualisation de la région d'intérêt utilisé pour afficher les zones vascularisées délimitées
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM de base (1×), contenant 4,5 g/L de D-glucose, de la L-glutamine et 110 mg/L de pyruvate de sodium, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Milieu de culture cellulaire endothélial complété avec du sérum FBS additionnel à une concentration finale de 10% avant utilisation
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualifié, format à usage unique, origine Australie, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Fibroblastes primaires isolés de la muqueuse buccale humaine; aimablement fournis par un autre laboratoire
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Cellules endothéliales primaires isolées des veines ombilicales humaines; aucun numéro de catalogue
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Logiciel open-source; version 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Pour l'imagerie en champ clair, en contraste de phase et en fluorescence
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Pour l'imagerie confocale; modèle non spécifié
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Concentration élevée (HC), sans rouge phénol, sans LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Solution de pénicilline-streptomycine pour la culture cellulaire, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, stérile, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, bouchon ventilé, traité pour la culture tissulaire, pour la culture de cellules adhérentes
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Solution de trypsine-EDTA 0,25%, 100 mL