Un modèle d’angiogenèse tridimensionnel basé sur des billes microporteuses utilisant des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines

Résumé

Ce protocole décrit un modèle d’angiogenèse tridimensionnel basé sur des billes microporteuses utilisant des cellules endothéliales de veines ombilicales humaines. Le test permet de visualiser directement la pousse endothéliale et la formation de structures semblables à la lumière, et peut être appliqué à des études sur les mécanismes angiogéniques et des interventions thérapeutiques.

Résumé

L’angiogenèse est un processus biologique en plusieurs étapes impliquant l’activation, la migration, l’allongement, la formation de la lumière, la ramification et l’anastomose. Les systèmes de culture bidimensionnelle conventionnels sont utiles pour l’évaluation préliminaire de médicaments, gènes ou conditions de culture, mais ils ne reproduisent pas adéquatement l’organisation spatiale de la morphogenèse endothéliale au sein d’une matrice extracellulaire tridimensionnelle. Le protocole actuel décrit un test d’angiogenèse tridimensionnel basé sur des billes microporteuses utilisant des cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC). Les HUVEC sont d’abord ensemencés sur des billes microporteuses contenant du collagène porcin de type I dénaturé chimiquement couplé, puis intégrés dans une matrice membranaire basale. Les fibroblastes muqueuseux buccaux sont ensuite ensemencés sur le gel pour fournir un soutien paracrine à la germination endothéliale et à la formation de structures vasculaires. Le milieu de culture est remplacé tous les deux jours, et le comportement de germination ainsi que les phénotypes angiogéniques sont surveillés par microscopie inversée. Dans des conditions de culture appropriées, les pousses endothéliales émergent en quelques jours, suivies de la formation de structures semblables à la lumière et de connexions entre germes. Cette méthode offre une plateforme pratique et reproductible pour les études in vitro de la morphogenèse endothéliale et peut être appliquée à des recherches sur la manipulation génique, l’intervention pharmacologique et la modélisation des maladies.

Introduction

La pousse endothéliale est un événement clé dans l’angiogenèse et implique l’émergence, la migration, la prolifération et l’alignement des cellules endothéliales à partir de structures vasculaires préexistantes, suivies de la formation de la lumière et de l’établissement de réseaux vasculaires^{interconnectés 1,2}. Bien que les systèmes de culture bidimensionnelle conventionnels et les tests de formation de tubes à base de gel soient techniquement simples, ils sont limités dans leur capacité à reproduire le remodelage spatial des cellules endothéliales dans un microenvironnement<....

Protocole

Les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine utilisées dans ce protocole ont été isolées et cultivées à partir de tissus du cordon ombilical humain collectés auprès du Département d’obstétrique du Premier Hôpital du Peuple de la province du Yunnan. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs avant la collecte de l’échantillon. Toutes les procédures impliquant des matériaux d’origine humaine ont été approuvées par le Comité d’éthique médicale du First People’s Hospital de la province du Yunnan (n° d’approbation KHLL2023-KY198). Les fibroblastes mucosaux buccaux humains (HOMF) ont été généreusement fourn....

Résultats

Angiogenèse dans le modèle tridimensionnel HUVEC

Dans les cultures établies avec succès, les cellules endothéliales sont uniformément réparties à la surface des billes microporteurs, et aucune agrégation évidente des billes n’est observée. L’observation dynamique a montré une pousse endothéliale progressive et la formation de réseaux microvasculaires aux jours 7, 9 et 11 (Figure 1A). L’analyse quantitative a égale.......

Discussion

Le protocole actuel décrit un modèle modifié de germination endothéliale tridimensionnelle basé sur des billes microporteurs. La Figure 3 offre un aperçu schématique du flux de travail expérimental. Le protocole a été adapté à partir du test classique d’angiogenèse rapporté par Nakatsu et Hughes et optimisé pour répondre aux objectifs de la présente étude ^8,9. Dans le système classique, les c.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Claire, sans nucléase
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Fond conique, stérile, emballé dans un sac
24-well cell culture plate	Haier	612003	Fond plat, traité pour la culture tissulaire, emballé individuellement, pour la culture de cellules adhérentes
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Diapositive jetable pour compteur de cellules automatisé, 50 diapositves/boîte
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Utilisé pour la culture cellulaire à 37 °C avec 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Poudre sèche; perles de microsupport de dextran recouvertes de collagène
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Plugin de visualisation de la région d'intérêt utilisé pour afficher les zones vascularisées délimitées
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM de base (1×), contenant 4,5 g/L de D-glucose, de la L-glutamine et 110 mg/L de pyruvate de sodium, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Milieu de culture cellulaire endothélial complété avec du sérum FBS additionnel à une concentration finale de 10% avant utilisation
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Qualifié, format à usage unique, origine Australie, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Fibroblastes primaires isolés de la muqueuse buccale humaine; aimablement fournis par un autre laboratoire
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Cellules endothéliales primaires isolées des veines ombilicales humaines; aucun numéro de catalogue
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Logiciel open-source; version 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Pour l'imagerie en champ clair, en contraste de phase et en fluorescence
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Pour l'imagerie confocale; modèle non spécifié
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Concentration élevée (HC), sans rouge phénol, sans LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Solution de pénicilline-streptomycine pour la culture cellulaire, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, stérile, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, bouchon ventilé, traité pour la culture tissulaire, pour la culture de cellules adhérentes
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Solution de trypsine-EDTA 0,25%, 100 mL