Article de méthode

Électroacupuncture assistée par isoflurane dans un modèle rat d’oligoasthénozoospermie

DOI :

10.3791/71878

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16 juin 2026

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1Ningxia Medical University School of Traditional Chinese Medicine, 2Medical College of Acu-Moxi and Rehabilitation, Guangzhou University of Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Dryness Syndrome in Chinese Medicine, Ministry of Education, Ningxia Regional Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Regional High Incidence Disease, Ningxia Medical University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole détaille l’établissement d’un modèle d’oligoasthénozoospermie induit par l’adénine chez les rats et la délivrance ultérieure d’électroacupuncture à CV3, CV4, ST36 et SP6 sous anesthésie isoflurane. Les résultats ont été vérifiés par analyse assistée par ordinateur pour le nombre et la motilité, ainsi que par l’histologie testiculaire avec la coloration de l’hématoxyline et de l’éosine.

Résumé

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L’oligoasthénozoospermie est l’une des formes les plus courantes de dysfonction reproductive masculine. Dans les études sur les rongeurs, administrer l’électroacupuncture (EA) de manière constante sur plusieurs séances pose un défi technique, notamment lorsqu’on combine les points d’acupuncture de la ligne médiane abdominale et des membres postérieurs, où un contact stable avec les électrodes est crucial. Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) et Sanyinjiao (SP6) ont été sélectionnés car ces points sont fréquemment utilisés dans les protocoles d’acupuncture pour l’infertilité et les anomalies sperme, et la configuration de la ligne médiane abdominale plus des membres postérieurs convient à l’appariement standardisé des électrodes. Ce rapport décrit un protocole pratique pour établir un modèle de rat induit par l’adénine pour l’oligoasthénozoospermie et pour administrer une EA assistée par l’isoflurane avec une stimulation appariée de CV3–CV4 et ST36–SP6. Les rats mâles de Sprague-Dawley recevaient de l’adénine par gavage quotidien pendant 28 jours pour induire une altération de la reproduction. Par la suite, l’EA a été administrée quotidiennement pendant 28 jours sous anesthésie inhalatoire, utilisant 3 % d’isoflurane pour l’induction et 1,5 % pour l’entretien du masque, afin de permettre un placement stable de l’aiguille et un appairage d’électrodes (CV3–CV4 et ST36–SP6) avec des paramètres de stimulation définis (2 Hz, 1,5 mA, 30 min). Les effets du traitement ont été évalués par analyse assistée par ordinateur du sperme pour le nombre de spermatozoïdes et la motilité, complétée par l’histologie de l’hématoxyline testiculaire et de l’éosine (HE). Les résultats représentatifs indiquent que l’exposition à l’adénine a réduit le nombre de spermatozoïdes et la motilité et perturbé l’architecture des tubules séminifères, tandis que l’EA était associée à une récupération partielle tant des paramètres du sperme que de la morphologie testiculaire. Ce protocole offre une référence prête à l’emploi pour les études nécessitant une livraison cohérente d’EA et une vérification sperme/histologique dans un modèle rat d’oligoasthénozoospermie.

Introduction

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Les facteurs masculins contribuent de manière significative à l’infertilité, représentant environ la moitié de tous les couples infertiles, les anomalies du nombre de spermatozoïdes et de la motilité étant parmi les résultats cliniques les pluscourants 1,2. L’oligoasthénozoospermie, caractérisée par une concentration réduite des spermatozoïdes et une altération de la motilité, est l’une des formes les plus courantes de dysfonction reproductivemasculine 3,4. Malgré la disponibilité des techniques de procréation assistée et des thérapies médicales empiriques, les stratégies efficaces pour améliorer la qualité du sperme restent limitées, soulignant la nécessité d’une investigation préclinique supplémentaire 5,6,7. Ces besoins cliniques et translationnels motivent le développement de flux de travail expérimentaux reproductibles pour étudier l’altération reproductive masculine dans des conditions contrôlées.

Des interventions d’acupuncture ont été étudiées pour les anomalies du sperme et l’infertilité masculine dans des contextes cliniques etexpérimentaux 8. Bien que les études cliniques suggèrent des bénéfices potentiels pour certains paramètres du sperme, leurs conceptions, protocoles d’intervention et mesures de résultats varientconsidérablement 9. L’électroacupuncture (EA) est particulièrement adaptée à la recherche en laboratoire car elle offre des paramètres de stimulation contrôlés et une régulation plus uniforme que l’acupuncture manuelle, ce qui facilite l’évaluation des changements liés au traitement dans les résultats reproductifsmesurables 10,11,12. Cet avantage procédural rend l’EA bien adaptée aux flux de travail précliniques structurés dans la recherche sur la reproduction masculine.

Les modèles animaux sont au cœur de cette évaluation, mais la sélection des modèles reste un enjeu méthodologique clé dans la recherche sur l’oligoasthénozoospermie. Une revue systématique récente a noté que les méthodes de modélisation induites par le busulfan sont controversées et présentent une hétérogénéité substantielle dans les indices d’évaluation, soulignant la nécessité de procédures plus claires et de lectures pluscohérentes 13. Les modèles basés sur l’adénine offrent une approche expérimentale pratique car la gavage d’adénine peut induire des troubles reproductifs chez les rats, y compris une réduction des points de départ liés aux spermatozoïdes et des lésions histologiques dans le tissutesticulaire 14,15. Dans nos travaux précédents, un modèle de rat chez l’oligoasthénozoospermie induit par l’adénine a été traité avec EA dans un ensemble de points d’acupuncture cerveau-rein de Shu-Mu (Epangsanxian, BL23, GB25 et KI3), ainsi que des conditions non acupunctaires et à taux de contrôle positif des drogues, avec des mesures de résultat élargies incluant les coefficients d’organes et les niveaux d’hormones sériques quantifiés par ELISA16. S’appuyant sur cette base expérimentale et reconnaissant l’hétérogénéité dans la sélection des points d’acupuncture, la conception des témoins, les paramètres de stimulation et les mesures de résultats au sein des études existantes d’EA, le protocole actuel a été conçu pour affiner et étendre le flux de travail méthodologique afin d’assurer une livraison stable de l’EA.

En conséquence, le protocole actuel se concentre sur la livraison, en traitant deux variables pratiques essentielles pour les séances d’EA répétées chez les rongeurs. Premièrement, pour éviter le déplacement de l’aiguille et le contact intermittent avec les électrodes causés par les mouvements des animaux et la traction du fil de plomb, nous décrivons une procédure maintenue à l’isoflurane qui stabilise le positionnement pendant la stimulation et assure un contact fiable des électrodes entre les séances ; Cela est particulièrement important lorsqu’on combine les points de la ligne médiane abdominale avec les points des membres postérieurs. Deuxièmement, sur la base de revues antérieures et d’analyses sur points d’acupuncture 9,17, identifiant CV4, SP6, ST36 et CV3 comme points d’acupuncture reproductifs courants dans les protocoles d’infertilité et d’anomalie du sperme, nous avons sélectionné CV3, CV4, ST36 et SP6 et appliqué une stimulation appariée à CV3-CV4 et ST36-SP6. Cette configuration, qui combine les points de la ligne médiane abdominale et des membres postérieurs, standardise les connexions des électrodes, minimise la variabilité causée par une fixation instable des électrons et soutient la délivrance reproductible d’EA à travers des séances de traitement répétées. Pour maintenir un scope orienté protocolaire et éviter de dupliquer les modules endocriniens, mécanistiques ou témoins positifs précédemment signalés, la vérification des résultats est limitée à un ensemble primaire de lecture du sperme et des testicules. Cet ensemble comprend une analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes et une coloration testiculaire de l’HE, qui sont suffisantes pour confirmer la réussite de l’induction du phénotype et des changements associés au traitement dans ce flux de travail.

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Protocole

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Toutes les procédures animales respectaient les directives institutionnelles pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et étaient approuvées par le Comité d’éthique de l’Université Médicale de Ningxia (n° d’approbation IACUC-NYLAC-2021-130). Des rats mâles Sprague-Dawley, âgés de 8 semaines et pesant entre 180 et 220 g, ont été obtenus auprès du Centre Expérimental pour les Animaux de l’Université Médicale de Ningxia (licence n° SYXK (Ning) 2020-0001). Les animaux étaient hébergés dans des conditions de laboratoire standard à 22–24 °C et 52 % à 56 % d’humidité relative, avec un cycle de 12 h de lumière et 12 heures d’obscurité, et ils avaient un accès libre à la nourriture et à l’eau.

1. Préparation animale, affectation en groupe et établissement modèle-modèle induit par l’adénine

  1. Acclimatez les rats pendant 7 jours avant l’expérience et surveillez leur état général quotidiennement.
  2. Après acclimatation, attribuez à neuf rats des numéros d’identification uniques et répartissez-les aléatoirement à un ratio 1:1:1 en trois groupes à l’aide d’une séquence de randomisation générée par ordinateur : un groupe témoin (n = 3), un groupe modèle (n = 3) et un groupe EA (n = 3). Utiliser chaque rat comme unité expérimentale, et inclure tous les animaux et échantillons dans l’analyse finale, sauf si des critères d’exclusion prédéfinis sont remplis.
  3. Gardez les chercheurs effectuant une analyse assistée par ordinateur du sperme et une évaluation histologique aveugles à l’allocation des groupes.
    REMARQUE : Les enquêteurs qui réalisent l’EA ne peuvent pas être aveuglés car l’intervention implique des procédures visibles spécifiques à chaque groupe.
  4. Préparez une suspension d’adénine de 20 mg/mL dans une solution saline normale contenant 0,5 % (p/v) de gomme arabique comme agent suspendant, et mélangez soigneusement avant et pendant la gavage pour éviter la sédimentation.
  5. Administrez une solution salée normale au groupe témoin et une suspension d’adénine au modèle et aux groupes EA via gavage à 10 mL/kg, équivalent à 1 mL/100 g de poids corporel, une fois par jour pendant 28 jours consécutifs. Utilisez une dose d’adénine de 200 mg/kg/jour.
  6. Enregistrez le poids corporel et l’état général tout au long de la période de modélisation.
    REMARQUE : L’adénine est administrée en suspension et s’occupe des sédiments lors de la manipulation. Maintenez une agitation continue pendant le gavage pour minimiser les précipitations, qui peuvent autrement provoquer des inconstances de dosage et un blocage de l’aiguille du gavage. Si un bouchon survient, re-suspendez bien la solution et remplacez l’aiguille de la fourchette avant de continuer.

2. Anesthésie isoflurane pour l’administration par électroacupuncture (Figure 1)

  1. Préparez un système d’anesthésie à l’isoflurane avec une chambre d’induction, un masque nasal et une bouillotte.
  2. Induire une anesthésie avec 3 % d’isoflurane dans la chambre d’induction jusqu’à ce que l’activité spontanée diminue nettement.
  3. Transférez le rat sur la bouillotte en position couchée et maintenez l’anesthésie avec 1,5 % d’isoflurane via un masque nasal tout au long de l’EA.
  4. Confirmez une anesthésie adéquate en réduisant les mouvements spontanés et en perdant le réflexe de clignement tout en maintenant une respiration régulière.

3. Fidélité de la délivrance de la stimulation et contrôle qualité

  1. Utilisez une bouillotte pour maintenir la température corporelle tout au long de la séance et réduire la variabilité physiologique due à l’hypothermie.
  2. Appliquez des réglages anesthésiques constants sur tous les animaux et séances, en utilisant 3 % d’isoflurane pour l’induction et 1,5 % d’isoflurane pour l’entretien. Maintenez la profondeur anesthésique au minimum nécessaire pour éviter de lutter tout en maintenant une respiration régulière.
  3. Insérez verticalement des aiguilles d’acupuncture jetables stériles (0,25 mm × 13 mm) aux points d’acupuncture sélectionnés. Insérez les aiguilles à des profondeurs d’environ 2 mm à CV3 et CV4, 7 mm à ST36 et 5 mm à SP6.
  4. Après l’insertion de l’aiguille et la connexion de l’électrode, vérifiez visuellement que chaque aiguille reste stable, sans aucun relâchement visible dû à la respiration ou au mouvement des membres. En cas de déplacement, réinsérez l’aiguille verticalement à la profondeur d’origine et vérifiez le contact stable de l’électrode avant de reprendre la stimulation.
  5. Clipsez les engins de l’électrode près de l’extrémité proximale du manche de l’aiguille, puis acheminez-les et fixez-les pour minimiser l’adhérence, car le poids du plomb et la traction sont des causes fréquentes de décollement.
  6. Confirmez la stimulation efficace en observant un léger tremblement musculaire local au point d’acupuncture sans mouvement corporel dégénéreux. S’il n’y a pas de tremblement, vérifiez à nouveau et reconfirmez le contact de l’électrode et le placement de l’aiguille.
  7. Effectuez un contrôle standardisé unique à mi-session à 15 minutes. Si nécessaire, réajustez les aiguilles et confirmez à nouveau un léger tremblement local avant de procéder à la réduction de la variabilité de la stimulation entre les animaux.
    REMARQUE : Lors de la connexion de l’appareil EA, attachez les pointes à l’extrémité proximale de la poignée de l’aiguille pour réduire l’adhérence due au poids du câble. Si nécessaire, fixez la mine et/ou l’aiguille avec du ruban adhésif pour éviter le détachement pendant la séance.

4. Traitement par électroacupuncture (Figure 2)

  1. Commencez l’EA le lendemain de la période de 28 jours de la déminence de l’adénine, et administrez-la une fois par jour pendant 28 jours consécutifs.
  2. Sous anesthésie isoflurane, exposez le bas de l’abdomen et les membres postérieurs, et localisez Zhongji (CV3), Guanyuan (CV4), Zusanli (ST36) et Sanyinjiao (SP6) en utilisant des repères anatomiques de surface.
  3. Insérez verticalement des aiguilles d’acupuncture jetables stériles (0,25 mm × 13 mm) à des profondeurs de 2 mm au niveau CV3 et CV4, 7 mm au niveau ST36, et 5 mm au SP6.
  4. Reliez une paire d’électrodes à CV3 et CV4, et branchez l’autre paire à ST36 et SP6.
  5. Administrez une stimulation électrique à 2 Hz et 1,5 mA pendant 30 minutes. Utilisez ces paramètres pour correspondre à ceux utilisés précédemment sur l’oligoasthénozoospermie induite parl’adénine 16.
  6. Appliquez les contrôles de qualité décrits dans la Section 3, y compris un contrôle unique en milieu de séance à 15 minutes.
    REMARQUE : Localiser les points d’acupuncture chez les rats en référence à l’Experimental Acupuncture and MoxibustionScience 18, Annexe II de Yong Tang (« Points d’acupuncture couramment utilisés chez les animaux expérimentaux »), ainsi que des repères anatomiques comparatifs. Parce que les points d’acupuncture des rats représentent des régions anatomiques distinctes plutôt que des points géométriques fixes, il faut utiliser une position corporelle cohérente, des points de référence anatomiques fixes et des mesures de surface au millimètre chez les animaux et les sessions. Localiser Zhongji (CV3) sur la ligne médiane ventrale, à environ 33 mm caudal au centre de l’ombilicus. Localiser Guanyuan (CV4) sur la ligne médiane ventrale, à environ 25 mm caudal au centre de l’ombilicus, près des artères superficielles sous-cutanées de la paroi abdominale. Localiser Zusanli (ST36) sur la face postérolatérale du genou, à environ 3 mm de distance par rapport à la tête fibulaire. Localiser Sanyinjiao (SP6) sur la face médiale du membre postérieur, à environ 10 mm proximal de la pointe de la malléole médiale. Appliquez systématiquement les mêmes références de localisation, la position du corps, l’angle d’insertion et la profondeur d’insertion à tous les animaux et aux séances de traitement.

5. Collecte d’échantillons

  1. Jûnire les rats pendant 24 heures après la dernière session EA.
  2. Induire une anesthésie profonde par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodium à 2 mL/kg avant la collecte des tissus. Confirmez l’anesthésie profonde par l’absence du réflexe de retrait des pédales et des mouvements spontanés.
  3. Euthanasiez le rat par décapitation sous anesthésie profonde, selon les protocoles approuvés par l’institution.
  4. Exposez immédiatement les organes reproducteurs de façon aseptique. Isoler un épididyme de la queue de la queue pour l’analyse des spermatozoïdes et exciser un testicule pour examen histologique.
  5. Fixez le testicule dans du paraformodéhyde à 4 % pendant au moins 24 heures avant le traitement histologique.

6. Analyse des spermatozoïdes

  1. Retirez la graisse environnante de l’épididyme de la queue, puis placez immédiatement le tissu dans 2 mL de solution saline normale préchauffée à 37 °C.
  2. Incubez le tissu dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 minutes, hachez-le avec des ciseaux ophtalmiques, filtrez la suspension à travers un écran de 200 mailles, puis mélangez doucement le filtrat.
  3. Chargez une aliquote de 10 μL de la suspension de spermatozoïdes dans une chambre de comptage préchauffée, et analysez le nombre et la motilité des spermatozoïdes à l’aide d’un système d’analyse du sperme assistée par ordinateur (CASA).
  4. Utilisez le même type de chambre, les mêmes conditions de réchauffement et les mêmes réglages d’acquisition pour tous les échantillons d’une expérience donnée.

7. Examen histologique du tissu testiculaire

  1. Fixez le tissu testiculaire dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant un minimum de 24 heures. Coupez la zone cible et placez-la dans des cassettes indiquées.
  2. Déshydratez les échantillons à travers une série d’éthanol graduée, éliminez-les dans le xylène, infiltrez-les avec de la paraffine, intégrez-les et sectionnez-les à 4 μm.
  3. Faites flotter les sections sur un bain-marie à 40 °C, montez-les sur des lames et séchez dans un four à 60 °C.
  4. Pour la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, faites un dewax sur les sections dans du xylène, réhydratez-les avec de l’éthanol gradué, colorez-les avec de l’hématoxyline pendant 5 à 10 minutes et de l’éosine pendant 1 à 5 minutes, puis déshydratez-les, dégagez-les et montez-les.
  5. Examinez l’organisation des tubes séminifères et l’organisation des cellules spermatogènes sous des réglages de grossissement constants pour tous les groupes.

8. Évaluation de l’établissement du modèle et des changements associés au traitement

  1. Confirmez l’établissement du modèle par une réduction du nombre et de la motilité des spermatozoïdes, ainsi qu’une structure désorganisée des tubules séminifères, par rapport au groupe témoin.
  2. Confirmer les changements associés au traitement par une augmentation du nombre de spermatozoïdes et de la motilité, ainsi que par une restauration partielle de la morphologie des tubules séminifères, dans le groupe EA par rapport au groupe modèle.
  3. Prédéfinissez les échantillons techniquement compromis, tels que ceux présentant un traitement du spermatozoïde retardé, une défaillance de la chambre ou des sections de faible qualité non liées à la modélisation, comme critères d’exclusion. Documentez toute exclusion lors de l’analyse.

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Résultats

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Analyse du sperme (Figure 3)
Les suspensions épididymaires de spermatozoïdes ont été analysées à l’aide d’un système d’analyse du sperme assisté par ordinateur pour quantifier le nombre et la motilité des spermatozoïdes. Dans ce jeu de données représentatif, l’administration d’adénine a nettement réduit les deux paramètres par rapport au groupe témoin, confirmant ainsi l’établissement réussi du modèle. L’intervention d’EA a ensuite augmenté le nombre de spermatozoïdes et la motilité par rapport au gro...

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Discussion

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Compte tenu de l’étiologie multifactorielle de l’oligoasthénozoospermie et de l’efficacité limitée des traitements pharmacologiques disponibles, l’acupuncture et l’AA ont attiré l’attention en tant qu’interventions répétables et nonpharmacologiques 19. La littérature clinique et préclinique existante suggère plusieurs mécanismes plausibles par lesquels l’acupuncture ou l’AE peut influencer la fonction reproductive masculine, notamment la modulation de la régulatio...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier ou non financier concurrent.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par le Fonds régional pour les sciences (82460972) de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine () et le Fonds régional pour les sciences (82260967) de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (2022) ; le programme clé de recherche et développement 2022 de la Région autonome Hui de Ningxia (2022BEG02040) ; le projet de construction disciplinaire de première classe de l’École de médecine traditionnelle chinoise de l’Université médicale de Ningxia (ZY0019110305) ; le programme clé de recherche et développement du comté de Yanchi 2023 (2023YCYDCT003) ; et le Programme spécial Science et Technologie au bénéfice du peuple de la Région autonome Hui de Ningxia (2024CMG03054).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AdénineBeijing Solarbio Science & Technology Co.Ltd.A8330
CASA système d'analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdesNanning Songjing Tianlun Biotechnology Co.,Ltd.VICOS-SPERM
CentrifugeuseSartoriusA-14C
Fluide de différenciationShanghai Biyuntian Biotechnology Co.,LtdC0163M
Aiguilles d'acupuncture stériles jetablesMarque Hanyi0,25 mm ´ 13 mm
SéchoirLeicaHI1220
Stimulateur électriqueChangzhou Yingdi Electronic Medical Device Co., LtdKWD-808I
Balance électroniqueHangzhou Youheng Weighing Equipment Co.,LtdHLD-6002
Solution de coloration à l'éosine YLanke BiotechBS248
Solution de coloration à l'hématoxylineZhuhai Beso Biotechnology Co. LTDBA-4041
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd.R510-22-10
MicrotomeLeicaRM2255
Balsam neutreBeijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co.,LtdZli-9555
Machine d'inclusion à la paraffineLeicaHistoCore Arcadia H
Rats SDCentre animalier de l'Université médicale du Ningxia8 semaines, mâle, 180-220 g
Scanner de lameLeicaAperio LV1
Machine d'anesthésie pour petits animauxRWD Life Science Co., Ltd.R500
Oscillateur vortexHaimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co.,LtdQL-902
Coussin chauffantDongguan Hongda Electronics Co., Ltd.45W-80X28CM

Références

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Mots-clés

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