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Évaluation multimodale du traitement par électroacupuncture de l'arthrose du genou chez la souris

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DOI :

10.3791/71901

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6 octobre 2026

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1Department of Acupuncture and Moxibustion, Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Science and Technology for Brain-Inspired Intelligence, Fudan University, 4Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude associe des techniques comportementales et d'imagerie pour une évaluation multimodale et longitudinale de souris atteintes d'arthrose après une électroacupuncture, incluant la coloration du cartilage et la notation selon la Société internationale de recherche sur l'arthrose (OARSI).

Résumé

L'arthrose est une maladie articulaire dégénérative chronique qui affecte fréquemment le genou et provoque douleur, gonflement, raideur et limitation fonctionnelle. L'inflammation synoviale et les modifications des muscles périarticulaires contribuent à l'initiation et à la progression de la maladie. Des preuves cliniques suggèrent que l'électroacupuncture pourrait atténuer l'inflammation locale et moduler le métabolisme du cartilage. Dans cette étude, une arthrose du genou a été induite chez des souris par instabilité chirurgicale du ménisque médial. Les résultats ont été évalués à l'aide d'un protocole multimodal comprenant le test du rotarod, l'échographie, la thermographie infrarouge, l'imagerie par résonance magnétique et des colorations histologiques. Le volume de la cavité articulaire et la température cutanée ont été suivis longitudinalement, et l'imagerie par résonance magnétique en fin d'expérience ainsi que la coloration au Safranin O-vert rapide ont été utilisées pour évaluer les modifications du signal des muscles périarticulaires et la pathologie du cartilage. L'électroacupuncture s'est associée à une amélioration de la performance motrice, à une réduction du gonflement articulaire, à une température cutanée locale plus élevée, à des modifications moins marquées du signal des muscles périarticulaires sur les images par résonance magnétique, et à des scores de dégénérescence du cartilage plus faibles. Ces résultats soutiennent l'utilisation de ce protocole multimodal pour évaluer les effets associés à l'électroacupuncture dans un modèle préclinique murin.

Introduction

L'arthrose du genou (AG) est la maladie ostéoarticulaire la plus répandue dans le monde, touchant environ 250 millions de personnes1. Ses caractéristiques pathologiques incluent une dégénérescence progressive du cartilage et une prolifération synoviale, et elle se manifeste cliniquement par des douleurs, un gonflement et une altération fonctionnelle2,3.

L’arthrose (OA) était longtemps considérée comme un trouble articulaire non inflammatoire, mais elle est désormais reconnue comme comportant un volet inflammatoire, avec une synovite détectable chez la plupart des patients. On pense que des cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine (IL)-1β et l’IL-18, ainsi que les espèces réactives de l’oxygène et le stress biomécanique, contribuent au processus pathologique4. L’inflammation s’accompagne fréquemment d’un accroissement du flux sanguin local, qui se manifeste cliniquement par une rougeur, une chaleur et un gonflement5. Outre l’accélération de la dégradation du cartilage et du déclin fonctionnel, l’inflammation pourrait être particulièrement active durant les stades précoces de la maladie. Ainsi, le suivi de l’état inflammatoire au fil du temps pourrait orienter des stratégies thérapeutiques ciblant le mécanisme sous-jacent et permettre une prise en charge adaptée au stade de la maladie6,7. Des études antérieures utilisant l’échographie (US) sur les genoux de souris ont identifié une région triangulaire située entre les condyles tibiaux et fémoraux. Une analyse histologique a confirmé que cette zone contient des tissus mous, notamment la synoviale, le ménisque et le bourrelet graisseux, ainsi que des espaces remplis de liquide synovial. Cette région détectée par échographie est définie comme le volume interarticulaire, englobant les zones de tissus mous susmentionnées8.

En outre, la température est un paramètre physique clé qui reflète directement l'évolution de l'inflammation articulaire. Une élévation de la température locale est l'un des quatre signes cardinaux de l'inflammation, et l'imagerie thermographique permet une détection et une quantification précises de ces modifications thermiques9. Une récente revue systématique a souligné la corrélation entre la température de surface cutanée et les maladies articulaires inflammatoires et dégénératives10, renforçant ainsi l'utilité de la thermographie infrarouge (IRT) dans la recherche sur l'arthrite et sa prise en charge clinique11. Par ailleurs, l'IRT fournit une mesure indirecte liée au perfusion tissulaire et à l'activité métabolique, et pourrait s'avérer utile pour le suivi des réponses thérapeutiques.

Dans cette étude, nous avons combiné le test du rotarod, l'échographie (US), l'imagerie par thermographie infrarouge (IRT) et l'imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'évaluer les effets de l'électroacupuncture (EA) dans un modèle murin d'arthrose (OA). Cette approche multimodale a permis d'évaluer simultanément la performance motrice, la morphologie articulaire, les variations thermiques et l'inflammation des tissus mous, des paramètres qui ne peuvent pas être obtenus par l'histologie seule. De manière importante, ce panel fournit des informations complémentaires à plusieurs niveaux biologiques, avec un coût et un travail supplémentaires minimes. Il est donc particulièrement adapté aux études précliniques nécessitant un suivi répété et non invasif dans le temps, notamment lorsque l'intervention étudiée est censée produire des effets modérés ou lorsque le profil temporel de la réponse est incertain. À notre connaissance, il s'agit de la première étude à utiliser cette combinaison particulière de techniques, englobant le volume de la cavité articulaire, l'inflammation musculaire et la température locale, pour suivre la réponse thérapeutique à l'électroacupuncture dans l'arthrose. Le protocole que nous décrivons est pratique et reproductible, et nous pensons qu'il pourrait servir de référence utile pour de futures évaluations longitudinales et en temps réel de l'efficacité dans des contextes expérimentaux similaires.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique sur les animaux de laboratoire de Wuchuang Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (numéro d'approbation éthique : WTPZ20260209001). Tous les animaux utilisés dans cette étude étaient des souris C57BL/6 âgées de 8 semaines et pesant environ 20 g, achetées auprès d'un fournisseur commercial (voir le Tableau des matériaux). L'expérience comprenait 24 souris. Après une période d'acclimatation d'une semaine, les animaux ont été répartis au hasard, six souris étant attribuées à chacune des quatre conditions expérimentales. Ces conditions comprenaient une chirurgie factice, une instabilité du ménisque médial (DMM), une acupuncture factice (SA) et une électroacupuncture (EA). Le nombre d'animaux utilisés n'a pas été déterminé par un calcul prospectif de taille d'échantillon ; la taille des groupes a plutôt été choisie en se référant à des études antérieures sur l'électroacupuncture utilisant des modèles et des critères d'évaluation comparables d'arthrose, et conformément au principe des 3R.

1. Soins préopératoires et modélisation

REMARQUE : Un technicien chirurgical expérimenté a effectué toutes les procédures de modélisation. Ne remettez les animaux dans leurs cages qu'après qu'ils aient retrouvé conscience sur un tapis chauffant.

  1. Acclimater les souris à l'environnement expérimental pendant au moins 7 jours avant le début de l'expérience.
  2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Désinfecter soigneusement la zone opératoire.
  3. Activer l'appareil d'anesthésie gazeuse. Placer la souris dans la chambre d'induction et induire une anesthésie générale avec 2–3 % d'isoflurane pendant 5 min.
  4. Une fois l'induction anesthésique terminée, transférer la souris sur la table d'opération. Maintenir l'anesthésie en administrant continuellement 1–1,5 % d'isoflurane via un masque d'anesthésie jusqu'à la fin de la procédure chirurgicale.
  5. Positionner la souris en décubitus dorsal, le genou orienté vers le haut. S'assurer que la position est stable et que le site chirurgical est entièrement exposé. Utiliser la DMM pour créer un modèle sur la patte postérieure droite12. Pour le groupe Sham, réaliser une incision au même emplacement, puis la fermer par points de suture.
    1. Procédure chirurgicale de la DMM
      1. Réaliser une incision médiale parapatellaire longitudinale de 1 cm afin d'exposer l'articulation du genou.
      2. Par l'incision parapatellaire médiale créée à l'étape 1.5.1.1, pratiquer une ouverture longitudinale dans la capsule articulaire. Utiliser une pince pour séparer suffisamment la capsule des tissus environnants. Ensuite, soutenir la patte postérieure distale dans la main gauche sans exercer de pression excessive et utiliser la pince pour déplacer la rotule et le ligament rotulien latéralement, exposant ainsi l'articulation du genou. Manipuler la patte avec précaution tout au long de cette procédure afin d'éviter toute lésion.
        NOTE : Un relâchement adéquat de la capsule articulaire permet de déplacer la rotule avec un effort minimal.
      3. Appliquer des gouttes de solution saline stérile sur la surface du cartilage articulaire pendant l'opération afin d'éviter la dessiccation.
      4. Localiser le ménisque médial dans l'espace entre le condyle fémoral médial et le plateau tibial médial. À partir de son aspect latéral, suivre le ligament ménisco-tibial médial jusqu'à son insertion à l'éminence intercondylienne du tibia. Stabiliser délicatement la patte postérieure à la main et sectionner le ligament à l'aide d'une lame chirurgicale n°10, en prenant soin de ne pas toucher le cartilage sous-jacent au ménisque médial. NOTE : Veiller à ne pas endommager le cartilage articulaire ni les autres ligaments. Dans de nombreux cas, il est nécessaire de rétracter, sans l'ablation, le bourrelet graisseux recouvrant le ligament pour pouvoir l'identifier.
      5. Rapprocher les bords de la capsule articulaire du genou et les fixer à l'aide d'un fil de suture résorbable 6-0.
      6. Fermer la peau avec un fil de suture en soie 6-012.
  6. Pour les soins postopératoires, instiller une goutte de bupivacaïne à 0,25 % sur le site chirurgical pour une analgésie locale, et maintenir les souris avec un accès libre à la nourriture et à l'eau.
    NOTE : Pendant l'anesthésie, maintenir le débit d'oxygène dans la plage de 0,5–1 NL/min. Une anesthésie réussie est confirmée par la perte du réflexe d'orientation, l'absence de réaction de retrait à une pincée des orteils et une respiration stable et régulière. Pendant toute la durée de la chirurgie, utiliser une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) comme solution d'irrigation afin de maintenir l'hydratation du cartilage. Les dimensions et caractéristiques spécifiques du fil résorbable utilisé pour la fermeture de la capsule articulaire et du fil de soie utilisé pour la fermeture cutanée sont précisées dans le Tableau des matériaux.

2. Traitement par électroacupuncture

REMARQUE : Les interventions chez les groupes SA et EA ont commencé une semaine après l'établissement du modèle (Figure 1A). Les deux groupes ont reçu un traitement tous les deux jours, trois fois par semaine, pendant 15 minutes par séance, sur une période de 4 semaines. Les groupes Sham et DMM ont subi les mêmes procédures d'anesthésie et d'immobilisation selon le même calendrier, sans stimulation par aiguille ni stimulation électrique. Tous les opérateurs ont suivi une formation préalable à l'expérience afin d'assurer une cohérence dans le choix des points d'acupuncture, de l'angle d'insertion et de la profondeur.

  1. Placer les souris dans la chambre d'induction et les en retirer après l'induction de l'anesthésie par l'isoflurane.
  2. Maintenir les souris en position supine sous anesthésie inhalatoire continue à l'isoflurane (1,5–2,0 % dans 100 % O₂)₂) tout au long de la séance d'électroacupuncture afin d'assurer un état calme et stable.
  3. Localiser précisément les points d'acupuncture sur les souris. Insérer deux aiguilles stériles jetables (0,16 mm × 25 mm) dans les points d'acupuncture ST36 (Zusanli) et SP10 (Xuehai) des membres inférieurs, jusqu'à une profondeur cutanée de 5 mm13 (Figure 1B).
    ​REMARQUE : ST36 est situé à 1 mm sur la latérale du tubercule antérieur du tibia, à 3 mm sous la tête du péroné, et directement en dessous de l'articulation du genou. SP10 est situé sur la face médiale de la cuisse, à 3 mm au-dessus de la marge superomédiale de la rotule, au niveau de la saillie médiale du muscle quadriceps lorsque le genou est fléchi.
    1. Dans le groupe SA, insérer les aiguilles superficiellement, à une profondeur d'environ 1 mm, dans des zones adjacentes non pointuelles plutôt que dans les points ST36 ou SP10, puis les relier au dispositif d'électroacupuncture sans délivrance de courant.14.
      REMARQUE : Ainsi, le groupe SA diffère du groupe EA par le positionnement de l'aiguille, la profondeur d'insertion et l'absence de stimulation électrique, mais est apparié pour tous les autres paramètres procéduraux. Par rapport au groupe DMM, le groupe SA reçoit une piqûre superficielle en dehors des points d'acupuncture et une connexion au dispositif sans courant, tandis que le groupe DMM reçoit uniquement une anesthésie et une immobilisation.
  4. Connecter l'aiguille au dispositif d'acupuncture électronique et appliquer une stimulation à 2/100 Hz et 2 mA pour provoquer de légers tremblements musculaires. Commencer la stimulation par acupuncture électroacupuncture (EA) pendant 15 minutes, 3 fois par semaine, à partir du 7e jour suivant la modélisation, et poursuivre pendant 4 semaines.
  5. Après le traitement, placer la souris sur un tapis chauffant et la remettre dans sa cage une fois qu'elle a retrouvé conscience.

3. Évaluation dynamique de l'efficacité de l'EA

REMARQUE : Toutes les évaluations (test de la roue rotative, échographie, IRT, IRM et score OARSI) ont été effectuées par des investigateurs aveugles à l'affectation des groupes, les identités des groupes ayant été masquées jusqu'à la fin complète des analyses de données. L'acquisition des images et l'analyse des données ont été réalisées par des personnes distinctes, et l'évaluation histologique a été effectuée indépendamment par deux pathologistes aveugles aux groupes de traitement. Aucun des évaluateurs n'a participé à l'affectation des animaux ni à l'intervention d'électroacupuncture.

  1. Test de fatigue sur rotarod
    1. Former préalablement les souris pour les familiariser avec l'appareil expérimental avant le test formel.
    2. Pendant le test formel, placer chaque souris individuellement sur le rotarod, qui accélère à un rythme de 4 tours par minute jusqu'à ce que la souris tombe.
    3. Enregistrer immédiatement la durée pendant laquelle chaque souris reste sur la tige. Prévoir un intervalle de 30 min entre chaque essai pour chaque souris, et calculer la valeur moyenne à partir de trois essais répétés.
      NOTE : Utiliser le test sur rotarod pour évaluer la coordination motrice avant la mise en place du modèle d'arthrose (OA) et après l'achèvement du traitement par EA. Pour minimiser la douleur postopératoire, réduire la collecte des données sur rotarod durant la première semaine suivant la chirurgie.
  2. Examen échographique chez les petits animaux
    ​NOTE : La procédure détaillée pour l'imagerie par échographie et la délimitation de la cavité articulaire est illustrée dans Figure 2.
    1. Avant l'acquisition formelle des données, placer la souris dans une chambre d'anesthésie jusqu'à la perte de la fonction motrice, puis utiliser une crème dépilatoire pour éliminer les poils du genou droit. Lors du retrait du pelage, manipuler la souris le plus délicatement possible ; l'essuyer doucement avec de l'eau tiède afin de minimiser toute irritation.
      NOTE : Maintenir l'aveugle lors de l'analyse en affichant uniquement les codes des animaux et les points temporels jusqu'à ce que toutes les mesures de volume soient terminées, puis révéler les groupes pour l'analyse statistique.
    2. Allumer le système d'échographie, installer la sonde échographique pour petits animaux, puis configurer le protocole d'examen adapté à la souris. Simultanément, placer la souris dans une cage pour une anesthésie continue.
    3. Une fois l'anesthésie réalisée, transférer la souris sur la plateforme de contrôle et administrer une anesthésie par inhalation d'isoflurane via un masque nasal. Positionner la souris de manière à ce que sa tête soit orientée vers l'extérieur par rapport à l'opérateur et sa queue face à l'opérateur.
    4. Fléchir l'articulation du genou, immobiliser la souris, puis appliquer un agent de couplage échographique sur la peau recouvrant le ligament patellaire.
    5. Régler la sonde et la positionner de manière à ce qu'elle soit parallèle à l'articulation du genou.
    6. Régler la distance de balayage à 4 mm et la taille du pas à 0,04 mm. Localiser la cavité articulaire sur l'image en fonction de sa position anatomique. Ne pas déplacer l'animal pendant le balayage de la sonde.
    7. Acquérir les images. Identifier la cavité articulaire : une région triangulaire aux limites bien définies entre le fémur, le tibia, ainsi que la peau et les muscles superficiels.
    8. Nommer et enregistrer les résultats du balayage, puis les exporter vers l'ordinateur d'analyse tout en conservant la structure initiale des dossiers.
    9. Analyser le volume de la cavité articulaire du genou à l'aide d'un logiciel. Entrer dans le module Study, puis cliquer sur la fonction Import.
    10. Parcourir et sélectionner le dossier de données, cocher les fichiers à importer, puis double-cliquer pour les ouvrir.
    11. En mode display, sélectionner successivement Image Processing | Load to 3D | Cross-sectional View | Volume Measurement | Start.
    12. Utiliser la molette de la souris ou le curseur de coupe pour faire défiler les coupes de la partie proximale vers la distale, en localisant la coupe où la cavité articulaire apparaît pour la première fois (apparaissant généralement comme une région triangulaire aux limites nettes entre le fémur, le tibia et les tissus musculaires et cutanés superficiels).
    13. Commencer le tracé sur la coupe où la cavité articulaire apparaît pour la première fois. Cliquer avec le bouton gauche pour démarrer le dessin du contour.
    14. Tracer point par point le long du bord de la cavité articulaire afin de dessiner un contour fermé, jusqu'à ce que la cavité articulaire disparaisse complètement.
    15. Cliquer sur Finish ; le système générera un volume segmenté en 3D et affichera les résultats de mesure du volume.
    16. Sélectionner le type de fichier souhaité pour exporter l'image sous forme de fichier d'image au format TIFF (.tif).
  3. Thermographie infrarouge chez les petits animaux
    ​NOTE : Les mesures ont été effectuées 1 jour avant la chirurgie, 7 jours après la chirurgie et à la fin du traitement chez les souris atteintes d'arthrose (OA). Réaliser l'IRT 6 h après le traitement dans une pièce à température contrôlée (22–24 °C), après une acclimatation des souris pendant 30 min avant l'imagerie.
    1. Placer l'animal en position dorsale avec les membres postérieurs étendus, et fixer tous les membres sur la table à l'aide de ruban adhésif afin d'assurer une exposition constante du genou. Placer la souris dans une chambre d'induction et administrer continuellement de l'isoflurane jusqu'à obtention d'une anesthésie complète.
    2. Immobiliser la souris anesthésiée en position dorsale sur la table d'opération et maintenir une température ambiante constante.
    3. Saisir délicatement le membre postérieur de la souris pour étendre l'articulation du genou droit, puis utiliser un imageur thermique infrarouge pour capturer les images et mesurer les températures dans la zone.
    4. Utiliser l'émissivité cutanée par défaut (0,98). Acquérir les images 3 min après l'anesthésie profonde. Définir la région d'intérêt (ROI) du genou comme la ligne articulaire médiale au niveau de l'articulation fémoro-tibiale, et la ROI de la cheville comme la surface dorsale de l'articulation tibio-talienne. Délimiter manuellement toutes les ROI par un seul opérateur formé, en se basant sur ces repères anatomiques.
    5. Analyser les images à l'aide du logiciel fourni avec l'appareil pour lire les données de température provenant de l'articulation du genou et de la peau environnante, et définir des points de contrôle de mesure aux niveaux des articulations de la cheville et du genou où les gradients de température diminuent.
  4. IRM chez les petits animaux
    ​NOTE : Après le traitement par EA, une IRM chez les petits animaux a été utilisée pour évaluer l'inflammation locale dans les articulations du genou des souris de chaque groupe.
    1. Placer la souris dans une chambre d'anesthésie. Une fois la fonction motrice perdue, appliquer une crème dépilatoire sur les deux articulations du genou.
    2. Après 1 min, essuyer la crème dépilatoire avec un tampon de gaze humidifié à l'eau tiède afin de terminer l'épilation des deux articulations du genou.
      ​NOTE : Veiller à épiler autant que possible tout le pelage de la souris, et réaliser cette étape sous anesthésie.
    3. Configurer le protocole approprié à l'aide d'un tunnel adapté à la taille de la souris.
      1. S'assurer que le dispositif de positionnement utilise une séquence d'écho de gradient rapide en trois plans (TR/TE = 50/3 ms, champ de vision (FOV) = 30 × 30 mm, épaisseur de coupe 1 mm) pour centrer l'articulation du genou dans l'image ; utiliser une séquence d'écho de spin rapide pondérée en T2 (T2WI) pour scanner l'articulation du genou de la souris.
      2. Utiliser les paramètres de balayage suivants : temps de répétition (TR) de 2 500 ms, temps d'écho (TE) de 8 ms, champ de vision (FOV) de 20 × 20 mm, matrice de 256 × 256, épaisseur de coupe de 0,5 mm, pas d'espacement entre les coupes, et 10 coupes consécutives couvrant la région allant du condyle fémoral au plateau tibial ; prévoir une durée d'environ 8 min et 20 s pour un seul balayage.
      3. Examiner les images pondérées en T2 obtenues pour observer les modifications morphologiques du cartilage du genou, du synovium, de la cavité articulaire et des tissus mous environnants, et évaluer l'épanchement articulaire, l'épaississement synovial et l'inflammation locale.
    4. Placer la souris sur le tunnel, induire une anesthésie par inhalation d'isoflurane via un masque, puis fixer les membres avec du ruban médical afin d'assurer une position constante des genoux vers le haut.
    5. Faire glisser le tunnel dans le scanner IRM pour l'imagerie.
      1. Sur le localisateur en trois plans, vérifier que l'espace articulaire du genou est parallèle au plan coronal, que le centre du volume de balayage est aligné avec l'espace articulaire, et que les anses intestinales ou les cavités aériennes sont exclues du champ de vision (FOV) afin d'éviter les artefacts de susceptibilité ; si le positionnement est incorrect, relocaliser et rescanner.
    6. Exporter les images pondérées en T2 multi-échos acquises au format DICOM ou NIfTI pour une évaluation qualitative.
    7. Évaluer les images IRM en examinant visuellement l'intensité du signal et la distribution des zones hyperintenses au sein de l'articulation du genou et des tissus mous périarticulaires, et comparer les signaux inflammatoires entre les groupes à partir de ces images exportées.

4. Observations pathologiques et morphologiques

  1. Fixation et sectionnement des genoux de souris
    1. Fixer les deux échantillons de genoux de souris dans du paraformaldéhyde à 10 % pendant 48 h. Ensuite, immerger les échantillons dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 30 min et rincer.
    2. Après avoir éliminé l'excès d'humidité par absorption, transférer rapidement les échantillons dans une solution de décalcification fraîchement préparée (pH 7,2–7,4) et renouveler la solution tous les 3 jours ;
    3. Poursuivre la décalcification pendant 2 semaines, rincer les échantillons à l'eau courante, puis les immerger dans de l'éthanol à 75 % pendant 2 h.
    4. Réaliser une déshydratation automatisée par gradient dans un appareil de traitement des tissus pendant 18 h.
    5. Après la déshydratation, immerger l'échantillon dans de la paraffine préchauffée pendant 2 h dans une inclusionneuse à paraffine, puis procéder à l'inclusion ;
    6. Lors de l'inclusion sagittale de l'articulation du genou, positionner la surface articulaire médiale vers le bas afin que cette surface soit sectionnée en premier.
    7. Monter le bloc tissulaire sur le microtome et effectuer un sectionnement continu à 4 µm. Après avoir atteint la séparation médiane du ménisque, recueillir 21 sections consécutives.
    8. Étaler les sections sur un étaleur de sections. Utiliser une pince pour séparer les échantillons à la surface de l'eau et les récupérer avec des lamelles, en plaçant deux échantillons par lamelle ;
    9. Placer les lames à plat dans un séchoir à lames pendant plus de 1 h pour assurer une évaporation complète de l'humidité. Placer les lames dans une boîte à échantillons et les déparaffiner dans une étuve à 60 °C pendant 8 h. Réserver pour une utilisation ultérieure.
      ​REMARQUE : Tous les fixatifs contenant du paraformaldéhyde, les solutions de décalcification et les rinçages à l'éthanol doivent être collectés comme déchets dangereux et éliminés conformément aux directives institutionnelles.
  2. Coloration au Safranin O-Vert rapide
    1. Placer les sections non colorées sur un porte-lames de coloration et les chauffer dans une étuve pendant 5 min. Pendant ce temps, préparer la solution de coloration sous une hotte aspirante.
    2. Laisser les sections revenir à température ambiante, puis les déparaffiner de façon classique jusqu'à l'eau.
    3. Transférer les sections dans une boîte humide et les colorer avec une solution fraîche de Weigert (partie A + partie B) pendant 5 min.
    4. Rincer à l'eau pendant 3 × 1 s.
    5. Différencier avec de l'acide chlorhydrique à 1 % dans l'éthanol pendant 15 s, puis rincer à l'eau distillée pendant 10 min.
    6. Colorer avec la solution de Vert rapide pendant 4 min 55 s.
    7. Laver rapidement les sections avec une solution d'acide acétique à 1 % pendant 10 à 15 s pour éliminer le Vert rapide résiduel, puis laisser sécher à l'air.
    8. Immerger dans la solution de coloration au Safranin O pendant 4 min 35 s.
    9. Déshydrater rapidement les sections avec de l'éthanol à 95 % pendant 3 à 5 s, suivis de rinçages avec de l'éthanol absolu pendant 2 × 1 min.
    10. Clarifier avec du xylène, monter avec une résine neutre et placer sous hotte aspirante pendant 4 h pour évaporer le xylène.
    11. Prévisualiser et numériser la section à l'aide d'un scanner de lames entières.
      REMARQUE : Le xylène, l'alcool acide, l'acide acétique, le paraformaldéhyde et les solutions de coloration utilisées dans cette étude, notamment la solution de Weigert, le Vert rapide et le Safranin O, sont des substances dangereuses. Toutes les manipulations doivent être effectuées sous hotte aspirante, en portant des équipements de protection individuelle appropriés, notamment des gants en nitrile, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité. Les déchets dangereux, y compris les réactifs usagés et les rinçages, doivent être triés, le xylène étant conservé séparément des déchets aqueux, collectés dans des récipients désignés et éliminés conformément à la réglementation institutionnelle.

5. Analyse statistique

  1. Présenter les données continues sous forme de moyenne ± déviation standard (DS) sauf indication contraire ; les scores OARSI sont exprimés en médiane (P25, P75).
  2. Pour les résultats rapportés comme moyenne ± SD, effectuer des comparaisons entre plusieurs groupes à l'aide d'une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie de tests a posteriori de Tukey. Les scores OARSI ont été analysés à l'aide du test de Kruskal-Wallis, suivi de a posteriori tests utilisant le test de Mann-Whitney unilatéral pour les comparaisons par paires entre les deux groupes15.
  3. Considérer P valeurs < 0,05 statistiquement significatif"ns" indique aucune différence significative.

Résultats

Le test sur rotarod a montré une latence plus longue avant la chute dans le groupe EA par rapport au groupe DMM (P < 0,05), tandis que le groupe SA ne différait pas significativement du groupe DMM (Figure 1C et Tableau 1). Avant la modélisation, des échographies longitudinales de l'articulation du genou (distance de balayage, 4 mm ; pas de déplacement, 0,04 mm) n'ont révélé aucune différence significative du volume de la cavité articulaire entre les groupes (Figure 3A,B et Tableau 2). Une semaine après la modélisation, la reconstruction tridimensionnelle a montré un volume de cavité articulaire significativement plus élevé dans les groupes DMM, SA et EA par rapport au groupe Sham (P < 0,05), sans différence significative entre les groupes DMM, SA et EA (P > 0,05) (Figure 3A,C). Après 4 semaines de traitement par EA, le volume de la cavité articulaire était significativement plus faible dans le groupe EA que dans le groupe DMM (P < 0,05) (Figure 3A,D), ce qui est compatible avec une réduction du gonflement de la cavité articulaire.

L’IRT est une technique utilisée pour recueillir des informations sur la température au niveau du plan focal dans un champ de vision et pour afficher les distributions de température de surface sous forme de pseudocouleurs16. Aucune différence significative de température de surface cutanée n’a été observée entre les groupes avant la modélisation ou une semaine après la modélisation (Figure 4A-C et Tableau 3). Toutefois, après le traitement par AE, la température de surface cutanée du groupe DMM était significativement plus basse que celle du groupe Sham. En revanche, la température de surface cutanée du groupe AE était significativement plus élevée que celle du groupe DMM (Figure 4A,D), ce qui montre que l’AE était associée à une température locale de surface cutanée plus élevée que la DMM, contrairement à l’AS.

Les images IRM n'ont montré aucune anomalie visible du signal musculaire périarticulaire dans le groupe témoin, des modifications du signal plus marquées dans le groupe DMM, des changements moins prononcés dans le groupe EA, et des modifications similaires dans les groupes SA et DMM (Figure 5A). Après le traitement par EA, les articulations du genou droit ont été prélevées, incluses dans de la paraffine et coupées en sections sagittales de 4 µm. Les sections ont été colorées à l'orange de safranine et au vert rapide, puis notées selon le système histopathologique OARSI. Par rapport au groupe témoin, le groupe DMM présentait une usure plus importante du cartilage articulaire et un score OARSI plus élevé. Le groupe EA montrait une dégénérescence cartilagineuse moindre et un score OARSI inférieur à celui du groupe DMM (P < 0,05), tandis que le groupe SA ne différait pas significativement du groupe DMM (Figure 5B,C et Tableau 4).

figure-results-1
Figure 1 : Chronologie expérimentale, schéma des points d'acupuncture et test du rotarod chez des souris atteintes d'arthrose. (A) Chronologie expérimentale. (B) Schéma des points d'acupuncture. (C) Test du rotarod. n = 6 par groupe. Chaque souris a effectué trois essais. Les données sont exprimées comme moyenne ± ÉT. ### Faux traitement vs DMM, P < 0,001 ; ns, SA vs DMM, P > 0,05 ; ** EA vs DMM, P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Examen échographique étape par étape. (A) Placer la souris dans une chambre d'induction pour l'anesthésie. (B) Appliquer une crème dépilatoire sur la patte postérieure. (C) Après avoir appliqué uniformément la crème, attendre 1 minute. (D) Essuyer l'excès de crème dépilatoire et les poils avec un tampon de gaze. (E) Examiner la patte postérieure dépilée. (F) Avant l'acquisition d'images, replacer la souris dans la chambre d'induction pour l'anesthésie. (G) Appliquer un agent de couplage échographique sur la patte postérieure et faire pivoter la sonde jusqu'à ce qu'elle soit parallèle à l'axe longitudinal de la patte postérieure. (H) Acquérir les images échographiques. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Images représentatives et résultats quantitatifs d'examens échographiques chez des souris atteintes d'arthrose. (A) Reconstructions échographiques tridimensionnelles de l'articulation du genou avant la chirurgie, une semaine après la chirurgie et après le traitement par EA (distance de balayage, 4 mm ; pas de déplacement, 0,04 mm). Les barres d'échelle = 2 mm. (B) Volume de la cavité articulaire préopératoire (n = 6 par groupe). (C) Volume de la cavité articulaire une semaine après la chirurgie (n = 6 par groupe). (D) Volume de la cavité articulaire après l'intervention par EA (n = 6 par groupe). ### Faux traitement vs DMM, P < 0,001 ; ns, SA vs DMM, P > 0,05 ; *** EA vs DMM, P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Thermogrammes infrarouges représentatifs et résultats quantitatifs de température cutanée chez des souris atteintes d'arthrose. (A) Thermogrammes des membres inférieurs avant la chirurgie, une semaine après la chirurgie et après le traitement par EA. Chaque thermogramme a été affiché à l’aide de la plage de température automatique du logiciel de la caméra infrarouge ; par conséquent, les couleurs ne sont pas directement comparables entre les panneaux. Les comparaisons quantitatives doivent être basées sur les graphiques de dispersion dans les panneaux B à D. (B–D)  Analyse quantitative de la température cutanée de la région d’intérêt (ROI) au niveau de l’articulation du genou, définie comme la ligne articulaire médiale au niveau de l’articulation fémorotibiale. (B) Température cutanée du membre inférieur avant la chirurgie (n = 6 par groupe). (C) Température cutanée du membre inférieur une semaine après la chirurgie (n = 6 par groupe). (D) Température cutanée du membre inférieur après l’intervention par EA (n = 6 par groupe). Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type. ### Faux opérés vs DMM, P < 0,001 ; ns, SA vs DMM, P > 0,05 ; ** EA vs DMM, P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Images représentatives d'IRM montrant des modifications du signal musculaire périarticulaire, coupes histologiques de l'articulation du genou et résultats quantitatifs chez des souris atteintes d'arthrose. (A) Images d'IRM représentatives de chaque groupe. (B) Coupes représentatives du genou colorées à la safranine O et au vert rapide. Les échelles correspondent à 1 mm. (C) Scores de pathologie du cartilage selon OARSI (n = 6 par groupe). Les scores OARSI sont exprimés en médiane (P25, P75). ### Sham contre DMM, P < 0,001 ; ns, SA contre DMM, P > 0,05 ; ** EA contre DMM, P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

GroupeNSemaine 5
Témoin6101,300 ± 5,416
DMM670,280 ± 3,363###
SA670,060 ± 7,796
EA684,390 ± 9,504**
Note : ### Témoin par rapport à DMM, P < 0,001 ; ** EA par rapport à DMM, P < 0,01.

Tableau 1 : Test du rotarod (moyenne ± ÉT ; n = 6 par groupe). ### Faux opérés vs DMM, P < 0,001 ; ** EA vs DMM, P < 0,01.

GroupeNSemaine 0Semaine 1Semaine 5
Témoin62,029 ± 0,0552,056 ± 0,0712,061 ± 0,079
DMM62,058 ± 0,0682,591 ± 0,056###2,926 ± 0,088###
SA62,056 ± 0,0452,592 ± 0,0762,915 ± 0,112
EA62,032 ± 0,0592,548 ± 0,0742,177 ± 0,110***
Note : ### Témoin par rapport à DMM, P < 0,001 ; *** EA par rapport à DMM, P < 0,001.

Tableau 2 : Volume de la cavité articulaire (moyenne ± ÉT ; n = 6 par groupe). ### Faux traitement vs DMM, P < 0,001 ; *** EA vs DMM, P < 0,001.

GroupeNSemaine 0Semaine 1Semaine 5
Témoin635,517 ± 1,36635,717 ± 0,54635,650 ± 0,701
DMM635,783 ± 1,29235,033 ± 0,78132,967 ± 1,223###
SA635,583 ± 1,78035,283 ± 0,86133,267 ± 0,501
EA635,500 ± 1,51035,417 ± 0,88234,533 ± 0,929**
Note : ### Témoin par rapport à DMM, P < 0,001 ; ** EA par rapport à DMM, P < 0,01.

Tableau 3 : Température cutanée (moyenne ± ÉT ; n = 6 par groupe). ### Faux traitement vs DMM, P < 0,001 ; ** EA vs DMM, P < 0,01.

GroupeNSemaine 5Médiane
Témoin60,000 (0,000 ; 0,250)0
DMM64,000 (3,000 ; 4,250)###4
SA64,000 (3,000 ; 4,250)4
EA62,500 (1,750 ; 3,000)**2,5
Note : ### Témoin par rapport à DMM, P < 0,001 ; ** EA par rapport à DMM, P < 0,01.

Tableau 4 : Score OARSI [médiane (P25, P75) ; n = 6 par groupe]. ### Faux opérés vs DMM, P < 0,001 ; ** EA vs DMM, P < 0,01.

Discussion

L'arthrose du genou (AG) est une maladie dégénérative progressive, et les interventions thérapeutiques actuelles ont une efficacité limitée pour en arrêter la progression sous-jacente17. Un dysfonctionnement musculaire et une diminution des performances physiques sont des facteurs prédictifs cliniquement significatifs de la gravité des symptômes. Par conséquent, la gestion active des facteurs de risque modifiables est essentielle pour ralentir la progression de l'AG18. À l'aide d'un système d'évaluation multimodal, cette étude a montré que l'électroacupuncture (EA) était associée à une amélioration des performances motrices, à une réduction du volume de la cavité articulaire, à une température cutanée locale plus élevée, à des modifications moins marquées du signal en IRM des muscles périarticulaires et à des scores OARSI plus faibles chez des souris atteintes d'arthrose.

Les résultats de l'IRT appuient davantage cette vision intégrée. Une semaine après la chirurgie, les températures cutanées ne différaient pas entre les groupes, y compris le groupe Sham, ce qui reflète probablement une réponse uniforme au traumatisme chirurgical, caractérisée par une vasoconstriction transitoire et un œdème superficiel réduisant temporairement l'émission de chaleur depuis la surface cutanée. En revanche, la divergence thermique significative observée après traitement suggère que les effets anti-inflammatoires et sur la microcirculation de l'EA sont cumulatifs plutôt qu'immédiats, ne devenant apparents qu'après plusieurs séances. Ces mesures de résultat pourraient être interdépendantes. L'augmentation du volume de la cavité articulaire reflète généralement l'importance de l'inflammation synoviale et de l'épanchement, tandis que l'état local de la microcirculation est étroitement lié aux modifications de la perméabilité vasculaire durant l'inflammation19. Dans nos expériences, la réduction du volume articulaire après administration d'EA coïncidait avec une élévation de la température locale. Bien que l'IRT ne mesure pas directement le débit sanguin, ces changements concomitants suggèrent qu'un débit sanguin local accru pourrait faciliter l'élimination des médiateurs inflammatoires, réduisant ainsi l'infiltration inflammatoire au niveau du tissu synovial et des muscles environnants. L'amélioration ultérieure de la fonction motrice pourrait découler des effets combinés d'une diminution de l'œdème et d'une atténuation de l'inflammation. Dans l'ensemble, les modifications observées pour ces différents paramètres semblent constituer des réponses interconnectées plutôt que des événements isolés. Ce schéma suggère que l'EA pourrait moduler plusieurs processus pathologiques de manière intégrée, plutôt que d'agir selon un mécanisme unique20.

Par rapport aux évaluations histologiques classiques à point final, le système de surveillance dynamique multimodal utilisé dans cette étude présente des avantages pratiques distincts. L'échographie chez les petits animaux permet un suivi longitudinal et non invasif de l'épanchement articulaire sans exposition aux rayonnements, évitant ainsi la variabilité interindividuelle inhérente au prélèvement tissulaire à point final21. L'IRM chez le petit animal complète l'échographie en offrant une visualisation détaillée des modifications du signal dans les muscles périarticulaires. Cela permet une évaluation qualitative de l'inflammation musculaire que l'échographie seule pourrait ne pas entièrement capter. Associée à l'imagerie infrarouge (IRT) pour la mesure en temps réel de la température cutanée locale, cette approche fournit un indicateur indirect de la résolution de l'inflammation. La disponibilité de ces modalités d'imagerie rend possible la réalisation de mesures répétées tout au long du traitement. Au-delà du respect des principes 3R, cette conception longitudinale permet des observations répétées chez chaque animal, ce qui minimise l'influence de la variabilité interindividuelle. À notre connaissance, aucune étude animale antérieure évaluant l'acupuncture pour l'arthrose n'a intégré l'échographie, l'IRM, la thermographie, les tests comportementaux et l'histopathologie au sein d'un même cadre expérimental. Cette approche multilatérale fournit des données complémentaires dans les domaines fonctionnel, morphologique et histologique, offrant ainsi une évaluation plus complète que ne pourrait le faire un seul point final.

Plusieurs limites doivent être reconnues. Premièrement, cette étude s'appuie sur des données observationnelles provenant d'expériences animales et manque de preuves mécanistiques issues d'études in vitro. Il reste inconnu si l'EA active la voie de la famille des récepteurs de type NOD, domaine pyrine 3 (NLRP3)/caspase-1/IL-1β. L'IL-1β et l'IL-18 sont des médiateurs clés de l'inflammation synoviale et musculaire, et leur maturation nécessite l'activation de l'inflammasome NLRP322. Nous ne pouvons pas non plus déterminer si les améliorations circulatoires observées sont corrélées à des modifications de l'expression du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) ou de la synthase de l'oxyde nitrique endothélial (eNOS)23. Deuxièmement, nous avons appliqué un seul paramètre d'EA (2/100 Hz) sur deux points d'acupuncture (ST36 et SP10). La question de savoir si d'autres réglages ou combinaisons alternatives de points d'acupuncture pourraient produire de meilleurs résultats nécessite des recherches supplémentaires24. Troisièmement, un seul opérateur a acquis toutes les données d'imagerie. Bien que cette approche ait assuré une cohérence technique, la fiabilité inter-observateur n'a pas été évaluée, ce qui pourrait limiter la généralisabilité des résultats d'imagerie. Quatrièmement, nous n'avons pas inclus de groupe témoin soumis uniquement à une contention, ce qui rend difficile de distinguer complètement les effets de l'anesthésie, de l'immobilisation et de la manipulation des effets thérapeutiques de l'EA. Cinquièmement, la procédure de faux traitement (SA) a été conçue comme un contrôle minimal afin de réduire les effets spécifiques liés aux points d'acupuncture, aux tissus profonds et à la stimulation électrique. Toutefois, la différence de profondeur de piqûre entre les interventions réelle et factice nous empêche d'isoler la contribution de la profondeur seule. Par conséquent, nos résultats doivent être interprétés comme une comparaison entre le protocole complet d'EA et une procédure factice minimale, plutôt que comme une évaluation stricte de la stimulation électrique isolée. Sixièmement, la distance de la caméra, l'angle d'imagerie et la surface absolue de la région d'intérêt (ROI) n'ont pas été documentés formellement, ce qui constitue une limite technique. Une dernière limitation est l'utilisation d'ANOVA séparées pour chaque point temporel, ce qui néglige les corrélations de mesures répétées et l'interaction temps par groupe, réduisant ainsi la sensibilité aux changements dynamiques.

En résumé, l'EA était associée à des effets anti-inflammatoires et fonctionnels dans un modèle murin de GOA induite par DMM. Malgré des limites telles qu'une résolution variable selon les modalités, la dépendance de l'ÉU et de l'IRT à l'opérateur, les coûts élevés de l'IRM et le stress potentiel lié à des mesures répétées, le protocole reste une plateforme réalisable pour une évaluation longitudinale multimodale. Le système intégré fournit un cadre pour l'évaluation préclinique. Les travaux futurs devraient optimiser les paramètres électriques et exploiter des plateformes d'organoïdes, d'organes-sur-puce et d'intelligence artificielle afin d'élucider les mécanismes et de guider des thérapies individualisées25,26. Des contrôles placebo améliorés, des protocoles standardisés et un suivi plus long sont également nécessaires pour renforcer la transposition clinique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d'intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le plan d'action pour l'innovation scientifique et technologique de Shanghai (23YF1447900 attribué à JMC) et par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U23A20508 attribué à LQY, 82575196 attribué à HSC et U24A6013 attribué à HX).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution d'acide acétique à 1 %SolarbioCat# G1371Solution de différenciation/lavage pour la coloration
Acide chlorhydrique à 1 % dans l'éthanolSolarbioCat# G1371Solution de différenciation acide-alcool
IRM pour petits animaux 7TShanghai Chenguang7T MRI NOVALSystème d'imagerie par résonance magnétique pour petits animaux
Aiguilles d'acupuncture (0,16 mm × 25 mm)Wuxi Jiajian Medical Instrument, Wuxi, Chinelot no. 491226Aiguilles d'acupuncture stériles
Lames porte-objets adhésivesJiangsu ShitaiMH0662Lames pour microscopie destinées aux coupes de tissus
Éthanol anhydreShanghai Titan Technology Co., Ltd.64-17-5Éthanol pour déshydratation
Souris C57BL/6Shanghai Silaike Laboratory Animal Co., Ltd.https://www.slaccas.com/Animaux d'expérience
Lames couvre-objetsJiangsu ShitaiNon fourniCollecte et montage des coupes de tissus
Solution de décalcificationSerivebioG1105-500mlRéactif de décalcification osseuse et articulaire, pH 7,2-7,4
Dispositif de thérapie électriqueSuzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd.SD-ZStimulateur d'électroacupuncture
Acide éthylènediaminotétraacétiqueShanghai Titan Technology Co., Ltd.60-00-4Réactif chélatant
Fiji (ImageJ)National Institutes of Health (NIH)ImageJ fourni avec Java 64 bits version 8.Logiciel d'analyse d'images
CompresseWeizhe MedicalType A1 : Compresse standard (stérile)Matériau pour l'épilation et le nettoyage
Crème dépilatoireVEETNon fourniCrème dépilatoire
Logiciel d'analyse d'images infrarougesFLIRVersion non fournieLogiciel fourni avec l'imagerie thermique infrarouge
Imagerie thermique infrarougeFLIR435-0007-03 (premier lot)Système d'imagerie thermique infrarouge
Système d'anesthésie par inhalation pour petits animauxMatrx07149Système d'anesthésie gazeuse pour petits animaux
Isoflurane (anesthésique par inhalation)RWD217140901Anesthésique par inhalation
Ruban élastique médical imperméable Naisikang (3,81 cm × 4,57 m)Naisikang™732Matériau pour positionnement des membres en IRM
Kit de coloration Safranin O modifié et vert rapide (pour os)SolarbioCat# G1371Kit de coloration du cartilage et de l'os
Porte-aiguilleRWDF21001-12Pinçage et suture peropératoires
Milieu de montage en résine neutrebiosharp23338664Milieu de montage histologique
OxygèneNon fourniNon fourniGaz vecteur pour l'anesthésie par inhalation
Machine d'inclusion en paraffineLEICAEG1150CSystème d'inclusion en paraffine
Microtome à paraffineLEICARM2235Microtome rotatif
Paraffineepredia151534Milieu d'inclusion
ParaformaldéhydeSinopharm Reagents Co., Ltd.80096618Fixateur tissulaire
PBSServicebioG0002Solution saline tamponnée au phosphate
Appareil rotarodPanlabLE8205Système de test de fatigue rotarod
Plateforme d'imagerie par ultrasons pour petits animauxFujiVevo 3100Système d'échographie pour petits animaux
Hydroxyde de sodiumShanghai Titan Technology Co., Ltd.G19852HRéactif de laboratoire
StéréomicroscopeOlympusSZ61Microscope de dissection
Aiguilles à suture avec fil (suture résorbable 6-0 et suture en soie 6-0)Ningbo Medical Suture Co., Ltd.Cosmetic Needles 1/2 4X12 40Suture postopératoire
Lames chirurgicales (10#)Hangzhou Nuoyang Biotechnology Co., Ltd.20090120Incision du ligament du ménisque médial
Déshydrateur de tissusLEICATP1020Appareil automatisé de traitement des tissus
Séchoir à tissusLEICAHI1220Séchoir pour lames
Blocs d'inclusion tissulairesJiangsu ShitaiREF31050102WConsommables d'inclusion
Étaleur de tissusLEICAHI1210Système d'étalage des sections
Logiciel d'analyse par ultrasons (Vevo Lab 3.1.0)OpticVersion 3.1.0Logiciel d'analyse tridimensionnelle par ultrasons
Agent de couplage pour ultrasonsHu Qingyu TangYY0299-2008Gel de couplage pour ultrasons
Scanner de lames entièresOlympusVS200Système de numérisation de lames numérique
XylèneSinopharm Reagents Co., Ltd.10023418Réactif de clarification

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