Enrichissement des thyrotropes hypophysaires de souris chez des souris hypothyroïdiennes utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence à base de CD90

Résumé

Ce protocole décrit l’enrichissement des thyrotropes provenant de glandes hypophysaires adultes de souris en hypothyroïde grâce à la dissociation enzymatique et au tri cellulaire activé par fluorescence CD90, permettant des analyses moléculaires en aval et une culture primaire à court terme d’une population cellulaire enrichie en thyrotrope.

Résumé

Les thyrotropes sont des cellules endocrines spécialisées dans la glande hypophyse antérieure qui sécrètent l’hormone thyroïdienne stimulante (TSH) et régulent l’activité thyroïdienne. La sécrétion de TSH est régulée positivement par l’hormone libératrice de thyrotropine hypothalamique et régulée négativement par les hormones thyroïdiennes circulantes. Les thyrotropes ne représentent qu’une petite fraction des cellules hypophysaires (~5 %), compliquant les efforts d’isolement et d’étude de leur physiologie. Ici, nous décrivons une approche améliorée pour isoler les thyrotropes chez les souris adultes hypothyroïdiennes. L’hypothyroïdie a été induite pour augmenter la population thyrotrope avant la dissociation enzymatique de la glande hypophyse antérieure et le tri cellulaire activé par fluorescence à l’aide de l’antigène de surface CD90.2. Le traitement des glandes hypophyses antérieures de douze souris a permis d’obtenir environ 1,5 × 10 cellules⁶ CD90,2 positives enrichies pour l’expression de l’ARN messager Tshb . Les cellules CD90,2 positives représentaient environ 25 % des cellules hypophyses antérieures et présentaient une expression de Tshb environ cinq fois supérieure par rapport aux cellules CD90,2 négatives, indiquant un enrichissement thyrotrophe substantiel. Les cellules isolées sont restées viables en culture à court terme et ont conservé leur réactivité au traitement à la triiodothyronine. Ce protocole permet l’enrichissement et la culture des thyrotropes de souris pour des analyses moléculaires, transcriptomiques, épigénomiques et physiologiques en aval.

Introduction

La glande pituitaire est un organe endocrinien situé à la base du cerveau qui exerce un contrôle hiérarchique sur l’homéostasie hormonale. Son activité est régulée par des signaux hypothalamiques qui stimulent ou inhibent la production d’hormones hypophysaires, qui à leur tour régissent la fonction des organes endocriniens périphériques. La glande contient une population cellulaire hétérogène et dynamique, incluant des cellules souches/progénitrices et des cellules productrices d’hormones^{différenciées 1}. En réponse au stress physiologique ou à une blessure, les cellules souches/progénitrices hypophysaires peuvent s’activer, s’auto-renouveler et se différencier en plusieurs lignées sécréteurs^{d’hormones 2,3}. Structurellement, l’hypophyse est organisée en deux lobes majeurs : le lobe postérieur (PL), composé d’hypocytes et de terminaisons neurosécrétoires qui libèrent de l’ocytocine et de la vasopressine, et le lobe antérieur (AL), qui contient des types cellulaires endocriniens spécialisés sécrétant l’hormone de croissance, la prolactine, l’hormone thyroïdienne stimulante (TSH), l’hormone adrénocorticotrope, ainsi que l’hormone folliculo-stimulante des gonadotrophes (FSH) et l’hormone lutéinisante (LH). L’hypophyse antérieure abrite également des types cellulaires non hormonaux, tels que les cellules folliculostellaires S100B-positives, les cellules endothéliales et les péricytes, qui soutiennent la fonction^{endocrine 4,5,6}. Les rongeurs contiennent également des mélanotrophes dans le lobe intermédiaire de l’hypophyse ^7,8.

L’intérêt pour la fonction, la différenciation et le développement de l’hypophyse a conduit à l’élaboration de multiples protocoles visant à isoler les cellules souches et progénitrices hypophysaires adultes dans des modèles de rongeurs. Les rats sont fréquemment utilisés dans la recherche en physiologie hypophysaire car leurs plus grandes glandes pituitaires produisent un plus grand nombre cellulaire et améliorent la récupération lors du traitement des^{tissus 4,9}. En revanche, isoler les cellules hypophysaires de souris reste techniquement difficile, et les protocoles standardisés sont limités. Les protocoles récents utilisant des agrégats de cellules souches/progénitrices hypophysaires adultes fournissent des outils utiles pour modéliser le développement et la fonction de l’hypophyse¹⁰ ; cependant, ces systèmes ne permettent pas encore l’isolement direct de populations cellulaires endocriniennes spécifiques. Parmi les types cellulaires producteurs d’hormones de l’hypophyse antérieure, les thyrotropes sont les principaux régulateurs de l’axe hypothalamo–hypophyse–thyroïdienne (THH), contrôlant la synthèse et la sécrétion de l’hormone thyroïdienne (TH) chez les mammifères. La TSH produite par les thyrotropes est une glycoprotéine hétérodimérique composée d’une sous-unité α commune (codée par la Cga et partagée avec la FSH et la LH) et d’une β-sous-unité (codée par la Tshb), qui confère la spécificité des récepteurs. Ces cellules sont très sensibles aux niveaux circulants de triiodothyronine (T3) et de thyroxine (T4). La population de thyrotropes s’étend lorsque les niveaux de T3 et T4 sont faibles lors de l’hypothyroïdie et se contracte pendant l’hyperthyroïdie grâce à un mécanisme classique de rétroaction négative 11,12,13.

Malgré leur rôle physiologique essentiel, les thyrotropes restent difficiles à étudier car ils ne constituent qu’une petite fraction des cellules hypophysaires antérieures (environ 5 %) et partagent des caractéristiques phénotypiques avec d’autres populations endocriniennes. Cette rareté, combinée à l’absence de modèles in vitro robustes, a limité les investigations mécanistiques sur la régulation des thyrotropes et le contrôle de l’axe HPT. La lignée cellulaire tumérale TαT1 représente un modèle¹⁴ de type thyrotrope couramment utilisé, mais elle ne reflète pas entièrement les réponses physiologiques ; en particulier, la répression dépendante de T3 de Tshb est souvent difficile à évaluer en raison de son très faible niveau de transcription^{basal 15}. Par conséquent, de nombreuses études se sont appuyées sur des lignées cellulaires non thyrotropes telles que les cellules HEK293, COS, CV1, GH3 ou JEG3 exprimant différents constructs Tshb ¹⁵. Cependant, il s’agit de systèmes hétérologues qui peuvent introduire des artefacts régulateurs non physiologiques, y compris des effets dictés par les colonnes vertébrales plasmidiques plutôt que par des mécanismes transcriptionnels endogènes.

Ici, nous présentons un protocole étape par étape pour isoler les thyrotropes de la glande pituitaire adulte de souris, adapté d’une méthode déjà établie chez les^{rats 9}, et optimisé pour la taille plus petite et la teneur en thyrotropes plus faible de l’hypophyse de la souris. Plusieurs modifications clés ont été introduites pour améliorer le rendement des cellules exprimant Tshb et garantir une analyse fiable en aval. Le protocole exploite l’expression de l’antigène de surface CD90, un marqueur de surface enrichi en thyrotropes. CD90 (également connu sous le nom de THY1) est une protéine membranaire ancrée dans le glycosylphosphatidylinositol^16,17 qui médiatise la signalisation juxtacrine par des interactions hétérotypiques avec le ligand intégrine β2 (ITGB2). Bien que CD90 soit couramment associé à des populations de cellules immunitaires et neuronales, des études transcriptomiques antérieures ont identifié un enrichissement de Thy1 dans les thyrotropes. La signalisation de contact dépendante de THY1 se produit dans divers types cellulaires, notamment les cellules hématopoïétiques, les lymphocytes T, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les neurones, où elle régule l’adhésion, la migration, l’apoptose, la suppression tumorale et^{la fibrose} 18,19,20.

Il est important de noter que le profilage transcriptomique unicellulaire de l’hypophyse antérieure du rat a identifié Thy1 comme l’un des gènes liés à l’adhésion les plus exprimés chez les thyrotropes⁵, suggérant que THY1 est un marqueur de surface enrichi dans les thyrotropes. De plus, des ensembles de données de séquençage des acides ribonucléiques (ARN) monocellulaires de l’hypophyse monocellulaire de la souris indiquent que l’expression de Thy1/CD90 est enrichie dans les thyrotropes^22,23. Cependant, son expression n’est pas entièrement limitée à cette lignée, avec une expression détectable dans des sous-ensembles de cellules de la lignée PIT1, y compris les somatotropes et les lactotropes, ainsi que dans des populations progénitrices. Des études transcriptomiques unicellulaires ont démontré un chevauchement transcriptionnel important entre cellules hypophysaires de la lignée PIT1, y compris l’identification d’une population commune de progéniteurs PIT1 capable de générer des somatotropes, des lactotropes et^{des thyrotropes 24}. De même, Thy1/CD90 n’identifie pas exclusivement la population de thyrotropes mais peut être utilisé pour enrichir les thyrotropes de souris. S’appuyant sur ces résultats, l’utilisation d’anticorps ciblés par THY1 dans notre stratégie d’isolement offre une méthode efficace pour enrichir les thyrotropes après une expansion induite par l’hypothyroïdie et permet des études fonctionnelles, y compris l’évaluation des réponses hormonales à la T3.

Le protocole commence par nourrir les souris sauvages de type C57BL/6 avec un régime pauvre en iode et par inhiber la fonction thyroïdienne avec du méthimazole (MMI) et du perchlorate de potassium (_{KClO 4}) dans l’eau^{potable 25}. Ce traitement induit une hypothyroïdie importante en moins d’une semaine et augmente la population de thyrotropes exprimant du tshb dans l’hypophyse antérieure. Les cellules productrices de TSH dans des conditions hypothyroïdiennes subissent d’importantes adaptations physiologiques et morphologiques, notamment l’hyperplasie, l’hypertrophie, une abondance de cytoplasme vacuolé, des processus cytoplasmiques proéminents et des lysosomes élargis, reflétant une adaptation à l’absence de rétroaction TH 26,27,28. Ainsi, l’induction de l’hypothyroïdie peut être utilisée comme stratégie pour augmenter la population de thyrotropes.

Après une induction d’hypothyroïdie, les souris sont anesthésiées avec de l’isoflurane et soumises à une perfusion cardiaque avec une solution saline tamponnée HEPES Ca²⁺/^{Mg 2+}-free afin de maximiser la viabilité cellulaire lors de la dissociation tissulaire. Après la prélèvement, la glande hypophyse antérieure subit une digestion enzymatique douce pour générer une suspension unicellulaire incubée avec un anticorps anti-CD90.2 conjugué phycoérythrine-cyanine 7 afin d’enrichir les thyrotropes par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les cellules marquées sont ensuite collectées soit dans un milieu de croissance pour culture à court terme, soit dans du TRIzol pour l’extraction d’ARN. Pour valider la stratégie d’enrichissement, l’expression de l’ARN messager Tshb a été mesurée dans des populations triées et s’est révélée fortement enrichie dans les cellules CD90-positives. Cette méthode soutient un large éventail d’applications en aval chez la souris, incluant le profilage de l’expression génique, les analyses transcriptomiques et épigénomiques, les tests à haut débit et la culture cellulaire primaire, et offre une plateforme précieuse pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la fonction thyrotrope et à la régulation de l’axe HPT.

Protocole

Ce protocole décrit l’isolement des thyrotropes de la AL des glandes pituitaires fraîchement disséquées obtenues sur des souris adultes après au moins une semaine d’induction de l’hypothyroïdie. Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité des soins et de l’utilisation des animaux institutionnels de la branche médicale de l’Université du Texas a approuvé toutes les procédures animales.

Les souris mâles et femelles ont été regroupées lors des expériences car aucune différence dépendante du sexe dans le rendement thyrotrophe ou les analyses en aval n’a été observée. Environ 12 souris ont été utilisées par expérience, bien que de plus grandes cohortes allant jusqu’à 20 animaux puissent être traitées en augmentant proportionnellement tous les volumes de réactifs.

Un isolement réussi dépend d’une perfusion rapide et constante, d’un temps de dissection minimal, d’un retrait complet de la PL et d’un plaque à haute densité des cellules primaires. Le temps maximal recommandé de traitement entre l’euthanasie, la perfusion, la dissection hypophysaire et le début de la digestion enzymatique était de 6 h. Les cellules étaient placées à une densité de 2,0 à 2,5 × 10⁵ cellules par 0,7 cm^{de puits 2} (la surface d’un puits d’une lame de chambre en verre à 8 puits). Une viabilité minimale de 95 % était requise pour soutenir la culture thyrotrophe à court terme.

Tous les réactifs utilisés pour la génération de suspension monocellulaire étaient préparés dans des conditions stériles. Les surfaces de travail ont été stérilisées avec 70 % d’éthanol, les instruments de dissection ont été autoclavés avant utilisation, et toutes les étapes de préparation de la culture cellulaire ont été réalisées dans un cabinet de biosécurité en utilisant une technique aseptique. Ce protocole a été standardisé pour 12 animaux. Ajustez tous les volumes de réactifs proportionnellement en utilisant un nombre différent de souris. Consultez le tableau des matériaux pour tous les réactifs, consommables et équipements.

Lors de l’induction de l’hypothyroïdie, les souris ont été logées dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes à 20°C–24°C et une humidité relative de 40 % à 60 %, avec un cycle de lumière de 12 h et 12 heures d’obscurité et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux étaient hébergés en groupe (jusqu’à trois souris par cage) dans des cages individuellement ventilées contenant une litière standard et un enrichissement environnemental, incluant du matériel de nidification et un abri. L’induction réussie de l’hypothyroïdie a été confirmée en mesurant l’expression hépatique d’iodothyronine déiodinase (Dio1). Une réduction d’au moins 50 % de l’expression de l’ARN messager (ARNm ) de Dio1 par rapport aux souris témoins euthyroïdiennes a été considérée comme indicative d’une induction réussie de l’hypothyroïdie.

1. Induction de l’hypothyroïdie chez les souris C57BL/6

REMARQUE : Effectuez cette procédure sur 7 à 10 jours pour induire l’hypothyroïdie in vivo grâce à un régime pauvre en iode et à l’inhibition chimique de la fonction thyroïdienne. Voir la Figure 1A pour le plan expérimental et la Figure 1B pour la validation de l’induction de l’hypothyroïdie.

Figure 1. Induction de l’hypothyroïdie chez des souris C57BL/6. (A) Représentation schématique du flux de travail expérimental utilisé pour induire l’hypothyroïdie chez les souris adultes C57BL/6. Les souris ont reçu 0,05 % de méthimazole (MMI) et 0,1 % de perchlorate de potassium (KClO₄) dans l’eau potable, accompagnés d’un régime pauvre en iode pendant 7 jours avant l’isolement hypophysaire antérieur. (B) Analyse par transcription inverse de la réaction quantitative en chaîne par polymérase (RT-qPCR) de l’expression hépatique d’acide ribonucléique messager Dio1 (ARNm) chez des souris euthyroïdiennes et hypothyroïdiennes. La cyclophiline A (CyA) a été utilisée comme gène de référence. Les données sont présentées en moyenne ± écart-type (SD) (n = 6 par groupe). La signification statistique a été déterminée à l’aide du test t de Student. **P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

1. Préparez de l’eau potable MMI/KClO₄
   1. Dissoudre 1 g de MMI et 2 g de KClO₄ dans 2 L d’eau filtrée.
   2. Remuer la solution à température ambiante (20°C–25°C) pendant 1 h jusqu’à la dissolution complète.
      ATTENTION : Le MMI et le KClO₄ sont des produits chimiques dangereux. Portez des gants, une blouse de laboratoire et une protection oculaire pendant la préparation et la manipulation.
      REMARQUE : L’IMM inhibe l’organification de l’iodure, tandis que le KClO₄ bloque l’absorption de l’iodure via le symporteur^{sodium-iodure 25}. Remplacez la solution à boire tous les deux jours pour maintenir la bonne dose et minimiser la contamination due à la litière, aux débris alimentaires et à la croissance microbienne. Si elle n’est pas utilisée immédiatement, conservez la solution dans un récipient hermétiquement fermé et résistant à la lumière à 4°C pendant jusqu’à 14 jours.
2. Induire l’hypothyroïdie
   1. Des chats de C57BL/6 mâles ou femelles de 8 semaines sont regroupés en groupes pouvant accueillir jusqu’à trois animaux par cage dans des conditions de logement sans iode.
      REMARQUE : Souris d’intérieur dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes à 20°C–24°C et avec une humidité relative de 40 % à 60 %, avec un cycle de lumière de 12 h et 12 heures d’obscurité et un accès improvisé à la nourriture et à l’eau. Maintenir les animaux dans des cages ventilées individuellement contenant une litière standard et un enrichissement environnemental, incluant du matériel de nidification et un abri. Acclimatez les animaux pendant 3 jours avant de commencer le traitement. Les souris mâles et femelles de maison séparément. Pour les expériences décrites ici, le groupe euthyroïdien comprenait six mâles et six femelles logés dans des cages séparées, et le groupe hypothyroïdien comprenait six mâles et six femelles logés dans des cages séparées. Les AL en pool chez des souris mâles et femelles appartenant au même groupe de traitement lors de la préparation cellulaire n’ont été observées aucune différence dépendante du sexe dans le rendement thyrotrope ou les analyses en aval.
   2. Nourrissez les souris avec un régime pauvre en iode à volonté pendant 7 à 10 jours.
      REMARQUE : Commencez simultanément le régime carent en iode et le traitement MMI/KClO₄.
   3. Fournir de l’eau potable contenant 0,05 % d’IMM et 0,1 % de KClO₄ ad libitum tout au long de la période de traitement.
      REMARQUE : Maintenez le traitement jusqu’à l’euthanasie. Surveillez quotidiennement le poids corporel, la consommation alimentaire, la consommation d’eau et les signes cliniques pendant l’induction de l’hypothyroïdie. Une induction réussie de l’hypothyroïdie est généralement associée à une prise de poids corporelle réduite et à des signes cliniques tels qu’une diminution de l’activité ou un pelage terne comparé aux témoins euthyroïdiens. Les périodes d’induction de sept et dix jours produisent une efficacité d’enrichissement thyrotrope comparable.

2. Perfusion cardiaque et dissection de la LA

REMARQUE : Effectuer cette procédure en environ 15 minutes par souris afin de maximiser la viabilité des tissus et de préserver l’intégrité cellulaire lors de l’isolement hypophysaire.

1. Préparez des solutions de perfusion et de collecte
   1. Préparez une solution saline tamponnée HEPES (HBSS) sans Ca²⁺ ni Mg²⁺
      1. Combinez 667 mL de 0,9 % de NaCl, 20 mL de 1 M HEPES et 313 mL d’eau double distillée (ddH₂O) pour préparer 1 L de HBSS préparé sur mesure sans Ca²⁺ ni Mg²⁺.
      2. Autoclave la solution et la conserver à 4°C jusqu’à utilisation.
   2. Préparez un HBSS héparinisé sans Ca²⁺ ni Mg²⁺
      1. Ajoutez 27 μL d’énoxaparine sodique (solution de fond de 100 mg/mL) à 50 mL de HBSS préparé sur mesure sans Ca²⁺ et Mg²⁺.
   3. Préparer le support de collecte (CM)
      1. Combinez 440 mL de médium Eagle modifié de Dulbecco, 50 mL de sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, 4 mM de L-glutamine et 10 mL de 1 M HEPES pour un volume final de 500 mL.
      2. Stérilisez la solution par filtre à 0,22 μm et conservez-la à 4°C pendant jusqu’à 1 mois.
         REMARQUE : Préparez 50 mL d’aliquotes sous un armoire de biosécurité avant le stockage afin de minimiser la contamination.
      3. Chauffez le CM à 20°C–25°C avant utilisation.
   4. Stérilisez les instruments de dissection
      1. Stérilisez ciseaux, pinces, pinces à épiler, porte-aiguilles, pinces à iris, cuillères chirurgicales et sondes émoussées avec 75 % d’éthanol avant utilisation.
         REMARQUE : Laissez les instruments sécher complètement à l’air libre après la stérilisation à l’éthanol avant le contact des tissus.
2. Effectuer une perfusion cardiaque
   1. Anesthésiez profondément la souris avec de l’isoflurane délivré à 100 % d’oxygène. Induire une anesthésie dans une chambre à 5 % d’isoflurane et maintenir l’anesthésie via un cône nasal à 3 % d’isoflurane avec une surveillance continue et un nettoyage des gaz résiduels.
      ATTENTION : Effectuer des procédures d’anesthésie à l’isoflurane conformément aux directives de sécurité institutionnelles et utiliser des systèmes de récupération appropriés pour minimiser l’exposition à l’inhalation.
   2. Confirmez l’anesthésie complète en vérifiant l’absence du réflexe de retrait des pédales à l’aide d’une pincée d’orteil.
   3. Vaporisez l’animal avec 75 % d’éthanol et placez-le sur l’étape de perfusion dans le bac de collecte.
   4. Immobilisez les membres pour exposer la région péritonéale.
   5. Ouvrez la cavité thoracique avec précaution tout en évitant d’endommager les organes majeurs et les vaisseaux sanguins.
   6. Coupez le long des côtes pour créer un rabat de poitrine, pliez le volet au-dessus de la tête, puis fixez-le avec un hémostat.
   7. Stabilisez le cœur à l’aide d’une pince et insérez une aiguille de calibre 23 dans l’apex du ventricule gauche.
   8. Reliez l’aiguille à une pompe péristaltique à l’aide de tubes en silicone.
   9. Commencez la perfusion avec un HBSS héparinisé sans Ca²⁺ ni Mg²⁺ maintenus à température ambiante.
   10. Incisez l’oreillette droite immédiatement après le début de la perfusion pour permettre le drainage.
   11. Perfusez l’animal pendant 5 minutes à un débit de 3 mL/min.
       REMARQUE : Confirmez la réussite de la perfusion en observant un flaut visible du foie.
3. Isoler la AL
   1. Décapitez la souris immédiatement après la perfusion.
   2. Retirez le cuir chevelu et les os crâniens à l’aide de ciseaux fins à disséquer et des pinces pour exposer le cerveau.
   3. Insérez une cuillère chirurgicale entre le cerveau et le crâne.
   4. Soulevez doucement le cerveau et coupez le chiasme optique.
   5. Retirez la fine membrane méningée (dure-mère) qui recouvre l’hypophyse sous un stéréomicroscope à l’aide d’une pince fine.
   6. Disséquez et écartez soigneusement la PL comme illustré à la Figure 2A.
      REMARQUE : Identifiez la AL comme le plus grand tissu rose situé rostralement. Identifiez la PL comme le tissu blanc-translucide plus petit situé dorsalement.
   7. Taillez les tissus conjonctifs environnants et les membranes méningées résiduelles avec une sonde émoussée pour améliorer l’accès à la SLA.
   8. Saisissez le AL avec une pince émoussée et transférez-le dans un tube en polypropylène de 15 mL contenant 1,8 mL CM.
      REMARQUE : Regroupez les AL de 12 animaux dans le même tube de collecte.
   9. Gardez l’échantillon à température ambiante jusqu’à ce que toutes les dissections soient terminées.
      REMARQUE : Ne pas dépasser 3 heures entre la collecte des tissus et le début de la digestion enzymatique afin de minimiser la perte de viabilité cellulaire.
4. Confirmez l’induction de l’hypothyroïdie
   1. Prélever un petit échantillon de foie (environ 50 mg) sur chaque souris.
   2. Quantifiez l’expression hépatique de l’ARNm Dio1 par réaction en chaîne de la polymérase par transcription inverse en temps réel et comparez-la avec des témoins euthyroïdiens non traités (Figure 1B).
      REMARQUE : Définissez l’induction réussie de l’hypothyroïdie comme une réduction d’au moins 50 % de l’expression hépatique de Dio1 par rapport aux témoins euthyroïdiens. L’expression de Dio1 est positivement corrélée aux niveaux circulants^{de TH 29} ; par conséquent, une expression réduite de Dio1 confirme une induction réussie de l’hypothyroïdie.
5. Collecte répétée de tissus
   1. Répétez les étapes 2.2–2.4. jusqu’à ce que les AL de 12 souris aient été collectées.
   2. Passez immédiatement à l’étape 3.

Figure 2. Préparation d’une suspension unicellulaire à partir de l’hypophyse antérieure de la souris. (A) Flux de travail illustrant la dissection du lobe antérieur (AL), la dissociation enzymatique et la préparation d’une suspension unicellulaire pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Le flux de travail comprend l’ablation du lobe postérieur, la digestion de la collagénase, la digestion de l’acide trypsine et éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) et la filtration avant analyse FACS. (B) Images représentatives de la coloration de colorant viable et du comptage automatisé des cellules hypophysaires antérieures dissociées chez des souris euthyroïdiennes et hypothyroïdiennes. Le rendement total des cellules et la concentration dans les cellules viables sont indiqués. Barre d’échelle = 200 μm. (C) Distribution des diamètres des cellules hypophysaires antérieures après dissociation tissulaire et préparation pour l’analyse FACS en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine. 

3. Préparation d’une suspension monocellulaire à partir de la AL de la souris

REMARQUE : Effectuez cette procédure en environ 60 minutes pour générer une suspension unicellulaire à partir du tissu hypophysaire antérieur.

1. Préparez des solutions enzymatiques pour la digestion
   1. Préparez une solution de collagénase à 2 %
      1. Dissoudez 100 mg de collagénase provenant de Clostridium histolyticum (>125 unités de digestion collagénase/mg solide) dans 4,9 mL de ddH₂O.
      2. Ajoutez 100 μL de 1 M HEPES pour obtenir un volume final de 5 mL.
      3. Stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
      4. Aliquote la solution en volumes de 200 μL et la conserve à −30°C pendant jusqu’à 2 mois.
         REMARQUE : Évitez les cycles répétés de gel-dégel. Ne réutilisez pas les aliquotes décongelées de collagénase.
   2. Préparez 0,25 % d’acide trypsine – acide éthylénédiamine tétraacétique (EDTA)
      1. Mélangez 1 mL de trypsine–EDTA à 0,5 % avec 1 mL de HBSS sans Ca²⁺ et Mg²⁺.
      2. Conservez la solution à 4°C jusqu’à utilisation.
         REMARQUE : Utilisez la solution de trypsine-EDTA diluée le jour de la préparation. Ne stockez pas et ne réutilisez pas la trypsine diluée-EDTA.
2. Effectuer la digestion de la collagénase
   1. Ajoutez 200 μL de solution de collagénase à 2 % aux tissus d’AL collectés.
   2. Mélangez doucement le tissu en pipettant avec une micropipette P1000 équipée de pointes à faible rétention.
   3. Incubez la suspension dans un bain-marie à 37°C pendant 15 minutes.
      REMARQUE : Gardez le bouchon du tube fermé pendant l’incubation pour minimiser la contamination.
   4. Tapotez doucement le tube toutes les 5 minutes pendant l’incubation.
3. Effectuer une digestion par désoxyribonucléase I (DNase I)
   1. Ajoutez 5 μL de DNase I (1 U/μL) directement à la suspension sans retirer le surnageant.
   2. Tapotez doucement le tube 10 fois pour mélanger la solution.
   3. Incubez la suspension à 37°C pendant 5 minutes.
4. Pelletez le tissu
   1. Centrifugez la suspension à 100 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
   2. Retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL.
      REMARQUE : Laissez environ 50 μL de liquide résiduel au-dessus du pellet lors du retrait du surnageant afin de minimiser la perte cellulaire.
5. Effectuer la digestion de la trypsine
   1. Ajoutez 2 mL de trypsine–EDTA à 0,25 % au pellet.
   2. Incubez la suspension à 37°C pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce qu’il ne reste plus aucun fragment de tissu intact visible.
      REMARQUE : Ne pas dépasser 15 minutes pour éviter une digestion tissulaire excessive et une réduction de la viabilité cellulaire.
6. Arrêter la digestion enzymatique et dissocier le tissu
   1. Ajoutez 2 mL de CM pour arrêter la trypsinisation.
   2. Pipettez doucement la suspension de haut en bas 10 à 20 fois à l’aide d’une micropipette réglée à 1 mL jusqu’à ce qu’aucun fragment de tissu visible ne reste ici.
      REMARQUE : Utilisez des embouts de pipette à faible rétention lors de la dissociation mécanique. Une suspension à cellule unique acceptable est une suspension uniforme à faible viscosité contenant principalement des cellules uniques avec un minimum d’agrégats ou de débris visibles (≤5 % à 10 % de grappes par inspection microscopique avec l’exclusion du bleu de Trypan).
7. Récupérer la suspension à cellule simple
   1. Centrifugez la suspension à 100 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
   2. Retirez le surnageant avec précaution.
   3. Passez immédiatement à l’étape 4.
      REMARQUE : Commencez la coloration dans les 15 minutes suivant la préparation de la suspension monocellulaire et terminez le tri des cellules en 1 h autant que possible. Maintenez les cellules sur glace pendant cet intervalle pour minimiser la perte de viabilité.

4. Coloration pour le tri cellulaire activé par fluorescence

REMARQUE : Effectuez cette procédure en environ 60 minutes pour colorer les cellules hypophysaires antérieures dissociées à la recherche de FACS des cellules CD90-positives.

1. Préparez la suspension de la cellule
   1. Ajouter un tampon de coloration de 350 μL composé de solution physiologique phosphatée (PBS, 1×) contenant 2 % de FBS et 0,09 % d’azide de sodium au pellet cellulaire.
   2. Resuspendez doucement le pellet en le pipettant 10 fois à l’aide d’une micropipette P1000 équipée de pointes à faible rétention pour obtenir une suspension monocellule.
   3. Transférez la suspension dans un tube microcentrifuge à faible liaison de 1,5 mL.
2. Déterminer la concentration et la viabilité cellulaires
   1. Retirez une aliquote de 5 μL de la suspension pour le comptage des cellules.
   2. Mélangez l’aliquote avec un colorant de viabilité de 5 μL.
   3. Chargez 10 μL du mélange dans un compteur de cellules automatisé.
      REMARQUE : Procéder au FACS lorsque la viabilité cellulaire est de ≥85 %, déterminée par l’exclusion de colorant de viabilité et lorsque des débris et des agrégats cellulaires sont minimes.
   4. Confirmez que la concentration totale des cellules est d’environ 1 × 10⁷ cellules/mL pour les échantillons d’euthyroïde et 2 × 10⁷ cellules/mL pour les échantillons d’hypothyroïde (Figure 2B). La répartition de la taille des cellules après la dissociation est illustrée à la Figure 2C.
3. Préparer les contrôles de compensation
   1. Transférez 50 μL de la suspension de la cellule dans un tampon de coloration de 300 μL.
   2. Divisez la suspension en trois aliquotes de 100 μL dans des tubes microcentrifuge séparés de 1,5 mL.
   3. Préparez les contrôles suivants : (i) contrôle non coloré, (ii) contrôle uniquement à iodure de propidium (PI), et (iii) contrôle uniquement à phycoérythrine-cyanine 7 (PE-Cy7) CD90.2 uniquement.
4. Teindre les cellules
   1. Ajouter 3 μL d’anticorps anti-CD90.2 conjugué PE-Cy7 à une suspension cellulaire de 300 μL.
      REMARQUE : La concentration d’anticorps a été déterminée par des expériences de titration antérieures. Une dilution finale de 1:100 a permis une séparation optimale entre les populations positives et négatives tout en minimisant la coloration de fond.
   2. Ajoutez 1 μL d’anticorps au contrôle de compensation CD90.2 pour obtenir une dilution finale de 1:100.
   3. Incubez tous les échantillons sur glace dans le noir pendant 30 minutes.
      REMARQUE : Mélangez doucement les échantillons toutes les 10 minutes pendant l’incubation pour maintenir une coloration homogène.
5. Lavez les cellules tachées
   1. Ajoutez 1 mL de tampon de coloration à froid à chaque tube.
   2. Centrifugez les échantillons à 210 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : Si disponible, désactivez le frein centrifugeuse pour minimiser la perturbation du pellet de cellule lors de la décélération.
   3. Retirez et jetez le surnageant avec précaution.
6. Résuspendre les cellules colorées
   1. Resuspendez la suspension de la cellule principale dans un tampon de coloration de 300 μL.
      REMARQUE : Ajoutez le PI immédiatement avant le tri à une concentration finale de 1 μg/mL.
   2. Resuspendez chaque contrôle de compensation dans un tampon de coloration de 100 μL.
7. Filtrez la suspension de la cellule
   1. Filtrez la suspension cellulaire à travers un tube de cytométrie en flux équipé d’un filtre cellulaire de 35 μm immédiatement avant le tri.
8. Procéder au tri cellulaire activé par fluorescence
   1. Passez immédiatement à l’étape 5 et triez les cellules colorées à l’aide d’un trieur cellulaire activé par fluorescence.

5. Stratégie de verrouillage et de tri FACS

REMARQUE : Effectuez cette procédure en environ 60 minutes pour isoler les thyrotropes viables CD90.2 positifs par FACS.

1. Configurez le trieur de cellules
   1. Installez une buse de 100 μm sur le trieur de cellules.
   2. Réglez la pression de la gaine à 20 psi.
      REMARQUE : Utilisez un liquide de gaine stérile à base de PBS maintenu à température ambiante.
2. Effectuer le contrôle qualité des instruments
   1. Exécutez les procédures de contrôle qualité de l’instrument selon les instructions du fabricant avant l’acquisition de l’échantillon.
      REMARQUE : Des flux de travail de contrôle qualité équivalents recommandés par le fabricant peuvent être utilisés sur des trieurs de cellules alternatifs.
   2. Vérifiez le délai de chute et la stabilité du flux à l’aide de billes d’étalonnage.
3. Effectuer la compensation de fluorescence
   1. Acquérez des contrôles de compensation monochrome.
   2. Effectuez la compensation de fluorescence avant de faire le contrôle et le tri.
      REMARQUE : Calculez la compensation à l’aide de contrôles non colorés et à coloration unique. Vérifier et ajuster manuellement les matrices de compensation avant de trier si nécessaire.
4. Définir la stratégie de verrouillage
   1. Excluez les débris en utilisant les paramètres de diffusion avant et latérale (Figure 3A,B).
   2. Créer des cases uniques en utilisant la hauteur de diffusion avant versus la zone de diffusion avant et la hauteur de diffusion latérale versus la surface de diffusion latérale (Figure 3A,B).
   3. Excluez les cellules mortes en verrouillant les cellules PI-négatives.
   4. Cellules à grilles CD90.2 positives pour l’enrichissement thyrotrope.
      REMARQUE : Définissez les cellules CD90.2 positives comme des événements présentant une intensité de fluorescence supérieure à 10-3 dans le canal de détection CD90 (Figure 3C–F).
5. Préparez les tubes de collecte
   1. Préparez les tubes de collecte selon l’application en aval prévue.
      REMARQUE : Préremplir les tubes de collecte à faible rétention avec soit un réactif de lyse QIAzol de 1 mL pour l’isolation de l’ARN, soit un Medium 199 complété par un sérum fœtal bovin détaché de charbon de 10 % pour applications en culture cellulaire.
6. Trier les thyrotropes CD90.2 positifs
   1. Triez les cellules individuelles CD90.2 positives dans des tubes de collecte.
   2. Collecter des cellules pour l’analyse de l’ARN
      1. Collectez directement les cellules dans un réactif de lyse de 1 mL.
      2. Faites un vortex sur les tubes pendant 1 minute pour lyser les cellules.
      3. Congèle immédiatement les échantillons sur de la glace sèche.
      4. Conserver les échantillons à −80°C jusqu’à l’extraction de l’ARN.
   3. Collecter les cellules pour la culture primaire
      1. Collectez les cellules dans un milieu de culture complété avec 10 % de sérum fœtal découpé de charbon et 1 % de pénicilline-streptomycine.
      2. Semez les cellules dans des lames de chambre vitrée à 8 puits à une densité d’au moins 2 × 10^{cellules de 5} puits dans un volume final de 200 μL.
      3. Cultivez les cellules jusqu’à 72 heures à 37°C dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO₂.
         REMARQUE : La performance acceptable en culture est indiquée par une attache cellulaire visible dans les 24 heures, une efficacité d’attache d’environ 60 % à 80 %, et une viabilité ≥ 70 % à 80 % après 72 heures.
      4. Ajoutez 100 nM T3 au milieu de culture si nécessaire.
         REMARQUE : Initiez le traitement T3 après l’attache cellulaire, généralement 24 h après le placage, et maintenez le traitement jusqu’à la collecte de l’échantillon à 72 h. Préparez la solution T3 en NaOH de 40 mM et incluez des témoins traités par véhicule à la même concentration finale de solvant.
         REMARQUE : Le sérum dépouillé au charbon de bois maintient un environnement de culture pauvre en TH et améliore la détection de la suppression expérimentale de l’expression de Tshb dépendante de la T3.

Figure 3. Stratégie de verrouillage FACS et validation de l’enrichissement thyrotrope. (A,B) Stratégie de porte séquentielle utilisée pour isoler des cellules hypophysaires antérieures viables uniques. Les portes incluent l’exclusion des débris utilisant la zone de diffusion avant (FSC-A) et la zone de diffusion latérale (SSC-A), la discrimination des singlets par hauteur de diffusion avant (FSC-H) versus FSC-A et la hauteur de diffusion latérale (SSC-H) versus SSC-A, ainsi que l’exclusion des cellules mortes positives au propidium iodure (PI). (C–F) Graphiques FACS représentatifs montrant l’identification et l’enrichissement des populations cellulaires CD90.2 et CD90.2 négatives à l’aide d’un anticorps anti-CD90.2 conjugué à la phycoythrine-cyanine 7 (PE-Cy7). (G–I) Validation quantitative par réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse (RT-qPCR) de l’enrichissement thyrotrope dans des populations cellulaires triées. Abréviations : FSC-A, zone de diffusion avant ; SSC-A, zone de diffusion latérale ; FSC-H, hauteur de diffusion avant ; SSC-H, hauteur de diffusion latérale ; PI, iodure de propidium ; PE-Cy7, phycoythrine–cyanine 7 ; NT, non traité. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

6. Analyse de l’expression génique de l’ARNm Tshb dans les cellules CD90-positives versus CD90-négatives par réaction en chaîne de la polymérase en temps réel

REMARQUE : Effectuez cette procédure en environ 5 heures pour quantifier l’expression de l’ARNm de Tshb dans les populations cellulaires triées.

1. Collecter les cellules triées pour l’extraction d’ARN
   1. Collectez un nombre égal de cellules CD90 positives et CD90 négatives (2,5 × 10⁵ cellules) dans des tubes séparés de 1,5 mL contenant un réactif de lyse de 1 mL.
2. Lyse les cellules
   1. Faites un vortex vigoureux sur les échantillons pendant 1 minute pour lyser complètement les cellules et placez-les sur la glace.
      REMARQUE : Conserver des échantillons lysés à −80°C avant l’extraction d’ARN si nécessaire.
3. Extraire l’ARN total
   1. Extraire l’ARN total selon les instructions du fabricant fournies avec le kit d’extraction d’ARN.
      REMARQUE : Effectuer la digestion de la DNase pendant la purification à l’aide de la DNase I sans RNase conformément aux instructions du fabricant pour retirer l’acide désoxyribonucléique génomique résiduel (ADN) avant élution.
   2. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Utilisez des échantillons avec un rapport A260/A280 d’environ 1,8–2,1 et un rapport A260/A230 supérieur à 1,8 pour la synthèse complémentaire de l’ADN (cDNA).
4. Synthétiser cDNA
   1. Synthétiser de l’ADNcC à partir de 100 ng d’ARN total selon les instructions du fabricant fournies avec le kit de synthèse d’ADNc de première brin.
      REMARQUE : Utilisez des amorces oligo(dT) lors de la synthèse de l’ADNc.
   2. Préparez le mélange gabine-amorce selon le tableau 1.
   3. Mélangez les réactifs délicatement et centrifugez brièvement pour prélever l’échantillon au fond du tube.
   4. Dénature le mélange de gaîte-amorce à 65°C pendant 10 minutes.
   5. Refroidissez immédiatement les échantillons sur glace.
   6. Préparez le mélange de réaction à transcription inverse selon le tableau 2 pour obtenir un volume final de 20 μL.
      REMARQUE : Préparez un mélange maître en multipliant les volumes de réactifs listés dans le tableau 2 par le nombre total d’échantillons et en ajoutant un volume supplémentaire de 10 % en excédent pour tenir compte de la variabilité du pipetage.
   7. Mélangez la réaction doucement sans vortex et centrifugez brièvement.
   8. Incubez la réaction à 50°C pendant 60 minutes.
   9. Inactivez la réaction à 85°C pendant 5 minutes.
   10. Refroidissez les échantillons sur de la glace.
   11. Procéder directement à la réaction en chaîne quantitative par transcription inverse (RT-qPCR) ou stocker l’ADNc à −30°C jusqu’à utilisation.
       REMARQUE : l’ADNc peut être stocké à −30°C pendant jusqu’à 6 mois dans des conditions sans nucléase. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
       REMARQUE : Effectuer des étapes de synthèse d’ADNc dans un thermocycleur équipé d’un couvercle chauffé pour minimiser l’évaporation.
5. Préparez le mélange de réaction RT-qPCR
   1. Préparez le mélange de réaction RT-qPCR selon le tableau 3.
6. Chargez la plaque RT-qPCR
   1. Ajouter 9 μL de mélange de réaction RT-qPCR à chaque puits d’une plaque de 96 puits.
   2. Ajoutez un modèle d’ADNc de 1 μL correspondant au produit rétrotranscrit généré à partir de 5 ng d’ARN total d’entrée.
   3. Mélangez doucement les échantillons et centrifugez brièvement.
7. Effectuer RT-qPCR
   1. Effectuez RT-qPCR selon les instructions du fabricant fournies avec le mélange master SYBR Green.
      REMARQUE : Utilisez une étape initiale de dénaturation de 95°C pendant 2 minutes, suivie de 40 cycles de 95°C pendant 5 s et 60°C pendant 30 s. Acquérez la fluorescence à la fin de chaque étape d’extension. Effectuer une analyse de la courbe de fusion de 65°C à 95°C par incréments de 0,5°C pour vérifier l’amplification sur un seul produit.
8. Normaliser l’expression de Tshb
   1. Normaliser l’expression de Tshb en expression de la cyclophiline A (CyA) en utilisant la méthode ΔCt.
      REMARQUE : Validez la stabilité de CyA avant analyse en confirmant une variation minimale de Ct entre les groupes expérimentaux.
9. Calculer l’expression relative des gènes
   1. Calculez l’expression relative de Tshb dans les cellules CD90-positives par rapport aux cellules CD90-négatives en utilisant la méthode 2^−ΔΔCt .
      REMARQUE : Effectuer une analyse RT-qPCR à partir de huit échantillons biologiques, chacun analysé lors de réactions techniques dupliquées (Figure 3G–I).

Réactif	Volume	Quantité/concentration finale
ARN total	Variable	100 ng
Amorce oligo(dT)18 ancrée (50 pmol/μL)	1 μL	2,5 μM
Eau de qualité PCR	Variable	Ajustez à un volume total de 13 μL
Total	13 μL	—

Tableau 1 : Préparation du mélange gabarit–amorce pour la synthèse complémentaire d’acides désoxyribonucléiques. Réactifs, volumes et quantités finales utilisés pour préparer le mélange modèle-amorce pour la synthèse complémentaire d’acide désoxyribonucléique (cDNA). Chaque réaction contenait 100 ng d’acide ribonucléique (ARN) total, un amorce oligo(dT)18 ancré, et de l’eau de qualité PCR ajustée à un volume final de 13 μL. La concentration rapportée de 2,5 μM fait référence à la concentration d’amorçage dans le mélange de 13 μL de gabarit et amorce avant l’ajout des composantes de la réaction de transcription inverse.

Réactif	Volume	Quantité/concentration finale
Tampon de réaction transcripteur à transcriptrice inverse (5×)	4 μL	1×
Inhibiteur de RNase protecteur (40 U/μL)	0,5 μL	20 U
Mélange de désoxynucléotides (10 mM chacun)	2 μL	1 mM chacun
Transcriptase inversée du transcripteur (20 U/μL)	0,5 μL	10 U
Mélange gabarit–amorce (Tableau 1)	13 μL	—
Total	20 μL	—

Tableau 2 : Mélange de réaction à transcription inverse pour la synthèse complémentaire d’acides désoxyribonucléiques. Réactifs, volumes et concentrations finales utilisés pour la synthèse d’acide désoxyribonucléique complémentaire (cDNA) de premier brin. Le volume de réaction final était de 20 μL. Les concentrations rapportées de triphosphate désoxynucléotide (1 mM chacune) font référence aux concentrations finales dans le mélange complet de la réaction.

Réactif	Volume	Quantité/concentration finale
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 μL	1×
Amorces d’oligonucléotides en direct et en arrière TSHB (voir Tableau des matériaux)	0,5 μL	400 nM
Eau de qualité PCR	3,5 μL	Ajustez à 9 μL de volume de réaction
Volume de réaction sous-total	9 μL	—
Modèle cDNA	1 μL	5 ng
Volume final de réaction	10 μL	—

Tableau 3 : Préparation quantitative de la réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse. Réactifs, volumes et concentrations finales utilisés pour l’amplification de la réaction en chaîne quantitative de la polymérase par transcription inverse (RT-qPCR) de l’acide ribonucléique messager Tshb (ARNm). Le volume du mélange de réaction avant l’ajout du gabarit était de 9 μL. Ajoutez 1 μL de gabarit complémentaire d’acide désoxyribonucléique (ADNc) immédiatement avant l’amplification pour obtenir un volume de réaction final de 10 μL.

Résultats

Douze souris C57BL/6 âgées de 8 semaines (6 mâles et 6 femelles) ont été traitées avec MMI et KClO₄ dans de l’eau potable, accompagnées d’un régime pauvre en iode pendant une semaine pour induire l’hypothyroïdie (Figure 1A). L’expression de l’ARNm hépatique de type 1 de Dio1 a été quantifiée chez des souris euthyroïdiennes et hypothyroïdiennes afin de confirmer une induction réussie^{de l’hypothyroïdie 29}. Les souris hypothyroï...

Discussion

Le protocole FACS basé sur CD90 décrit ici fournit une méthode reproductible pour enrichir les thyrotropes primaires du tissu hypophysaire adulte de souris tout en préservant la réactivité hormonale. Cette méthode répond à une limitation technique de longue date dans l’étude de la biologie des thyrotropes et de la régulation de l’axe HPT. Historiquement, les recherches sur la régulation des thyrotropes se sont largement appuyées sur la lignée cellulaire TαT1 ; cependant, les cellules TαT...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 µm filtre	Corning	430769	Pour la stérilisation du milieu de collecte
Filtre à seringue de 0,22 µm	Pall Life Sciences	PN4602	Pour la stérilisation de la collagénase
Trypsine-EDTA 0,5%	Gibco	15400-054	Pour la dissociation cellulaire
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL à liaison faible	Invitrogen	AM12450	Pour la coloration FACS
Tubes en polypropylène de 15 mL	Falcon	352097	Pour la collecte du lobe antérieur et la dissociation cellulaire
Aiguille de calibre 23	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Pour la perfusion cardiaque
Lame de chambre en verre à 8 puits	Millipore	PEZGS0816	Pour la culture post-FACS
Billes Accudrop	BD Biosciences	345249	Pour l'étalonnage du délai de goutte pendant le FACS
Anticorps anti-CD90.2 anti-souris PE-Cy7	Invitrogen	25-0902-82	Pour la coloration FACS
Compteur cellulaire automatisé	DeNovix	s-10700	Pour le décompte des cellules
Sérum bovin fœtal dépouillé au charbon	Gibco	12676029	Pour la culture des thyrotropes post-FACS
Collagénase de Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Pour la dissociation cellulaire
Plateau de dissection standard de laboratoire	Plateau de dissection standard de laboratoire	N/A	Pour la perfusion cardiaque
Solution de tampon HEPES sans Ca2+ et Mg2+	N/A	N/A	Pour la perfusion et la dissociation cellulaire
Primer oligonucléotidique A (CyA) cyclophiline forward	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	Pour la RT-qPCR
Primer oligonucléotidique A (CyA) cyclophiline reverse	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	Pour la RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Pour le milieu de collecte
Solution de DNase I	Promega	M6101	Pour la dissociation cellulaire
Enoxaparine sodique, injection	Sandoz	0781-3119-64	Pour la perfusion
Sérum bovin fœtal (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Pour le milieu de collecte
Tampon de coloration pour cytométrie en flux	Invitrogen	00-4222-26	Pour la coloration FACS
Hémostat	Fine Science Tools	13008-12	Pour la stabilisation de la cavité thoracique
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Pour le milieu de collecte
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	Pour la préparation de HBSS
Aliment sans iode	Envigo	TD.95007	Pour l'induction de l'hypothyroïdie in vivo
Pince à iris	Fine Science Tools	11065-07	Pour la dissection de l'hypophyse
Isoflurane	Piramal Critical Care	66794-017-25	Pour l'anesthésie
L-glutamine	Gibco	35050-061	Pour le milieu de collecte
Milieu 199	Gibco	11150-059	Pour la culture post-FACS
Méthimazole (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Pour l'induction de l'hypothyroïdie in vivo
Plaquette de réaction rapide MicroAmp à 96 puits	Applied Biosystems	4346907	Pour la RT-qPCR
Penicilline-Streptomycine	Gibco	15140122	Pour la culture post-FACS
Pompe péristaltique	Fisher Scientific	GP1000	Pour la perfusion cardiaque
Perchlorate de potassium (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Pour l'induction de l'hypothyroïdie in vivo
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Pour la RT-qPCR
Iodure de propidium	eBioscience	00-6990-50	Pour la coloration de viabilité pendant le FACS
Réactif de lyse QIAzol	Qiagen	79306	Pour l'extraction d'ARN
Tube en silicone	Cole-Parmer	EW-96410-13	Pour la perfusion cardiaque
Stéréomicroscope	Nikon	SMZ-745T	Pour la dissection du lobe antérieur
Système de PCR en temps réel StepOnePlus	Applied Biosystems	4376600	Pour la RT-qPCR
Cuillère chirurgicale	Fine Science Tools	10090-13	Pour le soulèvement du cerveau pendant l'exposition de l'hypophyse
Kit de synthèse d'ADNc de première chaîne Transcriptor	Roche	4379012001	Pour la préparation de l'ADNc
Bleu de trypan	Thermo Fisher Scientific	T10282	Pour le décompte des cellules
Primer oligonucléotidique Tshb forward	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	Pour la RT-qPCR
Primer oligonucléotidique Tshb reverse	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	Pour la RT-qPCR
Bain-marie	Fisher Scientific Isotemp Water Bath	15-462-5Q	Pour la digestion enzymatique